Procedury treningu behawioralnego dla wirtualnej rzeczywistości z głową u myszy

Podsumowanie

Artykuł opisuje procedury eksperymentalne dla powszechnie używanego paradygmatu wirtualnej rzeczywistości (VR) na myszach, a także określa wykonalność wykonywania złożonych zadań VR poprzez testowanie zadania dyskryminacji sygnału w kształcie litery Y.

Streszczenie

Wirtualna rzeczywistość (VR) w połączeniu z fiksacją głowy jest coraz częściej wykorzystywana w badaniach neuronauki behawioralnej, ponieważ pozwala na przeprowadzanie złożonych testów behawioralnych u myszy z głową. Umożliwia to precyzyjne zapisy behawioralne przy jednoczesnym zastosowaniu różnych technik neurofizjologicznych, które wymagają fiksacji głowy w celu zminimalizowania szumu sygnału związanego z ruchem podczas nagrań neuronowych. Jednak pomimo rosnącego wykorzystania VR, dostępnych jest niewiele opublikowanych danych na temat szczegółowej metodyki jej wdrażania. W tym badaniu opracowano protokół treningowy, w którym samce i samice myszy C57B16 / J są szkolone do biegania po wirtualnym korytarzu liniowym, którego długość zwiększa się z 1-3 m podczas wielu sesji treningowych. Opierając się na tych podstawach, w badaniu zbadano wykonalność myszy wykonujących złożone zachowania w VR przy użyciu paradygmatu labiryntu Y. Zadanie wymagało nawigacji do ramienia z czarnymi ścianami z wybranego punktu w labiryncie Y. Po osiągnięciu kryterium dwóch kolejnych dni równego lub większego niż 70% poprawności, myszy przeszły do coraz trudniejszej dyskryminacji sensorycznej. Odkrycia dostarczają ważnych szczegółów na temat metodologii przydatnych do skutecznego szkolenia myszy w VR i pokazują, że myszy wykazują zdolności uczenia się w poruszaniu się po labiryncie Y. Przedstawiona metodologia nie tylko oferuje wgląd w czas trwania szkolenia w testach opartych na VR, ale także podkreśla potencjał badania skomplikowanych zachowań u myszy, otwierając drogę do bardziej kompleksowych badań neurobiologicznych.

Wprowadzenie

Zadania wirtualnej rzeczywistości stały się potężną metodą oceny zachowania myszy ze względu na fiksację głowy, która pozwala na mechaniczną stabilność, która byłaby zagrożona u swobodnie zachowujących się myszy¹. Ta metoda umożliwia zredukowanie artefaktów ruchu w zapisach elektrofizjologicznych^2,3 i obrazowanie optyczne^4,5,6,7. Ułatwia również powtarzalne zachowania⁸ i precyzyjne śledzenie oczu⁹. W konfiguracji eksperymentalnej mysz jest zamocowana w miejscu i umieszczona na szczycie sferycznej bieżni podpartej powietrzem. Aparatura ta pozwala na skomplikowaną eksplorację wizualnie sterowanych zachowań w środowisku VR. Gdy mysz porusza się po bieżni, jej lokomocja płynnie synchronizuje się z nawigacją w wirtualnym krajobrazie, który jest wizualnie przedstawiony na ekranie otaczającym mysz.

Cel tego badania jest dwojaki: rozwiązanie kluczowych wyzwań w eksperymentalnej neuronauce behawioralnej i przyczynienie się do rozwoju metodologii w tej dziedzinie. Po pierwsze, pomimo zwiększonego wykorzystania VR w badaniach akademickich^10,11,12, nadal zauważalny jest brak kompleksowych metodologii i protokołów szkoleniowych, co utrudnia przyjęcie tej technologii przez nowych badaczy. Głównym celem było wypełnienie tej luki poprzez nakreślenie szczegółowego schematu treningowego dla paradygmatu toru liniowego, jak przedstawiono w poprzednich badaniach^13,14,15. Do opisania tych procedur operacyjnych wykorzystuje się dostępny na rynku system. Jako zastrzeżenie, niniejsze wytyczne proceduralne zawierają elementy charakterystyczne dla tego systemu; Jednak w celu omówienia możliwości uogólnienia tego protokołu można zapoznać się z dyskusją. Celem było nakreślenie procedur behawioralnych, typowego harmonogramu wykonywania tych procedur oraz wskaźnika sukcesu w szkoleniu myszy do biegania po prostym torze liniowym.

Po drugie, nadal brakuje dokumentacji na temat realizacji złożonych zadań labiryntowych w ramach tego paradygmatu u myszy. Złożone testy wirtualne zostały opracowane w szczurach¹¹. Jednak myszy mają obniżoną ostrość wzroku w porównaniu^{16 i często radzą} sobie gorzej w złożonych zadaniach¹⁷. Podczas gdy niektóre badania koncentrowały się na konkretnych zadaniach, takich jak gromadzenie dowodów lub nowość przestrzenna¹⁸, tutaj skupiono się na wyjaśnieniu metodologii szkolenia wymaganych od myszy do angażowania się w paradygmaty podejmowania decyzji w środowiskach VR. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano zadanie dyskryminacji sygnału, w którym myszy miały za zadanie nauczyć się kojarzyć kolor/luminancję (kontra biały) nagrodzonego ramienia z nagrodą, osiągniętą poprzez wybór czarnego ramienia w punkcie wyboru labiryntu Y, z właściwym ramieniem losowo przydzielonym w każdej próbie. Zadanie to zostało zaprojektowane tak, aby wymagało interakcji z wirtualnymi wskazówkami i zapewniało wgląd w zdolności percepcyjne myszy do rozróżniania.

Podsumowując, to badanie wypełnia krytyczne luki w dziedzinie eksperymentalnej neuronauki behawioralnej, dostarczając kompleksowe protokoły szkoleniowe dotyczące korzystania z paradygmatów VR u myszy i wyjaśniając metodologie dla złożonych zadań decyzyjnych w ramach tego systemu. Wykorzystując spostrzeżenia z poprzednich badań i innowacyjnych projektów eksperymentalnych, badanie to ma na celu usprawnienie praktyk badawczych i pogłębienie zrozumienia mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw zachowania. W kolejnych sekcjach zagłębimy się w procedury i wyniki eksperymentalne oraz omówimy wyniki.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt były przeprowadzane w ścisłej zgodności z protokołami ustalonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIEHS, zapewniając zgodność ze standardami etycznymi i wytycznymi dotyczącymi dobrostanu. Do badania wykorzystano myszy C57BL/6Tac w wieku około 8 tygodni

.

1. Operacja wszczepienia implantu pręta głowowego

1. Przygotowanie do zabiegu
   1. Zdobądź pożądaną ilość myszy dla swojej kohorty, najlepiej trzymając je pojedynczo, aby zminimalizować ingerencję w implant pręta na głowę, chociaż jest to opcjonalne¹⁹. W badaniu wykorzystano próbę trzech samców i trzech samic myszy (początkowo zrównoważonych, ale jeden samiec został wykluczony na początku treningu po tym, jak nie udało mu się biegać po piłce)
   2. Zdobądź materiały określone w Tabeli Materiałów, dostosowując je do specyfiki projektu badania.
   3. Po nabyciu myszy wyznacz indywidualne identyfikatory i wykonaj tatuaże na ogonie lub dziurkacze w uszach, aby zapewnić jednoznaczną identyfikację. Stwórz obszerny dziennik, aby systematycznie rejestrować ich wagę zgodnie z wymaganiami procedury ograniczenia wody.
2. Podawanie znieczulenia
   1. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są łatwo dostępne, w tym odpowiednie strzykawki, poduszka grzewcza, wyroby metalowe (takie jak pęseta, mikronożyczki i hemostatyki), roztwór jodu, lubrykant do oczu oraz zlewki na sól fizjologiczną i nadtlenek wodoru. Aby zapewnić sterylne warunki, zdezynfekuj cały sprzęt chirurgiczny i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu.
   2. Przed przystąpieniem do zabiegu należy przeprowadzić dokładne pomiary masy ciała myszy i aktywować poduszkę grzewczą do 34 °C. Zapisz wszystkie niezbędne informacje w notatniku laboratoryjnym/chirurgicznym swojej placówki. Sprawdź adekwatność poziomu tlenu i izofluranu w butli oraz potwierdź dostępność wszystkich niezbędnych materiałów ułatwiających nieprzerwane zabiegi chirurgiczne.
   3. Ułóż mysz i umieść ją w stożku na nos podłączonym do waporyzatora przeznaczonego dla małych zwierząt otrzymujących 4% izofluranu i natężenie przepływu tlenu 3 l/min w celu wywołania znieczulenia. Użyj zmiatacza, aby wychwycić wszelkie potencjalnie szkodliwe gazy odlotowe (zalecane).
   4. Podawaj maść weterynaryjną Petroleum ophthalmic do oczu myszy, gdy znajduje się ona pod nosem, aby zapobiec suchości oka. Na początku nałóż pojedynczą kroplę na każde oko i w razie potrzeby nałóż ponownie. Zapewnij stałą ochronę oczu, zawsze utrzymując warstwę tego smaru przy okresowej kontroli.
   5. Przygotuj miejsce operacji (Rysunek 1A) na głowie myszy, goląc obszar, w którym czaszka zostanie przymocowana do pręta na głowę.
   6. Umieść siekacze myszy w aparacie stereotaktycznym pod noskiem, dostosowując natężenie przepływu tlenu do 1 l/min i podając 1%-2% izofluranu z parownika. Zapewnij prawidłowy przepływ znieczulenia, regulując zawory i odpowiednio przełączając się między noskiem indukcyjnym a aparatem stereotaktycznym. Wyprostuj tylną nogę myszy i mocno dociśnij palec u nogi. Jeśli stopa nie wykazuje odruchowej reakcji wycofania, oznacza to, że znieczulenie jest skuteczne. Powtarzaj co 15 minut wraz z kontrolą oddechu.
   7. Zabezpiecz głowę myszy na miejscu, mocując chirurgiczne pręty stabilizujące w kanałach słuchowych, minimalizując potencjalny ruch głowy podczas operacji.
   8. Przed wykonaniem nacięć lub wstrzyknięć wysterylizuj ogoloną powierzchnię chirurgiczną na czubku głowy, szorując ją wacikiem zamoczonym w jodowym środku antyseptycznym. Od tego etapu należy używać sterylnych rękawiczek, aby utrzymać warunki aseptyki.
3. Podawanie we wstrzyknięciach
   1. Podskórnie wstrzyknąć 10 mg/kg (~0,05 ml na mysz z roztworu 5 mg/ml) bupiwakainy (znieczulenie miejscowe) za pomocą igły 25G w miejsce nacięcia chirurgicznego na skórze głowy.
   2. Podskórnie wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej (hydratacji) za pomocą igły 25G w jedną stronę obszaru międzyłopatkowego.
   3. Podskórnie wstrzyknąć 1 mg/kg (~0,05 ml na mysz z roztworu 0,5 mg/ml) buprenorfiny (znieczulenie całego ciała) za pomocą igły 25G po przeciwnej stronie obszaru międzyłopatkowego.
4. Odsłanianie czaszki
   1. Użyj mikronożyczek lub skalpela, aby wykonać nacięcie skóry nad szwami międzyczołowymi i międzynosowymi czaszki, zaczynając tuż nad grzbietem brwi i rozciągając się za wcięcie potyliczne (Ryc. 1A).
   2. Użyj hemostatów, aby przytrzymać lewy i prawy płat skóry, odsłaniając czaszkę.
   3. Użyj suchego bawełnianego wacika, aby usunąć tkankę łączną ze skóry głowy między upiętymi fałdami skóry.
   4. Użyj bawełnianego wacika zwilżonego (ale nie nasyconego) nadtlenkiem wodoru, aby wyszorować skórę głowy, zapewniając widoczność szwów i uważając, aby nadtlenek wodoru nie dostał się na otaczającą tkankę.
   5. Powtarzaj kroki 1.4.3 i 1.4.4, 2x-3x, aż zarówno bregma, jak i lambda będą wyraźnie widoczne, a skóra głowy zostanie dokładnie oczyszczona.
5. Chirurgiczne wszczepienie
   1. Przymocuj dwie do czaszki, umieszczając jedną z tyłu do bregmy, a drugą z przodu do lambda (Rysunek 1B), aby zmaksymalizować powierzchnię kleju dentystycznego i zwiększyć stabilność pręta na głowę. Ustaw położenie w celach w określonej odległości od bregma. Upewnij się, że jedna śruba jest umieszczona po lewej stronie, a druga po prawej (tj. Przednio-tylna (AP) +1.00, Przyśrodkowo-Boczna (ML) -1.00 i AP -3.00, ML +3.00), upewniając się, że między jest wystarczająca przestrzeń, aby dostosować się do umieszczenia głowicy i dostosować współrzędne i potrzebne.
   2. Wywierć pozycje docelowe, upewniając się, że wiercenie jest ograniczone do kości czaszki i nie przenika do tkanki mózgowej.
   3. Za pomocą śrubokręta wkręć mniej więcej połowę na miejsce. Powtórz dla drugiej.
6. Mocowanie implantu pręta głownego
   1. Wymieszaj cement dentystyczny i podaj go na spód pałąka, skupiając się na wklęsłej powierzchni, a następnie nałóż wzdłuż szwu międzyczołowego czaszki.
   2. Umieść pręt na głowie nad szwem międzyczołowym, aby ułatwić wiązanie między cementem dentystycznym na drążku a cementem na szwie. Bezpiecznie trzymaj go ręcznie pod żądanym kątem przez około 5 minut, aż stwardnieje. W razie potrzeby nałóż dodatkowy cement dentystyczny. (Rysunek 1C-E)
7. Ponowne zakładanie skóry na pałąk pod głowę
   1. Uwolnij hemostatyki i użyj pęsety, aby ponownie połączyć dwa płaty skóry nad wysuszoną kierownicą przymocowaną cementem dentystycznym. Użyj miejscowego kleju tkankowego, aby delikatnie zabezpieczyć skórę, powoli sklejając lewą i prawą część skóry głowy nad prętem na głowę, zaczynając od przedniego miejsca nacięcia, a kończąc na tylnym miejscu nacięcia.
   2. Poczekaj, aż miejscowy klej tkankowy stwardnieje, aby potwierdzić, że obszar chirurgiczny został ponownie uszczelniony przed uwolnieniem myszy z chirurgicznych prętów stabilizujących i nosa.
   3. Przenieś mysz do pojedynczo umieszczonej klatki i umieść ją na poduszce grzewczej w temperaturze 37.5 °C.
   4. Uważnie monitoruj mysz pod kątem oznak dyskomfortu lub nieprawidłowości w oddychaniu, dopóki nie odzyska przytomności. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska pozycji leżącej mostka, nie wykaże czujności i nie będzie chodzić.
   5. Po zabiegach chirurgicznych pozwól myszom na 1-tygodniowy okres odpoczynku. Monitoruj myszy codziennie, aby wykryć i zaradzić wszelkim zauważalnym wahaniom wagi. Zapewnij zacier myszom 3 dni po operacji, aby pomóc w powrocie do zdrowia. Aby zapobiec zakłóceniom w działaniu pałąka, umieść te myszy pojedynczo. Chociaż trzymanie grupowe może być możliwe i może potencjalnie poprawić dobrostan zwierząt.

2. Ograniczenie płynów

UWAGA: Ograniczenie dostępu do wody wywołuje u myszy stan pragnienia, zwiększając ich motywację do otrzymywania płynnych nagród. Jednak skrupulatna implementacja jest konieczna, aby zapewnić zachowanie dobrego samopoczucia myszy²⁰.

1. Po 1 tygodniu od dnia operacji ustal masę wyjściową dla myszy.
2. Przyklej jeden segment małej szalki Petriego (60 mm x 15 mm) wklęsłą stroną w dół do podłogi klatki, przyklejając mniejszą szalkę Petriego (35 mm x 10 mm) wklęsłą do środka płaskiej powierzchni szalki Petriego przyklejoną taśmą do podłogi, z kolejną małą szalką Petriego (60 mm x 15 mm) wklęsłą przyklejoną taśmą do płaskiej powierzchni środkowej szalki, aby służyła jako zbiornik na wodę (Rysunek 2).
3. Upewnij się, że wysokość górnego naczynia zapobiega zanieczyszczeniu materiałem ściółkowym, a jednocześnie umożliwia myszom łatwy dostęp do wody. Dodaj dzienną objętość wody do zbiornika za pomocą pipety.
4. W dniu 1 podaj myszom dawkę 15 ml wody na 100 g masy ciała.
5. W 2 dniu podaj myszom dawkę 10 ml wody na 100 g masy ciała.
6. W 3 dniu podaj myszom dawkę 5 ml wody na 100 g masy ciała. Myszy powinny otrzymywać minimalne spożycie 1 ml wody dziennie przez cały czas trwania badania, niezależnie od masy ciała.
   UWAGA: Badacze mogą zdecydować się na podawanie minimalnej objętości równomiernie u wszystkich badanych, chociaż takie korekty powinny być dokonywane z należytym rozważeniem.
7. Utrzymuj stałą dawkę wody przez cały czas trwania badania na poziomie 5 ml na 100 g masy ciała (lub jednolitą alokację 1 ml wody, jeśli jest to preferowane)
   UWAGA: Myszy powinny mieć zapewniony dostęp do wody ad libitum przez 1-2 dni w tygodniu, gdy myszy nie przeprowadzają eksperymentu VR (tj. w weekend). Ułatwi to przywrócenie im naturalnego poziomu nawilżenia. W przypadkach, gdy myszy spadną poniżej 90% zarejestrowanej masy wyjściowej, należy je przestawić na dostęp do wody ad libitum, aż osiągną 90% swojej masy wyjściowej. Myszy spadające poniżej 80% ich zarejestrowanej masy wyjściowej powinny zostać etycznie poddane eutanazji.
8. Opóźnij podawanie dziennej dawki wody o co najmniej 30 minut po ocenie behawioralnej, aby złagodzić potencjalne zakłócenia ich naturalnych zachowań związanych z pragnieniem, które są niezbędne do dokładnego przeprowadzenia eksperymentu.
   UWAGA: Zapewnienie dziennego przydziału wody bezpośrednio po sesji treningowej może nieumyślnie wpłynąć na wydajność myszy, ponieważ mogą one oczekiwać otrzymania wody niezależnie od swojej wydajności, co potencjalnie zagraża zaangażowaniu w zadanie.

3. Ustawienia systemu

1. Zapoznanie się ze sprzętem: Aby zapoznać się z komponentami sprzętowymi i innymi kwestiami dotyczącymi systemów behawioralnych VR, zapoznaj się z poniższymi krokami.
   Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby zapoznać się z możliwością uogólnienia protokołu na porównywalne konfiguracje systemu.
   1. W pełni wciągający wirtualny wyświetlacz lub kopuła: Ten wirtualny wyświetlacz zapewnia zwierzęciu pełne zanurzenie w konfigurowalnym środowisku wirtualnym. Ruch w środowisku wirtualnym jest zsynchronizowany z ruchem na bieżni sferycznej.
   2. Płynny układ nagrody: Płynny układ nagrody działa poprzez dostarczanie płynnego wzmocnienia (wody lub wody z cukrem) za pomocą pompy perystaltycznej, która kieruje roztwór nagrody przez pokrytą tworzywem sztucznym metalową rurkę przedłużającą się do myszy, gdy zadanie zostanie pomyślnie wykonane. Zawiera czujniki, które monitorują ilość nagród uzyskanych przez mysz podczas próby.
      1. Probówkę z nagrodą należy czyścić co tydzień za pomocą alkoholu etylowego lub alternatywnego środka czyszczącego. Aby to zrobić, przepłucz 2-5 ml środka czyszczącego przez rurkę, podobnie jak w przypadku dostarczania nagrody w postaci płynu, a następnie porównaj spłukiwanie równą objętością wody.
      2. Rozpoczynając eksperyment, określ szybkość dozowania płynnej nagrody z probówki nagrody, aktywując ją na określony czas i mierząc objętość dozowanego płynu. Procedura ta pozwala na określenie szybkości dostarczania cieczy przez pompę perystaltyczną. W tym badaniu zastosowano szybkość dozowania około 0,0083 ml/s.
         UWAGA: Większość systemów oferuje programowalne ustawienia czasu między wykonaniem zachowania a uwolnieniem nagrody, umożliwiając precyzyjne zaplanowanie protokołu badania w oparciu o zamierzoną ilość nagrody na próbę. Użyta ilość została uznana za wystarczającą, ponieważ dawała wystarczająco dużo czasu myszy na skonsumowanie nagrody, a jej objętość wydawała się być motywująca.
      3. Niektóre protokoły mogą wymagać od myszy polizania dziobka nagrody w celu zainicjowania dostarczania nagrody. Dla tego typu zadań, które zostały tu zastosowane, funkcjonalność ta nie została wykorzystana, dostarczaj nagrody uzależnione wyłącznie od pomyślnego wykonania pożądanego zachowania (tj. wyboru właściwej ręki w labiryncie y). Pomaga to uniknąć niepowodzeń na wczesnym etapie treningu, w których tendencja do lizania nie została wystarczająco ustalona, a początkowe lizanie jest mniej prawdopodobne. Może również pozwolić na pomiar oczekiwanej nagrody, która w pewnych warunkach jest oddzielona od wydajności nawigacyjnej¹¹.
      4. Podczas gdy niektóre eksperymenty z użyciem ograniczenia płynów optują za użyciem standardowej wody przez rurkę nagrody, tutaj używa się wody z cukrem (10% sacharozy v/v) jako dodatkowego bodźca motywacyjnego w paradygmacie instrumentalnym. Warto zauważyć, że po wprowadzeniu wody z cukrem zaobserwowano zwiększoną wydajność w wielu kohortach eksperymentalnych.
   3. Piłka styropianowa: Ta piłka działa jak kulista bieżnia. Po amortyzacji powietrzem od dołu wytrenuj myszy, aby wygodnie biegały lub chodziły po piłce. Umieść go na uchwycie kulkowym wyposażonym w czujniki śledzenia ruchu, które zbierają dane o odległości i prędkości.
   4. Uchwyt na głowę: Ustaw urządzenie z tyłu myszy, zapewniając wizualne wyrównanie z wyświetlaczem VR po przymocowaniu pałąka na głowę do uchwytu. Aparat ten ma kluczowe znaczenie dla utrzymania myszy w pozycji ustalonej na głowie, łagodząc w ten sposób artefakty ruchu, szczególnie gdy system jest używany wraz z obrazowaniem optycznym lub technikami elektrofizjologicznymi.
   5. Sprzęt do przepływu powietrza: Skonfiguruj przepływ powietrza ze źródła sprężonego powietrza do piłki w celu stworzenia nieważkiego środowiska sprzyjającego myszom biegającym po piłce. Ta konfiguracja wymaga regulatora przepływu, aby zapewnić precyzyjną kontrolę nad ciśnieniem powietrza przyłożonym do piłki. Piłka działa wydajnie w stanie nieważkości przy minimalnym dopływie powietrza. Dlatego podczas ustawiania systemu należy upewnić się, jaka jest minimalna ilość powietrza niezbędna do zapewnienia płynnego i niezakłóconego ruchu piłki w uchwycie. Zalecany przepływ w zakresie 10-20 l/min.
2. Konfiguracja oprogramowania: Szczegółowe informacje na temat działania systemu znajdują się poniżej.
   UWAGA: Podobnie jak w przypadku gier wideo²¹, architektura wirtualnych światów integruje kluczowe elementy, takie jak zewnętrzny kontroler, programowalne środowisko nawigacji oraz plik harmonogramu zawierający diagram stanów wyznaczający dynamiczne funkcje. Komponenty te synergistycznie łączą się, tworząc spójne, interaktywne doświadczenie dla osób zaangażowanych w badania naukowe. Skuteczność operacyjna oprogramowania zależy od precyzyjnej organizacji plików w wyznaczonych folderach. To wyjaśnienie przedstawi główne kroki potrzebne do wypełnienia gotowych szablonów, co pozwoli na łatwe dostosowanie istniejących plików i zapisanie ich jako nowych wersji. Te nowe wersje będą następnie stanowić podstawę badania.
   1. Użyj następujących trzech plików razem, aby skonfigurować operacyjny krajobraz wirtualny.
      1. Pliki XML: Ten format pliku umożliwia użytkownikom manipulowanie teksturą zdjęć różnych elementów, takich jak niebo, podłoga i ściany. Pliki użyte do wykonania zobrazowania należy umieścić w podfolderze Dane w folderze VR. Korzystając z nich, określ wymiary labiryntu i określ początkową pozycję myszy w labiryncie. Za pomocą tych plików zdefiniuj obiekty 3D (wskazówki wizualne) w określonych węzłach labiryntu. Zmodyfikuj te pliki za pomocą edytora tekstu.
      2. Pliki XLSX: Działają one jako pliki poleceń, które konfigurują wszystkie trzy typy plików (XML, XLSX i XAML) razem, tworząc spójną i interaktywną prezentację wirtualną. Pliki te służą do definiowania procedur eksperymentalnych, które uruchamiają VR i jego akcesoria, takich jak czułość wzmocnienia, które dane są wyodrębniane i które pliki są grupowane razem na potrzeby eksperymentu.
      3. Pliki XAML: Aplikacja zapewnia interfejs graficzny do tworzenia harmonogramów eksperymentalnych poprzez wykorzystanie schematów blokowych. Ułatwia to definiowanie parametrów czasowych dla próby, kontroli teleportacji po zakończeniu próby oraz czasu aktywacji wyjść cyfrowych w ramach badania.
   2. Poniższe aplikacje służą do pozyskiwania danych i kontroli użytkownika nad systemem podczas jego działania.
      1. [aplikacja] VR: Powiązany z plikiem .XML, który pokazuje reprezentatywny krajobraz, otwórz plik, aby wyświetlić podgląd wirtualnego krajobrazu na monitorach w trybie statycznym. W przypadku interakcji dynamicznej otwórz sparowaną konfigurację. XLSX w aplikacji sterującej.
      2. Kontrolka [aplikacja]: Skojarzona z plikiem .XSLX, otwórz tę aplikację, aby wyświetlić akcesoria powiązane z systemem. Z tego miejsca można ręcznie wysuwać i chować rurkę z nagrodą, dozować płynną nagrodę i przeglądać akwizycję danych w czasie rzeczywistym.
      3. Projektant harmonogramów [aplikacja]: Ta aplikacja umożliwia dostosowywanie plików XAML w celu ustanowienia harmonogramu wyzwalania zdarzeń w eksperymencie. Na przykład zaprojektuj konfigurowalny wyzwalacz, aby określić czas trwania dozowania nagród i zdefiniować czas trwania przerw między próbami dla myszy.
3. Przykładowe uruchomienie: Zacznij od podjęcia decyzji, jak będzie wyglądał protokół badania na podstawie regulowanych komponentów z kroków 3.2.1.1-3.2.1.3. Po jasnym zdefiniowaniu protokołu operacyjnego otwórz jeden z eksperymentów szablonu, które zostały wstępnie ustawione z systemem VR, wykonując poniższe czynności.
   1. Otwórz aplikację VR, która otworzy się w podfolderze Dane. Zapisz utworzony krajobraz wirtualny jako plik XML. Otwórz ten plik, a wirtualny krajobraz powinien pojawić się na monitorach VR.
   2. Otwórz aplikację Sterowanie i przejdź do ikony Otwórz folder w prawym górnym rogu ekranu. Kliknij ikonę, która powinna wywołać folder Configs, w którym znajduje się odpowiedni plik . Znajduje się konfiguracja eksperymentalna XLSX. Otwórz plik . Plik XLSX o takiej samej nazwie jak plik .XML otwarty w aplikacji VR. Zdefiniowane akcesoria systemowe, takie jak pompa i silnik wysuwanego urządzenia nagradzającego, są teraz widoczne w zakładce sterowania w aplikacji.
   3. Rozpocznij próbę eksperymentalną, ponieważ koordynacja między tymi dwiema aplikacjami umożliwia stworzenie interaktywnego wirtualnego krajobrazu. Ostatecznie ta integracja ułatwia monitorowanie istotnych danych, w tym odległości w płaszczyźnie XY i zbierania nagród ze znacznikami czasu.
4. Akwizycja danych: Wyodrębnij najcenniejsze dane behawioralne z systemu, którymi są dane pozycyjne i nagrody ze znacznikiem czasu. Dane te są zapisywane oddzielnie jako pliki dziennika.
   1. Dane dotyczące pozycji: Aby je uzyskać, wykonaj czynności opisane poniżej.
      1. Aby uzyskać dane pozycyjne XY myszy ze znacznikiem czasu, najpierw otwórz plik arkusza kalkulacyjnego labiryntu żądanego pozyskiwania danych. W tabeli 1 umieść polecenie WriteVRAndCamInfoToFile w jednej z komórek poniżej pozostałych w kolumnie A. Teraz dane pozycyjne zostaną automatycznie zapisane jako plik CSV z datą (o nazwie Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) w folderze configs po zakończeniu okresu próbnego.
      2. Aby wyeksportować dane o pozycji po próbie, zamknij aplikację kontrolną, a dane zostaną zapisane w pliku CSV z datą. Ten plik będzie zawierał wszystkie konkretne dane dla danego dnia, więc pamiętaj, aby ręcznie zanotować, kiedy każdy obiekt został umieszczony na piłce i zdjęty z niej. Otwórz plik i zaimportuj go przy użyciu zestawu znaków Unicode UTF-8. Kolumna A jest oznaczona etykietą DateTime, kliknij prawym przyciskiem myszy kartę A i kliknij Formatuj komórki. Przejdź do czasu i kliknij opcję MM/DD/RRRR HH:MM: SS. Teraz każde zdarzenie systemowe zostanie skatalogowane chronologicznie w celu dalszej analizy danych.
   2. Dane dotyczące nagrody: Aby je zdobyć, wykonaj czynności opisane poniżej.
      1. Dane dotyczące aktywacji pompy (dozowania nagrody) są automatycznie zapisywane w systemie jako pliki dziennika z datą, więc nie ma potrzeby wprowadzania polecenia, jak w przypadku danych o pozycji. Aby uzyskać do nich dostęp, przejdź do podfolderu Pliki dziennika w folderze configs.
      2. Powtórz krok 3.4.1 dla danych pozycji dla danych nagrody, aby wyeksportować dane jako plik arkusza kalkulacyjnego. Otwórz folder configs i wybierz plik nagrody z datą (o nazwie Corridor- MM.DD.YYYY lub Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) po wyświetleniu w folderze. Zapewni to datę i godzinę, kiedy myszy uzyskały nagrody, i można to wykorzystać w dalszej analizie danych w zależności od zastosowanego paradygmatu.

4. Zadania behawioralne

UWAGA: Zgodnie z ustalonymi metodologiami w neuronauce behawioralnej, sformułowane zadania wykorzystują technikę uczenia się opartego na nagrodach. Wykorzystując natychmiastowe nagrody w celu wzmocnienia określonych zachowań, zwierzęta są skutecznie szkolone do wykonywania powtarzalnych zadań, co jest ułatwione dzięki możliwości teleportacji VR. W ramach wirtualnego zachowania funkcja teleportacji umożliwia myszom angażowanie się w zadania bez stresu związanego z fizyczną manipulacją, jednocześnie skracając czas konfiguracji niezbędny do analogicznych zadań w świecie rzeczywistym. Podczas sesji treningowych używaj przyciemnionego czerwonego oświetlenia górnego w warunkach eksperymentalnych. Ten środek ostrożności jest zalecany ze względu na zmniejszoną wrażliwość wzrokową myszy na światło czerwone, co łagodzi potencjalne zakłócenia w postrzeganiu ekranów rzeczywistości wirtualnej (VR), w przeciwieństwie do stosowania światła białego²².

1. Przyzwyczajenia
   1. Rozpocznij przyzwyczajenie do bieżni sferycznej w tym samym czasie, co przyzwyczajenie do regulacji płynów, aby skojarzyć rurkę do lizania z nagrodą, korzystając z prawidłowo wymierzonej motywacji fizjologicznej. Zalecany jest trzydniowy okres przyzwyczajenia przed rozpoczęciem treningu na torze liniowym.
   2. W 1 dniu zajmij się myszami przez 5 minut po ważeniu. Podczas tej interakcji zaleca się delikatne chwytanie implantu pręta na głowę, gdy myszy znajdują się w klatce, co ułatwia zapoznanie się z taką manipulacją. Zapoznaj ich z obszarem, w którym VR jest przechowywany w tym dniu, aby umożliwić im przewidzenie środowiska przestrzennego, w którym odbędą się próby eksperymentalne. Ten pierwszy dzień przyzwyczajenia zbiega się z rozpoczęciem regulacji ilości płynów w ilości 15 ml na 100 mg masy ciała.
   3. W 2 dniu, który zbiega się z przejściem na etap regulacji płynów w dawce 10 ml na 100 mg masy ciała, ponownie zajmij się myszami przez 5 minut. Kontynuuj wielokrotne delikatne chwytanie pałąka na głowę w klatce. Przymocuj pałąk na głowę do uchwytu, pozwalając myszom zapoznać się z bieżnią sferyczną przez 5-20 minut, na nieskończenie powtarzającym się torze lub bez włączonego oprogramowania. Ułatwia to ich adaptację do stanu ustawienia na głowie. Należy przewidzieć, że myszy mogą w tym okresie wydalać odpady, które zwykle zmniejszają się w ciągu kolejnych sesji.
   4. W 3^dniu, który odpowiada ostatniemu dniu paradygmatu regulacji płynów (5 ml na 100 mg masy ciała), należy obchodzić się z myszami przez 5 minut. Następnie bezpiecznie przymocuj je do sferycznej bieżni z poduszką powietrzną i wprowadź je do płynnych nagród przez rurkę z nagrodami.
      1. Wprowadzenie dziobka do lizania naiwnym myszom na początku je zmyli, więc upewnij się, że mysz jest świadoma, że mają pić z rurki.
   5. Nie będąc zbyt forsownym, zastosuj poniższe wskazówki dotyczące pozycjonowania myszy i zindywidualizuj ustawienie myszy na piłce w stosunku do rurki w sposób, który dostarczy im nagrodę w wygodny sposób. Podczas uruchamiania upewnij się, że myszy piją z rurki; Wystąpi to u większości myszy naturalnie w warunkach ograniczonej ilości wody, gdy otrzyma się płyn do picia.
2. Ustawianie myszy
   1. Wstępne pozycjonowanie: Przed umieszczeniem myszy na piłce przedłuż wyśrodkowaną rurkę nagrody z małą kroplą nagrody na końcu. Wysuń rurkę nagrody przed umieszczeniem myszy na piłce, aby zapobiec potencjalnym obrażeniom wynikającym z nieumyślnego wysunięcia rurki zbyt daleko do przodu, gdy mysz jest zamocowana na głowie. Podnieś rurkę nagrody 5-15 mm ponad sferyczną bieżnię, tak aby lizanie dziobka wymagało naturalnej pozycji głowy skierowanej do przodu.
   2. Mocowanie głowy: Aby zamocować mysz głową, umieść mysz po dominującej stronie bieżni sferycznej. Następnie, używając dominującej ręki przewodnika, pociągnij mysz za pałąk w kierunku platformy mocującej głowę. Umieść pałąk w gnieździe przeznaczonym do mocowania, po czym za pomocą niedominującej ręki prowadzącego zatrzaśnij pręt górny na swoim miejscu.
   3. Lokalizacja na piłce: Zindywidualizuj rozmieszczenie na bieżni sferycznej dla każdej myszy, ale upewnij się, że spełniają one następujące wymagania, aby zapewnić motywację do degustacji nagrody i zminimalizować ogólny poziom stresu.
      1. Wyrównaj płaszczyznę środkową myszy ze środkiem kulistej bieżni. W przypadkach, gdy pasek głowy nie jest prosty, upewnij się, że płaszczyzna środkowa myszy, a nie pasek głowy, znajduje się w jednej linii ze środkiem umieszczenia. Dla jasności wizualnej zobacz Rysunek 3C.
      2. Upewnij się, że tylne łapy myszy znajdują się nie dalej niż 11 cm od wierzchołka bieżni sferycznej i że głowa znajduje się za wierzchołkiem. Upewnij się, że wszystkie cztery łapy dotykają bieżni i że brzuch może dotykać bieżni, gdy mysz jest w spoczynku; Zapewni to prawidłowy chód i stabilność na piłce podczas biegania.
      3. Kiedy myszy nie biegają, nazywa się to odmową piłki. Jeśli myszy nadal zastygają w bezruchu i nie próbują biegać, prawdopodobnie doświadczają nadmiernego lęku i badacz zdecydują się wykluczyć je z eksperymentu. W tym badaniu zastosowano ilościowy próg 5 dni odmowy przyjęcia piłki w celu określenia wykluczenia z danych.
   4. Stronniczość boczna: Kiedy myszy po raz pierwszy zaczynają przyzwyczajać się do rutyny treningowej, będą faworyzować jedną stronę nad drugą. Może to przeszkadzać w wykonywaniu zadań, więc należy uważać, aby żadna preferencja boczna nie wynikała z asymetrii w sposobie mocowania zwierzęcia na piłce. Zastosowane tutaj zadanie labiryntu Y wymaga od zwierzęcia dokonywania wyborów zarówno w prawo, jak i w lewo, aby zoptymalizować dostarczanie nagrody, co ułatwia przezwyciężenie preferencji pobocznych.
   5. Wylewka nagrody: To podejście polega na delikatnym manewrze zwanym metodą pocałunku, w którym mysz jest kierowana w kierunku przedłużonej rurki do lizania, aż jej usta prawie dotkną końcówki dziobka, zapewniając w ten sposób dokładne dostarczenie nagrody. Ustaw czas trwania przedłużonej rurki z nagrodami na 1 s, gdy myszy otrzymują nagrody, dając myszy wystarczająco dużo czasu na pełne skonsumowanie kropli. Zindywidualizuj położenie wylewki lizawki dla każdej myszy, ponieważ rozmiar i preferowane położenie dla każdej myszy mogą się różnić. Upewnij się, że rurka nagrody pozostaje wyśrodkowana przez wszystkie próby w celu standaryzacji lizania; Mysz powinna zawsze spodziewać się, że otrzyma nagrodę w tej samej fizycznej lokalizacji, niezależnie od projektu wirtualnego labiryntu.
      UWAGA: Chociaż określenie tego czasu trwania zależy od uznania badacza, wyniki te wskazują, że ten przedział czasowy był skuteczny w ułatwianiu całkowitego spożycia nagrody przez mysz przed wycofaniem rurki. Rysunek 3B przedstawia przykład preferowanego ustawienia do umieszczenia.
   6. Tor liniowy: Zgodnie z wcześniejszymi badaniami wykorzystującymi podobne metodologie, użyj zadania ścieżki liniowej, aby zbadać dwa kluczowe pytania: czas potrzebny na wyszkolenie myszy do pokonywania prostego korytarza oraz przewidywany wskaźnik sukcesu w pozyskiwaniu nagrody przez myszy.
      1. Upewnij się, że myszy przyzwyczaiły się zarówno do paradygmatu ograniczania płynów, jak i do sprzętu eksperymentalnego.
      2. Wykonuj codzienną 30-minutową sesję, aby poruszać się po liniowym wirtualnym korytarzu, zaczynając od długości 1 m. Po dotarciu do końca korytarza i otrzymaniu nagrody w postaci kropli cukru teleportuj myszy z powrotem do punktu początkowego.
      3. Określ oparte na kryteriach przejście do dłuższych labiryntów (np. 1 m, 2 m, 3 m). Przenieś myszy do następnej długości labiryntu po osiągnięciu 2 kolejnych dni otrzymywania średnio 2 nagród na minutę (Rysunek 4A).
      4. Dokumentuj codzienne zapisy danych ze znacznikiem czasu dotyczących pobierania nagrody oraz odległości pokonanej przez myszy na bieżni sferycznej w celu dalszej analizy (Rysunek 4B-D).
      5. W przypadku myszy otrzymujących średnio 2 nagrody na minutę na 3-metrowych torach liniowych, oznacz je jako biegłe w paradygmacie toru liniowego. Zaleca się, aby myszy osiągnęły tę fazę przed przejściem do bardziej złożonych zadań behawioralnych wymagających podejmowania decyzji.
   7. Złożone zadania behawioralne wymagające podejmowania decyzji (labirynt Y): Ta faza bada możliwość przejścia od prostego do bardziej złożonego zadania behawioralnego, które wymaga podejmowania decyzji. Aby to osiągnąć, utwórz wymyślone zadanie Y-Maze rozróżniania sygnałów.
      1. W tym paradygmacie labiryntu Y^23,24, upewnij się, że myszy poruszają się w kierunku punktu wyboru, w którym dwa ramiona rozciągają się pod kątem 45° w dowolnym kierunku, jak kształt litery Y. Wyłącz obrót od punktu początkowego labiryntu aż do osiągnięcia punktu wyboru, dwóch ramion o różnym kolorze, a następnie aktywuj go w strefie decyzji, aby umożliwić mysz obrócenie się w pożądanym kierunku.
      2. Po wejściu do ramienia prowadzącego do strefy nagród, ponownie dezaktywuj rotację. Czarne ramię reprezentuje poprawną ścieżkę, podczas gdy białe ramię reprezentuje nieprawidłową ścieżkę. Użyj czarnego ramienia i białego ramienia jako wskazówek, aby dostosować się do potencjalnych ograniczeń ostrości wzroku myszy, ponieważ są one łatwe do odróżnienia, ułatwiając badanie wykorzystania informacji wizualnych w najprostszej formie.
      3. Trenuj myszy, aby poruszały się w kierunku czarnego ramienia, aby uzyskać nagrodę w postaci cukru, a każda próba kończy się teleportacją myszy z powrotem do miejsca startu. Uwzględnij w projekcie eksperymentalnym losowe tasowanie lokalizacji nagrody między lewą a prawą stroną, upewniając się, że myszy kojarzą nagrodę ze wskazówkami wizualnymi, a nie z konkretną stroną.
      4. Wykonaj te same kroki, aby skonfigurować labirynt Y, co korytarz liniowy. Odzwierciedl kryteria progresji w paradygmacie labiryntu Y do tych z korytarza liniowego: każda próba trwa 30 minut, a myszy muszą osiągnąć z góry określony próg nagrody przez 2 kolejne dni. Próg 70% prawidłowo zdobytych nagród jest zalecany na podstawie średnich wyników poprzednich kohort pilotów w labiryncie Y; jest powyżej progu prawdopodobieństwa (50%) i reprezentuje rozsądnie osiągalny odsetek wskazujący na to, że myszy rozumieją zadanie (Rysunek 5A).
      5. Po dotarciu do punktu wyboru upewnij się, że mysz wybrała jedno z właściwych lub nieprawidłowych ramion. Na końcu ramienia teleportuj je z powrotem do punktu początkowego, aby powtórzyć labirynt w ciągu 30 minut.
      6. W tym podejściu zastosowano podejście inspirowane psychofizyką wizualną, w którym labirynty stawały się coraz trudniejsze do rozróżnienia. Postępuj zgodnie z poniższym opisem, aby zapoznać się z postępem w paradygmacie labiryntu Y.
         1. W początkowym labiryncie Y umieść solidne czarno-białe ramiona w wybranym punkcie labiryntu. Jeśli mysz poprawnie wybrała czarne ramię w 70% prób przez 2 kolejne dni, przejdź do kolejnego poziomu z coraz trudniejszymi zadaniami dyskryminacyjnymi. Aby to osiągnąć, stopniowo wprowadzaj dodatkowe 10% kontrastowego koloru do każdego ramienia na każdym poziomie postępu. Na przykład, zmień białe ramię tak, aby składało się w 90% z białych i w 10% z czarnych, i odwrotnie, co sprawi, że dyskryminacja stanie się bardziej wymagająca z każdym postępem.
            UWAGA: Pomysł na zwiększenie polega na tym, że jeśli uda się osiągnąć 50% białego/czarnego, będzie to skuteczna kontrola, ponieważ ramiona będą nie do odróżnienia. Jednak najdalej myszy były w stanie wizualnie rozróżnić 80%:20% (Rysunek 5B).

Wyniki

To pilotażowe badanie miało na celu nakreślenie metodologii efektywnego szkolenia myszy w dwóch różnych zadaniach: prostym korytarzu i złożonym zadaniu podejmowania decyzji (zadanie wizualnej dyskryminacji w labiryncie Y). Dane te posłużyły jako podstawa do ustalenia wytycznych czasowych dla treningu behawioralnego w VR.

Etapy procedury rozpoczynają się od nakreślenia chirurgicznego wszczepienia kierownicy w Rysunek 1. Implant ten służy do stabilizacji czaszki myszy podczas oceny behawioralnej, zwiększając w ten sposób precyzję zapisów neuronowych, szczególnie w połączeniu z elektrofizjologią lub technikami obrazowania.

Rysunek 2 i Rysunek 3 ilustruje komponenty sprzętowe i konfigurację systemu eksperymentalnego. Rysunek 2 przedstawia szczegółowo system dostarczania wody, który wykorzystywał metodę fontanny na szalkach Petriego. Polegało to na umieszczeniu płytki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm wklęsłą stroną do dołu na dnie klatki, zabezpieczeniu mniejszej szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm wklęsłą stroną do dołu na środku większej szalki i umieszczeniu kolejnej szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm wklęsłą stroną do góry na mniejszej szalce, która służyła jako zbiornik na wodę. Wysokość górnego naczynia została starannie dostosowana, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez materiał ściółkowy, jednocześnie zapewniając myszom łatwy dostęp do wody.

Rysunek 3 przedstawia wytyczne dotyczące sprzętu systemowego i pozycjonowania myszy. Rysunek 3A przedstawia konfigurację VR, która składała się z sześcioekranowego układu z kulistą bieżnią umieszczoną centralnie. Rysunek 3B pokazuje optymalne umiejscowienie myszy na bieżni, z głową ustawioną w naturalnej pozycji i wszystkimi czterema łapami stykającymi się z powierzchnią. Rysunek 3C porównuje prawidłowe i niepoprawne ułożenie myszy względem paska na głowę, podkreślając, że płaszczyzna środkowa myszy powinna być wyśrodkowana, a nie wyrównana z samą belką na głowę.

Rysunek 4 przedstawia krzywe zdobywania nagród na wykresie liniowym, ilustrując oczekiwane okresy nauki dla wąskich korytarzy 1 m, 2 m i 3 m w VR w oparciu o predefiniowane parametry postępu. Przedstawia średnie prędkości myszy na odpowiednich długościach torów, wykazując stopniowy wzrost prędkości jako dowód uczenia się i poprawy zadań współmiernych do zwiększonego poziomu trudności. Pokazany jest również wykres słupkowy ilustrujący średnią liczbę dni potrzebnych myszom do osiągnięcia kryterium torów liniowych, a także wykres słupkowy przedstawiający średnie prędkości dla każdej długości ścieżki. Następnie zilustrowano również kolejne etapy zadania toru liniowego, którego nauczyły się myszy. Zadania te zostały zaprojektowane tak, aby odtworzyć metodologie ustalone w literaturze naukowej, zapewniając jednocześnie wykonalną krzywą uczenia się dla myszy, ułatwiając im awans na kolejne poziomy.

Na koniec, Rysunek 5 przedstawia dane dotyczące zadania Y-Maze. Rysunek ilustruje progresywny charakter zadania, zaczynając od prostego rozróżnienia między solidnymi czarnymi i białymi ramionami. Ten początkowy etap służy jako podstawowy krok, ustalając zdolność myszy do rozróżniania kontrastujących sygnałów wizualnych. Kolejne poziomy zadania wprowadzają coraz większą złożoność poprzez włączenie dodatkowych procentów kontrastowego koloru do każdego ramienia, tym samym jeszcze bardziej podważając zdolności rozróżniania myszy. Stopniowe zwiększanie trudności zadań jest zilustrowane przejściem od jednolitych czarno-białych ramion do ramion składających się w 90% z jednego koloru i w 10% z drugiego. Warto zauważyć, że dane przedstawione w Rysunek 5 wskazują, że chociaż dokładność dyskryminacji poprawia się z każdym poziomem postępu, niektóre myszy konsekwentnie wykazują próg zdolności do dyskryminacji wizualnej, osiągając maksymalnie 80%/20% dyskryminacji białej/czarnej. Obserwacja ta podkreśla ograniczenia związane ze zdolnościami rozróżniania wzrokowego myszy w kontekście zadania Y-Maze, dostarczając cennych informacji na temat wykonalności zadania i zdolności poznawczych badanych. Następnie szczegółowo omówiono kolejne etapy zadania ścieżki Y-labirynt, które zostały zaprojektowane tak, aby były zgodne z ustalonymi metodologiami w literaturze. Etapy te zapewniły myszom wykonalną krzywą uczenia się, wspierając ich stopniowe przechodzenie przez kolejne poziomy.

Rysunek 1: Instrukcje chirurgiczne dotyczące wszczepienia pręta na głowę. (A) Miejsce nacięcia jest zaznaczone na czaszce myszy. (B) powinny być wszczepione 1 mm na lewo od szwu międzyczołowego nieco poniżej bregmy i 3 mm na prawo od szwu międzyczołowego nieco powyżej lambda. (C) Pręt na głowę powinien być umieszczony wzdłuż szwu międzyczołowego. (D) Nałóż cement dentystyczny na implant pręta na głowę. (E) Rzeczywista wizualizacja pręta pod głowę po nałożeniu cementu dentystycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: System dostarczania wody za pomocą metody fontanny na szalce Petriego. Szalka Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm została zamocowana wklęsłą stroną do dołu na podłodze klatki. Mniejsza szalka Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm została wyśrodkowana na większej szalce, a kolejna szalka Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm została umieszczona wklęsłą stroną do góry na górze, aby służyć jako zbiornik. Taka konfiguracja zapewniała, że woda pozostała nieskażona ściółką i dostępna dla myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Sprzęt systemowy i wytyczne dotyczące pozycjonowania myszy. (A) Wyświetla używaną konfigurację VR. Wykorzystano konfigurację z sześcioma ekranami, z kulistą bieżnią umieszczoną pośrodku. (B) Widok z boku optymalnego umieszczenia myszy na bieżni sferycznej. Głowa myszy znajduje się w naturalnej pozycji, podczas gdy wszystkie cztery łapy znajdują się na sferycznej bieżni. (C) Widok z góry na prawidłowe i nieprawidłowe ułożenie myszy w stosunku do paska na głowę. Aby uzyskać prawidłowe umieszczenie, płaszczyzna środkowa myszy powinna być wyśrodkowana, a nie sama belka na głowę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Dane ścieżki liniowej. (A) Prezentowane dane przedstawiają dzienne nagrody zebrane w ciągu każdego 30-minutowego okresu próbnego. Myszy przechodziły do dłuższych ścieżek, gdy osiągnęły średnio 2 nagrody na minutę przez 2 kolejne dni, co daje w sumie 60 nagród (próg). (B) W miarę jak myszy nabywały biegłości w tym zadaniu, ich prędkości wykazywały stopniowy wzrost, co wskazuje na skuteczność wzmocnienia nagrody. Wykres ilustruje średnią dzienną prędkość każdej myszy na torze w cm/s, przedstawiając liniowy postęp w wyuczonym zachowaniu. (C) Ten wykres słupkowy ilustruje czas potrzebny każdej myszy na osiągnięcie biegłości w zakresie poszczególnych długości torów, z odpowiednimi średnimi i błędem standardowym przedstawionymi dla każdej długości ścieżki. (D) Ten wykres słupkowy pokazuje średnią i błąd standardowy średnich dziennych prędkości osiąganych przez każdą mysz na różnych długościach torów. Prawie liniowa progresja sugeruje wyuczone zwiększenie prędkości biegu. (E) To ilustruje postęp zadania liniowego toru, które wymaga 2 kolejnych dni próbnych po 60 nagród przed awansem do dłuższej wersji labiryntu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Dane Y-Maze. (A) Pokazuje to rozkład nagród zdobytych na różnych etapach postępu w labiryncie Y. Analiza ta skupiła się wyłącznie na podgrupie czterech myszy, które ukończyły wszystkie fazy ścieżki liniowej, zapewniając w ten sposób sprawiedliwą reprezentację zarówno mężczyzn, jak i kobiet. (B) Ta wizualna reprezentacja ilustruje etapy zadania Y-Maze, w którym myszy się naprzód po osiągnięciu dwóch kolejnych dni z 70% poprawnymi wyborami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W badaniu tym zastosowano kompleksowe podejście do zbadania reakcji behawioralnych myszy w środowiskach VR, koncentrując się na realizacji procedur chirurgicznych, protokołach ograniczenia płynów, konfiguracji systemu i zadaniach behawioralnych. Odkrycia te przyczyniają się do rozwoju tej dziedziny, dostarczając szczegółów proceduralnych, ram czasowych szkoleń i wskaźników sukcesu. Umożliwi to skuteczniejsze przyjęcie procedur VR u myszy oraz ułatwi planowanie i realizację laboratoriom zainteresowanym wykorzystaniem tej procedury w swoich badaniach.

Chirurgiczne wszczepienie prętów na głowę było niezbędne do ułatwienia eksperymentów behawioralnych z głową w środowiskach VR. Dzięki starannemu przestrzeganiu ustalonych protokołów i zapewnieniu odpowiedniej opieki pooperacyjnej, zapewniono udaną integrację prętów na głowę przy jednoczesnym zminimalizowaniu niekorzystnego wpływu na zdrowie i zachowanie zwierząt. Ponadto wdrożono protokoły ograniczania płynów, aby regulować spożycie wody i utrzymywać poziom nawodnienia i pragnienia wśród myszy. Stopniowy proces aklimatyzacji i okresowy dostęp do wody były kluczowe dla zapewnienia dobrostanu zwierząt, a jednocześnie ułatwiały realizację zadań behawioralnych.

Konfiguracja systemu behawioralnego VR obejmowała integrację komponentów sprzętowych i programowych w celu stworzenia wciągających środowisk wirtualnych dla myszy. Wykorzystanie w pełni immersyjnych wirtualnych wyświetlaczy, płynnych systemów nagród, styropianowych kulek jako sferycznych bieżni i uchwytów na głowy umożliwiło precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych i pozyskiwanie danych. Zadania behawioralne, w tym paradygmaty toru liniowego i labiryntu Y, zostały starannie zaprojektowane, aby zbadać kluczowe aspekty zachowania myszy, takie jak lokomocja, podejmowanie decyzji i przetwarzanie nagrody.

Pomimo dołożenia wszelkich starań w celu optymalizacji procedur eksperymentalnych, w trakcie badania napotkano kilka wyzwań. Zmienność reakcji poszczególnych myszy oraz problemy techniczne związane z integracją sprzętu i oprogramowania stanowiły wyzwanie dla gromadzenia i analizy danych. Ponadto poleganie na protokołach ograniczenia płynów wymagało starannego monitorowania stanu nawodnienia zwierzęcia i odpowiedniego dostosowania procedur eksperymentalnych. Czasami myszy miały problemy po umieszczeniu na piłce, nie piły z dziobka nagrody lub zamarzały i nie biegały po piłce. Chociaż niektóre z tych wyzwań mogą być tymczasowe, ważne jest, aby monitorować myszy, aby upewnić się, że nie doświadczają przeszkód w swoim postępie. Myszy, które nie wykazują postępu w porównaniu z rówieśnikami, powinny zostać wycofane z badania. W jednym z podobnych eksperymentów usunięto 4 z 55 myszy z powodu ich niezdolności do nauczenia się paradygmatu²⁵. Myszy wykazujące stały bezruch na piłce przez 5 kolejnych dni zostały wykluczone z badania po dokładnej ocenie ich wagi, zdolności dostępu do dziobka nagrody w celu picia i ułożenia na piłce, aby upewnić się, że nie występują żadne podstawowe problemy. W takich przypadkach to od badacza zależy, jaką strategię przyjąć, aby skutecznie wznowić badanie.

Te protokoły treningowe zostały zaprojektowane tak, aby stopniowo rzucać wyzwanie myszom, zapewniając jednocześnie ich biegłość w wykonywaniu zadań behawioralnych. Kryteria progresji od toru liniowego do paradygmatu labiryntu Y opierały się na zdolności myszy do spełnienia wcześniej określonych progów wydajności, takich jak osiągnięcie kolejnych dni udanych prób i zdobycie nagrody. Wdrożenie rygorystycznych protokołów treningowych pozwoliło nam ocenić zdolności behawioralne myszy i zdolności adaptacyjne do coraz bardziej złożonych zadań. Te starannie skonstruowane protokoły zapewniają solidne ramy dla badaczy w dziedzinie neuronauki behawioralnej, oferując systematyczne podejście do oceny i szkolenia zwierząt pod kątem różnych paradygmatów eksperymentalnych. Określając jasne kryteria postępu, naukowcy mogą skutecznie ocenić krzywą uczenia się osób eksperymentalnych i odpowiednio dobrać paradygmaty treningowe. Co więcej, to podejście metodologiczne sprzyja odtwarzalności i standaryzacji eksperymentów, ułatwiając analizy porównawcze i pogłębiając zrozumienie procesów poznawczych i mechanizmów uczenia się w modelach zwierzęcych.

Projektując paradygmat VR dla myszy, kluczowe jest rozpoznanie zakresu dostępnych podejść dotyczących złożoności zadań i postępów w szkoleniu. Protokół ten oferuje szerokie ramy do konstruowania projektu eksperymentalnego, ale to od badacza pozostaje dostosowanie określonych aspektów, takich jak dostarczanie nagrody, kontrola uprzedzeń, rodzaj bodźca, postęp zadania i parametry systemu zgodnie z potrzebami badania. Na przykład niektóre badania optują za bardziej uproszczonym podejściem, koncentrując się na natychmiastowym zaangażowaniu w zadania. Przykładem są Krumin i in., którzy zaimplementowali pojedyncze, spójne zadanie T-labirynt, zamiast stosować progresywny reżim uczenia się między różnymi zadaniami. W przeciwieństwie do tego, inne badania oferują różne elementy projektu próby, takie jak strategie wzmacniania bodźców i sygnały słuchowe. W badaniu wykorzystano słuchowe sprzężenie zwrotne jako karę za nieprawidłowe próby i zapewniono tylko wodę jako nagrodę za prawidłowe próby²⁶. I odwrotnie, Zhao i in. zastosowali 10% roztwór sacharozy jako nagrodę za poprawne próby i nie włączyli żadnej formy kary za nieprawidłowe próby²⁷. Zamiast tego skupili się na łagodzeniu nieprawidłowych reakcji za pomocą metod takich jak trening zapobiegający uprzedzeniom, który polegał na zwiększeniu prawdopodobieństwa zmiany kierunku sygnału z poprzedniego wyboru zwierzęcia i dostosowaniu dziennego spożycia wody w celu zwiększenia motywacji. Różnice w projekcie eksperymentalnym, takie jak obecność wskazówek przestrzennych w całym zadaniu, mogą prowadzić do różnych interpretacji kodowania neuronalnego, o czym świadczą Zhao i wsp., którzy odkryli selektywność komórek tylnej kory ciemieniowej wyjaśnioną trajektoriami i preferencjami przestrzennymi, w przeciwieństwie do obserwowanych przez Harveya i in. sekwencji aktywacji zależnych od wyboru^27,28. Należy zauważyć, że zastosowany sprzęt obejmował sześć monitorów LCD, wysuwaną wylewkę do lizania i bieżnię z kulkami styropianowymi z poduszką powietrzną. Istnieje wiele różnic między systemami rzeczywistości wirtualnej w różnych laboratoriach, w tym użycie projektorów²⁹ w porównaniu z monitorami komputerowymi, bieżni niesferycznych³⁰ oraz stałych¹⁰ w porównaniu z wysuwanymi wylewkami do lizania.

Podsumowując, badanie to dostarcza cennych informacji na temat reakcji behawioralnych myszy w środowiskach VR i pokazuje możliwość zastosowania technologii immersyjnej do badania złożonych zachowań. Przyszłe przedsięwzięcia badawcze mogą koncentrować się na udoskonalaniu protokołów eksperymentalnych, badaniu mechanizmów neuronowych leżących u podstaw procesów decyzyjnych i przekładaniu wyników na zastosowania kliniczne. Kontynuując pogłębianie wiedzy na temat zachowania myszy, naukowcy mogą dokładniej wyjaśnić obwody neuronalne i procesy poznawcze leżące u podstaw złożonych zachowań zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,4 mm (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	dla zwiększenia stabilności headbara
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Znieczulenie miejscowe
Buprenorfina	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	analgezji
	Wahl	1565q	do golenia obszaru chirurgicznego
Wiertarka i robot do mikroiniekcji	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Chirurgiczny adhezyjny
implant głowy	Luigs-Neumann	130060	do implantu głowy myszy
(Lectro-Kennel)	K& H Produkcja	100212933
Hemostatyki	Światowe instrumenty precyzyjne	501291	narzędzie chirurgiczne
Nadtlenek wodoru	pływał	L0003648FB	środek czyszczący
Isoflurane	Dechra	B230008	Chirurgiczny inhalacyjny środek znieczulający
Isoflurane / O2 Urządzenie dostarczające z nasadkami do nosecomba	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anestezjologiczne	urządzenie chirurgiczne
Metabond	Parkell	CB-S380	Samoprzylepne
mikronożyczki	Narzędzia do nauki	15000-08	Narzędzie chirurgiczne
Tlen	Praxair	UN1072	Chirurgiczny
wacik tlenowy powidonowo-jodowy	Dynarex	g172095-05	Narzędzie chirurgiczne
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Środek nawilżający
Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką (końcówki Q)	Puritan	25-806 Narzędzie	chirurgiczne
Sacharoza	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Główny wzmacniacz / motywator / pęseta z
nagrodami	Świat Instrumenty precyzyjne	504505	Narzędzie chirurgiczne
System wirtualnej rzeczywistości	PhenoSys	JetBall-TFT	JetBall, sferyczna bieżnia z poduszką powietrzną, pozwala zwierzęciu bez wysiłku poruszać się w wirtualnym świecie wyświetlanym na 6 otaczających monitorach.
Biała maść do oczu z lubrykantem wazelinowym	AACE Pharmaceuticals	NDC: 71406-124-35	Smar do oczu