Artykuł metodologiczny

Tanie projekty mikrofluidyki laminacji politereftalanu etylenu do multipleksowanego obrazowania danio pręgowanego

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67313

⸱

27 września 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Bindley Bioscience Center, Purdue University, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Innowacyjna metoda wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych wykorzystujących laminowanie politereftalanu etylenu (PET) znacznie zmniejsza koszty i złożoność chwytania i obrazowania wielu żywych zarodków danio pręgowanego.

Streszczenie

Zarodki zebry są przezroczyste, a tym samym wyjątkowo nadają się do nieinwazyjnego obrazowania podstawowych procesów przyżyciowych, takich jak gojenie się ran i migracja komórek odpornościowych. Urządzenia mikroprzepływowe są używane do pułapek w celu wspomagania długoterminowego obrazowania organizmów wielokomórkowych, w tym danio pręgowanego. Jednak wytwarzanie tych urządzeń przy użyciu miękkiej litografii wymaga specjalistycznego zaplecza i kompetencji w zakresie druku 3D, które mogą nie być dostępne dla każdego laboratorium. Adaptacja wcześniej opracowanej, taniej metody laminowania politereftalanu etylenu do budowy urządzeń mikroprzepływowych zwiększa dostępność, umożliwiając projektowanie, wytwarzanie i iterację za ułamek inwestycji technicznych w porównaniu z konwencjonalnymi technikami. Używamy urządzenia wykonanego tą metodą, Rotacyjnego Asystenta Obrazowania Danio Późniejszego Gojenia (RADISH), aby dostosować się do leczenia farmakologicznego, ręcznego zraniania i długoterminowego obrazowania do czterech zarodków w tym samym polu widzenia. Dzięki tej nowej konstrukcji z powodzeniem rejestrujemy ogólne cechy morfologiczne sygnału wapniowego wokół ablacji laserowej i ręcznego przecięcia ran dla wielu zarodków w ciągu 2 godzin bezpośrednio po urazie, a także rekrutację neutrofili do krawędzi rany przez 24 godziny.

Wprowadzenie

Zdolność do adekwatnego reagowania na uraz jest kluczowa dla przetrwania każdego organizmu w każdej skali, od pojedynczej komórki do wielu tkanek. Ranienie i związane z nim reakcje, takie jak rekrutacja fagocytów do uszkodzonych obszarów1 są zatem istotnymi tematami w biologii komórki i tkanki. Rany są wykrywane natychmiast po naruszeniu bariery tkankowej, powodując reakcję gradientu tkanek obejmującą skurcz rany2,3, który koordynuje gojenie się ran i późniejszy odrost4. Ze względu na mechaniczny charakter tego skurczu, narzędzia używane podczas eksperymentów nie mogą fizycznie utrudniać ruchu komórek w pobliżu miejsca urazu.

Zarodki danio pręgowanego są doskonałym modelem do badania rozwoju i chorób, w tym reakcji na rany kręgowców, ze względu na ich łatwość pielęgnacji, wykonalność genetyczną i przejrzystość optyczną5,6. Jednak unieruchomienie całego organizmu na dłuższy czas jest potrzebne do zbadania długoterminowego zachowania komórek w pobliżu miejsca urazu. Osadzenie zarodków w niskotopliwej agarozie jest wystarczające do krótkotrwałego obrazowania nieuszkodzonej tkanki. Jednak otaczająca matryca żelowa ogranicza kurczenie się i rozluźnianie ran oraz hamuje wzrost rozwijających się zarodków w czasie7,8,9.

Urządzenia mikrofluidyczne mogą unieruchamiać zarodki danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju10,11,12,13,14,15,16, a także niektóre, takie jak zWEDGI7, umożliwia ręczne zwijanie. Istnieje jednak kilka wad dostępnych konstrukcji urządzeń. Na przykład wiele urządzeń drukowanych bezpośrednio na plastiku jest niekompatybilnych z obrazowaniem w systemach mikroskopów odwróconych ze względu na słabą przezroczystość optyczną. Co więcej, kanały równoległe umożliwiają obrazowanie wielopozycyjne10,11, ale fizyczny ruch stolika mikroskopu powoduje opóźnienie w akwizycji obrazu. Wielokrotne iteracje i optymalizacje w celu rozwiązania tych problemów są trudne, biorąc pod uwagę inwestycje finansowe i techniczne wymagane dla każdego nowego projektu, zwłaszcza dla obecnych złotych standardów metod wytwarzania urządzeń przy użyciu miękkiej litografii polidimetylosiloksanu (PDMS). Pierwszym krokiem, jakim jest stworzenie formy wzorcowej, często wymaga znajomości oprogramowania do modelowania 3D, dostępu do specjalistycznego sprzętu produkcyjnego oraz (w zależności od użytego materiału) dodatkowej obróbki przeciwadhezyjnej, takiej jak silanizacja, zanim forma zostanie kiedykolwiek użyta. Utwardzanie PDMS po wylaniu zajmuje co najmniej godzinę w wysokich temperaturach i generalnie musi być wykonywane w próżni lub za pomocą zacisku, aby uzyskać najlepsze wyniki, często w czystym pomieszczeniu7,17,18. Podobnie jak w biologii rozwojowej, koszty te mogą szybko okazać się zaporowe w przypadku eksperymentów wymagających wielu unikalnych środowisk mikroprzepływowych w wielu modelach.

Spośród dostępnych alternatywnych materiałów budowlanych, politereftalan etylenu (PET) jest trwały, nietoksyczny i łatwy w obsłudze. Arkusze PET są szeroko dostępnymi plastikowymi woreczkami do laminowania, dostępnymi w większości sklepów z artykułami biurowymi, z wstępnie nałożonym klejem aktywowanym termicznie (zwykle octanem etylenu i winylu). Kształtując te arkusze PET za pomocą dostępnych na rynku noży rzemieślniczych (tj. sterowanych komputerowo ploterów tnących przeznaczonych dla rzemieślników domowych) i sklejając warstwy ze sobą za pomocą standardowych urządzeń do laminowania termicznego, można szybko wygenerować i iterować szeroki zakres potencjalnych projektów. W związku z tym dostosowaliśmy wcześniej opisaną metodę projektowania i budowy z wykorzystaniem ułożonego w stos PET18, aby stworzyć Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH) (Rysunek 1A,B). Obrotowy układ kilku kanałów ograniczających w kształcie zbliżonego do klina optymalizuje bliskość, pozostawiając jednocześnie miejsce na ręczne przecięcie płetwy ogonowej, umożliwiając obrazowanie natychmiast po zranieniu i jednoczesne długoterminowe obrazowanie wielu zranionych zarodków danio pręgowanego w tym samym polu widzenia. Ponadto ta metoda budowy drastycznie zmniejsza początkowe koszty kapitałowe i czas potrzebny na budowę urządzenia przy jednoczesnym zachowaniu możliwości ponownego użycia.

Protokół

To badanie wykorzystywało zarodki 3 dni po zapłodnieniu (dpf), ale może być zaprojektowane tak, aby używać zarodków o wartości od 2 do 14 dpf. Eksperyment z danio pręgowanym został przeprowadzony zgodnie z przyjętymi na całym świecie standardami. Protokół opieki nad zwierzętami i jego użytkowania został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Purdue (PACUC), zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania danio pręgowanego w programie badawczym NIH (numer protokołu: 1401001018).

1. Montaż urządzenia mikroprzepływowego PET

UWAGA: Każda część tego protokołu może być wstrzymana w dowolnym momencie, z wyjątkiem kroków 1.8 i 1.9, które są wrażliwe na czas schnięcia cyjanoakrylanu.

  1. Zaprojektuj wzór dla urządzenia w wybranym oprogramowaniu (np. Adobe Illustrator, Rysunek 1A). W zależności od wieku i wielkości zarodka dostosuj szerokość kanału i rozmiar centralnej komory obrazowania, aby uzyskać najlepsze dopasowanie.
    1. Zapisz każdą warstwę jako osobny plik obrazu o identycznych wymiarach. Nazwij każdy plik tak, aby grubość arkusza, który ma być używany, i kolejność montażu były oczywiste.
  2. Zainicjuj maszynę do cięcia zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Prześlij każdy zaprojektowany wzór do oprogramowania do projektowania w celu cięcia.
    1. W przestrzeni roboczej projektu wybierz nowo przesłane projekty. Grupuj wzory przeznaczone dla arkuszy PET o tej samej grubości w tym samym kroju (Rysunek 2A). W razie potrzeby dostosuj rozmiar szablonów w oprogramowaniu do projektowania do odpowiednich wymiarów.
    2. Potwierdź liczbę i typ wzorów w cięciu, a następnie wybierz cięty materiał.
      UWAGA: Arkusze PET mogą nie być materiałem wybranym w oprogramowaniu do projektowania, w tym pod nazwami takimi jak "plastikowa torebka do laminowania". Zamiast tego można wybrać dowolny materiał o podobnej grubości i fakturze (np. przezroczyste arkusze lub nieprzylepny winyl).
    3. Przymocuj arkusze PET do maty do cięcia, mocno dociskając, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załaduj matę do maszyny do cięcia. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby poinstruować maszynę do cięcia o rozpoczęcie cięcia.
    4. Usuń gotowe kawałki z maty do cięcia. W razie potrzeby dostosuj wzory cięcia za pomocą noża rzemieślniczego lub ostrza skalpela.
      UWAGA: Pliki graficzne użyte do stworzenia projektu RZODKIEWKA (Rysunek 1A) są dostępne do pobrania w formatach wektorowych i PNG (Plik uzupełniający 1). Jeśli maszyna do cięcia podnosi, rozrywa lub nie jest w stanie przeciąć czysto arkusza PET, rozważ wymianę maty do cięcia.
  4. Wyrównaj warstwy na szkiełku nakrywkowym, samodzielnie lub z wcześniej wyciętymi znacznikami rejestracyjnymi. Jeśli przed laminowaniem można połączyć ze sobą wiele warstw, wyrównaj je jednocześnie.
  5. Zabezpiecz warstwy taśmą biurową, aby uniknąć przesuwania się podczas laminowania (Rysunek 2B). W zależności od wielkości urządzenia i pojemności laminatora, zamontuj małe konstrukcje na większym podłożu z większą ilością taśmy, aby uniknąć zakleszczenia lub zatkania zasilania laminatora (Rysunek 2C).
    UWAGA: Podłoże używane do laminowania NIE jest takie samo jak mata do cięcia i służy przede wszystkim do zapewnienia przyczepności laminatora. Jako podłoże sprawdzi się każdy materiał żaroodporny o znikomej grubości (w tym między innymi karton, złożony papier biurowy lub większy arkusz PET).
  6. Włącz laminator i laminat zgodnie z instrukcjami producenta. Usuń taśmę biurową przed wyrównaniem następnej warstwy ( Rysunek 2D).
  7. Powtarzaj kroki od 1.4 do 1.6, aż wszystkie warstwy zostaną przyklejone.
  8. Przymocuj urządzenie do naczynia 35 mm wywierconego z otworem 3/4" za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Rysunek 2E,F). Dostosuj kształt i rodzaj naczynia zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi (np. dowolny pojemnik wystarczająco duży, aby pomieścić urządzenie - jedna studzienka na 24-dołkowej płytce lub większa szalka Petriego). Użyj wystarczającej ilości kleju, aby całkowicie uszczelnić urządzenie do naczynia bez jego zalania.
    UWAGA: Mocowanie urządzenia do naczynia do przechowywania nie jest wymagane do działania urządzenia. UWAGA: Cyjanoakrylan wiąże skórę i oczy w ciągu kilku sekund i podrażnia układ oddechowy, oczy i skórę. Nosić ochronę rąk i oczu oraz pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
  9. Uszczelnij laminat PET, dokładnie pokrywając zewnętrzne krawędzie urządzenia klejem cyjanoakrylowym (Rysunek 2F). Użyj wystarczającej ilości kleju, aby całkowicie pokryć zewnętrzne krawędzie. Pozostaw klej do utwardzenia przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
    UWAGA: Zapewnij odpowiednią ilość miejsca na odprowadzanie oparów cyjanoakrylowych. Nagromadzenie oparów może spowodować osadzanie się cyjanoakrylanu na urządzeniu, zasłaniając optycznie przezroczysty materiał.

2. Umiejscowienie zarodków w rzodkiewce i przygotowanie do obrazowania

  1. Hoduj zarodki danio pręgowanego w standardowym podłożu do hodowli zarodków E319. W razie potrzeby należy dokonać dekorionacji zarodków co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić ich spłaszczenie. W tym eksperymencie użyto zarodków w temperaturze 3 dpf, ale zarodki mogą mieć do 14 dpf (Rysunek 1E).
  2. Barwić lub traktować zarodki zgodnie z potrzebami doświadczalnymi.
    UWAGA: W tych eksperymentach błony komórkowe zewnętrznej warstwy nabłonka barwiono tam, gdzie było to istotne, inkubując z 100 nM MemGlow 560.
  3. Znieczulenie zarodków za pomocą 164 mg/L MS-22220.
    UWAGA: Dokładne stężenie i zastosowany środek znieczulający można dostosować zgodnie z preferencjami eksperymentatora. Stężenie środka znieczulającego można zmniejszyć, aby umożliwić pomyślny rozwój podczas długotrwałych obrazów (patrz krok 4.1).
  4. Napełnić naczynie do przechowywania zawierające zamontowane urządzenie 5 ml E3 zawierającego 164 mg/L MS-222.
  5. Za pomocą pipety transferowej umieść jeden znieczulony zarodek w każdej komorze podtrzymującej urządzenie. Upewnij się, że zarodki pozostają zanurzone w płynie przez cały czas obrazowania.
    UWAGA: Konstrukcja RZODKIEWKA może unieruchomić 1-4 zarodki.
  6. Za pomocą pętli do włosów ustaw zarodki w taki sposób, aby ogon zarodka wystawał do centralnej komory obrazowania, a żółtko było bezpiecznie unieruchomione w kanale w kształcie klina (Rysunek 1C).
    UWAGA: Orientacja zarodków może być wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym w celu ułatwienia manipulacji.
  7. W razie potrzeby zabezpiecz głowę zarodka, dodając 1,5% niskotopliwej agarozy do komory trzymania za pomocą mikropipety.
  8. Przenieś urządzenie z zarodkami do wybranego systemu obrazowania, aby rozpocząć obrazowanie.

3. Obrazowanie stanów przejściowych wapnia po zranieniu

UWAGA: Ta sekcja i sekcja 4 są opcjonalne i dostarczane jako potencjalne przykładowe eksperymenty.

  1. Wybierz odpowiedni system i obiektyw do obrazowania.
    UWAGA: W tym przypadku konfokalny odwrócony skaning laserowy został wyposażony w obiektyw o powiększeniu 20x.
  2. Dostosuj ostrość próbki i parametry obrazowania (np. moc lasera: 5, wzmocnienie: 90, rozmiar otworka: 2 AU, czas ekspozycji [prędkość skanowania: 1 klatka/s]), aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu i szybkość akwizycji.
    UWAGA: Zaleca się, aby próbki były wstępnie zogniskowane, a parametry dla każdego kanału w wybranym systemie obrazowania zostały dostosowane przed zranieniem, aby zmniejszyć opóźnienie między powstawaniem rany a akwizycją obrazu.
  3. Rana Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821,22 zarodek.
    1. Aby zranić zarodek poprzez ręczną transcięcję, należy przyłożyć ostrze skalpela do tkanki płetwy ogonowej na końcu struny grzbietowej pod mikroskopem stereoskopowym (Wideo 1), a następnie przywrócić urządzenie do stanu.
      UWAGA: Nadmierny nacisk ostrzem skalpela może spowodować pęknięcie szkła znajdującego się pod spodem. Jeśli szkło pęknie, wyrzuć urządzenie i uruchom ponownie od kroku 1.2.
    2. Aby zranić zarodek za pomocą stymulacji laserowej, zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w pobliżu krawędzi fałdu płetwy ogonowej i stymuluj zgodnie z dostępną mocą lasera.
      UWAGA: W tym przypadku moc lasera 2,4 W przez 30 s przy długości fali 800 nm była wystarczająca do wywołania rany o pełnej grubości.
  4. Obraz w temperaturze pokojowej za pomocą kanałów GFP (wzbudzenie 488 nm, emisja 510 nm) i RFP (wzbudzenie 561 nm, emisja 610 nm) z interwałem ramki 1 min, co daje łącznie 1 h.
  5. (Opcjonalnie): W razie potrzeby uwolnij zarodki do pobrania po obrazowaniu poprzez delikatne ssanie w pobliżu głowy za pomocą pipety transferowej lub obracanie naczynia.

4. Obrazowanie rekrutacji neutrofili po zranieniu

  1. Co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem należy przenieść zarodki do E3 zawierającego połowę standardowego stężenia środka znieczulającego, w tym przypadku 82 mg/L MS-222.
  2. Wybierz odpowiedni obiektyw do obrazowania (w tym przypadku odwrócony skaning laserowy konfokalny wyposażony w obiektyw 10x).
  3. Dostosuj ostrość próbki i parametry obrazowania (np. moc lasera: 5, wzmocnienie: 90, rozmiar otworu: 2 AU, czas naświetlania [prędkość skanowania: 0,5 klatki/s]), aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu i szybkość akwizycji.
    UWAGA: Zaleca się, aby próbki były wstępnie zogniskowane, a parametry dla każdego kanału w wybranym systemie obrazowania zostały dostosowane przed zranieniem, aby zmniejszyć opóźnienie między powstawaniem rany a akwizycją obrazu.
  4. Nawiń cztery zarodki Tol2(mpx:Dendra2)23 poprzez ręczne przecięcie, wywierając nacisk ostrzem skalpela na tkankę płetwy ogonowej pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie przywróć urządzenie do etapu.
  5. Uchwyć obraz na kanale GFP (wzbudzenie 488 nm, emisja 510 nm) w temperaturze pokojowej w 5-minutowym odstępie między klatkami przez 24 godziny.
  6. W razie potrzeby uwolnij zarodki do pobrania po obrazowaniu poprzez delikatne odsysanie w pobliżu głowy za pomocą pipety transferowej lub obracając naczynie.

Wyniki

W celu porównania jakości obrazów uzyskanych za pomocą konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego z zastosowaniem i bez zastosowania urządzenia RADISH, zarodki wykazujące ekspresję intensiometrycznego biosensora wapnia GCaMP6f22,24 w zewnętrznej warstwie nabłonkowej zostały zabarwione za pomocą MemGlow 560 i obrazowane przy użyciu odwróconego konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego, obejmując całą grubość fałdu płetwy ogonowej w odstępach czasu 1 min na klatkę (Video 2). Bez urządzenia (Rycina 3A) próbki ulegały znacznemu dryftowi i wykazywały artefakty w postaci pasm, co wynikało z ograniczenia stosu Z do 25 przekrojów w celu zachowania określonej rozdzielczości czasowej w porównaniu do obrazowania z użyciem urządzenia (Rycina 3B). Urządzenie RADISH zostało ponadto wykorzystane do badania przejściowych zmian stężenia wapnia bezpośrednio po zranieniu w zarodkach wykazujących ekspresję Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821, co pozwoliło na uwidocznienie endogennej E-kadheryny w kolorze czerwonym oraz cytoplazmatycznego wapnia w nabłonku apikalnym w kolorze zielonym. Zarodki były ranić równolegle do boków komory centralnej za pomocą ostrza skalpela (Rycina 4A i Video 3) lub poprzez bezpośrednią ablację laserową za pomocą lasera IR (Rycina 4B), a następnie obrazowane przez pełną grubość fałdu płetwy ogonowej.

Aby zademonstrować skuteczność metody RADISH w obrazowaniu długoterminowym, zbadaliśmy rekrutację komórek odpornościowych do brzegu rany przez 24 h po zranieniu. Cztery embriony danio pręgowanego w 3 dpf wykazujące ekspresję Tol2(mpx:Dendra2) w celu znakowania neutrofili na zielono23 zostały zranione poprzez odcięcie ogona i obrazowane przez 24 kolejne godziny (Rysunek 5). Artefakty obrazowania typowo związane z embrionami od późnego 3 dpf do 4 dpf, takie jak przechylanie się i unoszenie, były wyraźnie nieobecne (Wideo 4), a odrastanie tkanki przebiegało bez zakłóceń w trakcie eksperymentu. Rekrutacja neutrofili do brzegu rany trwa przez cały czas obrazowania (Rysunek 5B), przy czym większość migrujących komórek opuszcza to miejsce do 24 h po zranieniu (Rysunek 5C), co jest zgodne z oczekiwanym ustąpieniem stanu zapalnego25,26.

Schemat montażu urządzenia mikrofluidycznego, układ eksperymentalny, obrazowanie rozwoju zebrafish w 3, 5 i 14 dpf.
Rycina 1: Projekt i zastosowanie mikrofluidycznego urządzenia z laminatu PET (RADISH). (A) Schemat ilustrujący rozmieszczenie i grubość poszczególnych warstw PET, montaż oraz instalację i użycie urządzenia. (B) Gotowy produkt, zamontowany w wycięciu ¾" w szalce 35 mm. (C) zarodki w 3 dpf, (D) zarodki w 5 dpf, (E) zarodki w 14 dpf umieszczone wewnątrz urządzenia. Paski skali = 1,000 µm (C,D,E). Skróty: PET = politeereftalan etylenu; RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing; dpf = dni po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu laminowania podczas montażu urządzenia z PET; pokazuje warstwy, szkiełko nakrywkowe i ostatecznie zabezpieczone urządzenie.
Rycina 2: Krok po kroku fotograficzna ilustracja montażu urządzenia z PET. (A) Poszczególne warstwy PET przed laminowaniem. (B) Warstwa PET przymocowana do 25 mm szkiełka nakrywkowego za pomocą taśmy biurowej. (C) Urządzenie w trakcie przygotowania przymocowane do plastikowej podkładki w celu laminowania. (D) Gotowe zalaminowane urządzenie z PET. (E) Zmodyfikowana szalka 35 mm przed montażem urządzenia. (F) Gotowe urządzenie. Skrót: PET = politereftalan etylenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek korzenia rośliny; badanie porównawcze wykazujące strukturę i wzrost komórek.
Rysunek 3: Poprawiona jakość obrazów z laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego zarodków 3 dpf w konstrukcji RADISH. (A) Reprezentatywny obraz zarodka Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) 3 dpf barwionego MemGlow 560 bez użycia RADISH. (B) Reprezentatywny obraz zarodka Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) barwionego MemGlow 560 zamontowanego w RADISH. Pasek skali = 100 µm. Skróty: RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing; dpf = days post fertilization. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna: analiza time-lapse dynamiki komórkowej, odstępy od 00:00 do 00:04 godz:min.
Rycina 4: Kompatybilność konstrukcji RADISH z wieloma technikami powodowania obrażeń. (A) Zarodek Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 w 3 dpf z obrażeniem powstałym w wyniku ręcznej transekcji płetwy ogonowej. (B) Zarodek z obrażeniem powstałym w wyniku ablacji laserowej. (C,D) Te same zarodki 4 min później, pokazujące progresję przejściowych wzrostów stężenia wapnia po obrażeniu. Paski skali = 100 µm. Skróty: RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing; dpf = dni po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia time-lapse pokazująca migrację komórek w ciągu 24 godzin na obrazach fluorescencyjnych, skala 100 µm.
Rysunek 5: Długoterminowe unieruchomienie embrionów w celu obrazowania migracji fagocytów. (A) embriony Tol2(mpx:Dendra2) bezpośrednio po zranieniu oraz te same embriony (B) 25 min, (C) 12 h i (D) 24 h później. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Pliki wektorowe i pliki PNG dla projektu urządzenia RADISH, przedstawionego na Rysunku 1A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo 1: Nagranie w polu jasnym przedstawiające ręczną transekcję płetwy ogonowej z wykorzystaniem konstrukcji urządzenia RADISH.Skrót: RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 2: Porównanie niezamontowanych i zamontowanych zarodków Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) w 3 dpf z Rysunku 3, zarejestrowanych z częstotliwością 1 klatka/min. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 3: Przejściowe zmiany stężenia wapnia w embrionach Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 po zranieniu poprzez przecięcie skalpelem lub ablację laserową z Rysunku 4, zarejestrowane z częstotliwością 1 klatka/min. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Film 4: Długoterminowe obrazowanie rekrutacji leukocytów i regeneracji płetwy ogonowej w embrionach Tol2(mpx:Dendra2). Skróty: RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing; hpw = godziny po zranieniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Podstawowym założeniem metody laminowania PET jest redukcja kosztów i minimalizacja technicznych barier wejścia w porównaniu z tradycyjnymi sposobami tworzenia urządzeń mikroprzepływowych, takimi jak miękka litografia czy formowanie PDMS. W związku z tym jedynymi krytycznymi krokami w tym protokole są dokładne wyrównanie warstw PET podczas laminowania i uszczelnienie krawędzi urządzenia po budowie. Wszystkie inne części metody mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb doświadczalnych (np. jeśli wymagane jest unieruchomienie młodszych lub starszych zarodków, grubość warstw PET może być dostosowana w celu odpowiedniego zwężenia lub poszerzenia kanału). Projekty mogą być tworzone w dowolnym kształcie i laminowane na dowolnym materiale bazowym, o ile materiał jest odporny na ciepło i wystarczająco cienki, aby można go było przesłać przez laminator18,27. Ponieważ arkusze PET są cięte za pomocą dostępnych na rynku noży rzemieślniczych, które odczytują dwuwymiarowe, a nie trójwymiarowe pliki obrazów, projekt i iteracja dowolnego urządzenia wymagają jedynie możliwości manipulowania czarno-białymi kształtami w programie do edycji obrazu, co znacznie zmniejsza trudność. Ta elastyczność w doborze oprogramowania i komercyjna dostępność używanych materiałów stanowią dramatyczny wzrost dostępności urządzeń mikrofluidycznych w ogóle, umożliwiając ich użycie w dowolnym laboratorium lub klasie za koszt początkowy mniejszy niż 500 USD w momencie pisania tego artykułu, w porównaniu z ponad 2000 USD początkowych kosztów sprzętu do produkcji form PDMS17.

Co więcej, czas potrzebny do stworzenia pojedynczego użytecznego urządzenia przy użyciu tej metody jest znacznie skrócony w porównaniu z typową miękką litografią. Zakładając znajomość wymaganego oprogramowania, jedno unikalne urządzenie mikroprzepływowe z laminatu PET może zostać opracowane, wyprodukowane i natychmiast użyte w ciągu ~ 3 godzin, wliczając czas utwardzania cyjanoakrylanu. Iteracja trwa jeszcze krócej, w zależności od skali potrzebnych zmian w oryginalnych plikach projektowych, a wiele wariantów urządzeń można tworzyć równolegle przy minimalnym dodatkowym czasie i bez dodatkowego sprzętu. Chociaż urządzenia stworzone przy użyciu tej metody są mniej trwałe niż te wykonane za pomocą PDMS z różnych powodów (w tym uszkodzenia kleju i naprężeń wewnętrznych w przypadku kształtów o wielu warstwach i długich proporcjach), ich niedrogi charakter i skalowalna produkcja oznaczają, że można je znacznie łatwiej wymienić. Ponieważ komercyjne noże rzemieślnicze są sprzedawane z możliwością wielokrotnego powtarzania tego samego precyzyjnego cięcia, a PET nie ma daty ważności, poszczególne warstwy gotowego projektu można wstępnie przygotować luzem do montażu i użycia w dowolnym momencie w przyszłości, co jeszcze bardziej zmniejsza całkowitą wymaganą inwestycję czasową.

Jednak szybkość i zmienność odbywają się kosztem precyzji. Głównym ograniczeniem laminacji PET w porównaniu z tradycyjnym formowaniem PDMS jest rozdzielczość przestrzenna. Komercyjne frezy rzemieślnicze często zmagają się z ostrymi kątami na kształtach mniejszych niż około 500 μm, a arkusze do laminowania PET nie są dostępne w grubościach poniżej 33 μm (nie wliczając grubości samego kleju, która nie jest uwzględniona w pomiarze na opakowaniu), co znacznie ogranicza skalę, w jakiej można zastosować tę technikę. Maksymalna liczba warstw jest również ograniczona rozmiarem laminatora, który może się różnić w zależności od producenta.

Ostateczna wersja protokołu, w tym różnice w technice rejestracji i dostosowania, dostawcach materiałów i oprogramowaniu, będzie w dużej mierze zależeć od preferencji użytkownika. Jednak dostępność metody i ogólna elastyczność zmniejszają koszty adaptacji. Indywidualni użytkownicy są zachęcani do iteracji w miarę potrzeb, aby dostosować podejście do swoich unikalnych potrzeb.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez fundusze badawcze z National Institutes of Health (R35GM119787 do QD). Praca ta opiera się na wysiłkach wspieranych przez EMBRIO Institute, kontrakt NSF #2120200, Instytut Integracji Biologii Narodowej Fundacji Nauki (NSF). Obrazowanie konfokalne przeprowadzono w Purdue Imaging Facility. Dziękujemy dr Guangjun Zhang (Purdue University) za udostępnienie linii Tg(UAS:GCaMP6f). Dziękujemy dr Davidowi Tobinowi (Duke University) za dostarczenie linii (cdh1-tdtomato)xt18.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okrągła szklana osłona o średnicy 25 mm o grubości #1Chemglass Life SciencesCLS-1760-025Materiał montażowy podstawy. Grubość została dobrana na podstawie specyfikacji soczewki mikroskopu.
Adobe Illustrator v28.5AdobeN/AEdytor wektorowy do projektowania wzoru urządzenia.
Dwuwodny chlorek wapniaFisherC79Do wytwarzania podłoża E3.
Projektuj pliki PNG (lustro online)N/AN/Abr/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png
https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39CricutN/AZastrzeżone oprogramowanie do sterowania nożem rzemieślniczym.
Fusion Plus 7000LGBC1703098Laminator termiczny. Ten konkretny model został wybrany ze względu na funkcje poprawiające jakość użytkowania, takie jak maksymalny rozmiar stosu arkuszy.
Ostrze z węglika spiekanego Germany Carbide PremiumCricut10396595Wymienne ostrze do noża rzemieślniczego.
Szary podstawowy zestaw narzędziCricut10307854Zestaw narzędzi do odchwaszczania nacięć, czyszczenia mat i montażu arkuszy PET. Opcjonalnie. 
Chlorek magnezu sześciowodnyAcros Organiczny223211000Do wytwarzania podłoża E3.
Maker 3Cricut10669040nóż rzemieślniczy. Cricut Maker 3 został wybrany zamiast Silhouette Cameo 4 ze względu na łatwość obsługi oprogramowania, ale każdy nóż rzemieślniczy zdolny do odczytywania czarno-białych obrazów będzie działał.
MemGlow 560CytoszkieletMG02-10Czerwony barwnik z żywych komórek do błon komórkowych. Nie wymaga mycia. Użyte na rysunku 3. 
No. 22 Ostrze skalpela węglowegoKonstrukcja chirurgiczna

22-079-697		Ostrze skalpela do ręcznej regulacji cięcia. Każdy podobny nóż rzemieślniczy (np. nóż X-acto #2) również się sprawdzi.
Chlorek potasuFisherBP366Do wytwarzania podłoża E3.
Chlorek soduFisherBP358Do wytwarzania podłoża E3.
Klej do cięcia StandardGripCricut10138842Mata montażowa do noża rzemieślniczego. Mata do cięcia LightGrip również się sprawdzi, ale unikaj mat do cięcia StrongGrip i FabricGrip, ponieważ siła kleju może wypaczyć końcowe cięcie podczas pielenia i usuwania. Klej na matach w końcu zużyje się przy dalszym użytkowaniu; W razie potrzeby wymień maty.
Taśma biurowa 12 mmDeli30014Taśma biurowa. Marka delikatesów została wybrana w testach ze względu na łatwość usuwania po laminowaniu.
Super klej, płynnyklej Loctite1364076klej cyjanoakrylowy. Użyty klej musi być płynny. Preparaty żelowe nie uszczelnią wystarczająco ani nie uszczelnią krawędzi urządzenia.
Woreczki do laminowania termicznego PET, 3 milScotchTP3854Arkusze PET z klejem termicznym. Arkusze są dostarczane jako pary warstwowe i należy je rozdzielić przed użyciem. Ciąć stroną klejącą skierowaną w dół.
Woreczki do laminowania termicznego PET, 5 milScotchTP5854Arkusze PET z klejem termicznym. Arkusze są dostarczane jako pary warstwowe i należy je rozdzielić przed użyciem. Ciąć stroną klejącą skierowaną w dół.
Trikaina (MS-222)SyndelIC10310680Znieczulenie ryb.
https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png<

Bibliografia

  1. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  2. Xu, S., Hsiao, T. I., Chisholm, A. D. The wounded worm. Worm. 1 (2), 134-138 (2012).
  3. Belacortu, Y., Paricio, N. Drosophila as a model of wound healing and tissue regeneration in vertebrates. Dev Dyn. 240 (11), 2379-2404 (2011).
  4. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J Cell Biol. 199 (2), 225-234 (2012).
  5. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231 (4), 693-699 (2004).
  6. Gault, W. J., Enyedi, B., Niethammer, P. Osmotic surveillance mediates rapid wound closure through nucleotide release. J Cell Biol. 207 (6), 767-782 (2014).
  7. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  8. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  9. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  10. Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
  11. Khalili, A., Rezai, P. Microfluidic devices for embryonic and larval zebrafish studies. Brief Funct Genomics. 18 (6), 419-432 (2019).
  12. Choudhury, D., et al. Fish and Chips: a microfluidic perfusion platform for monitoring zebrafish development. Lab Chip. 12 (5), 892-900 (2012).
  13. An integrated microfluidic system for zebrafish larva organs injection. Zhang, G., et al. Proceedings IECON 2017 - 43rd Annual Conference of the IEEE Industrial Electronics Society, 2017-January, , 8563-8566 (2017).
  14. Erickstad, M., Hale, L. A., Chalasani, S. H., Groisman, A. A microfluidic system for studying the behavior of zebrafish larvae under acute hypoxia. Lab Chip. 15 (3), 857-866 (2015).
  15. Mani, K., Hsieh, Y. C., Panigrahi, B., Chen, C. Y. A noninvasive light driven technique integrated microfluidics for zebrafish larvae transportation. Biomicrofluidics. 12 (2), 021101(2018).
  16. Lee, Y., Seo, H. W., Lee, K. J., Jang, J. W., Kim, S. A microfluidic system for stable and continuous EEG monitoring from multiple larval zebrafish. Sensors (Basel). 20 (20), 5903(2020).
  17. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Dev Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  18. Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111(2019).
  19. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  20. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  21. Cronan, M. R., Tobin, D. M. Endogenous tagging at the cdh1 locus for live visualization of E-cadherin dynamics. Zebrafish. 16 (3), 324(2019).
  22. Thiele, T. R., Donovan, J. C., Baier, H. Descending control of swim posture by a midbrain nucleus in zebrafish. Neuron. 83 (3), 679-691 (2014).
  23. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  24. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  25. Li, L., Yan, B., Shi, Y. -Q., Zhang, W. -Q., Wen, Z. -L. Live imaging reveals differing roles of macrophages and neutrophils during zebrafish tail fin regeneration. J Biol Chem. 287 (30), 25353-25360 (2012).
  26. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J Leukoc Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. 2019, (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowychobrazowanie multipleksowegojenie ranmigracja neutrofilisygnalizacja wapniowatransekcja manualnaablacja laserowapułapkowanie embrionów
Tanie projekty mikrofluidyki laminacji politereftalanu etylenu do multipleksowanego obrazowania danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.