Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Na implantację zarodka wpływają interakcje między różnymi typami komórek na styku matka-zarodek. Bezpośrednia i pośrednia komunikacja między różnymi typami komórek w obrębie decidua ma kluczowe znaczenie dla regulacji receptywności endometrium; Jednak mechanizmy molekularne pośredniczące w tej interakcji są nadal niejasne. W związku z tym potrzebny jest model do badania procesu implantacji, aby stworzyć kompleksowy model in vitro, który może podsumować biologię interakcji nabłonka-zrębu endometrium. Model ten składa się ze zwykłych płytek do hodowli komórkowych i dopasowanego rusztowania, które jest generowane przez drukowanie trójwymiarowe (3D) z tanich materiałów. W tym miejscu szczegółowo opisujemy zestaw protokołów budowy modelu, przygotowania komórek, wysiewu komórek, hodowli komórek, obserwacji i oceny. Ponadto dołączyliśmy reprezentatywne wyniki z komórkami wykazującymi dobre warunki wzrostu pod mikroskopem. Badanie to miało na celu opracowanie modeli in vitro, które naśladowałyby interakcję między komórkami zrębu endometrium a komórkami nabłonka, a także między komórkami trofoblastu a komórkami endometrium.
Wprowadzenie
Pomimo szeroko zakrojonych badań nad ciążą u ludzi, mechanizmy molekularne na styku matki i płodu podczas implantacji i wczesnej ciąży pozostają słabo poznane1. Ludzkie endometrium składa się głównie z dwóch typów komórek: komórek nabłonka endometrium (EEC) i komórek zrębu endometrium (ESC). Implantacja przebiega przez trzy etapy: apozycja, przyczepienie i inwazja, które prowadzą do rozwoju kompetentnego zarodka i receptywnego endometrium2. Biorąc pod uwagę ograniczenia etyczne związane z badaniami in vivo na ludziach, a także trudności w pełnej symulacji kondycji ludzkiej u zwierząt, budowa modeli hodowli ludzkiego endometrium in vitro stała się skutecznym sposobem odtworzenia procesów implantacji i wczesnej ciąży3. Modele te są cenne w badaniu zarówno ciąż normalnych, jak i patologicznych i stanowią podstawową platformę do wstępnego testowania i walidacji interwencji terapeutycznych w medycynie translacyjnej.
Komory handlowe są szeroko wykorzystywane w badaniach biologicznych komórek. Komory te dostarczają cennych informacji na temat migracji komórek i wzajemnych oddziaływań między różnymi typami komórek. Jednak komory handlowe są zazwyczaj jednorazowego użytku i mogą być kosztowne4.
Opracowano ogromną liczbę modeli in vitro ludzkich kultur składających się z endometrium i blastocysty, czyli surogatów blastocysty, aby lepiej zrozumieć szczegółowy proces implantacji. Modele te są jednak nadal w początkowej fazie zastosowania, ponieważ struktura 3D jest bardzo skomplikowaną konfiguracją eksperymentalną, a niektóre specyficzne nośniki różnicujące są drogie5,6,7.
Użycie niedrogiego sprzętu do druku 3D i stosunkowo krótki okres produkcji umożliwia dopasowanie struktur do różnych eksperymentalnych technik druku purposes. 3D, co pomaga obniżyć koszty czasu i umożliwia tworzenie złożonych, niestandardowych struktur. Technologia ta znacznie przyspiesza projektowanie i iterację prototypów, co czyni ją cennym narzędziem dla badaczy z różnych dziedzin, umożliwiając im bardziej efektywne wykonywanie pracy8,9,10.
Tutaj prezentujemy wykonalny i ekonomiczny eksperymentalny protokół budowy struktury 3D i jej wykorzystania jako systemu hodowli komórek, który może symulować interakcję między komórkami zrębu endometrium i nabłonka w celu zbadania receptywności endometrium podczas implantacji zarodka. Zapewnia to konfigurowalną i tanią alternatywę dla komercyjnych materiałów jednorazowego użytku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie odczynniki używane w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, wszystkie media zostały wstępnie wyważone do temperatury 37 °C przed użyciem.
1. 3D drukowanie rusztowania i budowy modelu
UWAGA: Kroki tutaj zostały wykonane zgodnie z instrukcją obsługi komercyjnej maszyny do druku 3D na metalu. Kroki są pokrótce opisane poniżej (Plik uzupełniający 1).
- Poziomowanie stołu roboczego
- Stuknij ikonę Menu na pulpicie nawigacyjnym i przejdź do Narzędzia. Wybierz Poziom łóżka, aby rozpocząć procedurę poziomowania.
- Wyjmij arkusz wydruku ze stołu roboczego i wybierz opcję Gotowe. Stół roboczy podniesie się do maksymalnej wysokości, aby przygotować się do poziomowania. Gdy pasek postępu osiągnie 100%, naciśnij Start.
- Jeśli drukarka Metal X nie była wcześniej poziomowana, wybierz opcję Resetuj. Jeśli tak, wybierz opcję Pomiń i przejdź bezpośrednio do kroku 1.1.5 (skanowanie 16-punktowe).
- Użyj klucza imbusowego 2.5 mm, aby przekręcić wszystkie poziomujące z trzema łożami zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż zostaną dokręcone. Następnie poluzuj je, obracając dwa pełne obroty w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby ustawić je na wysokości środkowej. Naciśnij Gotowe, aby kontynuować.
- Drukarka zeskanuje stół w 16 wyznaczonych punktach. Podczas tego procesu powstrzymaj się od dotykania łóżka lub ramy. Gdy postęp osiągnie 100%, naciśnij Dalej.
- Aplikacja arkusza wydruku
- Usuń wszelkie resztki metalu lub resztki podpory. Przełącz suwak Próżnia na Wł.
- Poczekaj, aż łóżko się obniży i nagrzeje, a następnie naciśnij Dalej. Umieść arkusz wydruku nad kratką próżniową i naciśnij przycisk Dalej.
- Umieść prasę arkuszową nad arkuszem druku, wyrównując ją z szynami Z z tyłu komory.
- Poczekaj, aż próżnia się włączy i stworzy stabilne uszczelnienie. Po włączeniu odkurzacza naciśnij Gotowe.
- Ładowanie filamentu metalowego
- Ręcznie ustaw głowicę drukującą na środku obszaru drukowania. Zdejmij pokrywę głowicy drukującej, przesuwając ją do góry i zdejmując mocujące.
- Stuknij ikonę Menu na tablicy opcji. Z opcji wybierz Materiały.
- Wybierz opcję Załaduj metal, aby rozpocząć procedurę ładowania. Wybierz opcję Szybkie ładowanie.
- Wybierz konkretny rodzaj materiału metalowego, który ma być załadowany (np. Aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
- Umieść szpulę na uchwycie i naciśnij Dalej. Zamknij drzwiczki i pozwól szpulom się rozgrzać, a następnie naciśnij Dalej.
- Włóż materiał do przedniego wlotu głowicy drukującej (oznaczonego M), aż ekstruder zacznie go przeciągać.
- Drukowanie części metalowych
- W panelu Ustawienia drukowania kliknij opcję Eksportuj pakietd. Zapisz plik na dysku USB sformatowanym w systemie FAT32 i włóż go do drukarki.
- Wybierz ikonę Menu na tablicy. Przejdź do opcji Pamięć i wybierz opcję Drukuj z pamięci. Wybierz plik części, aby rozpocząć drukowanie.
- Demontaż części metalowych
- Ostrożnie zsuń arkusz wydruku i drukowane części z stołu roboczego. Delikatnie odłącz części od arkusza druku. Elastyczny arkusz powinien łatwo się odkleić.
2. Przygotowanie do kohodowli komórek w modelu 3D
UWAGA: Zaleca się, aby materiały odporne na wysokie temperatury były używane jako materiały eksploatacyjne do drukowania 3D podpór rusztowań nakrywek komórkowych, aby ułatwić sterylizację w autoklawie przed każdym użyciem w eksperymentach z hodowlą komórkową. W badaniu wykorzystano unieśmiertelnione ludzkie komórki zrębu endometrium (HESC) i ludzkie komórki nabłonka endometrium (Ishikawa). Charakterystyka tych linii komórkowych została już wcześniej opisana5,6.
- Hodowla komórkowa i pasażowanie
- Przygotować 50 ml pożywki uzupełniającej dla hESC, dodając pożywkę DMEM/F12 + 2 mM L-glutaminy + 10% surowicy bydlęcej (FBS) pozbawionej węgla drzewnego + 1% roztworu penicyliny/streptomycyny.
- Przygotuj 50 ml pożywki uzupełniającej dla Ishikawy, dodając Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% roztwór penicyliny/streptomycyny.
- Rozmrażanie komórek
UWAGA: Zakupiona linia komórkowa została wysłana na suchym lodzie w stanie zamrożonym. Powinien być przechowywany w fazie gazowej ciekłego azotu lub w temperaturze poniżej -130 °C.- Przygotować cały niezbędny wysterylizowany sprzęt i enzym dysocjacyjny, a następnie ogrzać pożywkę uzupełniającą do temperatury 37 °C.
- Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie kołysząc. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki zawierającej 5 ml podstawowej pożywki hodowlanej i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
- Ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml przygotowanej kompletnej pożywki hodowlanej i rozlać go do dwóch kolb hodowlanych T25. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przygotowanie komórek za pomocą szkiełka nakrywkowego
- Użyj szkiełka nakrywkowego o średnicy 18 mm jako powierzchni hodowli komórkowej; upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest czyste i sterylne.
- Szkiełko nakrywkowe na dnie 12-dołkowej płytki pokryć 200 μl macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) o stężeniu 200-300 μg/ml. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Wyjąć moduł ECM z płytki. Sprawdź komórki pod kątem odpowiedniej konfluencji i upewnij się, że gęstość obu linii komórkowych wynosi około 70%-80%
- Usuń zużytą pożywkę i przemyj komórki 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 2x.
- Dodać 2 ml enzymu dysocjacyjnego i hodować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 minuty w celu ich odłączenia.
- Zneutralizować za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej i utworzyć zawiesinę jednokomórkową, pipetując w górę i w dół.
- Pobrać 100 μl zawiesiny komórek i wymieszać z błękitem trypanowym (współczynnik rozcieńczenia = 2).
- Nasunąć szkiełko nakrywkowe na komorę hemocytometru. Wypełnić obie komory boczne zawiesiną komórek zawierającą błękit trypanowy.
- Policz liczbę komórek w kwadratach po obu stronach pod 20-krotnym mikroskopem i oblicz gęstość komórek.
- Przenieść komórki na przygotowaną płytkę ze świeżą pożywką i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Wysiewać hESC do studzienki w dawce 1 x 105 komórek/ml przez 24 godziny.
- W przypadku linii komórkowej Ishikawy, następnego dnia zasiej komórkę do studzienki bez szkiełka nakrywkowego.
3. Montaż modelu kokultury
- Rusztowania dokładnie namoczyć alkoholem etylowym i wodą podwójnie destylowaną (ddw) przez 2 dni. Wysterylizuj rusztowania w autoklawie w temperaturze 121 °C i wysusz je.
- Dodaj około 2 ml pożywki uzupełniającej dla linii komórkowej Ishikawy do studni hodowlanej Ishikawy, upewniając się, że poziom płynu pokrywa szkiełko nakrywkowe.
- Przenieść pokrywę szkiełka nakrywkowego z hESC na rusztowanie i trzymać stronę z kuwetą skierowaną w dół. Podłącz rusztowanie do dobrze hodowanego Ishikawy. W przypadku drugiego zestawu odwróć ten układ, przenosząc pokrywę szkiełka nakrywkowego z Ishikawą na rusztowanie i podłączając rusztowanie do dobrze hodowanego hESC. Użyj komórek bez ustawienia rusztowania do analizy wzrostu komórek rosnących niezależnie.
- Inkubować system kohodowli w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 . Okres kohodowli może się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego, ale zwykle wynosi od 24 do 72 godzin.
4. Akwizycja obrazu
- Ostrożnie usunąć pożywkę hodowlaną i delikatnie przepłukać komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
- Usuń szkiełka nakrywkowe z przyczepionymi komórkami z naczyń hodowlanych za pomocą cienkich kleszczy lub pęsety. Opcjonalnie umieść szkiełka nakrywkowe w nowym naczyniu z PBS, aby zapobiec wysychaniu podczas przenoszenia.
- Weź czyste szkiełko mikroskopowe i umieść kroplę PBS. Delikatnie przenieś szkiełko nakrywkowe zawierające komórki na kroplę podłoża montażowego, upewniając się, że komórki są skierowane w dół na szkiełko.
- Umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego. Wybierz odpowiednią soczewkę obiektywu (np. 10x, 20x) i wyreguluj ostrość za pomocą pokręteł zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości.
- Ustaw parametry mikroskopu, takie jak intensywność oświetlenia i ustawienia kamery. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, uchwyć obrazy komórek w żądanych powiększeniach i polach widzenia. Dostosuj czas ekspozycji i inne ustawienia obrazowania, aby zoptymalizować jakość obrazu.
5. Przetwarzanie obrazu
- Kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć obraz, kliknij kolejno kolejno kolejno opcje Przetwarzaj filtry > ulepszanie >> wybierz opcję Korekcja lokalna, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.
- Kliknij przycisk Edytuj > Konwertuj na > skalę szarości 8. Kliknij przycisk Ulepsz, a następnie wybierz opcję Zastosuj kontrast.
- Kliknij opcję Policz i zmierz obiekty. Kliknij opcję Ręcznie, zaznacz zakres i dostosuj histogram, aby upewnić się, że wszystkie komórki są zakryte.
- Kliknij przycisk Zastosuj maskę, zamknij bieżące okno, kliknij opcję Automatycznie jasne obiekty > zmierzyć, wybierz opcję Pomiar i wybierz opcję Aera, Dendric, Density (Gęstość) i Size (Rozmiar).
- Kliknij w Automatycznie jasne obiekty, a następnie kliknij w Liczba. Kliknij przycisk Eksportuj dane, aby wyeksportować dane pomiarowe do arkusza kalkulacyjnego.
6. Zbieranie komórek
- Usuń szkiełka nakrywkowe ze szkiełka mikroskopowego i przenieś je do czystego i suchego dołka.
- Zbierz komórkę Ishikawy za pomocą odczynnika do izolacji RNA do transkryptomii lub odczynnika do lizy Ripa do badań proteomicznych.
UWAGA: W przypadku hESC metoda hodowli szkiełka nakrywkowego była bardziej skuteczna w przypadku przechwytywania obrazu po barwieniu immunologicznym. Alternatywnie, hESC można pobrać za pomocą odczynnika do izolacji RNA lub odczynnika do lizy Ripa. Linie komórkowe wyhodowane na szkiełku nakrywkowym lub na powierzchni płytki mogą być wymieniane; Zalecamy jednak, aby komórki przygotowane do analizy obrazowej zostały wysiane na szkiełku nakrywkowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia wykonany własnoręcznie stelaż do szkiełek z komórkami wykorzystywany w tym procesie, który składa się z górnego pierścienia wsporczego dostosowanego do mocowania w standardowych 12-dołkowych płytkach do hodowli komórek, uzupełnionego o podstawowy uchwyt do szkiełek z komórkami z czterema prętowatymi strukturami w kształcie litery L.
Zgodnie z Rysunkiem 2, gęstość obu typów komórek w warunkach kokultury (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano uproszczony i opłacalny protokół pośredniego współhodowli komórek zrębu i nabłonka endometrium. Metoda ta wykorzystuje domowe rusztowanie do szkiełek komórkowych, które składa się z górnego pierścienia nośnego dostosowanego do mocowania do standardowych 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, uzupełnionego uchwytem na szkiełko do komórek podstawnych z czterema strukturami przypominającymi pręty w kształcie litery L. Taka konfiguracja ułatwia separację komórek zrębu endometrium i nabłonka, umożliwiając jednocz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Chcemy podziękować wszystkim osobom zaangażowanym w to badanie. Doceniamy również pomoc w obrazowaniu ze strony Light Innovation Technology Ltd z Shenzhen. Badanie to było wspierane przez Natural Science Funding of China (grant nr 82201851), Shenzhen Science and Technology Program (grant nr 1). JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (grant nr SZXK028) oraz Szpital dla Kobiet i Dzieci w Shenzhen Baoan (grant nr BAFY 2023003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x Hanks ′ Zrównoważony roztwór soli | Solarbio | H1046 | 1/10 |
| 12-dołkowe przezroczyste płytki z powłoką TC | Corning | 3513-25 | |
| cm² Kolba do hodowli komórkowych | Corning | 430639-Aluminium | |
| Markforged | 6061-T6-DMEM | ||
| /F12 | Sigma-aldrich | D2906-Dulbecco | |
| ' s Zmodyfikowany Orzeł Średni | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | Gibco | 10099141C | 1/10 |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 10099141C | |
| ITS Premix | Biocoat | 354350 | 1/100 |
| Matrigel Matrix | Corning | 354248 | ECM |
| Metal X | Markforged | M F-PR-5000-Penicylina-Streptomycyna | |
| Gibco | 15140122 | 1/100 | |
| Okrągłe szkiełko nakrywkowe | Biosharp | BS-18-RC-TrypLE | |
| Select (10X) | Enzym dysocjacji | A1217701 Gibco |
Bibliografia
- Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation. Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).
- Dey, S. K., et al. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120(2022).
- Goss, S., et al. Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders. PLoS One. 17 (6), e0269345(2021).
- Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4. Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).
- Damdimopoulou, P., et al. Human embryonic stem cells. Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).
- Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years. Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).
- Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. 3d printing in cell culture systems and medical applications. Appl Phys Rev. 5 (4), 041109(2018).
- Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3d printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
- Li, S., et al. Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3131(2024).
- Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1. Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).
- Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support. Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).
- Cooke, P. S., et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle. Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).
- Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances. Cellular Signal. 97, 110375(2022).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
