Artykuł metodologiczny

Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67315

⸱

27 września 2024

 ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2School of Life Sciences, Guangzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje, jak izolować i oczyszczać pierwotny mikroglej hipokampa od dorosłych myszy, a następnie instrukcje dotyczące przeprowadzania zapisów całokomórkowych na tych ostro izolowanych komórkach.

Streszczenie

Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe w mózgu, które współdziałają z neuronami, aby utrzymać homeostazę ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Badania pokazują, że na powierzchni mikrogleju znajdują się kanały potasowe, które regulują aktywację mikrogleju, podczas gdy nieprawidłowości w tych kanałach potasowych mogą prowadzić do chorób nerwowych. Obecnie zapisy mikrogleju w postaci krosówek całokomórkowych są najczęściej wykonywane na hodowanym pierwotnym mikrogleju od płodu lub nowonarodzonych myszy ze względu na trudności w przeprowadzaniu ocen elektrofizjologicznych na ostro izolowanym mikrogleju. Badanie to wprowadza łatwy do naśladowania protokół izolowania mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy i wykonywania nagrań całokomórkowych na izolowanych komórkach. Krótko mówiąc, mózg został usunięty od myszy po dekapitacji, hipokamp został wypreparowany obustronnie, a mikroglej wyizolowano za pomocą zestawu do dysocjacji mózgu dorosłej myszy. Mikroglej został następnie oczyszczony za pomocą metody sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) i umieszczony na szkiełkach nakrywkowych. Udaną izolację mikrogleju potwierdzono barwieniem immunofluorescencyjnym przeciwciałami anty-CD11 i anty-Iba1. Szkiełko nakrywkowe umieszczono w komorze rejestracyjnej, a prądy potasowe w całych komórkach ostro izolowanego mikrogleju zarejestrowano w warunkach cęgów napięciowych.

Wprowadzenie

Mikroglej, który wywodzi się od przodków szpiku w pierwotnym woreczku żółtkowym, rezyduje w OUN i stanowi około 10% do 15% wszystkich komórek nerwowych1,2. Funkcjonalnie, oprócz monitorowania lokalnego środowiska, pełnienia funkcji obrony immunologicznej oraz odżywiania i wspierania neuronów3,4, mikroglej może również bezpośrednio kontaktować się z neuronami w celu regulacji receptorów powierzchniowych neuronów i odpowiadającego im wiązania ligandów, a także pośrednio oddziaływać z neuronami poprzez wydzielanie cytokin5. Badania in vitro i in vivo wykazały, że mikroglej wykazuje ekspresję różnych typów kanałów potasowych, które przyczyniają się do utrzymania ujemnego potencjału błonowego6 i regulują aktywację mikrogleju. Biorąc pod uwagę, że nieprawidłowe kanały potasowe mikrogleju zostały zaobserwowane w różnych chorobach mózgu7, kluczowe jest, aby naukowcy zidentyfikowali potencjalne leki, które celują w te kanały potasowe i opracowali strategie regulacji funkcji mikrogleju.

Tradycyjne metody trawienia i oczyszczania mikrogleju często wykorzystują cały mózg, co pomija niejednorodność mikrogleju w różnych obszarach mózgu8. Dysocjacja in vitro i długotrwała hodowla w pożywkach zawierających surowicę umieszczają mikroglej w stanie aktywnym9, co może nie odzwierciedlać dokładnie ich cech fizjologicznych i stanu rzeczywistego.

Dodatkowo, podczas gdy prądy potasowe prostownika na zewnątrz zostały zarejestrowane w pierwotnych hodowlach noworodków mikrogleju i liniach komórkowych10, dane z długoterminowych hodowli tkanki mózgowej płodu lub nowonarodzonej myszy mogą różnić się od tych z dojrzałego mikrogleju. Obecny protokół ma na celu dokładne wyizolowanie mikrogleju i natychmiastowe wykonanie całokomórkowych zapisów prądów potasowych mikrogleju przy użyciu tkanki mózgowej dorosłej myszy.

Właściwości biochemiczne i kanału potasowego zostały zbadane przy użyciu metody odpowiedniej do izolacji i oczyszczania mikrogleju z małych tkanek11,12,13,14,15. W związku z tym protokół ten zawiera wskazówki dla naukowców w celu wyjaśnienia biochemicznych i funkcjonalnych właściwości mikrogleju w warunkach fizjologicznych i chorobowych. Chociaż protokół ten wykorzystuje hipokamp i kanały potasowe jako przykłady, może być również stosowany do badania innych obszarów mózgu i właściwości elektrofizjologicznych kanałów/komórek.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Naukach Przyrodniczych Uniwersytetu Normalnego Południowych Chin, a odpowiednie standardy dobrostanu zwierząt zostały utrzymane (zatwierdzenie etyczne: SCNU-SLS-2023-048). Do tego badania wykorzystano samce lub samice 3-5-miesięcznych myszy C57BL/6J. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 50 ml roztworu wewnątrzkomórkowego zawierającego 160 mM KF, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA i 2 mM MgCl2. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą 1 M roztworu KOH i dostosuj ciśnienie osmotyczne do 300 mOsm za pomocą D-sacharozy13,16. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować 50 ml buforu do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) zawierającego 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS.
  3. Przygotować poli-L-lizynę (PLL) w rozcieńczeniu 1:1000 w wodzie.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe należy pokryć PLL dzień przed eksperymentem. Inkubować powlekane zrazy w temperaturze 37 °C przez noc. Drugiego dnia PLL należy poddać recyklingowi i wysuszyć powlekane szkiełka w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tkanki mózgowej

  1. Znieczulić myszy 2,5% hydratem chloralu (0,15 ml/10 g, i.p.) (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Zanik odruchu rogówkowego i odruchu bólowego poprzez szczypanie palców u nóg lub szczypanie skóry u myszy potwierdza głębokie znieczulenie. Ułóż zwierzęta na wznak na stole sekcyjnym i przygnij im kończyny.
    1. Odsłoń klatkę piersiową i wykonaj perfuzję serca17 za pomocą lodowatego sterylnego PBS, aby usunąć wewnątrznaczyniowe krążące krwinki. Przytrzymaj głowę i przetnij skórę wzdłuż linii środkowej mózgu nożyczkami, aby odsłonić czaszkę.
    2. Przetnij tylną część czaszki obustronnie i między oczodołami małymi nożyczkami. Przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego i usuń czaszkę pęsetą. Szybko wyodrębnij tkankę mózgową za pomocą pęsety17.
  2. Umieść tkankę mózgową w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych zawierających lodowaty PBS. Wytnij korę mózgową obustronnie za pomocą pęsety, wyizoluj tkankę hipokampa i pokrój ją na mniejsze kawałki. Przenieś kawałki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Obustronne rozwarstwienie kory mózgowej ujawnia półksiężyc tkanki hipokampa w obu półkulach mózgu.
  3. Ponownie zawiesić małe kawałki tkanki hipokampa w 2 ml lodowatego zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i odwirować przy 300 × g przez 3 minuty (w temperaturze pokojowej), a następnie wyrzucić HBSS.
  4. Dodać 1950 μl mieszaniny enzymów 1 do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej fragmenty tkanki hipokampa. Potrząsać probówką wirówkową w sposób ciągły w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: Mieszanina enzymatyczna 1 jest kombinacją 50 μl enzymu P i 1900 μl buforu Y, podgrzanego do 37 °C (obecnego jako część dostępnego w handlu zestawu, patrz tabela materiałów).
  5. Wyjąć probówkę wirówkową z łaźni wodnej. Dodać 30 μl świeżo przygotowanej mieszaniny enzymów 2 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odpipetować fragmenty tkanki w górę i w dół 20 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i inkubować w łaźni wodnej przez 5 minut, ciągle wstrząsając w temperaturze 37°C.
    UWAGA: Mieszanina enzymatyczna 2 to połączenie 20 μl buforu Y i 10 μl enzymu A. Powyższe dwa etapy trawienia przekształcają tkankę mózgową w zawiesinę komórkową. Całkowity czas trawienia nie powinien przekraczać 15 minut.
  6. Wyjąć probówkę wirówkową i kilkakrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml, aż nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki.
  7. Przefiltrować zawiesinę komórek przez filtr przesiewowy komórek o średnicy 70 μm i zebrać filtrat w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Ten krok usuwa wszelkie duże kawałki niestrawionej tkanki.
  8. Przenieść filtrat do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 10 minut. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  9. Przemyć zawiesinę komórkową pipetując 20 razy w górę i w dół za pomocą 15 ml HBSS i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 10 minut. Odrzucić sklarowany nad osadem i
    ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu MACS.
    UWAGA: Ten krok zapewnia zawiesinę jednokomórkową używaną w kolejnych eksperymentach.

3. Ostra separacja mikrogleju

  1. Przenieść 1 ml zawiesiny jednokomórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.
  2. Zawiesić osad jednokomórkowy w 90 μl buforu MACS. Dodać 10 μl mikrogranulek CD11b/c i inkubować zawiesinę w temperaturze 4 °C przez 15 minut na wytrząsarce poziomej.
  3. Umieścić kolumnę sortującą w polu magnetycznym odpowiedniego separatora MACS i dwukrotnie zwilżyć kolumnę 500 μl buforu MACS.
  4. Przemyć zawiesinę jednokomórkową, dodając 1 ml buforu MACS bezpośrednio do probówki i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 3 minuty. Całkowicie odessać supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MACS.
  6. Przenieść zawieszoną zawiesinę komórek do kolumny sortującej w polu magnetycznym za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odrzuć przepływ. Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu MACS, pozostając w polu magnetycznym.
    UWAGA: Przepływ zawiera nieoznaczone komórki. Kolumnę należy myć bez usuwania jej z pola magnetycznego.
  7. Usuń kolumnę sortującą z pola magnetycznego. Dodaj 1 ml buforu MACS do kolumny i powoli przepchnij go tłokiem. Zebrać przepływ.
    UWAGA: Przepływ zawiera znakowane komórki (tj. mikroglej). Aby poprawić czystość mikrogleju, proces można powtórzyć z nową kolumną sortującą (opcjonalnie).
  8. Wysiewaj wybrane komórki na 24-dołkową płytkę zawierającą szkiełko nakrywkowe pokryte PLL. Dodać 200 μl pożywki hodowlanej i inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 95%O2, 5% CO2 i wilgotności 60%-80%. Ten krok pozwala mikroglejowi przyczepić się do szkiełka nakrywkowego w celu przeprowadzenia kolejnych eksperymentów z opaską krosową całych komórek i immunofluorescencji.

4. Immunofluorescencja

  1. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków płytkowych i przepłukać komórki trzykrotnie 0,1 M PBS na wytrząsarce.
  2. Wyrzuć PBS i utrwal mikroglej na szkiełku nakrywkowym za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Usunąć utrwalacz i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe 0,1 M PBS.
  4. Odrzucić PBS i przepuścić komórki za pomocą 200 μl buforu blokującego zawierającego 0,2% Triton X-100 i 5% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
  5. Inkubować mikroglej z buforem blokującym oraz przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-Iba1 i anty-CD11b18 przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Następnego dnia należy usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe PBS w temperaturze RT na wytrząsarce.
  7. Inkubować mikroglej z buforem blokującym zawierającym przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodawać barwnik DAPI przez ostatnie 15 minut inkubacji.
  8. Usunąć przeciwciała drugorzędowe i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe PBS. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych w celu obrazowania.

5. Rejestracja prądów potasowych w mikrogleju za pomocą całokomórkowego patch-clampu

  1. Rozmrozić roztwór wewnątrzkomórkowy i trzymać go na lodzie.
  2. Wyciągnij pipety (elektrody) z cienkościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą pionowego ściągacza17.
    UWAGA: Rezystancja elektrody powinna być mniejsza niż 10 MΩ.
  3. Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory rejestracyjnej i dodać roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający 160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 10 mM HEPES. Przed użyciem dostosuj pH do 7,2 za pomocą 1 M roztworu NaOH 13,16 i dostosuj ciśnienie osmotyczne do 300 mOsm z D-sacharozą.
  4. Zlokalizuj sferyczny mikroglej pod mikroskopem wodnym za pomocą obiektywu 40x.
  5. Napełnij elektrodę roztworem wewnątrzkomórkowym, przymocuj ją do stopnia głównego wzmacniacza zestawu elektrofizjologicznego i zastosuj nadciśnienie. Przełącz się na obiektyw 4x i zlokalizuj elektrodę.
    1. Opuść elektrodę do roztworu kąpieli i ustaw amplifier w trybie napięcia-cęg, aby przeprowadzić test membrany w trybie kąpieli. Przełącz się z powrotem na obiektyw 40x i przesuń końcówkę elektrody bliżej mikrogleju.
      UWAGA: Gdy końcówka elektrody znajduje się bardzo blisko komórki mikrogleju, rezystancja powinna nieznacznie wzrosnąć.
    2. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby utrzymać komórkę. Gdy rezystancja osiągnie 100 MΩ, przełącz się z trybu kąpieli na tryb łatowy w teście membranowym. Gdy rezystancja osiągnie 300 MΩ, zwolnij podciśnienie.
    3. Gdy rezystancja wskazuje na tworzenie się uszczelnienia gigaomowego (tj. >1 GΩ) między elektrodą a błoną mikrogleju, przełącz się z trybu łaty na tryb ogniwa w teście membranowym.
  6. Zastosuj niewielką ilość ssania i zainicjuj porażenie prądem, aby rozerwać membranę. Pojawienie się dużych pojemnościowych stanów nieustalonych wskazuje na udane pęknięcie membrany.
  7. Przełącz na tryb cęgów napięcia i otwórz program nagrywania. Rejestruj prądy potasu przez 200 ms. Aby przetestować potencjały, należy zastosować kroki napięcia w krokach co 20 mV od -120 mV do +40 mV przy 1 Hz.
  8. Analizuj uzyskane dane w trybie offline za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Wyniki

W skrócie proces ten obejmuje izolację mikrogleju hipokampa z mózgu dorosłej myszy, a następnie rejestrację potencjałów tych komórek metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell (Rycina 1). Procedura rozpoczyna się od wypreparowania hipokampa z dorosłych myszy szczepu C57BL/6J w wieku od 3 do 5 miesięcy. W szczególności, po perfuzji cały mózg zostaje usunięty i umieszczony w naczyniu hodowlanym zawierającym lodowaty PBS (Rycina 2A). Aby zapewnić ostrą izolację komórek z hipokampa, usuwa się korę mózgową, a następnie w całości izoluje się półksiężycowatą tkankę hipokampa (Rycina 2B).

Aby zapewnić optymalną jakość komórek i późniejsze wysokiej jakości rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell, kluczowe jest kontrolowanie czasu trawienia podczas przygotowywania zawiesiny pojedynczych komórek. W badaniu konsekwentnie stosowano ręczne mieszanie tkanki hipokampa w mieszaninie enzymatycznej, a czas trawienia ograniczono ściśle do maksymalnie 15 min (Rycina 3). Następnie komórki wyizolowano metodą MACS, osiągając czystość na poziomie 86,20% ± 0,68%19,20. Aby potwierdzić, że posortowane komórki są mikroglejem, sprawdzono obecność markerów powierzchniowych mikrogleju za pomocą immunofluorescencji z użyciem przeciwciał anty-Iba1 i anty-CD11b, które są powszechnie stosowane do detekcji mikrogleju18. Wyniki wykazały, że wyizolowane komórki były dodatnie pod kątem CD11b i Iba1, co potwierdziło pomyślną izolację mikrogleju (Rycina 4).

Wreszcie, aby ocenić, czy doraźnie wyizolowana mikrogleja jest wysokiej jakości i nadaje się do dalszych eksperymentów, opisujemy sposób wykonywania rejestracji metodą patch-clamp z całej komórki (whole-cell) w celu oceny prądów potasowych mikroglei. Rejestrowana mikrogleja wykazywała średnią pojemność błony na poziomie 10,42 ± 2,05 (Rycina 5). Wyniki wykazały, że możliwe jest rejestrowanie prądów potasowych mikroglei, co wskazuje, że doraźnie wyizolowana mikrogleja nadaje się do badań neurobiologicznych.

Schemat izolacji komórek hipokampa, oczyszczania mikrogleju oraz rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell.
Rycina 1: Przegląd procedury eksperymentalnej. Proces składa się z czterech głównych etapów: ostrożne wypreparowanie tkanek mózgu i obustronna dyssekcja hipokampa; trawienie tkanek hipokampa w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu mieszaniny enzymów, zgodnie ze szczegółami opisanymi w sekcji protokołu; izolacja komórek docelowych metodą magnetycznego sortowania komórek (MACS); oraz pomiar prądów potasowych w świeżo izolowanych komórkach za pomocą rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Disekcja mózgu; cały mózg i przekroje mózgu; porównanie struktur anatomicznych.
Rysunek 2: Disekcja hipokampa. (A) Cały mózg myszy w wieku od 3 do 5 miesięcy. (B) Wyizolowany obustronny hipokamp. Pasek skali: 0.5 cm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat reakcji enzymatycznej w laboratorium; metoda wstrząsania w kąpieli wodnej w 37°C w celu inkubacji mieszaniny enzymów.
Rysunek 3: Schemat przedstawiający trawienie tkanek hipokampa. Ilustracja kluczowych etapów eksperymentalnych, zapewniająca strawienie tkanki hipokampa do zawiesiny pojedynczych komórek poprzez dodanie mieszanin enzymatycznych w 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu przez maksymalnie 15 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna barwienia Iba1, CD11b, DAPI; wizualizacja markerów komórkowych.
Rysunek 4: Identyfikacja mikrogleju izolowanego doraźnie z hipokampa. Reprezentatywne obrazy konfokalne przedstawiające komórki wykazujące pozytywną reakcję na CD11b (zielony) i Iba1 (czerwony), oczyszczone z hipokampa, potwierdzające, że izolowane komórki są mikroglejem. Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat metody patch clamp dla mikrogleju; konfiguracja rejestracji i wyniki zaciskowego pomiaru napięcia.
Rycina 5: Rejestracja prądów potasowych w mikrogleju metodą whole-cell. (A) Elektroda rejestrująca została umieszczona na powierzchni wyizolowanych komórek mikrogleju z hipokampa. Pasek skali: 20 µm. (B) Reprezentatywne prądy potasowe świeżo wyizolowanego mikrogleju z hipokampa w warunkach zacisku napięciowego (voltage clamp). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Hodowla mikrogleju od płodów lub nowonarodzonych myszy jest wyraźnie nieodpowiednia do badania dorosłego mikrogleju. Dodatkowo, biorąc pod uwagę niejednorodność mikrogleju w różnych obszarach mózgu21, mikroglej wyizolowany z całego mózgu może nie reprezentować dokładnie cech mikrogleju w określonej strukturze mózgu. Protokół ten zapewnia metodę izolowania mikrogleju hipokampa, w szczególności w celu oceny właściwości elektrycznych tych komórek. Zawiera on metody rejestracji prądów regulowanych przez mikroglejowe kanały potasowe.

Powszechnie wiadomo, że trawienie tkanek musi być ściśle kontrolowane podczas przygotowywania zawiesin jednokomórkowych, aby uniknąć pogorszenia właściwości tych komórek podczas pierwotnej hodowli komórkowej i późniejszych eksperymentów. Zazwyczaj zawiesinę jednokomórkową uzyskuje się z całego mózgu poprzez trawienie enzymami trzustkowymi i fizyczną homogenizację. Jednak podczas izolowania mikrogleju z określonego obszaru mózgu, takiego jak hipokamp, sama fizyczna homogenizacja nie daje wystarczającej ilości komórek do przeprowadzenia znaczących eksperymentów. Dodatkowo enzymy trzustkowe mają energiczną aktywność trawienną, co może wpływać na żywotność komórek.

Aby rozwiązać te problemy, w badaniu przyjęto stosunkowo łagodną procedurę dysocjacji i ręcznie kontrolowano czas trawienia do nie więcej niż 15 minut za pomocą zestawu do dysocjacji mózgu dorosłej myszy. Takie podejście utrzymuje mikroglej w stanie aktywnym, co ma kluczowe znaczenie dla kolejnych zapisów patch-clamp całych komórek. Procedura łagodnej dysocjacji oferuje również korzyści pod względem szybkości i opłacalności.

Metody oczyszczania pierwotnego mikrogleju obejmują metodę wytrząsania warstwowego (SSM)22, metodę wirowania w gradicynie gęstości (DGCM)23 oraz metodę sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)11,24. Wśród nich SSM jest szeroko stosowany do oczyszczania neuronów lub komórek glejowych. Poważnym ograniczeniem Jednolitego Mechanizmu Nadzorczego jest jednak jego niezdolność do osiągnięcia wysokiego poziomu czystości25. Podobnie, DGCM również skutkuje niskimi poziomami czystości. Metoda FACS wymaga barwienia komórek przez 15 minut do 1 godziny, a następnie sortowania za pomocą szybkiego sortera komórek, co może pogorszyć żywotność komórek. W przeciwieństwie do tego, protokół ten wykorzystuje metodę MACS, która zapewnia skrócony czas izolacji i pozwala uniknąć powtarzalnego i czasochłonnego użycia narzędzi i procedur barwienia. W rezultacie uzyskuje się mikroglej o wysokiej czystości, choć w potencjalnie mniejszych ilościach w porównaniu z niektórymi alternatywnymi metodami.

Technika ta ma swoje ograniczenia. Na przykład metoda sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) daje stosunkowo niewiele mikrogleju, a ostro izolowany mikroglej nie może być hodowany przez dłuższy czas. Jednak takie podejście jest cenne, ponieważ pozwala na badanie właściwości elektrofizjologicznych mikrogleju, który został świeżo przygotowany z dorosłego hipokampa myszy, zamiast polegać na komórkach, które były hodowane przez długi czas.

Technika klamry krosowej dla całych komórek jest kluczowym i szeroko stosowanym narzędziem do badania właściwości elektrofizjologicznych komórek, zwłaszcza neuronów, w dziedzinach takich jak neurobiologia, farmakologia i cytobiologia26. Zapis krosowy całych komórek został wykorzystany w licznych badaniach w celu zbadania właściwości ostro wypreparowanych wycinków mózgu, kultur pierwotnych i linii komórkowych. Jednak do czasu naszych badań brakowało zapisów całokomórkowych patch-clamp ostro izolowanego mikrogleju z mózgu dorosłej myszy.

Badanie to nie tylko dostarcza protokołu izolacji dorosłego mikrogleju hipokampa, ale także demonstruje udane rejestrowanie prądów potasowych w tych izolowanych mikrogleju. Warto zauważyć, że protokół ten prawdopodobnie będzie miał zastosowanie do badania mikrogleju w strukturach mózgu innych niż hipokamp.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32170950, 32371065), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong, nr 2023A1515010899 i 2021A1515010804.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalka Petriego 100 mmCorning353003
15 ml Probówki FalconBD352096
płytki 24-dołkoweBD353047
szalka Petriego 35 mmCorning
353001-50 ml Probówki FalconBD352070
70 μ m badanie przesiewowe komórekMiltenyi130-095-823Aby usunąć grudki komórek przed sortowaniem komórek
Zestaw do dysocjacji mózgu dorosłych myszyMiltenyi130-107-677
Przeciwciało anty-CD11bBio-RadMCA74Kozia IgG Anty-Mysz również dostępna. Do blokowania endogennych immunoglobulin.
przeciwciała anty-Iba 1SYSY234308Goat Anti-guinea pig IgG). Do blokowania endogennych immunoglobulin.
Axon Digidata 1440AUSA
Axon MultiClamp 700B WzmacniaczUSA
BSA Albumina Frakcja VBioFrox4240GR500Serum
C57BL/6 myszy Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b / c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
Hydrat chloraluAbsinabs47051394Szeroko stosowany jako znieczulenie u myszy
Clampfit 10.6USA
Mikroskop konfokalnyZeiss  LSM 800
Pożywka hodowlanaFisher Scientific
C11995500BT-DAPI barwnikBeyotimeC1002
Ściągacz elektrodNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Wytrząsarka poziomaSCILOGEXSLK-O3000-S
Oprogramowanie do analizy obrazuFidżi
Kolumny MACSMiltenyi130-042-201
Separatory MACSMiltenyi130-042-102
ParaformaldehydFisher ScientificT353-500Użyj świeżego 4% roztworu w 1X PBS, pH 7,2-7,4. 
Poli-L-lizynaBeyotime  C0313Powłoka szkiełka nakrywkowego
Triton X-100SigmaX100
Dostępne są również

Bibliografia

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).
  3. Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology. Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).
  4. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  5. Wohleb, E. S. Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse. Front Immunol. 7, 544(2016).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Sarkar, S. Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration. Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).
  8. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  9. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium. J Vis Exp. 133, e57122(2018).
  10. Lyons, S. A., et al. Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).
  11. Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage. Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).
  12. Sarkar, S., et al. Kv1.3 modulates neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. J Clin Invest. 130 (8), 4195-4212 (2020).
  13. Maezawa, I., et al. Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept. Brain. 141 (2), 596-612 (2018).
  14. Delbridge, A. R. D., et al. Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation. Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).
  15. Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia. J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).
  16. Wulff, H., et al. The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms. J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).
  17. Tan, S., et al. Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice. Molecules. 28 (10), 4092(2023).
  18. Manitz, M. P., et al. Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice. Brain Res. 1636, 172-182 (2016).
  19. Xu, Y. N., et al. A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium. Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).
  20. Zelenka, L., et al. Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes. J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).
  21. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).
  22. Yang, B., et al. Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model. Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).
  23. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  24. Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro. J Vis Exp. 160, e61467(2020).
  25. Mccarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  26. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mikroglejumózg dorosłej myszyprądy potasowesortowanie komórek metodą MACSbarwienie immunofluorescencyjnerejestracja metodą voltage clamppowlekanie poli-L-lizynąmikrokule CD11b
Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.