Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje, jak izolować i oczyszczać pierwotny mikroglej hipokampa od dorosłych myszy, a następnie instrukcje dotyczące przeprowadzania zapisów całokomórkowych na tych ostro izolowanych komórkach.

Streszczenie

Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe w mózgu, które współdziałają z neuronami, aby utrzymać homeostazę ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Badania pokazują, że na powierzchni mikrogleju znajdują się kanały potasowe, które regulują aktywację mikrogleju, podczas gdy nieprawidłowości w tych kanałach potasowych mogą prowadzić do chorób nerwowych. Obecnie zapisy mikrogleju w postaci krosówek całokomórkowych są najczęściej wykonywane na hodowanym pierwotnym mikrogleju od płodu lub nowonarodzonych myszy ze względu na trudności w przeprowadzaniu ocen elektrofizjologicznych na ostro izolowanym mikrogleju. Badanie to wprowadza łatwy do naśladowania protokół izolowania mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy i wykonywania nagrań całokomórkowych na izolowanych komórkach. Krótko mówiąc, mózg został usunięty od myszy po dekapitacji, hipokamp został wypreparowany obustronnie, a mikroglej wyizolowano za pomocą zestawu do dysocjacji mózgu dorosłej myszy. Mikroglej został następnie oczyszczony za pomocą metody sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) i umieszczony na szkiełkach nakrywkowych. Udaną izolację mikrogleju potwierdzono barwieniem immunofluorescencyjnym przeciwciałami anty-CD11 i anty-Iba1. Szkiełko nakrywkowe umieszczono w komorze rejestracyjnej, a prądy potasowe w całych komórkach ostro izolowanego mikrogleju zarejestrowano w warunkach cęgów napięciowych.

Wprowadzenie

Mikroglej, który wywodzi się od przodków szpiku w pierwotnym woreczku żółtkowym, rezyduje w OUN i stanowi około 10% do 15% wszystkich komórek nerwowych^1,2. Funkcjonalnie, oprócz monitorowania lokalnego środowiska, pełnienia funkcji obrony immunologicznej oraz odżywiania i wspierania neuronów^3,4, mikroglej może również bezpośrednio kontaktować się z neuronami w celu regulacji receptorów powierzchniowych neuronów i odpowiadającego im wiązania ligandów, a także pośrednio oddziaływać z neuronami poprzez wydzielanie cytokin⁵. Badania in vitro i in vivo wykazały, że mikroglej wykazuje ekspresję różnych typów kanałów potasowych, które przyczyniają się do utrzymania ujemnego potencjału błonowego⁶ i regulują aktywację mikrogleju. Biorąc pod uwagę, że nieprawidłowe kanały potasowe mikrogleju zostały zaobserwowane w różnych chorobach mózgu⁷, kluczowe jest, aby naukowcy zidentyfikowali potencjalne leki, które celują w te kanały potasowe i opracowali strategie regulacji funkcji mikrogleju.

Tradycyjne metody trawienia i oczyszczania mikrogleju często wykorzystują cały mózg, co pomija niejednorodność mikrogleju w różnych obszarach mózgu⁸. Dysocjacja in vitro i długotrwała hodowla w pożywkach zawierających surowicę umieszczają mikroglej w stanie aktywnym⁹, co może nie odzwierciedlać dokładnie ich cech fizjologicznych i stanu rzeczywistego.

Dodatkowo, podczas gdy prądy potasowe prostownika na zewnątrz zostały zarejestrowane w pierwotnych hodowlach noworodków mikrogleju i liniach komórkowych¹⁰, dane z długoterminowych hodowli tkanki mózgowej płodu lub nowonarodzonej myszy mogą różnić się od tych z dojrzałego mikrogleju. Obecny protokół ma na celu dokładne wyizolowanie mikrogleju i natychmiastowe wykonanie całokomórkowych zapisów prądów potasowych mikrogleju przy użyciu tkanki mózgowej dorosłej myszy.

Właściwości biochemiczne i kanału potasowego zostały zbadane przy użyciu metody odpowiedniej do izolacji i oczyszczania mikrogleju z małych tkanek^{11,12,13,14,15}. W związku z tym protokół ten zawiera wskazówki dla naukowców w celu wyjaśnienia biochemicznych i funkcjonalnych właściwości mikrogleju w warunkach fizjologicznych i chorobowych. Chociaż protokół ten wykorzystuje hipokamp i kanały potasowe jako przykłady, może być również stosowany do badania innych obszarów mózgu i właściwości elektrofizjologicznych kanałów/komórek.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Naukach Przyrodniczych Uniwersytetu Normalnego Południowych Chin, a odpowiednie standardy dobrostanu zwierząt zostały utrzymane (zatwierdzenie etyczne: SCNU-SLS-2023-048). Do tego badania wykorzystano samce lub samice 3-5-miesięcznych myszy C57BL/6J. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 50 ml roztworu wewnątrzkomórkowego zawierającego 160 mM KF, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA i 2 mM MgCl₂. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą 1 M roztworu KOH i dostosuj ciśnienie osmotyczne do 300 mOsm za pomocą D-sacharozy^13,16. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować 50 ml buforu do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) zawierającego 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS.
3. Przygotować poli-L-lizynę (PLL) w rozcieńczeniu 1:1000 w wodzie.
   UWAGA: Szkiełka nakrywkowe należy pokryć PLL dzień przed eksperymentem. Inkubować powlekane zrazy w temperaturze 37 °C przez noc. Drugiego dnia PLL należy poddać recyklingowi i wysuszyć powlekane szkiełka w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tkanki mózgowej

1. Znieczulić myszy 2,5% hydratem chloralu (0,15 ml/10 g, i.p.) (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Zanik odruchu rogówkowego i odruchu bólowego poprzez szczypanie palców u nóg lub szczypanie skóry u myszy potwierdza głębokie znieczulenie. Ułóż zwierzęta na wznak na stole sekcyjnym i przygnij im kończyny.
   1. Odsłoń klatkę piersiową i wykonaj perfuzję serca¹⁷ za pomocą lodowatego sterylnego PBS, aby usunąć wewnątrznaczyniowe krążące krwinki. Przytrzymaj głowę i przetnij skórę wzdłuż linii środkowej mózgu nożyczkami, aby odsłonić czaszkę.
   2. Przetnij tylną część czaszki obustronnie i między oczodołami małymi nożyczkami. Przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego i usuń czaszkę pęsetą. Szybko wyodrębnij tkankę mózgową za pomocą pęsety¹⁷.
2. Umieść tkankę mózgową w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych zawierających lodowaty PBS. Wytnij korę mózgową obustronnie za pomocą pęsety, wyizoluj tkankę hipokampa i pokrój ją na mniejsze kawałki. Przenieś kawałki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Obustronne rozwarstwienie kory mózgowej ujawnia półksiężyc tkanki hipokampa w obu półkulach mózgu.
3. Ponownie zawiesić małe kawałki tkanki hipokampa w 2 ml lodowatego zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i odwirować przy 300 × g przez 3 minuty (w temperaturze pokojowej), a następnie wyrzucić HBSS.
4. Dodać 1950 μl mieszaniny enzymów 1 do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej fragmenty tkanki hipokampa. Potrząsać probówką wirówkową w sposób ciągły w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 min.
   UWAGA: Mieszanina enzymatyczna 1 jest kombinacją 50 μl enzymu P i 1900 μl buforu Y, podgrzanego do 37 °C (obecnego jako część dostępnego w handlu zestawu, patrz tabela materiałów).
5. Wyjąć probówkę wirówkową z łaźni wodnej. Dodać 30 μl świeżo przygotowanej mieszaniny enzymów 2 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odpipetować fragmenty tkanki w górę i w dół 20 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i inkubować w łaźni wodnej przez 5 minut, ciągle wstrząsając w temperaturze 37°C.
   UWAGA: Mieszanina enzymatyczna 2 to połączenie 20 μl buforu Y i 10 μl enzymu A. Powyższe dwa etapy trawienia przekształcają tkankę mózgową w zawiesinę komórkową. Całkowity czas trawienia nie powinien przekraczać 15 minut.
6. Wyjąć probówkę wirówkową i kilkakrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml, aż nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki.
7. Przefiltrować zawiesinę komórek przez filtr przesiewowy komórek o średnicy 70 μm i zebrać filtrat w czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   UWAGA: Ten krok usuwa wszelkie duże kawałki niestrawionej tkanki.
8. Przenieść filtrat do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 10 minut. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
9. Przemyć zawiesinę komórkową pipetując 20 razy w górę i w dół za pomocą 15 ml HBSS i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 10 minut. Odrzucić sklarowany nad osadem i
   ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu MACS.
   UWAGA: Ten krok zapewnia zawiesinę jednokomórkową używaną w kolejnych eksperymentach.

3. Ostra separacja mikrogleju

1. Przenieść 1 ml zawiesiny jednokomórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.
2. Zawiesić osad jednokomórkowy w 90 μl buforu MACS. Dodać 10 μl mikrogranulek CD11b/c i inkubować zawiesinę w temperaturze 4 °C przez 15 minut na wytrząsarce poziomej.
3. Umieścić kolumnę sortującą w polu magnetycznym odpowiedniego separatora MACS i dwukrotnie zwilżyć kolumnę 500 μl buforu MACS.
4. Przemyć zawiesinę jednokomórkową, dodając 1 ml buforu MACS bezpośrednio do probówki i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 × g przez 3 minuty. Całkowicie odessać supernatant.
5. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MACS.
6. Przenieść zawieszoną zawiesinę komórek do kolumny sortującej w polu magnetycznym za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odrzuć przepływ. Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu MACS, pozostając w polu magnetycznym.
   UWAGA: Przepływ zawiera nieoznaczone komórki. Kolumnę należy myć bez usuwania jej z pola magnetycznego.
7. Usuń kolumnę sortującą z pola magnetycznego. Dodaj 1 ml buforu MACS do kolumny i powoli przepchnij go tłokiem. Zebrać przepływ.
   UWAGA: Przepływ zawiera znakowane komórki (tj. mikroglej). Aby poprawić czystość mikrogleju, proces można powtórzyć z nową kolumną sortującą (opcjonalnie).
8. Wysiewaj wybrane komórki na 24-dołkową płytkę zawierającą szkiełko nakrywkowe pokryte PLL. Dodać 200 μl pożywki hodowlanej i inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 95%_O2, 5% CO₂ i wilgotności 60%-80%. Ten krok pozwala mikroglejowi przyczepić się do szkiełka nakrywkowego w celu przeprowadzenia kolejnych eksperymentów z opaską krosową całych komórek i immunofluorescencji.

4. Immunofluorescencja

1. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków płytkowych i przepłukać komórki trzykrotnie 0,1 M PBS na wytrząsarce.
2. Wyrzuć PBS i utrwal mikroglej na szkiełku nakrywkowym za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Usunąć utrwalacz i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe 0,1 M PBS.
4. Odrzucić PBS i przepuścić komórki za pomocą 200 μl buforu blokującego zawierającego 0,2% Triton X-100 i 5% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
5. Inkubować mikroglej z buforem blokującym oraz przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-Iba1 i anty-CD11b¹⁸ przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Następnego dnia należy usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe PBS w temperaturze RT na wytrząsarce.
7. Inkubować mikroglej z buforem blokującym zawierającym przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodawać barwnik DAPI przez ostatnie 15 minut inkubacji.
8. Usunąć przeciwciała drugorzędowe i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe PBS. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych w celu obrazowania.

5. Rejestracja prądów potasowych w mikrogleju za pomocą całokomórkowego patch-clampu

1. Rozmrozić roztwór wewnątrzkomórkowy i trzymać go na lodzie.
2. Wyciągnij pipety (elektrody) z cienkościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą pionowego ściągacza¹⁷.
   UWAGA: Rezystancja elektrody powinna być mniejsza niż 10 MΩ.
3. Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory rejestracyjnej i dodać roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający 160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ i 10 mM HEPES. Przed użyciem dostosuj pH do 7,2 za pomocą 1 M roztworu NaOH ^13,16 i dostosuj ciśnienie osmotyczne do 300 mOsm z D-sacharozą.
4. Zlokalizuj sferyczny mikroglej pod mikroskopem wodnym za pomocą obiektywu 40x.
5. Napełnij elektrodę roztworem wewnątrzkomórkowym, przymocuj ją do stopnia głównego wzmacniacza zestawu elektrofizjologicznego i zastosuj nadciśnienie. Przełącz się na obiektyw 4x i zlokalizuj elektrodę.
   1. Opuść elektrodę do roztworu kąpieli i ustaw amplifier w trybie napięcia-cęg, aby przeprowadzić test membrany w trybie kąpieli. Przełącz się z powrotem na obiektyw 40x i przesuń końcówkę elektrody bliżej mikrogleju.
      UWAGA: Gdy końcówka elektrody znajduje się bardzo blisko komórki mikrogleju, rezystancja powinna nieznacznie wzrosnąć.
   2. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby utrzymać komórkę. Gdy rezystancja osiągnie 100 MΩ, przełącz się z trybu kąpieli na tryb łatowy w teście membranowym. Gdy rezystancja osiągnie 300 MΩ, zwolnij podciśnienie.
   3. Gdy rezystancja wskazuje na tworzenie się uszczelnienia gigaomowego (tj. >1 GΩ) między elektrodą a błoną mikrogleju, przełącz się z trybu łaty na tryb ogniwa w teście membranowym.
6. Zastosuj niewielką ilość ssania i zainicjuj porażenie prądem, aby rozerwać membranę. Pojawienie się dużych pojemnościowych stanów nieustalonych wskazuje na udane pęknięcie membrany.
7. Przełącz na tryb cęgów napięcia i otwórz program nagrywania. Rejestruj prądy potasu przez 200 ms. Aby przetestować potencjały, należy zastosować kroki napięcia w krokach co 20 mV od -120 mV do +40 mV przy 1 Hz.
8. Analizuj uzyskane dane w trybie offline za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Wyniki

W skrócie proces ten obejmuje izolację mikrogleju hipokampa z mózgu dorosłej myszy, a następnie rejestrację potencjałów tych komórek metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell (Rycina 1). Procedura rozpoczyna się od wypreparowania hipokampa z dorosłych myszy szczepu C57BL/6J w wieku od 3 do 5 miesięcy. W szczególności, po perfuzji cały mózg zostaje usunięty i umieszczony w naczyniu hodowlanym zawierającym lodowaty PBS (Rycina 2A). Aby zapewnić ostrą izolację k...

Dyskusja

Hodowla mikrogleju od płodów lub nowonarodzonych myszy jest wyraźnie nieodpowiednia do badania dorosłego mikrogleju. Dodatkowo, biorąc pod uwagę niejednorodność mikrogleju w różnych obszarach mózgu²¹, mikroglej wyizolowany z całego mózgu może nie reprezentować dokładnie cech mikrogleju w określonej strukturze mózgu. Protokół ten zapewnia metodę izolowania mikrogleju hipokampa, w szczególności w celu oceny właściwości elektrycznych tych komórek. Zawiera on metody rejestracji prądów regulowanych prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalka Petriego 100 mm	Corning	353003
15 ml Probówki Falcon	BD	352096
płytki 24-dołkowe	BD	353047
szalka Petriego 35 mm	Corning
353001-50 ml Probówki Falcon	BD	352070
70 μ m badanie przesiewowe komórek	Miltenyi	130-095-823	Aby usunąć grudki komórek przed sortowaniem komórek
Zestaw do dysocjacji mózgu dorosłych myszy	Miltenyi	130-107-677
Przeciwciało anty-CD11b	Bio-Rad	MCA74	Kozia IgG Anty-Mysz również dostępna. Do blokowania endogennych immunoglobulin.
przeciwciała anty-Iba 1	SYSY	234308	Goat Anti-guinea pig IgG). Do blokowania endogennych immunoglobulin.
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B Wzmacniacz	USA
BSA Albumina Frakcja V	BioFrox	4240GR500	Serum
C57BL/6 myszy	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b / c MicroBeads	Miltenyi	130-105-634
Hydrat chloralu	Absin	abs47051394	Szeroko stosowany jako znieczulenie u myszy
Clampfit 10.6	USA
Mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM 800
Pożywka hodowlana	Fisher Scientific
C11995500BT-DAPI barwnik	Beyotime	C1002
Ściągacz elektrod	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
Wytrząsarka pozioma	SCILOGEX	SLK-O3000-S
Oprogramowanie do analizy obrazu	Fidżi
Kolumny MACS	Miltenyi	130-042-201
Separatory MACS	Miltenyi	130-042-102
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	T353-500	Użyj świeżego 4% roztworu w 1X PBS, pH 7,2-7,4.
Poli-L-lizyna	Beyotime	C0313	Powłoka szkiełka nakrywkowego
Triton X-100	Sigma	X100

Dostępne są również