Identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów zaburzonych u pacjentów w stanie krytycznym przy użyciu metabolomiki opartej na NMR

Summary

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) służy do wykrywania dysregulacji metabolitów u pacjentów z różnymi chorobami. Technika ta pozwala na ilościowe określenie zaburzonych metabolitów, odkrywając patofizjologiczne wglądy. W tym miejscu opisujemy krok po kroku procedurę podejścia opartego na NMR w celu charakterystyki metabolicznej pacjentów.

Abstract

Metabolomika staje się ważnym podejściem odzwierciedlającym reakcję jednostki na stany patofizjologiczne. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) rozwinęła się jako narzędzie do identyfikacji zaburzeń metabolicznych u krytycznie chorych pacjentów dotkniętych stanami takimi jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), ciężkie ostre zapalenie trzustki (SAP), ostre uszkodzenie nerek (AKI) i posocznica. Dane spektralne z próbki surowicy grupy badanej i kontrolnej są rejestrowane za pomocą spektrometru NMR 800 MHz i przetwarzane przy użyciu narzędzi do przetwarzania i analizy NMR. Ponadto przeprowadza się rygorystyczną analizę statystyczną, taką jak testy jedno- i wieloczynnikowe, w celu wskazania istotnych metabolitów, które są następnie dokładnie identyfikowane i określane ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR. Ponadto analiza szlaków zwraca uwagę na zaburzone cykle biochemiczne, które skutkują ciężkością choroby. Dzięki temu kompleksowemu podejściu naukowcy chcą uzyskać głębszy wgląd w zmiany metaboliczne związane z tymi krytycznymi chorobami, potencjalnie torując drogę do lepszego zrozumienia choroby oraz poprawy strategii diagnostycznych i terapeutycznych.

Introduction

Pomimo ciągłych wysiłków na rzecz zapewnienia skutecznej diagnozy chorób na całym świecie, terapia celowana wciąż nie osiągnęła swojego prawdziwego potencjału. Różne podejścia, takie jak transkryptomika, proteomika itp., doprowadziły do zidentyfikowania kilku biomarkerów, ale nie miały one wystarczającej użyteczności klinicznej ze względu na brak czułości i swoistości^1,2. Terapia celowana jest dużym wyzwaniem w przypadku niektórych chorób wieloczynnikowych, co ostatecznie prowadzi do wyższej śmiertelności. Istnieje potrzeba lepszego zrozumienia mechanizmu i patofizjologii leżących u podstaw złożonych chorób występujących w dużej niejednorodności. Tak więc w związku z tym rozwój metabolomiki zrewolucjonizował rozwój terapeutyczny, który ostatecznie może pomóc w dostosowaniu schematów leczenia do różnych krytycznych chorób, takich jak zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), posocznica i ciężkie ostre zapalenie trzustki (SAP).

Metabolomika to kompleksowe podejście mające na celu identyfikację i ilościowe określenie cząsteczek o małej masie cząsteczkowej (metabolitów takich jak aminokwasy, lipidy, peptydy, kwasy organiczne i witaminy) w różnych biopłynach, komórkach lub ekstraktach tkankowych. Te metabolity, które zwykle ważą mniej niż 1500 Da, odgrywają aktywną rolę w procesach biochemicznych, odzwierciedlając postępujący zarys stanu biologicznego organizmu. Obejmują one substraty dla kluczowych procesów enzymatycznych, produkty pośrednie w szlakach biologicznych oraz produkty uboczne metabolizmu komórkowego. W związku z tym metabolomika rejestruje szczegółowy odcisk palca wpływów dietetycznych, interakcji leków i stanów chorobowych. Zmiany metabolitów są bardzo czułymi wskaźnikami metabolizmu i szlaków biologicznych, co pozwala na korelacje z ekspresjami fenotypowymi i wynikającymi z nich nieprawidłowościami patofizjologicznymi^3,4. Początkowe zmiany metabolitów mogą służyć jako wczesne wskaźniki ciężkości choroby, podczas gdy zmiany czasowe mogą pomóc w monitorowaniu skuteczności leczenia, postępu choroby i wyników klinicznych^5,6,7. W ten sposób metabolomika ulepsza testy kliniczne i różne inne podejścia omiczne, redefiniując choroby za pomocą klinicznych, fizjologicznych i biochemicznych punktów końcowych^{8,9,10,11,12,13}. Możliwości analityczne metabolomiki są wykorzystywane do monitorowania i określania podatności na choroby poprzez zmienione stężenia metabolitów^14,15.

W tym kontekście, zarówno spektrometria mas (MS), jak i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) stały się głównymi platformami analitycznymi do profilowania metabolitów w próbkach biologicznych. Metody te są stosowane zarówno do ukierunkowanej, jak i nieukierunkowanej identyfikacji i kwantyfikacji metabolitów^16,17,18. Każda platforma ma swoje zalety i ograniczenia, ale nieniszczący charakter NMR sprawia, że jest ona preferowana w różnych badaniach in vivo oraz do charakteryzowania struktury nieznanych związków, szczególnie na początkowych etapach badań metabolomicznych. Frakcjonowanie, derywatyzacja i jonizacja próbki wymagane, zanim MS może wprowadzić błędy systematyczne i często powodować utratę próbki, wpływając na cechy dynamiczne, które spektroskopia NMR może uchwycić przy minimalnym lub zerowym przygotowaniu próbki. Podstawowym ograniczeniem NMR jest jego niższa czułość w porównaniu do SM, która oferuje niższą granicę wykrywalności, co utrudnia wykrycie mniej obfitych metabolitów¹⁹. Jednak postępy, takie jak magnesy nadprzewodzące o wysokiej rozdzielczości, chłodzone kriogenicznie sondy NMR i techniki zwiększające czułość, złagodziły to ograniczenie^20,21,22. Jako podejście uzupełniające genomikę i proteomikę, profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem spektroskopii NMR zyskuje na popularności jako preferowana technika^23,24,25. Minimalne przygotowanie próbki, odtwarzalność i powtarzalność NMR sprawiają, że jest on cennym narzędziem do uchwycenia nieodłącznych cech dynamicznych metabolitów pomimo wyzwań związanych z czułością²⁶.

Kilka grup badawczych przeprowadziło pomyślne przeprowadzenie metabolomiki, określając rozregulowany profil metaboliczny pacjentów z różnymi chorobami²⁷ takie jak ARDS^{28,29,30,31,32,33}, zapalenie płuc³⁴, sepsa⁷, kamienie żółciowe³⁵, oraz zapalenie trzustki³⁶. Badania metabolomiczne oparte na NMR u pacjentów w stanie krytycznym odegrały zasadniczą rolę w śledzeniu progresji od zespołu układowej odpowiedzi zapalnej (SIRS) do zespołu dysfunkcji wielonarządowej (MODS), który jest główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności na oddziałach intensywnej terapii (OIOM)³⁷. W badaniu przeprowadzonym przez Stringera i wsp., próbki osocza wykorzystano do zbadania zmian metabolicznych u pacjentów z ostrym uszkodzeniem płuc wywołanym sepsą (ALI) w porównaniu z pacjentami z grupy kontrolnej³⁸. Kluczowe metabolity, u których stwierdzono podwyższone wartości w tym badaniu pilotażowym, odzwierciedlały zaangażowane szlaki metaboliczne i ich związek z wynikami klinicznymi. Badania te zostały rozszerzone na metabolomikę surowicy w celu odróżnienia sepsy od wczesnych stadiów mechanizmów uszkodzenia płuc w ARDS³². Ponadto w innym badaniu ARDS zidentyfikowano silne biomarkery surowicy, które wyraźnie różnicują ostre uszkodzenie płuc/ARDS i osoby zdrowe, oferując wgląd w ogólnoustrojowe zmiany metaboliczne odpowiadające ostremu początkowi uszkodzenia płuc^39,40.

Spektroskopia NMR to wysoce przepustowa i zautomatyzowana technika analityczna, która dostarcza solidnych i bezstronnych informacji na temat metabolicznego odcisku palca, ujawniając leżącą u jego podstaw patofizjologię³⁸. Zastosowanie kliniczne i biologiczna interpretacja danych NMR zależą od uzyskania wysokiej jakości widm, które zawierają bogate informacje. Dlatego kluczowe znaczenie ma zapewnienie dokładnego, jednolitego i dobrze sformułowanego gromadzenia, przetwarzania i analizy danych. Dlatego celem tego badania jest wykorzystanie podstawowych etapów metabolomiki opartej na NMR do identyfikacji i kwantyfikacji metabolitów. Badanie to podkreśla kluczowe etapy protokołu wymaganego do klinicznego badania metabolomicznego (Rysunek 1), takie jak wybór odpowiednich próbek, pobieranie i przechowywanie, przetwarzanie i przygotowanie próbek, pozyskiwanie i analiza danych, identyfikacja i kwantyfikacja metabolitu będącego przedmiotem zainteresowania, a ostatecznie interpretacja wyników w kontekście klinicznym w celu uzyskania odpowiednich spostrzeżeń. Każdy z tych etapów jest niezbędny do wykorzystania spektroskopii NMR w metabolomice w celu odkrycia istotnych informacji biologicznych i klinicznych.

Protocol

Zatwierdzenie etyczne (kod IEC: 2022-71-PhD-126) uzyskano od IEC Podyplomowego Instytutu Nauk Medycznych Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Pobrano pisemne i świadome zgody od pacjentów lub ich bliskich na przeprowadzenie badania i opublikowanie danych do celów badawczych. Ponadto badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Projekt badania i poświadczenie etyczne

1. Określ wielkość próby dla każdej grupy. Dokładnie przejrzyj i ustal kryteria wyboru uczestników. Dodatkowo, jeśli projekt badania wymaga włączenia próbek ludzkich lub zwierzęcych, przed rozpoczęciem pobierania próbek należy uzyskać zgodę etyczną od odpowiedniej instytucjonalnej komisji etycznej (IEC).
2. Wybieraj pacjentów z ARDS sklasyfikowanych jako łagodne, umiarkowane i ciężkie, na podstawie kryteriów diagnostycznych definicji berlińskiej z 2012 r. opartej na stosunku ciśnienia parcjalnego tlenu we krwi tętniczej (PaO2) do frakcji wdychanego tlenu (FiO2) (P / F). Pacjenci z ARDS z zakresem P/F 300-200 są uważani za łagodnych, 200-100 za umiarkowanych, a poniżej 100 za ciężkie³⁸. W tym przypadku skupiliśmy się na dwóch grupach: pacjentach z łagodnym i umiarkowanym ARDS (patrz Tabela 1).
   UWAGA: Badanie polega na wykorzystaniu surowicy uzyskanej z próbek krwi do przeprowadzenia metabolomiki opartej na NMR. W tym badaniu uczestnicy uwzględnieni w celach informacyjnych mieli średni wiek 42 lat (± 10,9 lat), z rozkładem płci 2 mężczyzn i 6 kobiet.

szt. szt.

kategoria	Wskaźnik P/F
Łagodny	300-200
umiarkowany	200-100
Silny	100-0

Tabela 1: Kategoryzacja pacjentów z ARDS.

2. Wybór, pobieranie i przetwarzanie próbek

1. Wykonaj izolację surowicy, wykonując czynności opisane poniżej.
   1. W celu eksperymentowania należy pobrać 2 ml próbek krwi z tętnic za pomocą sterylnej igły w zwykłej (bez dodatków) i sterylnej fiolce. Pozostawić próbkę do skrzepnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej. Do tego badania wybrano 4 pacjentów, u których zdiagnozowano łagodny ARDS i 4 pacjentów z umiarkowanym ARDS.
   2. Odwirować próbkę o sile 3100 x g przez 15 minut, aby oddzielić surowicę²⁵. Przenieść surowicę do sterylnych probówek do mikrowirówek, tworząc porcje o mniejszej objętości (tj. 400-500 μl), odpowiednio je oznaczyć (imię i nazwisko pacjenta, numer CR, punkt dzienny itp.) i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
      UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać i wznowić w dogodnym czasie.
2. Przetwórz próbkę surowicy przed eksperymentami NMR, wykonując następujące czynności.
   1. Rozmrozić próbkę przed wykonaniem eksperymentów NMR. Zmieszać 250 μl podwielokrotności surowicy z 250 μl roztworu buforowego fosforanu soli fizjologicznej (zawierającego 100%_D2O, 0,9% NaCl, 50 mM buforu fosforanowego sodu, pH 7,4) w celu zminimalizowania zmian pH.
   2. Mieszaj mieszaninę przez kilka sekund (~15 s), aby upewnić się, że jest jednorodnie wymieszana. Na koniec przenieś przygotowaną próbkę do czystej probówki NMR ze współosiową wkładką zawierającą propionian trimetylosililu (TSP) o stężeniu 0,05 mM, który służy jako zewnętrzny wzorzec do kalibracji i kwantyfikacji⁴¹,
      UWAGA: Dla porównania, stosuje się obojętny i niereaktywny związek, który nie oddziałuje z analitami. Inne powszechnie stosowane związki referencyjne to tetrametylosilan (TMS) i trimetylosililosanosulfonian sodu (DSS).

3. Eksperymenty NMR

UWAGA: Skupiamy się na identyfikacji małych cząsteczek w próbkach surowicy, dlatego użyliśmy sekwencji impulsów Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), która tłumi sygnały makromolekuł. Wszystkie próbki surowicy w tym badaniu zostały zarejestrowane za pomocą spektrometru NMR 800 MHz wyposażonego w chłodzoną kriogenicznie głowicę odwróconej sondy TCI o średnicy 5 mm i ekranowany gradient z.

1. Umieść próbkę w magnesie. Wpisz polecenie wrpa (wspomnij numer eksperymentu) i naciśnij enter, aby skonfigurować eksperyment protonowy za pomocą programu impulsowego cpmg. Podaj imię i nazwisko pacjenta oraz inne niezbędne szczegóły, klikając opcję Tytuł.
2. Zablokuj pole magnetyczne, pisząc polecenie Zablokuj, naciśnij enter i wybierz opcję 90% H₂O i 10% D₂O dalej. Dostosuj i dopasuj sondę ręcznie za pomocą ATMM, aby zoptymalizować wydajność impulsów o częstotliwości radiowej i zmaksymalizować czułość. Wykonaj podkładkowanie gradientu 1D, klikając topshim.
3. Ustaw następujące parametry akwizycji, w tym opóźnienie relaksacji wynoszące 5 s, szerokość widmową przemiatania 12 części na milion (ppm) i czas echa wynoszący 300 μs. Wszystkie te parametry można łatwo modyfikować, wybierając opcję Parametry akwizycji w górnym panelu.
4. Zastosuj poszerzenie linii o 0,3 Hz za pomocą funkcji okna wykładniczego, zbierając dane w 64 000 punktów w ciągu 128 skanów. Parametry te można w podobny sposób modyfikować, wybierając opcję Parametry akwizycji w górnym panelu. Klikając na Acquisition Parameters, pojawi się lista specyfikacji, a wymienione atrybuty, wraz z innymi parametrami, mogą być modyfikowane podczas optymalizacji.
5. Uzyskaj widma NMR za pomocą narzędzi do przetwarzania i analizy NMR. Po uzyskaniu ostatecznych widm napisz polecenie apk i absn i naciśnij enter, aby wykonać odpowiednio korekcję fazy i korekcję linii bazowej. Kliknij opcję Kalibruj oś znajdującą się na górnym panelu, a następnie skalibruj szczyt TSP do 0 ppm automatycznie lub ręcznie.
6. Przenieś pozyskane dane z systemu na stację roboczą, gdzie odbywa się dalsza obróbka i analiza.
   UWAGA: Faza eksperymentalna została zakończona i może zostać wstrzymana. Wstępne przetwarzanie, analiza i interpretacja danych mogą być wykonywane w wygodny sposób.

4. Wstępne przetwarzanie danych

1. Przeprowadzenie wstępnego przetwarzania danych przy użyciu narzędzi do przetwarzania i analizy NMR oraz oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR.
   1. Czasami sama automatyczna korekta nie wystarcza i w takim przypadku konieczna jest również korekta ręczna. Aby ręcznie wykonać korekcję fazy, kliknij opcję Proces na górnym pasku menu narzędzi do przetwarzania i analizy NMR. Następnie kliknij Dostosuj fazę, przeciągnij myszą i obserwuj, aż widma zostaną skorygowane fazowo. Po zakończeniu kliknij opcję Zapisz i zwróć (obecną w postaci ikony) dostępną na tym samym pasku menu.
   2. Aby wykonać ręczną korekcję linii bazowej (metoda Whittakera), otwórz plik spektralny w module procesora oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR. Wybierz opcję Korekta linii bazowej. Następnie wybierz opcję Metoda Whittakera. Teraz umieść kropki u podstawy pików w całym widmie (zwykle od 0,0 do 10 ppm w przypadku surowicy lub w zależności od dostępności metabolitu w widmach), aby dostosować zasadę. Po skorygowaniu wszystkich plików spektralnych linii bazowej zapisz je w jednym folderze. Dalsze przetwarzanie, zarówno przy użyciu procesora, jak i modułu profilera oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR, można przeprowadzić przy użyciu tego samego pliku zapisanego w określonym formacie.
   3. Wykonaj kategoryzację przy użyciu modułu profilera tego samego oprogramowania. Wybierz opcję Narzędzia, następnie Proces wsadowy, a następnie Kwantowanie spektralne.
2. Aby wygenerować końcowy arkusz kategoryzacji, który ma być używany do analizy statystycznej, wybierz folder zawierający wszystkie pliki spektralne z korekcją linii bazowej po kliknięciu opcji Binning spektralny.
3. Podziel widma na określoną liczbę pojemników o równej wielkości o określonej szerokości spektralnej, w zakresie od 0,01 do 0,04 ppm (można zoptymalizować zgodnie z badaniem). Proces ten upraszcza i porządkuje dane spektralne, ułatwiając bardziej spójną analizę. Określ rozmiar zasobnika wraz z początkowymi i końcowymi wartościami ppm i wyznacz folder, w którym zostaną zapisane wyjściowe arkusze kategoryzacji.
4. Wyklucz obszary przesunięcia chemicznego odpowiadające wodzie i rozpuszczalnikowi TSP (4,8-5,2 i 0,0-0,7 ppm), aby zapobiec interferencji spektralnej^42,43,44.
5. Ten arkusz kalkulacyjny zawiera nazwy próbek w jednym wierszu oraz różne wartości przedziału wraz z ppm w pozostałych wierszach. Przed użyciem tego arkusza do analizy statystycznej należy go zmodyfikować, organizując próbki w grupy do analizy i zapisując go tylko w formacie rozdzielanym przecinkami (CSV).
   UWAGA: Na przykład, porównując grupę z łagodną grupą z umiarkowaną grupą pacjentów z ARDS, ułożyliśmy dane za pomocą etykiet łagodnych i umiarkowanych, dodaliśmy numer seryjny i zapisaliśmy plik w formacie CSV.

5. Analiza statystyczna

UWAGA: Arkusz kategoryzacji uzyskany w poprzednim kroku służy jako plik wejściowy do analizy statystycznej. W pracy wykorzystano moduł analizy statystycznej (jednoczynnikowej) oprogramowania do analizy statystycznej metabolomiki.

1. Przed analizą statystyczną wykonaj krok normalizacji przy użyciu sumy, logarytmu i Pareto, ale może się to różnić w zależności od badania⁴⁵.
2. Przeprowadzić analizę jednoczynnikową i wielowymiarową, aby rozróżnić różne grupy i określić dokładność zidentyfikowanych metabolitów.
   1. Przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA), częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (PLS-DA) i ortogonalną częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), aby zaobserwować dyskryminację między grupami dającymi zmienne znaczenie wyników projekcji (VIP) dla każdego metabolitu odpowiedzialnego za różnicę w profilu metabolicznym.
   2. Wykonaj metody jednoczynnikowe, takie jak test t Studenta i ANOVA, w celu zidentyfikowania istotnych metabolitów na podstawie kryteriów wartości p mniejszej niż 0,05. W obu badaniach uzyskano wykresy wąsów pudełkowych pokazujące różnicę we względnym stężeniu metabolitów.
   3. Wykonaj analizę biomarkerów, która daje obszar pod wykresem charakterystyki operacyjnej odbiornika (AUROC). Wartość AUC (pole pod krzywą) > 0,8 jest uważana za istotną⁴⁶.
   4. Należy wybrać ostateczną listę istotnych metabolitów, korzystając z kryteriów VIP score>1, skorygowanej o Bonferroniego wartości p<0,05⁴⁴ i AUC > 0,8⁴⁶.
3. Metabolity należy zidentyfikować w sposób opisany poniżej.
   1. Binning dostarcza istotnych metabolitów w postaci wartości ppm, a nie nazw. Zidentyfikuj metabolity odpowiadające określonym wartościom ppm, korzystając z baz danych, takich jak Bank Biologicznego Rezonansu Magnetycznego (BMRB)⁴⁷i Baza Danych Metabolomu Człowieka (HMDB).
   2. Poza tym należy użyć wcześniej opublikowanej literatury^42,44 do identyfikacji i walidacji.
   3. Użyj modułu profilera oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR, aby potwierdzić zidentyfikowane metabolity za pomocą ich wartości ppm.

6. Kwantyfikacja metabolitów za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR

UWAGA: Moduł profilera oprogramowania jest powszechnie używany do ilościowego określania zidentyfikowanych metabolitów.

1. Przed rozpoczęciem oznaczania ilościowego należy skalibrować związek referencyjny wybrany do badania (tsp użyty w tym badaniu) za pomocą modułu procesora. Kliknij opcję Kalibruj CSI (wskaźnik kształtu chemicznego). Podaj stężenie związku referencyjnego (0,05 mM dla tego badania). Następnie przeciągnij pik oprogramowania na pik odniesienia spektralnego i odpowiednio dostosuj jego wysokość i szerokość. Gdy spektralne piki odniesienia pasują do piku oprogramowania, kliknij przycisk Akceptuj.
2. Otwórz żądane widma w module profilera i wybierz odpowiednią bibliotekę związków do badania.
3. U dołu ekranu wyświetlana jest lista metabolitów. Z tej listy należy wybrać metabolit, który go interesuje. Po wybraniu, możliwe ppm wybranego metabolitu pojawi się w górnym rogu widma.
4. Wybierz wartość Ppm w górnym rogu i powiększ widma do określonej skali ppm metabolitu.
5. W tym momencie na ekranie pojawią się dwa szczyty: jeden reprezentujący zarejestrowane dane, a drugi, wyświetlany jako przerywana linia, reprezentująca pik oprogramowania. Wyrównaj oba szczyty. Przeciągnij pik oprogramowania i dostosuj jego wysokość i położenie tak, aby pasowały do piku obecnego w próbce.
6. Po prawidłowym wyrównaniu, stężenie metabolitu można uzyskać z wartości wyświetlanej pod nagłówkiem stężenie w mM dla tego metabolitu (Rysunek 1).
7. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla wszystkich metabolitów i próbek, a następnie wyeksportuj określone ilościowo wartości do arkusza kalkulacyjnego. Aby wygenerować plik wyjściowy, kliknij opcję Operacje wsadowe w menu Narzędzia. Określ żądany folder, w którym ma zostać zapisany plik wyjściowy.

7. Analiza ścieżek

UWAGA: Znaczące metabolity zidentyfikowane po analizie są wykorzystywane do określenia głównych szlaków bezpośrednio wpływających na wynik w grupach chorobowych. Do tego celu zazwyczaj wykorzystuje się moduł analizy szlaków w oprogramowaniu do analizy statystycznej metabolomiki oraz bazę danych KEGG.

1. Wprowadź do modułu uzyskaną listę istotnych metabolitów. Generowana jest lista zawierająca nazwy ścieżek.
2. Wybierz końcowe ścieżki w oparciu o kryterium współczynnika wpływu większego niż 0,1. Istotne wartości wpływu wskazują ścieżki związane z chorobą³⁰.
3. Dokładnie przeanalizuj powstałe ścieżki, aby wyjaśnić rozregulowanie związane z ciężkością choroby. Jedną z wad tej metody jest jej nieskuteczność w identyfikacji rozregulowanych szlaków, gdy istotne metabolity są mniejsze niż 3.
4. Aby sobie z tym poradzić, zidentyfikowany metabolit i jego korelację z ciężkością choroby można również określić, korzystając z wcześniej opublikowanej literatury. Przeprowadź dokładny przegląd literatury i obserwuj, czy zidentyfikowany metabolit również podąża za tym samym trendem, zgodnie z Twoim zainteresowaniem.

Rysunek 1: Podstawowe kroki w metabolomice opartej na NMR. Rysunek przedstawia kluczowe etapy metabolomiki opartej na NMR: pobieranie i przygotowywanie próbek, wykonywanie spektroskopii NMR, wstępne przetwarzanie danych, przeprowadzanie analizy statystycznej, identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów oraz interpretacja znaczenia biologicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Aby przeprowadzić badanie metabolomiczne, konieczne jest określenie wielkości próby i konkretnych grup, które będą analizowane. Wybór odpowiedniej wielkości próby jest niezbędny do uzyskania istotnych wyników, które dokładnie korelują z ciężkością choroby⁴⁸. Jednak w tej konkretnej pracy użyliśmy małej próby, aby zademonstrować etapy związane z identyfikacją i kwantyfikacją metabolitów za pomocą metabolomiki opartej na NMR, która była przeznaczona przede wszystkim jako odniesienie. W tym badaniu zbadaliśmy różnice metaboliczne między pacjentami w łagodnych i umiarkowanych stadiach ARDS w 1. dniu przyjęcia na OIOM, w tym łącznie 8 osób. Zgodnie z protokołem, widma NMR wszystkich próbek zostały pozyskane i przetworzone, a ostatecznie utworzono arkusz kalkulacyjny z wynikami kategoryzacji.

Następnie przeprowadziliśmy rygorystyczną analizę statystyczną, gdzie arkusze kategoryzacji zostały użyte jako pliki wejściowe, normalizując dane za pomocą sumy, logu i Pareto. Przeprowadziliśmy PCA (Rysunek 2A) i OPLS-DA (Rycina 2B), gdzie pierwsza wykazała grupowanie, ale druga ujawniła wyraźną dyskryminację między grupami i podkreśliła różnice metaboliczne. Analiza statystyczna testu permutacji (20x) dała wartości R2Y=0,99 i Q2=0,47. Następnie przeprowadziliśmy test t studenta (Rysunek 2C) i analizę biomarkerów (Rysunek 2D) w celu zidentyfikowania rozregulowanych metabolitów. Postępując zgodnie z kryteriami przedstawionymi w sekcji dotyczącej protokołu, przefiltrowaliśmy wyniki do istotnych metabolitów (Tabela 2).

Rysunek 2: Analiza wielowymiarowa i jednowymiarowa. (A) Analiza głównych składowych (PCA) oraz (B) Ortogonalna częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) dla pacjentów z łagodnym ARDS (reprezentowanym przez kolor czerwony) i umiarkowanym pacjentom z ARDS (reprezentowanym przez kolor zielony). (C) Wykresy pudełkowo-wąsy podkreślają różnice we względnym stężeniu metabolitów między łagodnymi i umiarkowanymi pacjentami z ARDS wykrytymi za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego protonów w próbkach surowicy. Oś x reprezentuje grupy badane, a oś y pokazuje względne stężenie, gdy pacjenci z łagodnym ARDS (reprezentowanym przez kolor czerwony) i pacjenci z umiarkowanym ARDS (reprezentowanym przez kolor zielony) zostali porównani w 1. dniu przyjęcia na OIOM. (D) Wykres pola pod krzywą (AUC) istotnych metabolitów przewidujących nasilenie uzyskany po przeprowadzeniu analizy biomarkerów porównującej pacjentów z łagodnym i umiarkowanym ARDS w 1. dniu przyjęcia na OIT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.

S.No.	nazwa	Lokalizacja spektralna (ppm)	Wartość p	VIP	Wartość AUC
1	mleczan	Klasa 1,34	0,04	1,99	1
cyfra arabska	izoleucyna	Rejon 1,42	0,03	Pozycja 2.01	0,875

Tabela 2: Lista istotnych metabolitów uzyskanych po porównaniu łagodnych i umiarkowanych pacjentów z ARDS w 1. dniu przyjęcia na OIOM.

Ponieważ wyniki uzyskano w wartościach ppm, przypisaliśmy metabolity za pomocą poprzedniej literatury i zweryfikowaliśmy je za pomocą profilera. Po przypisaniu mleczan i izoleucyna zostały uzyskane jako znaczące metabolity, które zostały również zgłoszone w niektórych poprzednich badaniach ARDS^30,40. Zadbaliśmy o wybór dobrze rozdzielonych, nienakładających się na siebie szczytów. Po zidentyfikowaniu przefiltrowaliśmy listę istotnych metabolitów przy użyciu kryteriów wymienionych w protokole. Następnie określiliśmy ilościowo interesujące nas metabolity za pomocą modułu profilera, otwierając widma, wyszukując interesujący metabolit i dopasowując pik oprogramowania do piku uzyskanego w widmach. W ten sposób uzyskano określone ilościowo wartości metabolitów w mM. Arkusz kalkulacyjny zawierający nazwy próbek, nazwy metabolitów i stężenia został wygenerowany w celach informacyjnych. Po kwantyfikacji za pomocą oprogramowania można przeprowadzić walidację za pomocą innych metod, takich jak proteomika.

Ponadto, zidentyfikowane metabolity są dokładnie analizowane, aby określić ich korelację z ciężkością choroby i zidentyfikować szlaki biochemiczne, w których te metabolity są aktywnie zaangażowane. Ze względu na to, że po zastosowaniu kryteriów wymienionych w rozdziale poświęconym materiałom i metodom zidentyfikowano tylko dwa istotne metabolity, analiza szlaku przy użyciu oprogramowania nie była możliwa. W związku z tym przeprowadzono dokładny przegląd literatury, aby zwrócić uwagę na zaburzone cykle metaboliczne. Dwa metabolity zidentyfikowane w tym badaniu z powodzeniem korelowały z nasileniem ARDS. Zwiększony poziom mleczanu oznaczał zapalenie płuc i oddychanie beztlenowe, podczas gdy wzrost izoleucyny wskazywał na katabolizm białek związany z uszkodzeniem płuc, infekcją i metabolizmem energetycznym⁴⁰. Zrozumienie tych szlaków metabolicznych służy dwóm celom. Po pierwsze, ujawnia złożoność choroby, dostarczając wglądu w jej mechanizmy biologiczne. Po drugie, wspomaga postęp terapeutyczny, pomagając klinicystom w dostosowywaniu leczenia do pacjentów, co ostatecznie poprawia wyniki kliniczne.

Discussion

Metabolomika skutecznie identyfikuje i określa ilościowo metabolity, celując w cykle metaboliczne, które ulegają zaburzeniom podczas choroby. Jakość wyników zależy od skrupulatnego wykonania każdego kroku w podejściu metabolomicznym. Każdy etap, od wyboru i pobrania próbki po identyfikację szlaku, ma kluczowe znaczenie dla dokładnej identyfikacji głównych czynników przyczyniających się do choroby. Przed wykonaniem metabolomiki niezbędny jest dokładny przegląd literatury i należy zwrócić szczególną uwagę na każdym etapie.

Projektując badanie metabolomiczne, wybór próbki ma kluczowe znaczenie dla wydobycia istotnych informacji i zapewnienia idealnego przygotowania próbki, niezależnie od tego, czy chodzi o ukierunkowane, czy nieukierunkowane metaboliczne odciski palców danego stanu klinicznego. Właściwe wstępne przetwarzanie próbki ma kluczowe znaczenie, a protokoły powinny być konsekwentnie przestrzegane dla wszystkich próbek przez cały czas trwania badania⁴⁹. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z próbkami klinicznymi. Powszechnie stosowane próbki do metabolomiki opartej na NMR obejmują płyny biologiczne, ekstrakty komórkowe i ekstrakty tkankowe ^50,51. Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i mocz często wymagają minimalnego leczenia wstępnego i są często badane w takich kontekstach, jak dolegliwości związane z nerkami, choroby neurodegeneracyjne i toksyczność leków. Krew pełna, osocze i surowica dostarczają wyczerpujących informacji na temat szerokiego spektrum krytycznych chorób i są preferowane ze względu na łatwość pobierania. Szeroka gama innych płynów biologicznych, takich jak płyn nasienny, ślina, żółć, płyn dializacyjny, płyn owodniowy, kondensat wydychanego oddechu, aspiraty płucne, płyn maziowy i mini płyn do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (mBALF), były szeroko stosowane ze względu na ich specyficzność i dokładność przy użyciu NMR 52,53,54. Każdy biopłyn przedstawia swoje zalety i wyzwania związane z gromadzeniem, dostępnością i zawartością informacyjną, w zależności od projektu badania lub eksperymentu⁵⁵. W tym badaniu skupiliśmy się na próbkach surowicy pacjentów z ARDS, ponieważ próbki krwi zazwyczaj dostarczają informacji na poziomie całego ciała i nie mają na nie znaczącego wpływu ekstremalne dzienne wahania. Z drugiej strony, próbki moczu podlegają różnym wahaniom i mogą na nie wpływać dieta, styl życia, leki i czynniki środowiskowe²⁷. Właściwe przechowywanie próbki jest również ważne, aby uniknąć aktywności enzymatycznej lub degradacji mikrobiologicznej. Próbki są zazwyczaj kriokonserwowane w temperaturze -80 °C z minimalnymi cyklami zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec rozpadowi metabolicznemu i utrzymać stabilność próbki. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas, co pozwala na wygodne przeprowadzanie eksperymentów NMR. Jednak zaplanowanie i przeprowadzenie eksperymentu tak szybko, jak to możliwe, jest wskazane w celu uzyskania optymalnych wyników.

W tym badaniu użyliśmy spektrometru NMR 800 MHz do akwizycji danych, który zapewnia dane spektralne o wysokiej rozdzielczości. W tym eksperymencie zastosowaliśmy te same parametry akwizycji, o których mowa powyżej. Należy jednak zauważyć, że te same parametry akwizycji określone w tym protokole można zastosować przy użyciu spektrometrów NMR działających przy innych natężeniach pola magnetycznego. Liczba skanów można zwiększyć podczas pracy przy niższym polu magnetycznym, aby poprawić rozdzielczość. Podczas gdy wyższe natężenie pola może zapewnić lepszą rozdzielczość, podstawowe aspekty procesu akwizycji, takie jak sekwencje impulsów, opóźnienia relaksacji i kontrola temperatury, pozostają spójne w różnych instrumentach, zapewniając odtwarzalność i wiarygodność wyników.

Przestrzeganie ustandaryzowanej procedury jest niezbędne do utrzymania odtwarzalności i bezstronności, ponieważ odchylenia mogą utrudniać późniejszą analizę i ocenę danych. Każdy etap eksperymentowania z NMR musi być wykonany skrupulatnie, ponieważ od niego zależy jakość widm. Szczególną uwagę należy zwrócić na podkładkowanie, ponieważ określa ono kształt piku, a parametry akwizycji powinny być zoptymalizowane zgodnie z próbką i projektem badania. W przypadku próbek o niskim stężeniu metabolicznym w próbce można zwiększyć liczbę skanów. Akwizycja danych w NMR obejmuje standardową optymalizację eksperymentów zarówno 1D, jak i 2D dostosowanych do wyboru próbki i konkretnych wymaganych informacji. Różne eksperymenty NMR zostały zoptymalizowane w celu uzyskania wysokiej jakości widm z biopłynów, minimalizując wpływ niepożądanych makrocząsteczek. Sekwencja impulsów CPMG⁵⁶ jest preferowana w przypadku próbek takich jak surowica, osocze lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Technika ta tłumi szerokie sygnały z makrocząsteczek, takich jak lipidy i białka, które mają długie czasy relaksacji poprzecznej i mogą zaciemniać rezonanse metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej.

Wstępne przetwarzanie danych obejmuje metody pośrednie stosowane w celu zapewnienia jednolitej i jednorodnej analizy danych oraz ich interpretacji. Proces ten obejmuje unikanie niepożądanych sygnałów lub obszarów widmowych podatnych na niespójności i korygowanie przesunięć pików. W przypadku płynów biologicznych wykluczenie niepożądanych obszarów często oznacza usunięcie sygnałów, takich jak te z wody, które dominują w zakresie od 4,6 ppm do 5 ppm. Przesunięcia szczytowe, spowodowane zmianami pH, temperatury, stężenia soli, czynników rozcieńczenia i składu jonowego, można zminimalizować poprzez zastosowanie o homeostatycznym pH. Ponadto zastosowanie standardowych związków odniesienia, wyrównanie pików i kategoryzowanie może pomóc w zmniejszeniu przesunięć pików. Wyrównanie pików ma kluczowe znaczenie dla skorelowania wzorców w różnych widmach uzyskanych w identycznych warunkach.

Przetwarzanie widm musi być wykonane prawidłowo, aby zapewnić dokładne binowanie w dalszej części analizy. Wszystkie widma powinny być skalibrowane i wyrównane równomiernie, a korekcje zasady i fazy mogą być wykonywane ręcznie lub automatycznie. Właściwa korekcja fazy i zasady, a także kalibracja, mają kluczowe znaczenie. Przeprowadzenie korekty wartości wyjściowej jest niezbędne do uniknięcia zniekształceń, które mogą mieć wpływ na identyfikację i kwantyfikację metabolitów⁵⁷. Korekcja fazy jest konieczna, aby zapewnić, że żadne zniekształcone lub odwrócone piki nie mogą wpływać na interpretację wyników. Ostrożnie zdecyduj o kryteriach wyboru istotnych metabolitów i odpowiednio przefiltruj wyniki. Ponieważ kategoryzacja dostarcza wyników w postaci wartości ppm, należy dokładnie zidentyfikować nazwę metabolitu, korzystając z różnych źródeł wymienionych w protokole. Jeśli wiele metabolitów jest obecnych przy tych samych wartościach ppm, należy je zidentyfikować na podstawie kształtu piku.

Przed wykonaniem analizy statystycznej przeprowadza się normalizację w celu zmniejszenia zmian w zbiorze danych, niezależnie od tego, czy są indukowane, czy nie, ze względu na różnice w wielkości i wahania stężeń metabolitów. Proces ten obejmuje różne metody centrowania, skalowania i transformacji, wybierane na podstawie rozkładu i zmienności danych. Celem jest zminimalizowanie niepożądanych systematycznych uprzedzeń przy jednoczesnym zachowaniu interesujących czynników biologicznych. Metody wieloczynnikowe, w tym PCA, PLS-DA i OPLS-DA, są stosowane do ustalania metabolitów różnicowych o wartościach VIP większych niż 1. Przewidywalność modelu i walidacja krzyżowa są określane przy użyciu wartości R2 (dobroć dopasowania) i Q2 (dobroć przewidywania), podczas gdy statystyki testów permutacji weryfikują model. Mapa cieplna oparta na korelacji Pearsona ocenia solidność modelu poprzez wyliczenie metabolitów regulowanych w górę i w dół w subfenotypach i wynikowych endotypach.

Metody jednowymiarowe, takie jak test t-Studenta i ANOVA, takie jak poprawka Bonferroniego lub minimalizacja FDR (wskaźnika fałszywych odkryć) i Benjaminiego-Hochberga, są stosowane w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa wyników fałszywie dodatnich. Metody te zapewniają przybliżony pomiar potencjalnie ważnych cech niezależnie od ich korelacji w obrębie cząsteczek lub między nimi a innymi czynnikami zakłócającymi. Istotne metabolity są identyfikowane na podstawie wartości p mniejszej niż 0,05, które są następnie wykorzystywane do uzasadnienia endotypów metabolicznych w podgrupach końcowych⁴⁵.

Indywidualne wykresy wąsów pudełkowych i AUROC są wykorzystywane do oceny swoistości i wrażliwości endotypów w podgrupach wynikowych. Wynik kliniczny jest łączony z modelem w AUROC w celu walidacji dokładności modelu. Wartość AUC > 0,8 jest uważana za znaczącą⁴⁶. W internecie dostępne są różne inne testy służące do sprawdzenia dokładności rozróżniania i skuteczności zidentyfikowanych metabolitów. Niektóre z nich to losowa klasyfikacja lasów, mapa cieplna, korelacja ^itp.45.

Do ilościowego określenia znaczących metabolitów stosuje się różne podejścia, w tym integrację pików, która może być wyzwaniem dla początkujących ze względu na ich zaawansowany charakter. Identyfikacja charakterystycznych pików metabolitów poprzez odniesienie do indywidualnych zmian chemicznych w celu precyzyjnej identyfikacji. Określić obszar tych charakterystycznych pików w stosunku do obszaru piku odniesienia, TSP. Aby obliczyć bezwzględne stężenie metabolitu (Cm), należy użyć następującego równania:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Gdzie Cr jest stężeniem związku odniesienia (TSP) w roztworze, Im i Ir są zintegrowanymi obszarami pików (można je uzyskać za pomocą narzędzia do przetwarzania i analizy NMR) odpowiednio metabolitu i odniesienia (TSP), a nm i nr są liczbą protonów reprezentujących odpowiednio metabolit i piki odniesienia²⁴.

Alternatywnie, do uzyskania stężeń metabolitów dla pojedynczych lub wielokrotnych widm w oparciu o stężenie wzorca referencyjnego, TSP, stosuje się zautomatyzowane oprogramowanie do oznaczania ilościowego metabolitów NMR. Oznaczanie ilościowe za pomocą oprogramowania upraszcza proces i zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia błędów w porównaniu z innymi metodami. Chociaż w tym artykule badawczym podkreślono wykorzystanie oprogramowania do ilościowej oceny metabolitów, mogą wystąpić problemy, jeśli metabolit będący przedmiotem zainteresowania nie jest obecny w bibliotece oprogramowania. Dodatkowo oprogramowanie jest płatne, więc mogą z niego korzystać tylko badacze posiadający autoryzowaną licencję.

Metabolomika okazała się pomocna w odkrywaniu złożoności różnych chorób poprzez identyfikację rozregulowanych cykli metabolicznych przyczyniających się do nasilenia choroby. Jednak przełożenie tych wyników na praktykę kliniczną było wyzwaniem. Społeczność medyczna kładzie obecnie nacisk na podejście medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników choroby. Podczas gdy identyfikacja rozregulowanych metabolitów była wcześniej wystarczająca, obecne wysiłki koncentrują się na precyzyjnej kwantyfikacji w celu zdefiniowania zakresów specyficznych dla choroby. Informacje te są nieocenione dla klinicystów w dostosowywaniu strategii leczenia. Postęp w technikach kwantyfikacji ułatwił wysiłki badawcze, a liczne grupy badawcze na całym świecie z powodzeniem stosują te podejścia przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.

Postęp ten podkreśla potencjał metabolomiki w zakresie znaczącego wpływu na medycynę spersonalizowaną i poprawy wyników klinicznych. Co więcej, integracja danych metabolomicznych z innymi danymi omicznymi, takimi jak genomika i proteomika, może zapewnić bardziej kompleksowe zrozumienie mechanizmów choroby i dalsze udoskonalenie interwencji terapeutycznych. Oczekuje się, że wraz z rozwojem technologii precyzja i użyteczność metabolomiki w warunkach klinicznych wzrośnie, torując drogę do bardziej skutecznych i spersonalizowanych rozwiązań w zakresie opieki zdrowotnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Kanada		Oprogramowanie do kwantyfikacji metabolitów NMR
Wkładka współosiowa	Sigma aldrich	Z278513
Tlenek deuteru	Probówki Sigma aldrich	151882
Eppendorf Tarsons		500020
Metaboanalyst	Grupa		Oprogramowanie do analizy statystycznej metabolomiki
Rurka NMR	Wilmad	Z412007	średnicy 5mm
Pipeta	Eppendorf research plus	3123000039	0-100 μ l
Fiolki do pobierania próbek	Fiolki kriogeniczne Tarsons	523194
Azydek sodu	Sigma aldrich	S2002
Kryształ chlorku sodu	Sigma aldrich	S9625
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma aldrich	567550
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Narzędzie do przetwarzania i analizy NMR	Bruker
Sól Sigma	aldrich	269913