Artykuł metodologiczny

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

DOI:

10.3791/67321

⸱

18 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histony przechodzą różne modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak metylacja, acetylacja, fosforylacja, acylacja i ubikwitynacja, które kontrolują dynamikę nukleosomów i determinują los komórki. Nukleosom, który jest jednostką funkcjonalną chromatyny, składa się z DNA, czterech par histonów (H3, H4, H2A i H2B) tworzących jądro kuliste oraz łącznika histonu H1, który stabilizuje strukturę chromatyny. Ogony aminowe (N)-końcowe histonów wystają z domen jądra kulistego i przechodzą wyraźne PTM, które wpływają na krajobraz chromatyny. Niektóre dowody sugerują, że homeostaza histonów PTM ma kluczowe znaczenie dla zachowania wszystkich czynności fizjologicznych. Deregulacja histonów PTM jest główną przyczyną nieprawidłowej proliferacji, inwazji i przerzutów komórkowych. Dlatego kluczowe znaczenie ma opracowanie metod charakteryzowania histonów PTM. W tym miejscu opisujemy skuteczną technikę izolowania i analizowania izoform histonów. Metoda, oparta na połączeniu dwóch ortogonalnych separacji, pozwala na wzbogacenie izoform histonów i późniejszą identyfikację za pomocą spektrometrii mas. Technika, pierwotnie opisana przez Shechtera i wsp., łączy żele poliakryloamidowe kwasowo-mocznikowe (TAU-GEL), które mogą oddzielać podstawowe białka histonowe na podstawie wielkości i ładunku, oraz żele poliakryloamidosiarczanu sodu (SDS-PAGE), które mogą oddzielać białka według masy cząsteczkowej. Rezultatem jest dwuwymiarowa mapa izoform histonów, nadająca się do trawienia w żelu, a następnie identyfikacji za pomocą spektrometrii mas i analizy western blot. Rezultatem jest dwuwymiarowa mapa izoform histonów, odpowiednia zarówno do trawienia w żelu, jak i identyfikacji za pomocą spektrometrii mas i analizy western blot. To podejście proteomiczne jest solidną metodą, która pozwala na wzbogacenie pojedynczej izoformy histonu i scharakteryzowanie nowych histonów PTM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początek, progresja i chemooporność raka są związane ze zdarzeniami genetycznymi i epigenetycznymi, w tym z histonami PTM. Histony przechodzą różne PTM, które regulują dynamikę chromatyny i decydują o losie komórki1.

Nukleosom jest jednostką funkcjonalną chromatyny i jest molekularnym kompleksem DNA i białek, który pozwala na upakowanie DNA w jądrze. Składa się z czterech par histonów (H3, H4, H2A i H2B), które tworzą rdzeń nukleosomu, a także histon łącznikowy H1, który pomaga ustabilizować strukturę chromatyny. Ogony aminowe (N)-końcowe histonów wystają ze swoich globularnych domen rdzeniowych i podlegają specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym, które wpływają na krajobraz chromatyny2.

Do tej pory znane są co najmniej 23 klasy histonów PTM. Te PTM są kowalencyjnymi modyfikacjami, które składają się głównie z metylacji, acetylacji, fosforylacji, glikozylacji, ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji3. Ponadto niedawno zaproponowano ścisłą korelację między homeostazą epigenomu a ponownym okablowaniem metabolicznym, co wyjaśnia wykładniczy wzrost możliwej liczby histonów PTMs4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Histony PTM, zdeponowane, wymazane i transdukowane przez enzymy modyfikujące, są nazywane odpowiednio jako pisarze, gumki i czytniki. Wpływają one na właściwości fizyczne i chemiczne struktury chromatyny, wpływając na profil ekspresji genów, w tym na ekspresję genów supresorowych nowotworów i onkogenów14,15,16.

Liczba proteoform histonów wzrasta po włączeniu do nukleosomu jako warianty histonów. Warianty te są nieallelicznymi izoformami kanonicznych histonów i zwiększają złożoność poprzez zmianę chemicznych i fizycznych właściwości chromatyny. W porównaniu z histonami kanonicznymi, warianty histonów mają domeny funkcjonalne, które ulegają unikalnym modyfikacjom potranslacyjnym lub oddziałują z określonymi składnikami chromatyny, wpływając na dynamikę i stabilność nukleosomu17.

W komórkach nowotworowych deregulacja PTM i wariantów histonów wpływa na profil ekspresji genów, prowadząc do nieprawidłowej proliferacji komórek, inwazji, przerzutów i aktywacji szlaków oporności na leki3,18,19,20. Mutacje w histonach lub kompleksach przebudowujących chromatynę mogą zmieniać fenotyp komórki, przyczyniając się do transformacji nowotworowej. Nagromadzenie zmian epigenetycznych, takich jak metylacja histonów, jest kluczowym czynnikiem aktywującym szlaki oporności na leki21,22,23. Mutacje w obrębie kompleksu SWI/SNF, który składa się z 15 podjednostek kodowanych przez 29 genów, wpływają na ponad 20% nowotworów u ludzi w wielu typach nowotworów. W ciągu ostatniej dekady opracowano epigenetyczne strategie leków (epi-leki), a wiele leków ukierunkowanych na raka z nieprawidłowymi wzorcami modyfikacji histonów zostało zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA)23.

Analiza białek histonowych jest dość wymagająca, co czyni ją wymagającym obszarem badań. Ostatnio metody spektrometrii mas stały się preferowanym sposobem charakteryzowania i badania proteoform histonów. Jednak drastyczne warunki ekstrakcji, w połączeniu ze słabą rozpuszczalnością niektórych wariantów i wysoką homologią sekwencji, sprawiają, że ich analiza jest trudna.

W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka metod opartych na spektrometrii mas do profilowania i badania histonów24,25,26,27. W niniejszej pracy przedstawiamy opłacalną i wiarygodną metodę tworzenia dwuwymiarowej mapy proteoform histonowych, która może zwiększyć szanse na odkrycie nowych modyfikacji potranslacyjnych.

2D Elektroforeza TAU łączy separację w warunkach kwaśnych z SDS PAGE. W pierwszym wymiarze kwaśny stan pożywki nadaje dodatni ładunek netto białkom zasadowym. Ponieważ histony są bardzo podstawowymi białkami i mają wyższy punkt izoelektryczny (pH) w porównaniu z podłożem, stają się naładowane dodatnio i migrują pod wpływem pola elektrycznego. W drugim wymiarze histony są denaturowane przez SDS i rozdzielane na podstawie ich masy cząsteczkowej. Uzyskana mapa 2D może być wykorzystana jako narzędzie do wzbogacania określonych proteoform w rozdzielczości pojedynczej plamki do analizy spektrometrii mas i badań immunologicznych28,29. Po elektroforezie plamki 2D TAU można odbarwić, trawić trypsyną i analizować za pomocą spektrometrii mas. Alternatywnie, mapę 2D TAU można nanieść na filtr nitrocelulozy/PVDF i zbadać za pomocą immunostainingu27.

W tym kontekście, metody te mogą być strategiczne dla poprawy identyfikacji i analizy nowych modyfikacji potranslacyjnych skorelowanych z przemianami metabolicznymi30,31.

Ulepszyliśmy oryginalną metodę, wprowadzając etap sonikacji, który jest pomocny w degradacji DNA i poprawie rozpuszczalności białek. Dodatkowo wydłużyliśmy etap inkubacji do ekstrakcji histonów, w celu uzyskania próbki białka o wysokiej czystości. Co więcej, w naszym protokole uruchomiliśmy pierwszy wymiar przy niskim napięciu przez dłuższy czas, aby osiągnąć lepszą rozdzielczość. Otrzymany żel wykorzystano do zbadania kanonicznych histonów PTM i scharakteryzowania nowych modyfikacji, takich jak glikacja10,32.

Ogólnie rzecz biorąc, opracowaliśmy metodę ekstrakcji i oczyszczania histonów, a następnie rozdzielczość proteoform histonów za pomocą dwuwymiarowej mapy. Praca obejmuje również procedurę trawienia w żelu do analizy spektrometrii mas oraz etapy dwuwymiarowej analizy western blot.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja histonów

  1. Wykonaj ekstrakcję histonów z co najmniej 1 x 106 komórek, które w 80% się zlewają. W tym eksperymencie użyliśmy linii komórkowych MCF-10A z ATCC. Po posianiu przemyć komórki trzykrotnie 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Wykonaj wszystkie kroki na lodzie.
  2. Przygotuj bufor do lizy komórek zawierający 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KCl i 1,5 mM MgCl2. Dodać 1 mM ditioerytrytolu oraz inhibitory proteazy i fosfatazy tuż przed użyciem.
  3. Dodać 800 μl buforu do lizy komórek na płytkę Petriego zawierającą komórki, zeskrobać i zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubować na rotatorze przy 300 obr./min, 4 °C przez 1 godzinę.
  4. Wirować w temperaturze 10 000 x g, 4 °C, przez 10 minut we wstępnie schłodzonej mikrowirówce z rotatorem do probówek o pojemności 1,5 ml.
  5. Przepłukać osad 400 μl buforu do lizy komórek i odwirować w temperaturze 10 000 x g, 4 °C, przez 10 minut. Wyrzucić supernatant. Powtórz krok prania 3x.
    UWAGA: Do wszystkich etapów należy użyć wstępnie schłodzonej mikrowirówki (4 °C) z rotatorem do probówek o pojemności 1.5 ml. Z granulatem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć utraty materiału.
  6. Zawiesić osad w 640 μl 0,2 M H2SO4 i inkubować na rotatorze przy 300 obr./min, w temperaturze 4 °C, przez 16 h.
    UWAGA: Kwas siarkowy jest niebezpieczną substancją chemiczną; Proszę używać go pod wyciągiem chemicznym.
  7. Wirować w temperaturze 16 000 x g, 4 °C, przez 10 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać go do następnych kroków. Wyrzuć szczątki nuklearne.
  8. Wytrącić histony, dodając 212 μl kwasu trichlorooctowego, kropla po kropli (końcowe stężenie TCA wynosi 33%). Wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 10 razy. Inkubować na lodzie, w ciemności, przez 16 godz.
    UWAGA: TCA jest niebezpieczną substancją chemiczną; Stosować pod wyciągiem chemicznym.
  9. Osady histonów należy rozdrabniać przez wirowanie we wstępnie schłodzonej wirówce o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć osad 3x 200 μl zimnego acetonu.
  10. Ponownie zawiesić osad zimnym acetonem, a następnie 2x sonikować o dużej mocy w 3 cyklach po 30 s włączania/wyłączania, na przemian z 10-minutową przerwą na lodzie.
    UWAGA: Zabieg został wykonany przy użyciu ultradźwięków. Ten krok jest niezbędny do wyeliminowania DNA owiniętego histonami.
  11. Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut, wyrzucić aceton i ponownie zawiesić próbkę w 100 μl podwójnie destylowanej wody. Oznaczyć stężenie białka za pomocą metody testu Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta33.
    UWAGA: Po odwirowaniu osad czasami wydaje się biały lub półprzezroczysty. Biały i nieprzezroczysty osad może wskazywać na obecność zanieczyszczeń solą, które mogą zakłócić separację 2D. Jeśli tak, powtarzaj etapy prania acetonem, aż granulka stanie się przezroczysta.
  12. Liofilizować 70 μg histonów, zgodnie z instrukcjami producenta. Ustawić liofilizator w temperaturze 30 °C na 60 min. Sprawdzić objętość probówki i powtórzyć ten krok w temperaturze 30 °C, aż próbka zostanie całkowicie zliofilizowana (zazwyczaj do całkowitej liofilizacji próbki potrzeba 90 minut). Po 60 minutach sprawdzaj objętość co 10 minut, ponieważ proces jest zależny od próbki.
    UWAGA: Jeśli ilość białek histonowych jest niska, zacznij od 2 x 106 komórek. W takim przypadku użyj tej samej objętości odczynników, co dla 1 x 106 komórek. Sprawdź czystość wszystkich substancji chemicznych użytych podczas zabiegu; wszystkie odczynniki muszą być klasy HPLC.

2. Mini elektroforeza 2D żelowa trytonowo-kwasowo-mocznikowa (TAU)

  1. Przygotuj żel mini-TAU do mini pionowego systemu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, jak opisano poniżej.
    1. Przygotować żel separacyjny: 6 M mocznik, 15% akrylamid/bisakryloamid (29:1), 5% kwas octowy lodowcowy, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Aby przygotować roztwór, rozpuścić mocznik w akrylamidzie/bisie i 1 ml ultraczystej wody, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej; Dodaj pozostałe składniki i dostosuj głośność. Aby uzyskać żel mini-TAU, przygotuj 10 ml roztworu. Napełnij wstępnie ustawione płytki żelowe roztworem, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza zaledwie 1,5 cm od góry. Przykryj roztwór 1 ml izopropanolu, aby wyrównać żel.
    2. Przygotuj żel do układania: 6 M mocznika, 6% akrylamid/bisakryloamid (29:1), 5% kwas octowy lodowcowy, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Aby przygotować roztwór, rozpuścić mocznik w akrylamidzie/bisie i 1 ml ultraczystej wody; Dodaj pozostałe składniki i dostosuj głośność. Napełnij płytki żelowe roztworem do układania w stosy, umieść 10-dołkowy grzebień żelowy między płytkami i włóż go, aż roztwór żelu znajdzie się w połowie wysokości zębów grzebienia. Pozostawić żel do polimeryzacji przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ostrożnie włóż grzebień, aby zapewnić regularne formowanie studzienek.
  2. Przygotować 100 μl buforu do próbek TAU, rozpuszczając 6 M mocznika, 5% kwasu octowego i podwójnie destylowaną wodę. Tak przygotowaną liofilizowaną próbkę rozpuścić w 30 μl buforu do próbek TAU.
  3. Napełnij mini kasetę buforem do pracy TAU, 5% kwasem octowym o końcowym stężeniu. Przepłukać dołki żelu TAU strzykawką wypełnioną działającym buforem i załadować próbkę do studzienki za pomocą mikropipety.
  4. Podłącz komorę elektroforetyczną do zasilania, tak aby elektroda dodatnia (czerwona) znajdowała się na dole. Zwróć uwagę, gdy IP > pH, białka są naładowane dodatnio, więc migracja odbywa się od elektrody dodatniej do ujemnej. Uruchom żel najpierw pod napięciem 30 V przez 70 minut, a następnie przy stałym napięciu 25 V przez 17 h.
    UWAGA: W tym czasie od czasu do czasu wyłączaj zasilanie i przepłucz studzienki żelu za pomocą jednorazowej strzykawki. Zwrócić uwagę na usunięcie wszelkich pęcherzyków z dolnej powierzchni żelu za pomocą strzykawki, aby uniknąć utraty próbki i obecności rozmazywania się w rozwiązanych białkach.
  5. Usuń żel z płytek żelowych i przetnij interesującą Cię linię czystym skalpelem. Z żelem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć jego pękania. Ponieważ linia zainteresowania jest bezbarwna, załaduj próbkę do studzienki numer 1, aby dokładnie zidentyfikować i przeciąć interesujący nas pas.
    UWAGA: Aby sprawdzić separację na żelu mini-TAU, należy przygotować i uruchomić próbkę w dwóch egzemplarzach. Jeden z tych żeli można zabarwić za pomocą Coomassie Brilliant Blue. Wzorzec separacji jest opisany w Rysunek 1A.
  6. Umyj tor 15 ml 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 przez 15 minut.
  7. Przygotuj 15 ml buforu równowagowego 1, używając 6 M mocznika, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glicerolu, 20% SDS i 2% ditioerytrytolu. Przygotuj 15 ml buforu równowagowego 2, używając 6 M mocznika, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glicerolu, 20% SDS i 2% jodoacetamidu. Przygotować bufor równowagi 1 i 2 tuż przed użyciem; Przechowuj bufor równowagi 2 w ciemności.
  8. Inkubować pas żelowy, pod delikatnym mieszaniem, w 10 ml buforu równoważącego 1 przez 15 minut, a następnie zdekantować. Inkubować pas żelowy, pod delikatnym mieszaniem, z 10 ml buforu równowagowego 2 przez 15 minut w ciemności, a następnie zdekantować.
  9. Przygotować rozdzielczy żel akryloamidowy SDS 15%, postępując zgodnie z Tabelą 1. Ustaw płytkę żelową i napełnij ją rozdzielczym roztworem żelu. Napełnij roztwór, aż znajdzie się 1,5 cm od końca długiej płytki żelowej. Umieść 1 ml izopropanolu na powierzchni, aby wyrównać żel i pozwolić mu spolimeryzować.
  10. Po polimeryzacji żelu zdekantować izopropanol i wysuszyć studzienkę bibułą chromatograficzną 3MM Chr. Włóż powstały pas z kroku 8 do dołka żelu.
  11. Uszczelnij tor do żelu rozdzielczego roztworem uszczelniającym zawierającym 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x buforze Tris/glicyna/SDS i 5 μl 0,003% błękitu bromofenolowego. Pozostawić polimeryzację w żelu agarozowym przez 30 min.
    UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas uszczelniania agarozy, aby zapobiec rozmazywaniu się żelu.
  12. Umieść płytki żelowe w kasecie i napełnij 1x buforem Tris/glicyna/SDS. Uruchom żel pod napięciem 120 V, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna. Delikatnie usuń żel z płytek, wyrzuć nadmiar agarozy i zabarwij żel srebrem, stosując procedurę zgodną ze spektrometrią mas lub blot do testu immunologicznego.

3. Barwienie srebra 32

  1. Przygotuj następujące odczynniki - Utrwalacz: 50% metanolu, 5% kwasu octowego, 45% wody dejonizowanej; Roztwór do mycia: 50% metanolu, 50% wody dejonizowanej; Substancja uczulająca: 0,02% Na2S2O3 5H2O w wodzie dejonizowanej; Odczynnik srebra: 0,1% azotan srebra w zimnej (4°C) wodzie dejonizowanej; Wywoływacz: 0,04% formaliny i 2% Na2CO3, formaldehyd (37%) (dodać tuż przed użyciem) 0,4 ml wody dejonizowanej i napełnić do 1000 ml; Odczynnik stop: 5% kwas octowy; Roztwór do przechowywania żelu: 1% kwas octowy.
    UWAGA: Ponieważ chemikalia używane do barwienia są niebezpieczne, wszystkie czynności należy wykonać pod wyciągiem chemicznym.
  2. Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w tabeli 2, biorąc pod uwagę następujące kwestie. Wszystkie inkubacje wykonuj z delikatnym mieszaniem. Przygotować odczynnik zatrzymujący przed rozpoczęciem etapu wywoływania; Zapewni to opracowanie żelu o odpowiedniej intensywności. Podczas etapu rozwoju plamy pojawią się jako żółte sygnały, które pod koniec inkubacji staną się jasnobrązowe. Intensywność różnych plam będzie zależeć od ilości proteoform histonowych. Żel jest gotowy do punktowego wycięcia i trawienia w żelu (Rysunek 1B)

4. Trawienie w żelu

  1. Przygotować następujące roztwory: 50 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3)/50% (v/v) acetonitrylu; 10 mM ditiotreitol (DTT) w 50 mM NH4HCO3; 55 mM jodoacetamid (IAA) w 50 mM NH4HCO3; 0,1% TFA; 50 mM NH4HCO3, pH 8; Acetonitryl klasy HPLC; 1 ml probówki silikonowe.
    UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia ludzką keratyną z włosów lub skóry, używaj czystych rękawic i pracuj w czystym miejscu.
  2. Wytnij interesujące miejsca histonów z barwionego żelu za pomocą czystego skalpela i umieść je w świeżej silikonowej probówce (1,5 ml). Uważaj, aby wyciąć jedno miejsce i umieścić je w jednej tubie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego izoformą.
  3. Do każdego miejsca żelu dodać 250 μl 50 mM NH4HCO3/50% acetonitrylu i inkubować pod delikatnym mieszaniem w termomikserze w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór i powtórzyć ten krok 3 razy. Kawałki żelu będą przezroczyste.
  4. Odwodnić plamy żelu, dodając acetonitryl (200 μl). Na tym etapie kawałki żelu przyjmą nieprzezroczysty biały kolor.
  5. Zdekantować acetonitryl i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Kawałek żelu będzie wyglądał na wysuszony w tubce. Redukcja i alkilacja nie są konieczne, ponieważ białka histonowe zostały zredukowane i alkilowane na etapie równoważenia.
  6. Uwodnić plamki żelu w 20 μl roztworu trypsyny (0,1 mM HCl) lub objętości wystarczającej do pokrycia kawałków żelu. Umieścić probówki w termomikserze i inkubować, pod delikatnym mieszaniem, w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny do godziny 16 godzin.
  7. Przenieść supernatant zawierający peptydy tryptyczne do świeżej probówki. Dodać 50 μl roztworu ekstrakcyjnego (60% acetonitrylu, 1% TFA) do kawałków żelu i sonikować 2x w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przenieść supernatant zawierający dodatkowe peptydy tryptyczne do świeżej probówki. Użyj liofilizatora, aby wysuszyć zebrane wyekstrahowane peptydy. Ustawić liofilizator na 30 °C i wysuszyć roztwór; W probówce pojawi się liofilizowany osad.
    UWAGA: Ten krok jest zależny od woluminu; Generalnie wystarczy 1 godzina, ale sprawdzaj objętość co 10 minut, aż próbka całkowicie wyschnie.
  9. Dodać 15 μl 0,1 % TFA do każdej probówki i delikatnie inkubować w termomikserze w temperaturze 25 °C. Przenieść supernatant do fiolki w celu analizy LC-MS/MS.

5. 2DTAU western blot

  1. Przygotuj bufor transferowy, 250 mM zasady Tris, 92 mM glicyny i 10% metanolu przy użyciu podwójnie destylowanej wody.
  2. Przyciąć membranę nitrocelulozową i bibułę filtracyjną do wymiarów żelu.
  3. Zrównoważyć żel i zanurzyć membranę, bibułę filtracyjną i bibułę filtracyjną w buforze transferowym na 15 minut. Użyć membran nitrocelulozowych lub PVDF. W przypadku stosowania membran PVDF (polifluorku winylidenu) aktywuj je poprzez namoczenie w 100% MetOH.
  4. Przygotuj kanapkę z żelem w kasecie do transferu półsuchego w następujący sposób: elektroda ujemna/bibuła filtracyjna/żel/membrana nitrocelulozowa/bibuła filtracyjna/elektroda dodatnia. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między żelem a membraną, aby zapewnić dobre rezultaty.
  5. Umieść kasetę w urządzeniu półsuchym i uruchom blot pod napięciem 25 V przez 30 minut. Na koniec zdemontuj kanapkę bibułkową i przechowuj błonę do testu immunologicznego. Sprawdź wydajność nanoszenia za pomocą barwienia Ponceau. Oznacz membranę znakiem w prawym górnym rogu, aby zachować właściwą orientację filtra.
  6. Inkubuj z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi w zależności od eksperymentu (Rysunek 2).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 1A, można zaobserwować, jak białka histonowe migrują w żelu 1D. Jest to ważny krok wstępny do zrozumienia czasu trwania pierwszego wymiaru. Po ustaleniu właściwego czasu separacji uruchom drugi wymiar. Mapa 2D proteoform histonowych pokazuje charakterystyczny wzór topograficzny (Rysunek 1B). Każde miejsce w Rysunek 1B reprezentuje określony typ histonu. Obserwuj dokładny obszar żelu, w którym można znaleźć każdą proteoformę histonową. Identyfikacja spektrometrii mas dla każdej proteozy histonowej jest opisana w Perri et al.32. Dlatego każde miejsce w tym stanie jest związane z określonym typem histonu. Obecność dodatkowych plam, obok kanonicznych, może wskazywać na istnienie nowych modyfikacji. Obrazy żelu można uzyskać za pomocą densytometrii, a uzyskany obraz można przeanalizować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Niezawodność mapy 2D TAU zależy od rotuncji miejsca. Jeśli przebieg został wykonany poprawnie, punkty pojawią się jako wyraźne sygnały i nie będą widoczne żadne poziome i pionowe smugi. I odwrotnie, zanieczyszczenia w próbce, roztworach i nakładce agarozowej mogą powodować smugi i/lub paski w żelu. Jakość żelu będzie miała wpływ na digitalizację obrazu oraz późniejszą analizę ilościową i jakościową. Co więcej, może to mieć wpływ na powodzenie analizy Western Blot i dochodzeń w sprawie stwardnienia rozsianego. Aby zweryfikować wiarygodność metody, zbadaliśmy błonę nitrocelulozową rozwiązanych proteoform histonowych z pierwszorzędowym przeciwciałem Acetylowana-lizyna (Ac-K2-100) królik mAb32 (Rysunek 2). Do wykrywania sygnałów histonowych użyto drugorzędowego przeciwciała przeciw królikowi HRP. Zgodnie z oczekiwaniami, za pomocą densytometru możliwe jest ilościowe określenie osobliwej modyfikacji potranslacyjnej na każdym wariancie histonu obecnym w blot.

figure-results-1
Rysunek 1: 1D i 2D TAUgel. (A) Reprezentatywny obraz wzorca topograficznego histonów uzyskany przy użyciu 1D TAUgel. (B) Reprezentatywny obraz wzoru topograficznego histonów uzyskany przy użyciu 2D TAUgel. Identyfikacje danych są zgłaszane przez Perri et al. 32. Zgodnie z oczekiwaniami każda plamka reprezentuje określoną proteoformę histonową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywny Western blot 2DTAU. Na zdjęciu można zaobserwować poziom acetylacji lizyny w każdej proteoformie histonowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

OdczynnikiStężenie: 15%
40% akrylamid/bisKlasa 3,75
1,5 M Tris pH 8,82,5 ml
Woda MilliQ 3,6 ml
10% SDS100 μL
10% SOA50 μL
TEMED 5 μL

Tabela 1: Rozpoznawanie składu roztworu żelu.

. .
krok Godzina
Wiązanie 50% metanolu / 5% kwasu octowego 1 godz
Umyj 30% etanolu 2 x 20 minut
Umyj wodę dejonizowaną 1 x 20 min
Uczulacz Odczynnik tiosiarczanowy 1 min
Umyj wodę dejonizowaną 3 x 20 sekund
Srebro Azotan srebra Czas trwania: 30 min
Umyj wodę dejonizowaną 3 x 1 min
Programista 25-30 min Uwaga: Rozwijaj żel, aż plamy będą widoczne (jasnobrązowe)
Rozwiązanie zatrzymujące 1 x 10 minut
Umyj wodę dejonizowaną 2 x 5 minut
Umyj wodę dejonizowaną 1 godz

Tabela 2: Metoda barwienia srebrem.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady terapia pacjentów z rakiem została zrewolucjonizowana poprzez identyfikację różnych zmian molekularnych, które napędzają rozwój i progresję raka. Najważniejszym postępem we współczesnej onkologii jest opracowanie terapii opartej na kompleksowej analizie molekularnej. Postęp technologiczny w genomice i proteomice odegrał kluczową rolę w profilowaniu określonych biomarkerów na potrzeby wczesnego wykrywania, nadzoru, prognozowania i monitorowania leków. Proteomika jest definiowana jako analiza kompletnego zestawu białkowego komórki, tkanki lub organizmu w określonych warunkach, a także obejmuje badanie interakcji białek, modyfikacji potranslacyjnych i lokalizacji34. Specyficznym obszarem proteomiki jest epiproteomika, która polega na systematycznym badaniu potranslacyjnych modyfikacji histonów. Zostały one powiązane z rozwojem i progresją raka35. W artykule przedstawiono metodę identyfikacji określonych izoform histonów, które przyczyniają się do fenotypu komórkowego.

Krytycznym etapem metody jest ekstrakcja histonów ze względu na ich słabą rozpuszczalność i wysoką zasadowość. Jej głównymi ograniczeniami są złożoność mapy 2D oraz mała liczba wariantów, co może utrudniać analizę MS/MS.

Ogólnie rzecz biorąc, główną zaletą tego podejścia jest to, że można je przeprowadzić w dowolnym laboratorium, a mini aparat żelowy może być posiadany z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności. W tym kontekście jesteśmy przekonani, że metoda ta może pomóc dużej liczbie naukowców, takich jak ci, którzy nie mogą skorzystać z dużego obiektu w swojej instytucji, w identyfikacji nowych epimarkerów, mających na celu poprawę wiedzy na temat epi-proteomu. Co więcej, metodę tę można połączyć ze spektrometrią mas, którą można zlecić na zewnątrz jako usługę, w celu odkrycia nowych proteoform. Może być również stosowany z testami immunologicznymi w celu potwierdzenia zmian w określonej modyfikacji potranslacyjnej, dla której dostępne jest komercyjne przeciwciało.

Metodę wykorzystano do zbadania typowych zmian w modyfikacjach histonów związanych z rozwojem raka piersi28oraz do zbadania modyfikacji H1 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy36. Ponadto metoda ta została z powodzeniem zastosowana do pomiaru poziomu karbonylacji histonów37 w szybko rosnących fibroblastach oraz do zbadania nowych modyfikacji histonów, takich jak glikacja histonów i MARylacja histonów38.

Z naszej perspektywy jesteśmy przekonani, że metoda ta może być z powodzeniem stosowana do profilowania nowych histonów PTM, szczególnie tych związanych z nieprawidłową aktywacją określonych szlaków metabolicznych, takich jak acetylacja, malonylacja, metylacja, lipidacja, laktylacja, butylacja i inne. Ostatecznie metoda ta może również służyć jako narzędzie mikropreparatywne do izolowania poszczególnych proteoform i może ułatwić analizę PTM związanych z metabolizmem, pogłębiając w ten sposób naszą wiedzę na temat tego kluczowego obszaru badań.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez PRIN2022, DS, CF i AC były wspierane przez PRIN2022, a MLC było wspierane przez program doktorancki z Onkologii Molekularnej, szkołę doktorancką UMG. Prace wsparł również projekt PNRR INSIDE CUP:

B83C22003920001

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-DitioerytrytolSIGMA- ALDRICHD8255 Odczynnik do utrzymania − Grupy SH w stanie zredukowanym; Ilościowo redukuje dwusiarczki.
1,5 M bufor Tris-HCL, pH 8,8BIO-RAD161-0798Żel rozdzielczy
10x Tris/Glicyna/SDS BIO-RAD 1610772Użyj tego wstępnie zmieszanego 10-krotnego buforu biegowego Tris/glicyna/SDS, aby oddzielić próbki białek za pomocą SDS-PAGE.
2-PropanolSIGMA-ALDRICH335392-Propanol (Isopropanol) jest alkoholem drugorzędowym. Został przetestowany jako substytut paliwa do stosowania w różnych ogniwach paliwowych. Proszek CuO rozpuszczony w 2-propanolu został wykorzystany do syntezy koloidów Cu wspomaganej ablacją laserową. Zawiesina 2-propanolu z Zn(NO3)2 została wykorzystana do wytworzenia fotoanody ze stali nierdzewnej pokrytej dwutlenkiem tytanu (P25-TiO2/SS) pokrytej jednolicie grubą warstwą P25-TiO2.Ta fotoanoda została wykorzystana w procesie elektrochemicznej degradacji fotokatalitycznej (ECPC).
30% roztwór akryloamidu/bis BIO-RAD16101582,6% środkiem sieciującym. Odczynnik czystości do elektroforezy 
Kwas octowy LodowatyCarlo Erba Reagennts401392Kwas octowy jest ważnym odczynnikiem chemicznym o wielu zastosowaniach przemysłowych.
AcetonPanreac Applichem211007.1214Aceton  to rozpuszczalnik znany ze swojej wszechstronności w różnych zastosowaniach laboratoryjnych, produkcyjnych i czyszczących.
AcetonitylVWR83640320do HPLC    LC-MS gatunek
Agaroza Invitrogen15510-027Agaroza  jest  Heteropolisacharyd  Często stosowany w biologii molekularnej.
Wodorowęglan amonuSIGMA-ALDRICHA6141minimum 99,0%
Nadsiarczan amonuSIGMA-ALDRICHA3678Do biologii molekularnej, Do elektroforezy, ≥ 98% 
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003sonikator
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5GŚrodek redukujący stosowany w celu redukcji wiązań dwusiarczkowych w białkach.
Zestaw srebrnych bejc Dodeca BIO-RAD161-0480Zestaw do barwienia srebra Dodeca jest łatwy w użyciu do wykrywania poziomów nonagramowych białek w żelach poliakrylamidowych.
GlycerolGE - Healthcare Life Sciences171325010LGlicerol jest prostym związkiem triolowym, bierze udział w odlewaniu żeli gradientowych, stabilizatora białka i składnika bufora magazynowego.
Inhibitor fosfatazy zatrzymanej Thermo SCIENTIFIC78428Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail zachowuje stan fosforylacji białek podczas i po lizie komórek lub ekstrakcji białek tkankowych  Koktajl jednorazowego użytku (100X).   
Zatrzymaj inhibitor proteazy Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) to gotowe do użycia skoncentrowane roztwory podstawowe inhibitorów proteazy do dodawania do próbek w celu zapobiegania degradacji proteolitycznej podczas lizy komórek i ekstrakcji białek. Koktajl jednorazowego użytku (100X).   
Kwas solnySIGMA-ALDRICHH1758BioReagent, do biologii molekularnej
JodoacetamidSIGMA-ALDRICHI6125≥ 99% (NMR), krystaliczny
KClSIGMA-ALDRICHP9541Chlorek potasu, KCl, jest  zwykle stosowany w procedurach laboratoryjnych. Jego zastosowanie jako bufora do przechowywania elektrod pH oraz jako roztworu referencyjnego do pomiarów przewodności jest dobrze znane.
Linia komórkowa MCF10atccCRL-10317 linia komórkowa nabłonka, która została wyizolowana w 1984 roku z gruczołu sutkowego białej, 36-letniej kobiety z włóknisto-torbielowatymi piersiami. Ta linia komórkowa została zdeponowana przez Michigan Cancer Foundation.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337Chlorek magnezu jest bezbarwnym krystalicznym ciałem stałym.
N,N,N',N'-Tetrametyloetylen-diaminaSIGMA-ALDRICHT9281Do elektroforezy, ok. 99%
Bufor soli fosforanowej 1XCorning153736311 X PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) jest  buforowany  Zrównoważony roztwór soli  Stosowany do różnych zastosowań biologicznych i hodowli komórkowych, takich jak mycie komórek przed dysocjacją, transport komórek lub tkanek, rozcieńczanie komórek do liczenia i przygotowywanie odczynników.
Heksacyjanożelazian potasuSIGMA-ALDRICH60299Akceptor elektronów, stosowany w układach z udziałem transportu elektronów,
SDS Roztwór 20% (w/v) BIO-RAD161-0418Dodecylosiarczan sodu. Odczynnik czystości do elektroforezy 
Tiosiarczan sodu, ReagentPlus 99%SIGMA- ALDRICH21,726-3Tiosiarczan sodu, Reodagent Plus 99%
Kwas siarkowySIGMA-ALDRICH339741Kwas siarkowy, Odczynnik, jest  Niezwykle kwas, który występuje w postaci żółtawej, lekko lepkiej cieczy. Jest rozpuszczalny w wodzie i jest kwasem diprotonowym . Posiada bardzo silne właściwości, odwadniające i utleniające, a także jest higroskopijny.
Kwas trichlorooctowySIGMA-ALDRICHT6399-5GKwas trichlorooctowy (TCA) jest  Stosowany jako odczynnik do wytrącania białek1,2 i kwasów nukleinowych3. 
Kwas trifluorooctowyRiedel-de Haë n34957Kwas trifluorooctowy
Triton X-100SIGMA- ALDRICHT9284-1LTriton X-100 to niejonowy polioksyetylenowy środek powierzchniowo czynny, który jest najczęściej stosowany do ekstrakcji i rozpuszczania białek.
Trypsyna z trzustki świniSIGMA-ALDRICHT6567Klasa proteomiczna, BioReagent, Dimetylowany
MOCZNIKSIGMA-ALDRICH33247Mocznik jest środkiem chaotropowym i służy do denaturacji białek. Zaburza wiązania wodorowe w drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze białek. Może również zaburzać wiązania wodorowe obecne w drugorzędowej strukturze DNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  2. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  3. Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  4. Sun, L., et al. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  5. Kinnaird, A., et al. Metabolic control of epigenetics in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).
  6. Díaz-Hirashi, Z., et al. Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis. Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).
  7. Panatta, E., et al. Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability. Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).
  8. Scumaci, D., Zheng, Q. Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer. Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).
  9. Chiaradonna, F., Scumaci, D. Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy. Cells. 10 (6), 1393(2021).
  10. Scumaci, D., et al. DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation. Cells. 9 (9), 1968(2020).
  11. Olivo, E., et al. Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism. Cells. 11 (9), 1432(2022).
  12. Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics. Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).
  13. Maksimovic, I., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code. Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).
  14. Lowe, B. R., et al. Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer. Cancers. 11 (5), 660(2019).
  15. Karsli-Ceppioglu, S. The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer. Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).
  16. Yang, C., et al. Histone methyltransferase and drug resistance in cancers. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).
  17. Vardabasso, C., et al. Histone variants: emerging players in cancer biology. Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).
  18. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).
  19. Liu, Y., et al. Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2. Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).
  20. Nowsheen, S., et al. ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage. Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).
  21. Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. 77, 87-95 (2019).
  22. Yang, Y., Wang, Y. Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment. Front Immunol. 12, 640369(2021).
  23. Miranda Furtado, C. L., et al. Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment. Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).
  24. Thomas, S. P., et al. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  25. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  26. Kwak, H. G., Dohmae, N. Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis. Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).
  27. Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).
  28. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  29. Basak, S. K., Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).
  30. Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors. Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).
  31. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).
  32. Perri, A. M., et al. Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer. Aging. 11, 11722-11755 (2019).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  34. Omenn, G. S., et al. Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project. J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).
  35. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  36. Starkova, T. Y., et al. The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells. Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).
  37. García-Giménez, J. L., et al. Histone carbonylation occurs in proliferating cells. Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).
  38. García-Saura, A. G., Schüler, H. PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis. Cells. 10, 654(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dwuwymiarowa elektroforeza elowaPTM histon wspektrometria masstruktura chromatynySDS PAGEtrawienie w elubarwienie srebremmodyfikacje epigenetyczne

Powiązane artykuły