Method Article

Wysokoprzepustowe podejście przesiewowe do oceny powinowactwa wiązania zanieczyszczeń środowiska z receptorami jądrowymi

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy system przesiewowy, który wykorzystuje polaryzację fluorescencyjną określonej sondy fluorescencyjnej wiążącej się z receptorem jądrowym jako odczyt do badania zanieczyszczeń środowiska.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykryto rosnące poziomy związków chemicznych w środowisku, powodując powszechne zanieczyszczenie i stwarzając zagrożenia dla zdrowia ludzkiego. Jednak pomimo ich dużego występowania w środowisku, istnieje bardzo niewiele informacji na temat ich skutków toksykologicznych. Pilne jest opracowanie wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych (HTS), które mogłyby stanowić podstawę badań toksykologicznych. W tym badaniu opracowano test wiązania receptor-ligand przy użyciu systemu HTS w celu określenia siły wiązania zanieczyszczeń środowiskowych z receptorami jądrowymi. Test przeprowadza się przy użyciu czytnika mikropłytek (tj. 96-dołkowej płytki zawierającej różne substancje chemiczne) poprzez pomiar polaryzacji fluorescencji (FP) określonej sondy fluorescencyjnej. Test ten składa się z czterech części: budowy i transformacji wektorów rekombinowanych, ekspresji i oczyszczania białka receptorowego (domeny wiążącej ligand), wiązania receptor-sonda oraz konkurencyjnego wiązania substancji chemicznych z receptorem. W celu zilustrowania procedury oznaczania określono siłę wiązania dwóch zanieczyszczeń środowiska, kwasu perfluorooktanosulfonowego (PFOS) i fosforanu trifenylu (TPHP), z receptorem gamma aktywowanym proliferatorem peroksysomów (PPARγ). Na koniec omówiono również zalety i wady tej metody oraz jej potencjalne zastosowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duża liczba substancji chemicznych została powszechnie wykryta w środowisku i ciałach ludzkich, co budzi poważne obawy dotyczące ich wpływu na środowisko ekologiczne i zdrowie ludzi1,2,3. Pomimo częstego występowania w środowisku, informacje na temat ich skutków toksykologicznych są skąpe. W związku z tym pilne jest opracowanie wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych (HTS) w celu ułatwienia oceny toksyczności chemicznej.

Zgłoszono kilka metod wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) do oceny toksyczności chemicznej, takich jak testy biologiczne HTS używane w programach Tox21 i ToxCast4,5. Metody te mogą szybko zidentyfikować potencjalne substancje toksyczne i dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów toksyczności chemicznej. Jednak te testy biologiczne HTS opierają się głównie na systemach opartych na komórkach, które mogą być złożone i kosztowne. Dodatkowo, metody sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zostały również wykorzystane do oceny toksyczności chemicznej, ale osiągnięcie wysokoprzepustowej oceny chemikaliów pozostaje wyzwaniem6. W poprzednich badaniach opracowano testy konkurencyjnego wiązania receptor-ligand oparte na polaryzacji fluorescencyjnej (FP) w celu określenia siły wiązania kilku zanieczyszczeń środowiska, w tym substancji per- i polifluoroalkilowych (PFAS)7,8,9, bisfenol A (BPA)10,11 i cząstki stałe (PM)12, z receptorami jądrowymi, takimi jak receptor aktywowany proliferatorem peroksysomów (PPAR)7,8,9,10,13, farnezoidowy receptor X (FXR)11,12 i receptor tarczycy (TR)14,15. Takie podejście jest wydajne, ekonomiczne i zapewnia wgląd w mechanizmy mechaniczne.

W tym badaniu, protokół testu wiązania receptor-ligand jest opisany na podstawie wykrywania polaryzacji fluorescencji (FP) małej sondy fluorescencyjnej. Zasada testu wiązania receptor-ligand opartego na FP jest zilustrowana na Rysunek 1. Kiedy mała cząsteczka fluorescencyjna jest wzbudzana przez światło spolaryzowane w płaszczyźnie, emitowane światło staje się wysoce zdepolaryzowane z powodu szybkiej rotacji molekularnej. Jednak, gdy znacznik wiąże się z większym receptorem, jego rotacja jest spowolniona. Wysoka wartość FP jest wykrywana, gdy znacznik jest związany z dużym receptorem, podczas gdy niska wartość FP jest obserwowana, gdy znacznik jest wolny. Receptor gamma aktywowany proliferatorem peroksysomów (PPARγ) został oczyszczony w celu związania sondy z receptorem. Rozyglitazon (Rosi), kwas perfluorooktanosulfonowy (PFOS) i fosforan trifenylu (TPHP) były używane do konkurowania o wiązanie sondy z receptorem. Rosi, swoisty agonista PPARγ, był stosowany jako kontrola pozytywna w testach konkurencyjnego wiązania receptora. Ponadto PFOS i TPHP zostały wcześniej zidentyfikowane jako słabi agoniści PPARγ w poprzednich badaniach8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Ponadto należą one do różnych kategorii strukturalnych związków znanych z narażenia środowiskowego i wyróżniają się stosunkowo wysokimi wskaźnikami wykrywalności w populacjach ludzkich. Związki te wykorzystano do dalszej walidacji szerokiego zastosowania testu wiązania konkurencji. Procedura składa się z czterech etapów: budowy i transformacji wektorów rekombinowanych, ekspresji i oczyszczania białka receptorowego (domeny wiążącej ligand), wiązania receptor-sonda oraz konkurencyjnego wiązania substancji chemicznych z receptorem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Budowa i transformacja wektorów rekombinowanych

UWAGA: PPARγ jest zależnym od ligandu czynnikiem transkrypcyjnym o klasycznej strukturze receptora jądrowego, składającej się z domeny wiążącej DNA, która reguluje geny docelowe i domeny wiążącej ligand aktywowanej przez ligandy. Po aktywacji liganda, PPARγ tworzy heterodimer z innym receptorem jądrowym, receptorem retinoidowym X (RXR) i wiąże się z elementami odpowiedzi PPARγ, regulując w ten sposób transkrypcję dalszych genów docelowych9,16.

  1. Zaprojektuj startery dla PPARγ-LBD (patrz Tabela 1) i amplifikuj segment DNA PPARγ-LBD (patrz Tabela 2 i Tabela 3).
  2. Linearyzuj wektor pET28a znakowany His×6, trawiąc go endonukleazami restrykcyjnymi XhoI i BamHI18.
  3. Sklonuj segment DNA PPARγ-LBD do wektora pET28a znakowanego His×6 za pomocą dostępnego na rynku zestawu do klonowania, w wyniku czego powstanie rekombinowany plazmid pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. Transfekcja rekombinowanego plazmidu ekspresyjnego pET28a-PPARγ-LBD-6×His do komórek BL21 (DE3) Escherichia coli w celu ekspresji białka18.
  5. Dodać 5 μl rekombinowanego wektora do właściwych komórek BL21(DE3), inkubować na lodzie przez 30 minut, przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie natychmiast powrócić do lodu.
  6. Dodać 900 μl pożywki LB, wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (160-200 obr./min), następnie odwirować przy ~3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad bakteryjny w 100 μl pożywki LB i rozprowadzić na pożywce stałej. Odwrócić płytki i kulturę w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.
  8. Wybierz poszczególne kolonie do sekwencjonowania, identyfikacji, a następnie ekspresji i oczyszczania białka.

2. Ekspresja i oczyszczanie białka receptorowego

  1. Inkubować przekształcone komórki BL21 (DE3) w 200 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny na wytrząsarce orbitalnej (230 obr./min) przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Indukować komórki, gdy OD600 osiągnie 0,4-0,6 jednostek absorbancji, dodając 10 μM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i inkubować w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.
  3. Zebrać zawiesinę bakteryjną i odwirować w temperaturze 8000 × g, 4 °C, przez 10 minut.
  4. Poddać komórki lizie w 20 ml rozpuszczalnego buforu do lizy (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, pH 8,0), dodając 200 μl fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 200 μl lizozymu. Ponownie zawiesić osad bakteryjny za pomocą pipety o pojemności 5 ml, a następnie kontynuować sonikację przy 30% mocy przez 20 minut.
  5. Dodaj bufor do lizy równy 5-krotności objętości kolumny, aby zrównoważyć kolumnę niklu. Powtórz ten proces dwa razy i odłóż na bok.
  6. Odwirować sonikowaną zawiesinę bakteryjną o stężeniu 8000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu otrzymania bakteryjnego supernatantu lizatu (CL).
  7. Załaduj CL na kolumnę niklu (do adsorpcji białek), aby uzyskać przepływ (FT).
  8. Przemyć kolumnę 5-krotnością objętości buforu płuczącego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0) w celu otrzymania eluatu do przemywania (W1-W6).
  9. Przepłukać kolumnę 1 ml buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH 8,0) w celu elucji białka docelowego i otrzymania frakcji białkowych (E1-E5).
  10. Weź 20 μl podwielokrotności każdej frakcji (CL, FT, W1-W6 i E1-E5) i przeanalizuj za pomocą SDS-PAGE18 z barwieniem Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD działa jako białko o masie 34,9 kDa w żelu denaturującym.

3. Test wiązania receptora

UWAGA: W tym teście, C1-BODIPY-C12 został użyty jako specyficzna dla miejsca sonda fluorescencyjna do ustalenia systemu wiązania receptor-ligand. C1-BODIPY-C12, specyficzny ligand dla PPARγ, jest fluorescencyjnym analogiem kwasu tłuszczowego z grupą fluorescencyjną BODIPY wbudowaną w kwas tłuszczowy w pozycji C1.

  1. Rozcieńczyć oczyszczony ludzki PPARγ-LBD w buforze Tris-HCl (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0) do zakresu stężeń od 1 nM do 6400 nM. Sondę C1-BODIPY-C12 należy również rozcieńczyć w buforze Tris-HCl do stężenia 50 nM.
  2. Wymieszaj rozcieńczony roztwór PPARγ-LBD (55 μl na studzienkę) i roztwór sondy C1-BODIPY-C12 (55 μl na dołek) na 96-dołkowej czarnej płytce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Zmierz polaryzację fluorescencji (FP) za pomocą czytnika mikropłytek.
  4. Wykreślić wartości FP w stosunku do stężenia receptora, dopasować krzywą za pomocą specyficznego wiązania z równaniem nachylenia wzgórza za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego i obliczyć wartość Kd.

4. Konkurencyjny test wiązania

UWAGA: W tym teście do wiązania receptora użyto 800 nM ludzkiej sondy PPARγ-LBD i 50 nM sondy C1-BODIPY-C12. Rozyglitazon (Rosi), fosforan trifenylu (TPHP) i kwas perfluorooktanosulfonowy (PFOS) stosowano w celu konkurowania z wiązaniem sondy z PPARγ.

  1. Rozcieńczyć trzy związki w buforze Tris-HCl w zakresie stężeń od 0 do 200 μM.
  2. Przygotować roztwór wiążący receptor-sonda o końcowym stężeniu 800 nM ludzkiego PPARγ-LBD i 50 nM sondy C1-BODIPY-C12.
  3. Wymieszaj roztwór wiążący receptor-sonda (55 μl na dołek) i roztwór złożony (55 μl na dołek) w 96-dołkowej czarnej płytce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Zmierz polaryzację fluorescencji (FP) za pomocą czytnika mikropłytek.
  5. Wykreślić wartości FP w funkcji stężenia liganda. Uzyskaj połówkowe maksymalne stężenie hamujące (IC50) każdego liganda z krzywej konkurencji za pomocą modelu sigmoidalnego przetworzonego przez oprogramowanie do tworzenia wykresów i analizy.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja i oczyszczanie białka PPARγ-LBD
PPARγ-LBD ulegał heterologicznej ekspresji w BL21 (DE3) jako białko znakowane histydyną. Białko wykryto we frakcjach rozpuszczalnych, a oczyszczony PPARγ-LBD wykazał pojedyncze prążki na SDS-PAGE o pozornej masie cząsteczkowej około 34,9 kDa (Rysunek 2), zgodnie z przewidywaną masą cząsteczkową białka.

Powiązanie sondy C 1-BODIPY-C12 z PPARγ-LBD
W teście wiązania receptora, C1-BODIPY-C12, kwas tłuszczowy znakowany BODIPY, który może wiązać się z PPARγ-LBD, został użyty jako sonda fluorescencyjna do zbadania siły wiązania zanieczyszczeń środowiska z hPPARγ-LBD. Jak pokazano na Rysunek 3A, wartości polaryzacji fluorescencji (FP) wzrosły z 20 do 250 po dodaniu PPARγ-LBD, co wskazuje na wiązanie C1-BODIPY-C12 z receptorem. Krzywa wiązania osiągnęła wysycenie przy 800 nM PPARγ-LBD, przy stałej dysocjacji (Kd) 253,5 nM ± 10,05 nM. W związku z tym wybrano 800 nM PPARγ-LBD do kolejnych testów wiązania konkurencyjnego.

Konkurencyjne wiązanie zanieczyszczeń środowiska z PPARγ-LBD
Rozyglitazon (Rosi), swoisty agonista PPARγ, zastosowano jako kontrolę pozytywną w celu wyparcia sondy fluorescencyjnej w konkurencyjnych testach wiązania ligandów. Jak pokazano w Rysunek 3B, Rosi zahamował wiązanie sondy C1-BODIPY-C12 z PPARγ-LBD w sposób zależny od dawki, z IC50 wynoszącym 6,89 μM, co wykazało wykonalność testu. Następnie określono powinowactwo wiązania TPHP i PFOS do PPARγ-LBD. Jak pokazano w Rysunek 3C,D, TPHP i PFOS również hamowały wiązanie sondy C1-BODIPY-C12 z PPARγ-LBD w sposób zależny od dawki, z wartościami IC50 wynoszącymi odpowiednio 60,45 μM i 37,27 μM.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja testów konkurencyjnego wiązania receptorów opartych na polaryzacji fluorescencyjnej (FP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza SDS-PAGE oczyszczonego PPARγ-LBD. M jest markerem masy cząsteczkowej białka. Cl to lizat komórkowy, FT to frakcja przepływowa, W1-W6 to roztwory płuczące, E1 to eluat, a E2-E4 to oczyszczone białka PPARγ-LBD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Krzywa wiązania receptora oparta na polaryzacji fluorescencyjnej (FP) i konkurencyjne krzywe wiązania. (A) Krzywa wiązania C 1-BODIPY-C12 oparta na FP z ludzkim PPARγ-LBD. (B-D) Oparte na FP konkurencyjne krzywe wiązania Rosi, TPHP i PFOS z ludzkim PPARγ-LBD. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (SD) dla trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

idseq
pET28a-Człowiek PPARG-P1CAAATGGGTCGCGGATCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-Człowiek PPARG-P2GTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGTACAAGTCCTTAGATCTCTC
Sekwencja nukleotydowa PPARγ-LBDAGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACACAGCAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAAA
TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACACACA
GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAGAGCAA
AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG
AGGCTGTGCAGGAGATCAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG
CTCGAGGCCACCCACCC powiedział:

Tabela 1: Sekwencja startera i nukleotydu domeny wiążącej ligand PPARγ.

Nazwy odczynników eksperymentalnychObjętość/Dawka
pET28a-Człowiek PPARG-P11 μL
pET28a-Człowiek PPARG-P21 μL
2×phanta Max Master Mix12,5 μl
Zawartość cDNA2 μl
ddH2O8,5 μL

Tabela 2: Eksperymentalny system odczynników do PCR.

Nazwy eksperymentówtemperaturaGodzina
Wstępna denaturacja95 °CCzas trwania: 3 min
denaturacja95 °C15 sekund
Wyżarzanie65 °C15 sekund
rozszerzenie72 °CCzas trwania: 6 min
sklep12 °C--

Tabela 3: Program eksperymentalnej reakcji PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polaryzacja fluorescencyjna (FP), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) są powszechnymi technikami stosowanymi do oceny bezpośrednich oddziaływań wiążących między białkami i związkami19,20. FP jest szeroko stosowany w badaniu interakcji molekularnych w celu odkrywania leków i chemicznych badań przesiewowych 21,22,23. Dla porównania, testy SPR i NMR są drogie i czasochłonne, co czyni je mniej odpowiednimi do zastosowań w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych (HTS). Protokół ten opisuje metodę analizy receptor-ligand opartą na FP z systemem detekcji płytek wielodołkowych, umożliwiającym HTS substancji chemicznych.

Wybór odpowiedniej sondy do testu wiązania receptora ma kluczowe znaczenie. Sonda powinna składać się z dwóch elementów: specyficznego liganda dla receptora jądrowego i grupy fluorescencyjnej. Zazwyczaj takie sondy można uzyskać komercyjnie, czego przykładem jest sonda C1-BODIPY-C12 użyta w tym badaniu. C1-BODIPY-C12 jest fluorescencyjnym analogiem kwasu tłuszczowego, z grupą fluorescencyjną BODIPY wbudowaną w pozycję C1 i jest specyficznym ligandem dla PPARγ. Jeśli dostępna na rynku sonda fluorescencyjna nie jest opcją, powinna zostać zsyntetyzowana chemicznie poprzez dołączenie grupy fluorescencyjnej do znanego specyficznego liganda.

Klasyczna struktura receptora jądrowego obejmuje domenę wiążącą DNA odpowiedzialną za regulację ekspresji genu docelowego oraz domenę wiążącą ligand (LBD), zwykle zlokalizowaną na C-końcu receptora24. Miejsce wiązania koregulatora znajduje się na ogół w domenie funkcji aktywacji transkrypcji receptora jądrowego, gdzie oddziałuje z jądrowymi czynnikami koregulacyjnymi25. Te koregulatory mogą zwiększać lub tłumić aktywność transkrypcyjną receptora, modulując w ten sposób ekspresję genów. LBD, zlokalizowany w określonym regionie białka receptora, reguluje zmiany konformacyjne receptora po związaniu liganda, co z kolei aktywuje lub hamuje jego aktywność transkrypcyjną. Ponieważ LBD jest dobrze zdefiniowaną domeną kluczową dla rozpoznawania i wiązania określonych ligandów małocząsteczkowych24, w tym badaniu w teście konkurencyjnego wiązania receptora użyto tylko receptora-LBD. To podejście, które obejmowało ekspresję i oczyszczanie domeny wiążącej ligand PPARγ, zmniejszyło koszty testu.

Odczynniki stosowane w tej metodzie, w tym do oczyszczania białek, sonda C1-BODIPY-C12 i Tris-HCl, są dostępne na rynku i niedrogie, co stanowi istotną zaletę dla testu. Detekcja polaryzacji fluorescencyjnej (FP) odbywa się na płytce wielodołkowej (96-dołkowej lub 384-dołkowej), z szybkim czasem odczytu wynoszącym 3-5 minut na płytkę, co zwiększa przepustowość i wydajność testowania. Podejście do wiązania receptor-ligand jest bardzo elastyczne i można je łatwo dostosować do różnych receptorów, pod warunkiem, że białka receptorowe są dostępne. Ta zdolność adaptacyjna poszerza zakres badań, które można prowadzić tą metodą. Ogólnie rzecz biorąc, połączenie tych zalet - łatwości użycia, efektywności kosztowej, wysokiej przepustowości, szybkiego przetwarzania i elastyczności w adaptacji receptorów - sprawia, że metoda ta jest obiecującą opcją do badań przesiewowych toksycznych zanieczyszczeń środowiska.

Obecne wyniki pokazują, że PFOS i TPHP mogą wiązać się z PPARγ, co jest zgodne z wcześniejszymi wynikami molekularnych testów dokowania i genów reporterowych 9,26. Dodatkowo, metoda opisana w tym manuskrypcie została wykorzystana do oceny siły wiązania kilku zanieczyszczeń środowiska z receptorami jądrowymi. Na przykład, stosując test kompetycyjnego wiązania receptor-ligand oparty na FP, siłę wiązania 19 substancji per- i polifluoroalkilowych (PFAS) oraz 7 związków bisfenolu A (BPA) z receptorem aktywowanym proliferatorem peroksysomów β/δ (PPARβ/δ)7,10, 12 PFAS z PPARγ 9,13, 7 związków BPA i 3 składników pyłu zawieszonego (PM2,5) z receptorem farnesoidu X (FXR)11, Oznaczono 12 i 8 polibromowanych eterów difenylowych (PBDE) i 6 polichlorowanych bifenyli (PCB) do receptora tarczycy (TR)14,15. Odkrycia te podkreślają potencjał tej metody w zakresie badań przesiewowych interakcji wiążących między zanieczyszczeniami środowiska a receptorami jądrowymi.

Wcześniejsze badania donosiły o metodach oznaczania polaryzacji fluorescencyjnej (FP) dla PPARγ, które polegają na użyciu filtracji żelowej do pomiaru wiązania, co wymaga co najmniej 1,5 godziny na wykrycie wiązania pojedynczego związku23. Natomiast metoda ta pozwala na wykrycie powinowactwa wiązania dla co najmniej 12 związków z PPARγ w ciągu 10 minut. Ponadto niektóre dostępne na rynku zestawy testowe (patrz tabela materiałów) kosztują ponad 3000 USD za format 800 × 20 μl. Metody te są szczególnie drogie i czasochłonne. W niniejszym badaniu przedstawiono ulepszenia w stosunku do tych istniejących metod.

Jednym z potencjalnych ograniczeń tej metody jest to, że sonda fluorescencyjna musi być ligandem dla receptora, a sondy fluorescencyjne nie oddziałują bezpośrednio z zanieczyszczeniami środowiska. Dlatego tak ważne jest, aby upewnić się, że sonda i zanieczyszczenia środowiska są oddzielone w roztworze. Ponadto test ten odzwierciedla sytuację in vitro i nie może w pełni uchwycić interakcji in vivo , ponieważ receptory są heterodimeryczne in vivo27. W związku z tym, chociaż metoda ta służy jako szybkie narzędzie przesiewowe, konieczne są dalsze badania aktywacji receptorów i związanych z nią mechanizmów toksykologicznych in vivo .

Kolejną wadą jest zjawisko "przesunięcia w prawo" obserwowane w testach polaryzacji fluorescencyjnej (FP) podczas oceny powinowactwa wiązania, co może prowadzić do systematycznego niedoszacowania mierzonych powinowactw. W poprzednich badaniach powinowactwo wiązania rozyglitazonu z PPARγ oceniano za pomocą testu czasowo-rozdzielczego transferu energii rezonansu fluorescencji (TR-FRET)28, który jest bardzo czułą metodą pomiaru powinowactwa wiązania ligand-receptor. Jednak test TR-FRET jest stosunkowo czasochłonny i kłopotliwy, wymaga 4-godzinnej inkubacji roztworu reakcyjnego w temperaturze pokojowej przed wykryciem. Chociaż test FP wykazuje niższą czułość w porównaniu z testem TR-FRET, jest bardziej odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych ligandów środowiskowych, które wiążą się z receptorami jądrowymi. Niemniej jednak test FP może pominąć niektóre słabe ligandy środowiskowe. Dodatkowo, w poprzednich badaniach, powinowactwo wiązania PFOS z PPARγ określono za pomocą dializy równowagowej (EqD)29, innej bardzo czułej metody pomiaru powinowactwa wiązania ligand-receptor. Jednak EqD opiera się na drogim sprzęcie analitycznym (LC-MS/MS), co ogranicza jego zastosowanie i wyklucza możliwości wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Chociaż ten test polaryzacji fluorescencji (FP) wykazuje zjawisko "przesunięcia w prawo", które może skutkować ogólnie wyższymi obliczonymi wartościami IC50 , nie wpływa to na ranking względnego powinowactwa ani późniejsze przewidywania oceny ryzyka. Co więcej, test FP jest opłacalny, efektywny czasowo i zdolny do badania przesiewowego szerokiej gamy związków pod kątem ich powinowactwa do wielu receptorów jądrowych. Ogólnie rzecz biorąc, wysokoprzepustowe badania przesiewowe ligandów środowiskowych oparte na FP ułatwiają szybką identyfikację toksycznych zanieczyszczeń środowiska.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 82103875).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sonda C1-BODIPY-C12Thermo Fisher Scientific, Chiny102209-82-3Wiąże się z PPARγ-LBD i emituje fluorescencję.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, Chiny6104-59-2Zabarwić pasma białkowe.
Pryzmat GraphPadDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazolSolarbio, ChinyI8090Przygotuj do procesu oczyszczania białek.
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydSolarbio, Chiny367-93-1Indukuj ekspresję PPARγ-LBD
Czytnik mikropłytekBiotek, USASynergy H1 Wykrywanie wartości FP
Odczynnik NaClShanghai7647-15-5Przygotuj do procesu oczyszczania białka.
NaH2PO4 · 2H2OOdczynnik Shanghai13472-35-0Przygotuj do procesu oczyszczania białka.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinySA005005Oczyszczanie białek.
Pochodzenie 8.5 OriginLab, Northampton, Massachusetts, Stany Zjednoczone
Kwas perfluorooktanosulfonowy (PFOS)J& K Scientific Ltd, Chiny1763-23-1Wykryte zanieczyszczenia środowiska
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Solarbio, ChinyP0100Hamują degradację białek.
PPARγ-Zestaw do oznaczania konkurencjiThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-Zestaw do badań przesiewowych ligandów LBDCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rozyglitazon (Rosi)aladyn, Chiny122320-73-4Agoniści PPARγ
WytrząsarkaZHICHENG, ChinyZWY-211CEkspansja kultur bakteryjnych i indukcja ekspresji białek
Fosforan trifenylu (TPHP)Macklin, ChinyT819317Wykryte zanieczyszczenia środowiska
TrisSolarbio, ChinyT8230Przygotuj do procesu oczyszczania białek.
TryptoneOXOID Limited, ChinyLP0042BPrzygotuj bulion lizogeniczny (LB).
Myjka ultradźwiękowaKimberly, ChinyLHO-1Zakłóć bakterie, aby osiągnąć całkowitą
lizę MocznikSolarbio, ChinyU8020Przygotuj do procesu oczyszczania białek.
Ekstrakt drożdżowyOXOID Limited, ChinyLP0021BPrzygotuj bulion lizogeniczny (LB).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ScreeningNuclear ReceptorsBinding AffinityEnvironmental PollutantsReceptor Ligand BindingFluorescence PolarizationMicroplate ReaderProtein ExpressionCompetitive BindingPPAR Gamma
Video Coming Soon

Related Articles