Artykuł metodologiczny

Platforma wspomagająca podejmowanie decyzji medycznych do identyfikacji trombospondyny 1 w niealkoholowej stłuszczeniowej chorobie wątroby za pomocą analizy nacieków immunologicznych

704 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67328

⸱

30 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie badało związki między niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) a zawałem mięśnia sercowego (MI) poprzez koekspresję genów, identyfikując Trombospondynę 1 (THBS1) jako biomarker. Analiza infiltracji immunologicznej wykazała, że limfocyty T CD8 + i neutrofile są kluczowymi czynnikami, a THBS1 wykazuje potencjał jako narzędzie diagnostyczne dla NAFLD i MI.

Streszczenie

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) i zawał mięśnia sercowego (MI) to dwa główne obciążenia zdrowotne o znacznym rozpowszechnieniu i śmiertelności. Badanie to miało na celu zbadanie genów ulegających koekspresji, aby zrozumieć związek między NAFLD a MI oraz zidentyfikować potencjalne kluczowe biomarkery zawału mięśnia sercowego związanego z NAFLD przy użyciu bioinformatyki i uczenia maszynowego. Przeprowadzono analizę wzbogacenia funkcjonalnego, skonstruowano diagram sieci interakcji kobiałko-białko (PPI) oraz zastosowano techniki wektora nośnego z rekurencyjną eliminacją cech (SVM-RFE) oraz operatora najmniejszego bezwzględnego skurczu i selekcji (LASSO) w celu identyfikacji jednego genu o zróżnicowanej ekspresji (DEG), trombospondyny 1 (THBS1). THBS1 wykazał wysoką skuteczność w rozróżnianiu pacjentów z NAFLD (AUC = 0,981) i pacjentów z MI (AUC = 0,900). Analiza naciekania immunologicznego wykazała znacznie niższe limfocyty T CD8 + i wyższe poziomy neutrofili u pacjentów z NAFLD i MI. Limfocyty T CD8 + i neutrofile były skuteczne w odróżnianiu NAFLD / MI od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Analiza korelacji wykazała, że THBS1 był dodatnio skorelowany z CCR (receptorem chemokinowym), klasą MHC (klasa głównych kompleksów zgodności tkankowej), neutrofilami, parazapaleniem i Tfh (pęcherzykowymi limfocytami T pomocniczymi) i ujemnie skorelowany z limfocytami T CD8 +, aktywnością cytolityczną i TIL (limfocyty naciekające nowotwór) u pacjentów z NAFLD i MI. THBS1 okazał się nowym biomarkerem do diagnozowania NAFLD/MI w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Wyniki wskazują, że limfocyty T CD8 + i neutrofile mogą służyć jako zapalne cechy immunologiczne do różnicowania pacjentów z NAFLD/MI od osób zdrowych.

Wprowadzenie

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest poważnym problemem zdrowia publicznego, którego częstość występowania wynosi 25%-30%1. Doniesiono, że częstość występowania NAFLD jest wysoka wśród pacjentów z cukrzycą2. Jednak znaczenie NAFLD u pacjentów bez cukrzycy nie jest jeszcze jasne. Badania sugerują, że NAFLD odgrywa niezależną rolę w patogenezie miażdżycy3,4. Ponadto metaanaliza wykazała, że NAFLD jest ściśle związana ze zwapnieniem tętnic wieńcowych, dysfunkcją śródbłonka i miażdżycą, a także stała się niezależnym czynnikiem ryzyka sercowo-naczyniowego5. Związek między NAFLD a chorobami sercowo-naczyniowymi nadal wymaga dalszych badań.

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest katastrofalną chorobą, która zagraża zdrowiu i stanowi znaczne obciążenie ekonomiczne dla pacjentów i ich rodzin na całym świecie6. Zawał mięśnia sercowego jest również główną przyczyną zgonów pacjentów z NAFLD. Badanie kliniczne opublikowane w British Medical Journal wykazało, że ryzyko zawału mięśnia sercowego u pacjentów z NAFLD jest 1,17 razy większe niż u pacjentów bez NAFLD7,8. Niektóre badania zidentyfikowały szlaki molekularne, w tym stan zapalny, stres oksydacyjny i metabolizm lipidów, które przyczyniają się do związanego z NAFLD MI9,10,11. Jednak mechanizmy leżące u podstaw NAFLD i MI pozostają niejasne. Kluczowe znaczenie ma identyfikacja nowych biomarkerów związanych z rokowaniem w przypadku NAFLD i zawału serca.

Rosnące rozpowszechnienie NAFLD, które dotyka szeroki segment populacji, podkreśla istotny problem zdrowia publicznego, szczególnie biorąc pod uwagę jego związek z cukrzycą. Jednak wpływ NAFLD na pacjentów bez cukrzycy pozostaje słabo poznany. NAFLD bierze udział w patogenezie miażdżycy i jest uznawana za niezależny czynnik ryzyka sercowo-naczyniowego, ściśle związany ze zwapnieniem tętnic wieńcowych, dysfunkcją śródbłonka i miażdżycą. Pomimo tych powiązań, dokładne mechanizmy łączące NAFLD z chorobami sercowo-naczyniowymi, takimi jak zawał mięśnia sercowego (MI), wymagają dalszych wyjaśnień. Wskaźnik zawału mięśnia sercowego jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności na świecie i stanowi znaczne obciążenie ekonomiczne. Ryzyko wystąpienia zawału mięśnia sercowego u pacjentów z NAFLD jest znacznie wyższe niż u osób bez NAFLD, co podkreśla potrzebę głębszego zrozumienia szlaków molekularnych łączących te schorzenia. Chociaż sugeruje się, że stan zapalny, stres oksydacyjny i metabolizm lipidów są czynnikami przyczyniającymi się do tego, dokładne mechanizmy pozostają niejasne. Istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych biomarkerów, które mogą dostarczyć informacji na temat prognozowania i leczenia zawału serca związanego z NAFLD.

W związku z tym, w tym badaniu, zestawy danych mikromacierzy RNA dla NAFLD i MI zostały pobrane z National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus (NCBI-GEO, patrz Tabela materiałów) w celu zidentyfikowania i przeanalizowania interakcji genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) między NAFLD i MI. Analiza wzbogacenia, budowa diagramu sieci interakcji białko-białko (PPI), wektor nośny - eliminacja cech rekurencyjnych (SVM-RFE), oraz algorytmy najmniejszego bezwzględnego operatora skurczu i selekcji (LASSO) zostały użyte do identyfikacji genów huba12,13,14,15,16,17,18,19. Przeprowadzono analizę naciekania immunologicznego w celu zbadania komórek odpornościowych u pacjentów z NAFLD i zawałem mięśnia sercowego. Ostatecznie metody te zostały zintegrowane, aby wyjaśnić związek między NAFLD i MI. Rysunek 1 ilustruje sekwencję projektową zastosowaną w tym badaniu. Łącząc bioinformatykę, uczenie maszynowe i analizę infiltracji immunologicznej, badanie to ma na celu przyczynienie się do opracowania nowatorskiej platformy wspomagającej podejmowanie decyzji medycznych.

Kluczowe wkłady tego artykułu to: (1) Identyfikacja genów o współekspresji: Badanie podkreśla związek między NAFLD i MI poprzez identyfikację genów o koekspresji, oferując głębsze zrozumienie molekularnych powiązań między tymi dwoma stanami. (2) Zastosowanie bioinformatyki i uczenia maszynowego: Wykorzystując techniki bioinformatyczne i uczenia maszynowego, w tym eliminację cech rekurencyjnych wektorów nośnych (SVM-RFE)17 i najmniejszy bezwzględny operator skurczu i selekcji (LASSO)19, badanie identyfikuje THBS1 jako gen o zróżnicowanej ekspresji. THBS1 wykazuje wysoką skuteczność w odróżnianiu pacjentów z NAFLD i MI od zdrowych osób z grupy kontrolnej. (3) Analiza naciekania immunologicznego: Badanie przeprowadza analizę naciekania immunologicznego, ujawniając znacznie niższe poziomy limfocytów T CD8 + i wyższe poziomy neutrofili u pacjentów z NAFLD i MI. (4) Analiza korelacji: Badania wykazują, że THBS1 jest dodatnio skorelowany z kilkoma czynnikami immunologicznymi, w tym CCR (receptor chemokiny), MHC klasy I (główny kompleks zgodności tkankowej klasy I), neutrofile, parazapalenie i komórki Tfh (pęcherzyki pomocnicze T). Jest ujemnie skorelowany z limfocytami T CD8 +, aktywnością cytolityczną i limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL).

Protokół

Szczegóły dotyczące baz danych, linków internetowych i oprogramowania/pakietów są wymienione w Tabeli Materiałów. Zastosowane parametry symulacji przedstawiono w tabeli 1.

1. Pobieranie zestawów danych mikromacierzy RNA

  1. Pobierz zestaw danych dotyczących zawału mięśnia sercowego (MI) GSE66360 z bazy danych NCBI-GEO.
  2. Pobierz zestaw danych dotyczących niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) GSE89632 z bazy danych NCBI-GEO.
  3. Upewnij się, że pobrane zestawy danych zawierają 49 próbek MI, 50 zdrowych kontrolek dla GSE66360, 39 próbek NAFLD i 24 kontrolki w dobrej kondycji dla GSE89632.

2. Identyfikacja stopni

  1. Wstępne przetwarzanie danych i identyfikacja DEG
    1. Załaduj zestawy danych do programu RStudio przy użyciu odpowiednich funkcji języka R.
    2. Wykorzystaj pakiet R limma, aby zidentyfikować DEGs12 z następującymi progami: P < 0.05P i | log FC | > 1.5.
    3. Użyj pakietów R pheatmap, ggplot2 i Venn, aby wygenerować mapy cieplne i diagramy Venna do wizualizacji DEGs.
  2. Tworzenie wizualizacji
    1. Użyj pheatmap, aby wygenerować mapy popularności DEP.
    2. Użyj ggplot2, aby utworzyć diagramy Venna pokazujące nakładanie się stopni DEG między NAFLD i MI.

3. Analiza wzbogacenia

  1. Wykonywanie analizy wzbogacania GO, KEGG i DO
    1. Załaduj DEG do pakietu języka R clusterProfiler13.
    2. Przeprowadź analizę wzbogacenia ontologii genów (GO), aby skategoryzować DEG na funkcje molekularne, procesy biologiczne i składniki komórkowe.
    3. Wykonaj analizę szlaku Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG), aby zmapować DEG na szlaki biochemiczne.
    4. Użyj analizy wzbogacenia ontologii choroby (DO), aby powiązać DEG z określonymi stanami klinicznymi.

4. Analiza PPI poprzez konstruowanie sieci PPI

  1. Użyj platformy internetowej STRING14, aby zbudować diagramy sieci interakcji białko-białko (PPI) dla co-DEG z wynikiem ufności 0,4.
  2. Wizualizacja sieci PPI za pomocą Cytoscape15.

5. Selekcja DEG centrum kandydatów poprzez zastosowanie algorytmów uczenia maszynowego

  1. Użyj algorytmów regresji SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) i LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) w RStudio, aby wybrać najbardziej odpowiednie DEGs16,17,18.
  2. Upewnij się, że SVM-RFE klasyfikuje i usuwa cechy iteracyjnie, podczas gdy LASSO regression19 stosuje regularyzację w celu zidentyfikowania rzadkiego zestawu DEGs.

6. Konstrukcja krzywej ROC do oceny wydajności diagnostycznej

  1. Użyj RStudio, aby przeprowadzić analizę krzywej ROC (Receiver Operating Characteristic)20.
  2. Oblicz pole pod krzywą (AUC) dla kluczowych współ-stopni.

7. Analiza infiltracji immunologicznej w celu zbadania infiltracji immunologicznej

  1. Wykonaj analizę wzbogacenia zestawu genów dla pojedynczej próbki (ssGSEA) przy użyciu pakietów R GSVA i GSEABase do analizy infiltracji immunologicznej w NAFLD i MI21.
  2. Porównaj względną liczebność typów komórek odpornościowych między próbkami NAFLD i MI a zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.

8. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj wszystkie analizy statystyczne w programie RStudio.
  2. Zastosuj analizę korelacji Pearsona do zbadania wzorców koekspresji genów.
  3. Zapewnij istotność statystyczną za pomocą P < 0,05,
    UWAGA: Przed uruchomieniem protokołu upewnij się, że wszystkie pakiety oprogramowania i języka R są prawidłowo zainstalowane i zaktualizowane do najnowszych wersji.

Wyniki

Kluczowe wyniki proponowanego badania są przedstawione tutaj, obejmując różne analizy przeprowadzone w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw NAFLD i MI.

Identyfikacja stopni <br /> W zbiorze danych GSE89632 76 genów regulowanych w górę i 20 genów regulowanych w dół zostało zidentyfikowanych jako NAFLD-DEG (Rysunek 2B,D), podczas gdy zestaw danych z GSE66360 ujawnił 118 genów regulowanych w górę i 8 w dół jako MI-DEG ( Figura 2C, E). Następnie współ-DEG uzyskano z nakładania się NAFLD-DEG i MI-DEG, identyfikując 13 DEG regulowanych w górę i 1 DEG regulowanych w dół wśród CO-DEG (Rysunek 2A).

Identyfikacja DEG unikalnych dla NAFLD i MI, a także tych wspólnych dla obu zaburzeń, dostarcza cennych informacji na temat procesów molekularnych leżących u podstaw tych chorób. Zrozumienie odrębnych i wspólnych wzorców ekspresji genów związanych z obydwoma schorzeniami pomaga wyjaśnić patofizjologię NAFLD i MI oraz może zidentyfikować potencjalne cele molekularne dla interwencji terapeutycznej. Dalsze badania nad co-DEG mogą ujawnić krytyczne regulatory lub szlaki niezbędne do interakcji między tymi dwoma zaburzeniami, ułatwiając opracowanie terapii celowanych mających na celu złagodzenie negatywnych skutków zdrowotnych związanych z NAFLD i MI.

Analiza wzbogacenia
Analiza GO wykazała, że NAFLD DEG były przede wszystkim wzbogacone w następujące procesy biologiczne (BP): różnicowanie komórek tłuszczowych, odpowiedź na lipopolisacharyd i procesy organizmu wielokomórkowego (p < 0,05, Rysunek 3A). W przypadku składników komórkowych (CC), DEG NAFLD były głównie związane z kompleksem kinazy 3-fosfatydyloinozytolu, światłem granulki wydzielniczej i światłem pęcherzyków cytoplazmatycznych (p < 0,05, Figura 3A). Jeśli chodzi o funkcję molekularną (MF), kluczowe działania obejmowały aktywność regulatora kinazy fosfatydyloinozytolu-3, aktywność aktywatora transkrypcji wiążącego DNA (specyficzna dla polimerazy RNA) i ogólna aktywność aktywatora transkrypcji wiążącej DNA (p < 0,05, Figura 3A).

Dla MI-DEG analiza BP wykazała wzbogacenie w chemotaksję leukocytów, aktywację leukocytów szpikowych i chemotaksję komórek (p < 0,05, Rysunek 3B). Analiza CC wykazała wzbogacenie w trzeciorzędowe granulki, granulki bogate w ficolinę-1 i światło granulek wydzielniczych (p < 0,05, Rysunek 3B). Analiza MF wykazała wzbogacenie w aktywność receptora rozpoznawania wzorców, wiązanie receptora RAGE i aktywność receptora immunologicznego (p < 0,05, Figura 3B).

Analiza wzbogacenia KEGG wykazała, że NAFLD-DEG były znacząco wzbogacone w następujące szlaki: IL-17, AGE-RAGE, TNF, różnicowanie osteoklastów, malaria, reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Chagasa i szlaki sygnałowe JAK-STAT (p < 0,05, Rysunek 3C). MI-DEG zostały wzbogacone w IL-17, TNF, metabolizm lipidów i miażdżycę, sygnalizację receptora toll-podobnego, sygnalizację receptora lektyny typu C, legionellozę, reumatoidalne zapalenie stawów i szlaki sygnałowe NF-κB (p < 0,05, Rysunek 3D). Analiza wzbogacenia ontologii choroby (DO) wykazała, że trzy najwyższe DEG zarówno dla NAFLD, jak i MI były istotnie związane z miażdżycą, miażdżycową chorobą sercowo-naczyniową i miażdżycą (p < 0,05, Rysunek 3E-F).

analiza diagramów sieciowych PPI
Na diagramie sieci PPI dla NAFLD zidentyfikowano 92 węzły i 250 krawędzi, co odzwierciedla złożoną sieć interakcji między białkami związanymi z tym schorzeniem. Podobnie, diagram sieci PPI dla MI ujawnił 117 węzłów i 587 krawędzi, co wskazuje na bardziej skomplikowaną sieć charakterystyczną dla molekularnego krajobrazu zawału mięśnia sercowego. Ponadto diagramy sieci PPI dla co-DEG zidentyfikowały 14 węzłów i 21 krawędzi, podkreślając potencjalne kluczowe interakcje między białkami wspólnymi dla NAFLD i MI (Rysunek 4A-F).

Sieci PPI są cenne dla konstruowania i analizowania celów terapeutycznych oraz dostarczają ważnych informacji na temat połączeń molekularnych leżących u podstaw NAFLD i MI. Unikalne topologie sieci obserwowane w NAFLD i MI podkreślają odrębne mechanizmy patofizjologiczne zaangażowane w te choroby. Co więcej, odkrycie wspólnych połączeń między co-DEG sugeruje potencjalne wspólne ścieżki lub sieci regulacyjne, które pośredniczą w interakcji między MI i NAFLD. Dalsze badania nad tymi powiązaniami mogą ujawnić nowe cele molekularne dla interwencji i rozwoju terapii, potencjalnie oferując nowe opcje leczenia tych złożonych chorób.

Badanie przesiewowe stopnia centrum kandydującego
Algorytm SVM-RFE17 został wykorzystany do badania przesiewowego pod kątem potencjalnych kluczowych DEG, co zaowocowało identyfikacją 6 genów w GSE89632 i 4 genów w GSE66360 (Rysunek 5A,B). Podobnie, algorytm LASSO19 został użyty do zidentyfikowania kandydatów na kluczowe DEG, dając 4 geny w GSE89632 i 5 genów w GSE66360 (Rysunek 5C,D). Warto zauważyć, że diagram Venna przedstawił przecięcie węzła DEG (THBS1) zidentyfikowanego przez analizy sieci SVM-RFE, LASSO i co-PPI, podkreślając jego znaczenie zarówno w patogenezie NAFLD, jak i MI (Rysunek 5F).

Te zaawansowane algorytmy uczenia maszynowego zapewniły solidne ramy do identyfikacji kluczowych DEG związanych z MI i NAFLD oraz dostarczyły cennych informacji na temat ich potencjału jako celów terapeutycznych lub diagnostycznych. Identyfikacja THBS1 jako genu węzłowego za pomocą wielu technik analitycznych podkreśla jego znaczenie w szlakach molekularnych leżących u podstaw obu chorób. Dalsze badania nad funkcjonalnym znaczeniem THBS1 i jego interakcjami w sieci co-PPI mogą wyjaśnić nowe mechanizmy łączące NAFLD i MI, potencjalnie torując drogę dla terapii celowanych i strategii medycyny precyzyjnej.

Wartość diagnostyczna jednego huba DEGs
Analizę ROC przeprowadzono w celu oceny skuteczności diagnostycznej zidentyfikowanych DEG piasty zarówno w zestawach danych NAFLD, jak i MI. Jak pokazano w Rysunek 6A,B, THBS1 wykazywał wysoką moc dyskryminacyjną, z AUC 0,981 (95% CI: 0,949-1,000) u pacjentów z NAFLD i 0,900 (95% CI: 0,834-0,956) u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego. Wysoka wydajność THBS1 jako biomarkera diagnostycznego podkreśla jego potencjalną przydatność w różnicowaniu między NAFLD, MI i zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.

Te wyniki sugerują, że THBS1 może służyć jako cenny marker stanu choroby, oferując klinicystom użyteczne narzędzie do oceny ryzyka i wczesnej identyfikacji. Aby ułatwić integrację THBS1 z praktyką kliniczną oraz poprawić opiekę nad pacjentem i leczenie, potrzebne są dalsze badania walidacyjne, aby potwierdzić jego dokładność diagnostyczną w różnych populacjach pacjentów i warunkach klinicznych.

Analiza infiltracji immunologicznej
ssGSEA przeprowadzono w celu przeanalizowania 29 genów związanych z odpornością między NAFLD/MI a grupą kontrolną (CON). W porównaniu z grupą CON, infiltracja komórek odpornościowych była znacznie zwiększona w grupach NAFLD i MI, szczególnie w przypadku CCR, MHC klasy I, neutrofili, parazapalenia i komórek Tfh (p < 0,05, Figura 7A,B). I odwrotnie, infiltracja komórek odpornościowych zmniejszyła się znacznie w grupach NAFLD i MI w porównaniu z grupą CON, szczególnie w przypadku limfocytów T CD8 +, aktywności cytolitycznej i limfocytów naciekających nowotwór (TIL) (p < 0,05, Figura 7C, D).

Te wyniki sugerują dysregulację infiltracji komórek odpornościowych zarówno w NAFLD, jak i MI, podkreślając złożony krajobraz immunologiczny związany z tymi warunkami. Zaobserwowane zmiany w składzie komórek odpornościowych dostarczają cennych informacji na temat procesów immunologicznych leżących u podstaw rozwoju i patofizjologii tych chorób. Dalsze zrozumienie tych cech immunologicznych może ujawnić nowe cele terapeutyczne dla interwencji i wesprzeć rozwój zindywidualizowanych planów leczenia w oparciu o profile immunologiczne pacjentów z NAFLD i zawałem mięśnia sercowego.

figure-results-1
Rysunek 1: Sekwencja projektowania systemu wspomagania decyzji medycznych do identyfikacji THBS1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Diagramy Venna, diagramy wulkanów i mapy cieplne. (A) Diagram Venna dla GSE89632 i GSE66360. (B) Diagram wulkaniczny genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) w GSE89632. (C) Wulkaniczny diagram stopni w GSE66360. (D) Diagram mapy cieplnej stopni w GSE89632. (E) Diagram mapy cieplnej stopni w GSE66360. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza wzbogacenia genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG). (A) Pięć pierwszych NALFD-DEG wzbogaciło ontologię genów (GO) w procesie biologicznym (BP), komponencie komórkowym (CC) i funkcji molekularnej (MF). (B) Pięć pierwszych MI-DEG wzbogaconych GO w BP, CC i MF. (C) Osiem najważniejszych szlaków sygnałowych NALFD-DEG wzbogaconych w encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG). (D) Osiem pierwszych MI-DEG wzbogaciło szlaki sygnałowe KEGG. (E) Pięć pierwszych NALFD-DEG wzbogaciło ontologię choroby (DO). (F) Pięć pierwszych MI-DEG wzbogaconych DO. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Diagramy sieci interakcji białko-białko (PPI). (A) Diagram sieci PPI niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) uzyskany z platformy internetowej String. (B) Diagram sieci PPI NAFLD uzyskany z Cytoscape. (C) Diagram sieci PPI zawału mięśnia sercowego (MI) uzyskany z platformy internetowej String. (D) Diagram sieci PPI MI uzyskany Cytoscape. (E) Diagram sieciowy PPI oddziaływań białek. (F) Diagram sieci PPI IL1B i FOS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Badanie DEG dla kandydatów na piastę. (A) Sześć kluczowych stopni uzyskanych przez SVM-RFE w NAFLD. (B) Cztery kluczowe DEG uzyskane przez SVM-RFE w zawale mięśnia sercowego (MI). (C) Cztery kluczowe stopnie uzyskane przez LASSO w NAFLD. (D) Pięć kluczowych stopni uzyskanych przez LASSO w stanie Michigan. (E) Tylko jeden stopień uzyskany z powyższych wyników na diagramie Venna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wartość diagnostyczna jednego węzła genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG). (A) Krzywe ROC w NAFLD. (B) Krzywe ROC w MI. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Dystrybucja naciekających komórek odpornościowych i korelacja między THBS1 a infiltrującymi komórkami odpornościowymi w niealkoholowej stłuszczeniowej chorobie wątroby (NAFLD) i zawale mięśnia sercowego (MI). (A) Dystrybucja naciekających komórek odpornościowych w NAFLD. (B) Dystrybucja naciekających komórek odpornościowych w zaw. (C) Korelacja między THBS1 a infiltrującymi komórkami odpornościowymi w NAFLD. (D) Korelacja między THBS1 a infiltrującymi komórkami odpornościowymi w MI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

) Narod
skrótnomenklatura
AucObszar pod krzywą
BpProces biologiczny
DWSkładnik komórkowy
oszukaćFormantów
StopniachGeny o zróżnicowanej ekspresji
robićOntologia choroby
iśćOntologia genów
KEGG (Orzech KEGGEncyklopedia genów i genomów z Kioto
lassoOperator najmniejszego bezwzględnego skurczu i selekcji
MfFunkcja molekularna
MIZawał
NAFLD (Międzynarodowa FederacjaNiealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby
PpiInterakcja białko-białko
RocCharakterystyki operatora odbiornika
ssGSEA (Morze Śródziemne)Analiza wzbogacenia zestawu genów dla pojedynczej próbki
SVM-RFE (Federacja Przekaźników Republikańskich)Wektor nośny Eliminacja funkcji rekurencyjnej maszyny
THBS1 (POWIERZCHNIA)Trombospondyna 1

Tabela 1: Parametry symulacji użyte w eksperymencie.

Dyskusja

Metoda opisana w tym badaniu ma znaczące implikacje dla badań nad mechanizmami molekularnymi leżącymi u podstaw NAFLD i MI. Identyfikując kluczowe biomarkery, takie jak THBS1, proponowany protokół oferuje potencjalne cele zarówno dla interwencji diagnostycznych, jak i terapeutycznych. Podejście to można rozszerzyć na inne złożone choroby obejmujące wiele szlaków i odpowiedzi immunologicznych, ułatwiając odkrywanie nowych biomarkerów i celów terapeutycznych. Co więcej, integracja technik bioinformatycznych i uczenia maszynowego zapewnia wszechstronne ramy dla medycyny spersonalizowanej, umożliwiając tworzenie dostosowanych strategii leczenia w oparciu o indywidualne profile molekularne. Metodę tę można również dostosować do stosowania w warunkach klinicznych w celu zwiększenia dokładności diagnostycznej i poprawy wyników leczenia pacjentów poprzez ukierunkowane interwencje.

NAFLD i zawał mięśnia sercowego (MI) to dwa główne obciążenia zdrowotne o znacznej częstości występowania i śmiertelności. NAFLD charakteryzuje się nagromadzeniem lipidów w wątrobie1. Coraz więcej dowodów sugeruje, że NAFLD niekorzystnie wpływa nie tylko na integralność strukturalną serca, ale także na jego funkcję, szczególnie w kontekście MI 22,23,24. Co więcej, istnieją przekonujące dowody wskazujące na silną korelację między NAFLD a miażdżycą. Badania wykazały, że częstość występowania i nasilenie NAFLD u pacjentów z niecukrzycowym zawałem serca są związane z chorobą wieńcową25. Wykazano, że NAFLD o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego jest niezależnym czynnikiem ryzyka, trzykrotnie zwiększającym ryzyko wystąpienia wielu zmian w tętnicach wieńcowych4. Jednak badania te koncentrują się przede wszystkim na NAFLD i zawałie mięśnia sercowego, pozostawiając mechanizmy leżące u podstaw związku między NAFLD a miażdżycą, które pozostają niejasne. Dlatego tak ważne jest zbadanie tych mechanizmów, aby zapobiec zawałowi serca związanemu z NAFLD.

W tym badaniu uzyskano dwa zestawy danych z NCBI-GEO. Analiza wykazała 13 DEG regulowanych w górę i 1 DEG regulowanych w dół między NAFLD i MI. Przeprowadzono analizę wzbogacenia funkcjonalnego, skonstruowano diagram sieci co-PPI, a do identyfikacji DEG węzła zastosowano dwa algorytmy uczenia maszynowego. W rezultacie, THBS1 został zidentyfikowany jako nowy biomarker o wyjątkowej skuteczności diagnostycznej zarówno dla NAFLD, jak i MI. Maszyna wektorów nośnych (SVM) to nadzorowana technika uczenia maszynowego szeroko stosowana do klasyfikacji i regresji17. Eliminacja cech rekurencyjnych (RFE) pomaga wybrać najważniejsze geny z próbki. Algorytm regresji LASSO19 stosuje regularyzację w celu poprawy dokładności przewidywania. Łącząc te algorytmy z co-DEG, byliśmy w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w poszukiwaniu optymalnych stopni szczegółowości.

Na podstawie analizy z wykorzystaniem dwóch algorytmów uczenia maszynowego i co-DEG, trombospondyna 1 (THBS1 lub TSP1) została zidentyfikowana jako kluczowy węzeł diagnostyczny DEG. THBS1 jest członkiem białek macierzy zewnątrzkomórkowej i został po raz pierwszy wykryty w płytkach krwi w odpowiedzi na stymulację trombiną26. Różne komórki, w tym komórki śródbłonka, komórki gwiaździste wątroby i komórki mięśni gładkich, mogą wytwarzać i wydzielać THBS1 do przestrzeni zewnątrzkomórkowej 27,28,29. THBS1 oddziałuje z CD36, znanym ligandem30, i wywiera działanie antyangiogenne poprzez regulację CD36 29,31, co podkreśla jego znaczącą rolę w chorobach sercowo-naczyniowych. Dodatkowo THBS1 może regulować angiogenezę i agregację płytek krwi poprzez interakcje z receptorami i białkami, takimi jak CD47, transformujący czynnik wzrostu-β i integryny32. Sugeruje to, że THBS1 może odgrywać kluczową rolę w tworzeniu skrzepliny, wrażliwym pękaniu płytki nazębnej i późniejszej przebudowie komór podczas MI 33,34,35.

Co więcej, rozwój NAFLD jest ściśle związany z syntezą wydzielanych białek w krążeniu. Kluczowe badanie opublikowane w czasopiśmie EBioMedicine wykazało, że THBS1, jako wydzielane białko, może służyć jako nowy biomarker NAFLD. Badanie to wykazało również, że egzogenne podawanie THBS1 poprawia odkładanie się lipidów w wątrobie poprzez hamowanie szlaków syntezy lipidów36. Warto zauważyć, że CD36 został zidentyfikowany jako kluczowy receptor dla działania THBS1 przeciwko NAFLD. Ponadto wykazano, że ABT-526, peptydowy analog THBS1, hamuje syntezę lipidów w hepatocytach. Odkrycia te dostarczają nowych informacji na temat diagnozowania i leczenia NAFLD i sugerują, że THBS1 może być nowym biomarkerem zarówno dla NAFLD, jak i zawału serca, oferując szybkie, proste i dostępne narzędzie diagnostyczne.

Najnowsze dowody podkreślają kluczową rolę odpowiedzi immunologiczno-zapalnych w progresji NAFLD i zawału serca. Kluczowe cechy obejmują ekspresję cytokin, regulację immunologiczną i aktywację układu neuroendokrynnego. Wabitsch i wsp. wykazali, że metformina zapewnia hepatoprotekcję poprzez hamowanie ekspresji limfocytów T CD8 + u myszy z NAFLD37. Dolejsi i in. zgłosili spadek liczby limfocytów T CD8 + i znaczne zmniejszenie zdolności naprawczej mięśnia sercowego38. Qin i wsp. stwierdzili, że neutrofile, jako część ogólnoustrojowego wskaźnika immunologiczno-zapalnego, są związane z wydalaniem albumin z moczem u pacjentów z NAFLD39. Zhang i wsp. wskazali, że infiltracja i degranulacja neutrofili są zaangażowane zarówno w procesy urazu, jak i rekonwalescencji podczas MI27.

Zgodnie z tymi odkryciami, obecne wyniki wykazały zwiększoną infiltrację CCR, MHC klasy I, neutrofili, parazapaleń i komórek Tfh, podczas gdy limfocyty T CD8 +, aktywność cytolityczna i TIL były zmniejszone u pacjentów z NAFLD i MI w porównaniu ze zdrowymi kontrolami. Co więcej, analiza korelacji wykazała, że THBS1 był dodatnio skorelowany z CCR, MHC klasy I, neutrofilami, parazapaleniem i komórkami Tfh oraz ujemnie skorelowany z limfocytami T CD8 +, aktywnością cytolityczną i TIL u pacjentów z NAFLD i MI. Obserwacje te sugerują, że THBS1 może przyczyniać się do modulacji odpowiedzi immunologicznej poprzez zwiększenie CCR, MHC klasy I, neutrofili, parazapalnego i komórek Tfh, przy jednoczesnym zmniejszeniu limfocytów T CD8 +, aktywności cytolitycznej i TIL podczas rozwoju i progresji NAFLD i MI. Jednak spekulacje te wymagają dalszych badań, aby potwierdzić dokładną rolę THBS1 w tych procesach.

Badanie to miało na celu wyjaśnienie powiązań molekularnych między NAFLD i MI przy użyciu kompleksowych podejść bioinformatycznych i uczenia maszynowego. Odkrycia zidentyfikowały 96 genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) w NAFLD i 126 w MI, przy czym 14 stopni genów nakłada się na te dwa stany. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego wykazała, że te DEG są zaangażowane w krytyczne procesy i szlaki biologiczne, takie jak różnicowanie komórek tłuszczowych, chemotaksja leukocytów i różne szlaki sygnałowe, w tym IL-17, TNF i NF-κB. Wyniki te podkreślają skomplikowane wzajemne oddziaływanie szlaków zapalnych i metabolicznych w NAFLD i zawałie mięśnia sercowego. Konstrukcja diagramów sieci interakcji białko-białko (PPI) w połączeniu z analizami uczenia maszynowego (SVM-RFE i LASSO) zidentyfikowała THBS1 jako kluczowy gen węzłowy. THBS1 wykazał doskonałą skuteczność diagnostyczną, z polem pod krzywą (AUC) wynoszącym 0,981 dla NAFLD i 0,900 dla MI, co sugeruje jego potencjał jako solidnego biomarkera dla obu schorzeń.

Co więcej, analiza infiltracji immunologicznej ujawniła odrębne profile komórek odpornościowych u pacjentów z NAFLD i MI w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. W szczególności pacjenci z NAFLD i MI wykazywali zwiększoną infiltrację CCR, MHC klasy I, neutrofili, parastanu zapalnego i komórek Tfh, wykazując jednocześnie obniżony poziom limfocytów T CD8 +, aktywność cytolityczną i TIL. Te cechy immunologiczne podkreślają zapalny charakter obu schorzeń i podkreślają rolę THBS1 w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej.

Badanie to dostarcza nowych informacji na temat wspólnych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw NAFLD i zawału mięśnia sercowego, przy czym THBS1 jawi się jako nowy biomarker do diagnozy i potencjalny cel terapeutyczny. Odkrycia torują drogę do przyszłych badań nad ukierunkowanymi interwencjami i spersonalizowanymi strategiami leczenia pacjentów z tymi wzajemnie powiązanymi schorzeniami. Integrując bioinformatykę, uczenie maszynowe i analizę infiltracji immunologicznej, badania przyczyniają się do opracowania platformy wspomagającej podejmowanie decyzji medycznych, której celem jest poprawa klinicznego zarządzania NAFLD i zawałem mięśnia sercowego.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 62271511, U21A200949), Fundację Yucai Szpitala Ogólnego Dowództwa Południowego Teatru Działań (2022NZC011), Projekt Programu Nauki i Technologii w Kantonie (2023A03J0170), Narodowe Centrum Badań Klinicznych Geriatrii (NCRCG-PLAGH-2023006) oraz Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych i Stosowanych Guangdong (nr 2020A1515010288, nr 2021A1515220101).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CytoscapeCytoscape Consortiumwersja 3.6.1Służy do wizualizacji sieci interakcji białko-białko (PPI)
MI dataset GSE66360 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).Baza danych NCBI-GEO -Do zbierania zestawów danych mikromacierzy RNA do analizy
Pakiet R clusterProfilerBioconductor -Używany do analiz wzbogacania GO, KEGG i DO
Pakiet R ggplot2CRAN&nbsp;-Służy do tworzenia diagramów Venna i innych wizualizacji
Pakiet R GSEABaseBioconductor -Używany w połączeniu z GSVA do analizy wzbogacenia zestawu genów
Pakiet R GSVABioconductor -Używany do analizy wzbogacania zestawu genów pojedynczej próbki (ssGSEA)
Pakiet R limmaBioconductor -Używany do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG)
Pakiet R pheatmapCRAN -Służy do generowania map cieplnych
Pakiet R vennCRAN -Służy do tworzenia diagramów Venna
Zestawy danych mikromacierzy RNA (GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO -Publicznie dostępne zestawy danych mikromacierzy RNA używane do analizy
RStudioRStudio, PBCw wersji 1.4.1717Zintegrowane środowisko programistyczne dla
bazy danych R StringSTRING (www.string-db.org/) -Narzędzie online do budowy sieci PPI
,

Bibliografia

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907(2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47(2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123(2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972(2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371(2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907(2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50(2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza bioinformatycznauczenie maszynowemaszyna wektor w no nychoddzia ywanie bia ko bia kogen r nicowo wyra anylimfocyty T CD8poziomy neutrofili
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły