Method Article

Kwantyfikacja modulacji aktywności enzymu elastazy za pomocą analizy kolorymetrycznej

DOI:

10.3791/67331

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Research, Development and Innovation in Health Biotechnology of Elche (IDiBE), Miguel Hernández University (UMH), 2CIBER, Pathophysiology of Obesity and Nutrition, CIBERobn, Carlos III Health Institute (CB12/03/30038)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje rozwój metody testu kolorymetrycznego do określania zdolności związków do hamowania lub aktywowania aktywności elastazy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastaza, proteaza serynowa, odgrywa istotną rolę w degradacji elastyny. Elastyna jest białkiem zewnątrzkomórkowym, które pomaga utrzymać elastyczność tkanek w płucach, skórze i naczyniach krwionośnych. Ścisła regulacja aktywności elastazy ma kluczowe znaczenie dla homeostazy tkanek, ponieważ rozregulowanie może przyczyniać się do patologii, takich jak rozedma płuc, zmarszczki i miażdżyca. Niektóre związki, takie jak naturalnie występujące fitochemikalia, wykazały potencjał interwencji terapeutycznej i wzbudziły duże zainteresowanie. Wyjaśnienie modulacyjnego wpływu różnych związków na elastazę, zarówno hamującego, jak i stymulującego, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii terapeutycznych i kosmetycznych ukierunkowanych na zaburzenia związane z elastazą. Powszechnie akceptowaną metodą pomiaru aktywności elastazy jest kolorymetryczny test elastazy. W tym teście specyficzny substrat jest używany do rozkładu elastazy, uwalniając wykrywalny żółty związek, p-nitroanilinę (pNA). Ilość wytworzonego pNA odzwierciedla aktywność elastazy w próbce i może być mierzona za pomocą kolorymetrii. Test ten oferuje kilka korzyści, w tym prostotę, wysoką czułość, szybkie wyniki i możliwość dostosowania do różnych potrzeb badawczych. Test elastazy kolorymetrycznej pozostaje cennym narzędziem do badania, w jaki sposób związki wpływają na aktywność elastazy. Ze względu na łatwość użycia i skuteczność, test ten jest kamieniem węgielnym badań w tej dziedzinie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastaza to enzym proteazy seryny, który odgrywa kluczową rolę w rozbijaniu elastyny, białka, które zapewnia elastyczność różnym tkankom w ciele, w tym płucom, skórze i naczyniom krwionośnym. Aktywność elastazy jest ściśle regulowana w celu utrzymania homeostazy tkanek, a rozregulowanie może prowadzić do stanów patologicznych i skórnych, takich jak rozedma płuc, miażdżyca i zmarszczki skóry1.

Istnieje kilka rodzajów elastaz, z których każdy ma określone cechy i funkcje. Elastazy neutrofilowe, wytwarzane przez neutrofile, są ważne w odpowiedzi immunologicznej i zapaleniu. Enzymy te mogą rozkładać szeroką gamę białek z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie 0,2 M bazowego buforu reakcyjnego (RB) Tris

  1. Zważyć odpowiednią zasadę Tris za pomocą wagi analitycznej.
  2. Przenieś bazę Tris do zlewki i dodaj wodę dejonizowaną za pomocą cylindra z podziałką.
  3. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego, aż do całkowitego rozpuszczenia zasady Tris.
  4. Dostosuj pH do 8,0, dodając kroplami 4 N HCl. Użyj pH-metru, aby monitorować pH.
  5. Po osiągnięciu pożądanego pH przenieść roztwór do kolby miarowej i napełnić ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zakończeniu protokołu można uzyskać dane dotyczące absorbancji niezbędne do przeprowadzenia odpowiednich obliczeń i ilościowego określenia zdolności próbek do modulowania aktywności elastazy. Rysunek 3 przedstawia lokalizację studni z różnymi kontrolami i próbkami. W przypadku próbek kolorowych, takich jak ta użyta w tym przykładzie, konieczne jest dodanie kontroli koloru w celu zminimalizowania interferencji spektrofotometrycznej, ponieważ kolor może zakłócać pomiar żółtego koloru pNA pr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej metodzie modulacyjny wpływ fitochemikaliów na enzymy elastazy jest badany za pomocą testu kolorymetrycznego. Elastaza, proteaza serynowa kluczowa dla degradacji elastyny, odgrywa znaczącą rolę w utrzymaniu elastyczności tkanek w różnych narządach. Kolorymetryczny test elastazy opisany w tej pracy oferuje prostą, czułą i szybką metodę pomiaru aktywności elastazy.

W tym kontekście naukowcy skupili się na modulatorach, takich jak ekstrakty roślinne i czyste fitochemikalia, ze względu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE; projekty: RTI2018-096724-B-C21, TED2021-129932B-C21 i PID2021-125188OB-C32) oraz Generalitat Valenciana (PROMETEO/2021/059). Prace te były również wspierane przez Oficjalną Agencję Finansującą Badania Biomedyczne rządu hiszpańskiego, Instytut Zdrowia Carlosa III (ISCIII) za pośrednictwem CIBEROBN (CB12/03/30038), Agencia Valenciana de la Innovación: INNEST/2022/103; , który jest współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. E.B.-C oraz M.H.-L. zostały wsparte w ramach Rekwalifikacji Hiszpańskiego Systemu Uniwersyteckieg....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well Cell Culture PlateCorning Incorporated3599Płaskie dno z pokrywką, polistyren
Czytnik wielomodowy do obrazowania komórekAgilentBioTek Cytation 1Używany z oprogramowaniem Gen5
Elastaza z trzustki świniSigma-AldrichE7885CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
Izopropanol 99,5%Fisher ScientificAC184130010CAS 67-63-0; C3H8O; 60,10 g/mol
N-sukcynil-(Ala)3-nitroanilidSigma-AldrichS4760CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451,43 g/mol
pH-metrHach LangesensION+ PH31Z mieszadłem magnetycznym i uchwytem czujnika
Fluorek fenylometanosulfonyluSigma-AldrichP7626CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol
Tris dla biologii molekularnejPanReac AppliChemA2264CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Imokawa, G., Ishida, K. Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging. Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).
  2. Voynow, J. A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastase ActivityColorimetric AssayElastin DegradationEnzyme InhibitionSerine ProteasePlant ExtractsMicroplate ReaderTissue ElasticityAbsorbance MeasurementReaction Buffer

Related Articles