Ten protokół opisuje rozwój metody testu kolorymetrycznego do określania zdolności związków do hamowania lub aktywowania aktywności elastazy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja modulacji aktywności enzymu elastazy za pomocą analizy kolorymetrycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elastaza, proteaza serynowa, odgrywa istotną rolę w degradacji elastyny. Elastyna jest białkiem zewnątrzkomórkowym, które pomaga utrzymać elastyczność tkanek w płucach, skórze i naczyniach krwionośnych. Ścisła regulacja aktywności elastazy ma kluczowe znaczenie dla homeostazy tkanek, ponieważ rozregulowanie może przyczyniać się do patologii, takich jak rozedma płuc, zmarszczki i miażdżyca. Niektóre związki, takie jak naturalnie występujące fitochemikalia, wykazały potencjał interwencji terapeutycznej i wzbudziły duże zainteresowanie. Wyjaśnienie modulacyjnego wpływu różnych związków na elastazę, zarówno hamującego, jak i stymulującego, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii terapeutycznych i kosmetycznych ukierunkowanych na zaburzenia związane z elastazą. Powszechnie akceptowaną metodą pomiaru aktywności elastazy jest kolorymetryczny test elastazy. W tym teście specyficzny substrat jest używany do rozkładu elastazy, uwalniając wykrywalny żółty związek, p-nitroanilinę (pNA). Ilość wytworzonego pNA odzwierciedla aktywność elastazy w próbce i może być mierzona za pomocą kolorymetrii. Test ten oferuje kilka korzyści, w tym prostotę, wysoką czułość, szybkie wyniki i możliwość dostosowania do różnych potrzeb badawczych. Test elastazy kolorymetrycznej pozostaje cennym narzędziem do badania, w jaki sposób związki wpływają na aktywność elastazy. Ze względu na łatwość użycia i skuteczność, test ten jest kamieniem węgielnym badań w tej dziedzinie.
Wprowadzenie
Elastaza to enzym proteazy seryny, który odgrywa kluczową rolę w rozbijaniu elastyny, białka, które zapewnia elastyczność różnym tkankom w ciele, w tym płucom, skórze i naczyniom krwionośnym. Aktywność elastazy jest ściśle regulowana w celu utrzymania homeostazy tkanek, a rozregulowanie może prowadzić do stanów patologicznych i skórnych, takich jak rozedma płuc, miażdżyca i zmarszczki skóry1.
Istnieje kilka rodzajów elastaz, z których każdy ma określone cechy i funkcje. Elastazy neutrofilowe, wytwarzane przez neutrofile, są ważne w odpowiedzi immunologicznej i zapaleniu. Enzymy te mogą rozkładać szeroką gamę białek z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie 0,2 M bazowego buforu reakcyjnego (RB) Tris
- Zważyć odpowiednią zasadę Tris za pomocą wagi analitycznej.
- Przenieś bazę Tris do zlewki i dodaj wodę dejonizowaną za pomocą cylindra z podziałką.
- Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego, aż do całkowitego rozpuszczenia zasady Tris.
- Dostosuj pH do 8,0, dodając kroplami 4 N HCl. Użyj pH-metru, aby monitorować pH.
- Po osiągnięciu pożądanego pH przenieść roztwór do kolby miarowej i napełnić ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po zakończeniu protokołu można uzyskać dane dotyczące absorbancji, które są niezbędne do przeprowadzenia odpowiednich obliczeń i ilościowego określenia zdolności próbek do modulowania aktywności elastazy. Rysunek 3 przedstawia rozmieszczenie studzienek z różnymi kontrolami i próbkami. W przypadku próbek kolorowych, takich jak ta użyta w niniejszym przykładzie, konieczne jest dodanie kontroli koloru w celu zminimalizowania interferencji spektrofotometrycznej, ponieważ kolor może zakłócać pomi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej metodzie modulacyjny wpływ fitochemikaliów na enzymy elastazy jest badany za pomocą testu kolorymetrycznego. Elastaza, proteaza serynowa kluczowa dla degradacji elastyny, odgrywa znaczącą rolę w utrzymaniu elastyczności tkanek w różnych narządach. Kolorymetryczny test elastazy opisany w tej pracy oferuje prostą, czułą i szybką metodę pomiaru aktywności elastazy.
W tym kontekście naukowcy skupili się na modulatorach, takich jak ekstrakty roślinne i czyste fitochemikalia, ze względu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE; projekty: RTI2018-096724-B-C21, TED2021-129932B-C21 i PID2021-125188OB-C32) oraz Generalitat Valenciana (PROMETEO/2021/059). Prace te były również wspierane przez Oficjalną Agencję Finansującą Badania Biomedyczne rządu hiszpańskiego, Instytut Zdrowia Carlosa III (ISCIII) za pośrednictwem CIBEROBN (CB12/03/30038), Agencia Valenciana de la Innovación: INNEST/2022/103; , który jest współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. E.B.-C oraz M.H.-L. zostały wsparte w ramach Rekwalifikacji Hiszpańskiego Systemu Uniwersyteckieg....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning Incorporated | 3599 | Płaskie dno z pokrywką, polistyren |
| Czytnik wielomodowy do obrazowania komórek | Agilent | BioTek Cytation 1 | Używany z oprogramowaniem Gen5 |
| Elastaza z trzustki świni | Sigma-Aldrich | E7885 | CAS 39445-21-1; 25,9 kDa |
| Izopropanol 99,5% | Fisher Scientific | AC184130010 | CAS 67-63-0; C3H8O; 60,10 g/mol |
| N-sukcynil-(Ala)3-nitroanilid | Sigma-Aldrich | S4760 | CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451,43 g/mol |
| pH-metr | Hach Lange | sensION+ PH31 | Z mieszadłem magnetycznym i uchwytem czujnika |
| Fluorek fenylometanosulfonylu | Sigma-Aldrich | P7626 | CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 g/mol |
| Tris dla biologii molekularnej | PanReac AppliChem | A2264 | CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol |
Bibliografia
- Imokawa, G., Ishida, K. Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging. Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).
- Voynow, J. A., ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
