Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Podsumowanie

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Streszczenie

Obrazowanie za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej stało się kluczową techniką badania dynamicznych procesów biologicznych, zwłaszcza w kontekście regeneracji tkanek, rozwoju guza i odpowiedzi terapeutycznych. W szczególności szpik kostny calwarii jest tkanką wysoce dynamiczną, w której los układu krwiotwórczego jest powiązany z otaczającym mikrośrodowiskiem, z wyspecjalizowanymi naczyniami reagującymi na normalną i patologiczną hematopoezę. Tradycyjne obrazowanie tkanek utrwalonych dostarcza informacji statycznych, często ograniczając kompleksowe zrozumienie tych procesów.

Integracja transgenicznych zwierząt wykazujących ekspresję markerów specyficznych dla komórek, znaczników żywych komórek, postęp w sprzęcie do obrazowania oraz wykorzystanie specjalistycznych komór sprawiły, że mikroskopia przykomórkowa stała się kluczowym narzędziem do uzyskiwania wglądu w dynamiczne zjawiska biologiczne. Jednym z zastosowań obrazowania przyżyciowego jest badanie zachowania naczyń nowotworowych i efektów terapeutycznych. Nowo zaprojektowany, wydrukowany w 3D tytanowy implant mocujący głowę może być stabilnie połączony z czaszką myszy i nadaje się do obrazowania wzdłużnego podczas wielu sesji.

Proponowany protokół pozwala na przestrzenne i czasowe badanie dynamiki naczyń w szpiku kostnym kalwarii, w tym wizualizację i kwantyfikację niejednorodności naczyniowej, interakcję z komórkami zrębu i krwiotwórczemu oraz pomiar parametrów funkcjonalnych naczyń. Dodatkowo technika umożliwia wizualizację ustalonych łożysk naczyniowych oraz monitorowanie efektów terapeutycznych, mobilizacji komórek macierzystych oraz lokalizacji związków chemoterapeutycznych w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół obrazowania podłużnego przyżyciowego stanowi kompleksową platformę do badania zarówno zachowania naczyń nowotworowych, jak i dynamiki komórek krwiotwórczych, oferując cenny wgląd w skomplikowane procesy rządzące tymi zjawiskami biologicznymi.

Wprowadzenie

Obrazowanie przyżyciowe szpiku kostnego nazębnego (BM) służy jako potężna i niezbędna technika do badania dynamicznych procesów hematopoezy, regulacji mikrośrodowiska tkanek i dynamiki naczyń w niszy BM. Głównym celem tego podejścia metodologicznego jest umożliwienie wizualizacji i analizy w czasie rzeczywistym zachowań, interakcji i organizacji przestrzennej komórek w mikrośrodowisku BM in vivo. Poprzez bezpośrednią obserwację kalwarii BM przy użyciu zaawansowanych technik obrazowania w połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, naukowcy mogą wyjaśnić złożone wzajemne oddziaływanie między hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC), komórkami zrębu i otaczającymi naczyniami krwionośnymi, dostarczając w ten sposób kluczowych informacji na temat regulacji hematopoezy i odpowiedzi immunologicznej.

Rozwój i wykorzystanie obrazowania za pomocą mikroskopii przyżyciowej wynika z ograniczeń tradycyjnych metod obrazowania histologicznego i ex vivo, które często nie są w stanie uchwycić dynamicznej natury zachowań komórkowych i interakcji w tkance. W przeciwieństwie do technik obrazowania statycznego, mikroskopia przyżyciowa umożliwia naukowcom obserwację dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym, co pozwala na badanie procesów podłużnych, takich jak migracja komórek, proliferacja i różnicowanie w ich rodzimej niszy, bez poświęcania zwierząt doświadczalnych. Co więcej, mikroskopia przyżyciowa zapewnia wyjątkową zaletę badania zachowań funkcjonalnych in vivo, takich jak funkcjonalność naczyń krwionośnych (np. perfuzja, przepuszczalność, niedotlenienie), zachowując w ten sposób znaczenie fizjologiczne i unikając artefaktów związanych z utrwalaniem i przetwarzaniem tkanek. Pionierskie badania w tej dziedzinie wykazały ogromne zalety tego podejścia ^1,2, a ich wyniki zostały potwierdzone i rozszerzone przez ostatnio udoskonalone podejścia ^3,4,5, które wykorzystywały mikroskopię przyżyciowe do śledzenia endogennej lokalizacji HSC, migracji i interakcji z naczyniami krwionośnymi w niszy BM. Co więcej, mikroskopia przyżyciowa odegrała zasadniczą rolę w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń krwiotwórczych, takich jak białaczka i zespoły niewydolności BM, oferując nowe informacje na temat ruchliwości komórek białaczkowych ^6,7, implikacji naczyniowych związanych z chorobą⁸ i odpowiedzi na lek⁹.

Istnieje kilka zalet obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym kości kalczastej w celu pokrycia alternatywnych miejsc kostnych. Po pierwsze, BM zawarty w kości czaszki zapewnia łatwy dostęp do obrazowania przyżyciowego w porównaniu z głębszymi kośćmi, takimi jak kość udowa lub piszczelowa. Ta dostępność ułatwia bezpośrednią obserwację mikrośrodowiska tkankowego, w tym samej kości, poprzez wizualizację generacji drugiej harmonicznej (SHG)¹⁰, bez konieczności wykonywania inwazyjnych zabiegów chirurgicznych. Po drugie, czaszka jest stosunkowo cienka i półprzezroczysta, co pozwala na lepszą wizualizację dynamiki komórkowej w niszy BM. Ta przezroczystość ułatwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii dwufotonowej, mikroskopii konfokalnej i mikroskopii z użyciem arkuszy świetlnych, bez konieczności stosowania technik rozrzedzania lub oczyszczania kości. Kość nazębna stanowi stabilną, płaską i sztywną platformę do eksperymentów obrazowania przyżyciowego, minimalizując artefakty ruchu tkanek i zapewniając spójne warunki obrazowania przez długie okresy obserwacji. Ta stabilność jest szczególnie korzystna w badaniach podłużnych śledzących zachowania i reakcje komórek w czasie. Powtarzalność jest kolejną wielką zaletą, biorąc pod uwagę stosunkowo małą i przestrzennie zdefiniowaną strukturę kości calwarialnej u zwierząt doświadczalnych. Ta jednorodność ułatwia porównywanie różnych grup eksperymentalnych i umożliwia solidną analizę statystyczną danych obrazowych.

Tutaj opisujemy metodę obrazowania BM kalwarii kalowej myszy za pomocą przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej poprzez wprowadzenie nowo opracowanego implantu mocującego głowę¹¹, wydrukowanego w 3D przy użyciu biokompatybilnego stopu tytanu klasy 23 (Ti6Al4V), który posiada dedykowaną i łatwą do umiejscowienia twardą okładkę wykonaną z tego samego stopu tytanu, umożliwiającą bezpieczne zamknięcie rany, aby uniknąć infekcji lub uszkodzenia miejsca operacji. Implant mocno i stabilnie mocuje głowę myszy do stolika mikroskopowego za pomocą uchwytu implantu, minimalizując artefakty oddychania i umożliwiając obrazowanie wzdłużne tych samych obszarów w czasie. Podano kilka przykładów wielokolorowych obrazów przedstawiających komórki i struktury z mikrośrodowiska BM (powierzchnia kości SHG⁺; komórki mezenchymalne nestyny-GFP⁺; komórki śródbłonka cdh5-DSRED⁺, cdh5-GFP⁺ lub pdgfb-GFP⁺) i złośliwy przedział krwiotwórczy (komórki AML tdTOMATO⁺), a także fluorescencyjne środki kontrastowe obrazujące światło naczyń (dextran-TRITC). Parametry naczyniowe mierzone przez godziny lub dni, w tym długość naczynia, prostoliniowość i średnica, a także przepuszczalność w różnych obszarach naczyniowych, mogą dostarczyć ważnych informacji na temat zachowania i zdrowia tkanek.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z umową etyczną APAFIS#27215-2020041513522374 v6, zatwierdzoną przez francuskie "Ministère de l'enseignement supérieur, de la recherche et de l'innovation".

1. Projekt biokompatybilnego tytanowego implantu mocującego głowę do druku 3D

UWAGA: Zaprojektowaliśmy biokompatybilny implant stabilizujący głowę przy użyciu oprogramowania CAD do modelowania parametrycznego z wbudowanymi funkcjami analizy elementów skończonych (MES) (patrz Tabela materiałów). Podstawowe dane wejściowe w procesie projektowania obejmują model anatomiczny czaszki myszy o wysokiej rozdzielczości, model obiektywu mikroskopu oraz model systemu mocowania, które razem informują o wymiarach i konfiguracji implantu. Końcowym wynikiem jest niezależny od platformy plik siatki, zwykle w formacie STL lub STEP, kompatybilny z większością programów do drukowania 3D. Ten format pliku zapewnia bezproblemowy transfer do drukarki 3D w celu dokładnego wykonania implantu.

1. Przygotowanie modelu 3D myszy
   1. Umieścić czaszkę myszy, przygotowaną lub in vivo, w mikrotomografie komputerowym.
   2. Ustaw parametry skanowania, aby uzyskać optymalną rozdzielczość drobnych szczegółów anatomicznych: otwórz Panel sterowania i w sekcji Warunki skanowania wybierz pole widzenia (FOV). Użyj widoku LiveView , aby zdefiniować wolumin skanowania.
      UWAGA: Poprzez rozdzielczość detektora pole widzenia określi rozmiar woksela na podstawie rozdzielczości detektora. W nowszych mikro-tomografach komputerowych pole widzenia 5 mm zwykle odpowiada rozmiarowi woksela 5 μm, pole widzenia 10 mm rozmiarowi woksela 10 μm, pole widzenia 25 mm rozmiarowi woksela 21 μm. Ograniczone pole widzenia przy tej rozdzielczości może wymagać wielu skanów, aby pokryć całą czaszkę. Wielokrotne skanowania wymagają nakładania się skanów.
   3. Połącz ze sobą wiele skanów o wysokiej rozdzielczości w oprogramowaniu do obrazowania, aby stworzyć jeden, kompleksowy model czaszki.
   4. Zaimportuj pliki DICOM micro-CT do oprogramowania do segmentacji (np. 3D Slicer, Amira, Avizo lub Mimics), aby wyizolować czaszkę.
   5. Wykonuj segmentację opartą na progach, aby oddzielić tkankę kostną od otaczających struktur i dokonaj ręcznych korekt w celu udoskonalenia złożonych lub hałaśliwych regionów.
      1. We fragmentatorze 3D najpierw zaimportuj pliki DICOM, załaduj zestaw danych i obserwuj wycinki CT w widokach wycinków osiowych, strzałkowych i koronalnych .
      2. Otwórz edycję segmentu, kliknij przycisk Dodaj , aby utworzyć nową segmentację | Dodaj , aby utworzyć nowy segment, który ma być progowy.
      3. W panelu Edytor segmentów kliknij efekt Próg . Dostosuj suwaki Dolny i Górny próg (lub wpisz wartości liczbowe) tak, aby region, który ma zostać podzielony na segmenty, był podświetlony na czerwono w widokach plasterków. Progowy segment 3D jest gotowy.
   6. Aby wyeksportować czaszkę podzieloną na segmenty jako plik STL, przejdź do modułu segmentacji. Upewnij się, że wybrano segment z progiem. W sekcji Eksport/Importuj modele i mapy etykiet ustaw Typ eksportu na Modele. i Format pliku: STL. Kliknij przycisk Eksportuj .
      UWAGA: Pliki STL używają trójkątnego formatu siatki, reprezentującego powierzchnię czaszki za pomocą tysięcy trójkątów, oddając anatomiczny kształt w najdrobniejszych szczegółach.
      1. W razie potrzeby wykonaj szycie w MeshLab w następujący sposób:
         1. Zaimportuj siatki, klikając Plik | Importuj siatkę i wybierz jedną z nich jako skan referencyjny.
         2. Wyrównywanie innych skanów za pomocą narzędzia Wyrównaj (punkt menu Filtry | Rejestracja | Wyrównaj), zaznaczając odpowiednie punkty i używając opcji Proces.
         3. Scal wyrównane skany, klikając Filtry | Warstwa siatki | Spłaszcz widoczne warstwy za pomocą opcji Scal tylko widoczne warstwy .
   7. Oczyść i napraw siatkę, eliminując zduplikowane wierzchołki i trójkąty w następujący sposób, aby zapewnić usunięcie trójkątów wywołanych hałasem i wypełnienie wszelkich niezamierzonych otworów, aby uzyskać gładką i ciągłą powierzchnię:
      1. Kliknij Filtry | Czyszczenie i naprawa | Usuń zduplikowane wierzchołki.
      2. Kliknij Filtry | Czyszczenie i naprawa | Usuń zduplikowane twarze.
      3. Kliknij Filtry | Czyszczenie i naprawa | Usuń izolowane kawałki (według numeru twarzy). Określ próg dla minimalnej liczby powierzchni do zachowania (np. ustaw ten próg na niskim poziomie, aby usunąć małe skupiska lub szum).
      4. Kliknij Filtry | Ponowne tworzenie siatki, upraszczanie i rekonstrukcja | Zamknij otwory.
   8. Uprość siatkę do ~10 000-30 000 trójkątów, ponieważ początkowe pliki STL z micro-CT zawierają bardzo dużą liczbę trójkątów, które nie są kompatybilne z oprogramowaniem CAD. W obszarach o dużej szczegółowości należy zachować mniejsze trójkąty na górze czaszki, aby zapewnić dokładne dopasowanie implantu. W grubszych regionach należy uprościć mniej krytyczne regiony za pomocą większych trójkątów, aby zmniejszyć rozmiar pliku i zoptymalizować wydajność przetwarzania.
      UWAGA: Uproszczenie siatki jest dokonywane według obszarów i szczegółowo opisane w 1.1.8.1-1.1.8.3.
      1. Użyj narzędzia wyboru Wybierz połączone komponenty w regionie , aby wybrać obszary do uproszczenia.
      2. Użyj Quadratic Edge Collapse Decymation na wybranych obszarach z parametrami. Kliknij Filtry | Ponowne tworzenie siatki, upraszczanie i rekonstrukcja | Uproszczenie: Zdziesiątkowanie zapadania się krawędzi kwadratowej. Ustaw Próg jakości na 0,8, Zachowaj obwiednię siatki na TAK, Zachowaj topologię na TAK, Docelowa liczba ścian: ustaw liczbę docelową odpowiadającą wymaganej rozdzielczości .
      3. W razie potrzeby wykonuj iteracje, aż całkowita liczba trójkątów zostanie zmniejszona do żądanego poziomu. Następnie zapisz uproszczony model w pliku STL.
2. Przygotowanie modelu czaszki w modelu CAD
   1. Zaimportuj uproszczony model czaszki w formacie STL do oprogramowania CAD jako nową część lub model. Upewnij się, że zaimportowany plik jest poprawnie przekonwertowany na bryłę lub powierzchnię, jeśli to konieczne, w zależności od możliwości oprogramowania. Zapisz model w natywnym formacie pliku CAD, aby umożliwić dalsze modyfikacje i zapewnić kompatybilność z kolejnymi krokami projektowania.
   2. Umieść punkty odniesienia na Bregma i Lambda i utwórz oś Bregma-Lambda w tym modelu.
   3. Utwórz płaszczyznę pasa rozdzielającego z osią Bregma-Lambda.
   4. w płaszczyźnie pasa środkowego utwórz oś styczną do kalwarii, a następnie zapisz przygotowaną czaszkę (rysunek uzupełniający S1).
   5. Utwórz nowy zespół i wstaw przygotowaną czaszkę w taki sposób, aby Bregma pokrywała się z początkiem układu współrzędnych, płaszczyzna pasa środkowego z prawą płaszczyzną, a oś kości kalwaryjnej była pozioma.
   6. Implant mocujący głowę zostanie zaprojektowany bezpośrednio w zespole, aby zapewnić idealne dopasowanie do przygotowanego modelu czaszki. Aby to osiągnąć, należy utworzyć implant jako nową część w zespole. Zacznij od przejścia do punktu menu Wstaw | Składnik | Nowa część w oprogramowaniu CAD. Po wyświetleniu monitu wybierz powierzchnię kalwarii lub górną płaszczyznę zespołu jako odniesienie do położenia i zakotwiczenia nowej części.
      1. Utwórz zestaw równomiernie rozmieszczonych płaszczyzn (odstęp 2 mm) w poprzek czaszki. Na każdej płaszczyźnie utwórz szkic, a na każdym szkicu narysuj krzywą rzutowaną z przesunięciem 0,2 mm w postaci symetrycznego splajnu z dziewięcioma punktami, podążając za przekrojem górnej powierzchni czaszki 0,2 mm powyżej czaszki (rysunek uzupełniający S2).
      2. Za pomocą tych splajnów można utworzyć powierzchnię po wypchnięciu - Skull Limit Surface - zapewniając, że powierzchnia ta jest gładka bez żadnych wad, do wykorzystania do budowy elementów implantu.
3. Definicja obserwowalnej powierzchni czaszki
   UWAGA: Na podstawie modelu 3D identyfikowany jest najbardziej płaski obszar kości kalwarii idealny do obserwacji 3D. Obszar ten jest starannie dobrany, aby zapewnić optymalny dostęp do obiektywu mikroskopu dwufotonowego, biorąc pod uwagę biologiczną i strukturalną integralność czaszki. W definicji można używać współrzędnych stereotaktycznych, w których punkt Bregma służy jako początek układu współrzędnych.
   1. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i utwórz splajn w kształcie gruszki od AP +6,5 do -2,6 mm szerokości przy AP 0,0. Będzie to obserwowalny kontur powierzchni (rysunek uzupełniający S3).
      UWAGA: Obiektyw mikroskopu jest wirtualnie ustawiony względem wcześniej zdefiniowanej obserwowalnej powierzchni czaszki. Etap ten polega na określeniu ograniczeń przestrzennych narzuconych przez rozmiar i kształt obiektywu, upewniając się, że projekt implantu spełnia wymagania mikroskopu.
   2. Włóż model obiektywu mikroskopu do zespołu pionowo. Ogranicz jego punkt ostrości na płaszczyźnie równoległej do płaszczyzny kalwarii w kości kości nazębnej i określ objętość graniczną obiektywu mikroskopu.
   3. Utwórz objętość, przesuwając obiektyw zgodnie z obserwowalnym konturem powierzchni.
   4. Utwórz okno obserwacyjne wokół zdefiniowanej obserwowalnej powierzchni, zapewniając niezakłócony dostęp do obiektywu mikroskopu.
      UWAGA: Okienko obserwacyjne jest strukturą przypominającą pierścień, pełniącą drugorzędne funkcje, takie jak zatrzymywanie cieczy przez zanurzenie i solidna struktura dla prawidłowego zamykania pokrywy ochronnej.
   5. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i skopiuj obserwowalny kontur powierzchni.
   6. Utwórz równoległy kontur o grubości 0,5 mm. Wyciągnij ten podwójny kontur w górę o 0,9 mm i w dół do powierzchni Skull Limit Surface z kątem pochylenia 4°.
4. Definiowanie struktur cementujących, ogonowych i na jaskółczy ogon.
   1. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i narysuj kształt C o grubości 0,5 mm łączący się z oknem obserwacyjnym i wyciągnij 2 mm na wysokość i w dół do powierzchni Powierzchni Granicznej Czaszki z kątem pochylenia 4° (Rysunek uzupełniający S4).
   2. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i wypełnij tę przestrzeń prostokątami o grubości 0,4 mm umieszczonymi promieniście z odstępem 1 mm między nimi.
   3. Wyciągnięcie proste jest podobne do okna obserwacji.
   4. Utwórz ogon implantu, opierając się na czaszce do utrwalenia, przestrzegając dostępnej objętości.
      1. Utwórz płaszczyznę poprzeczną stycznie do konstrukcji cementującej i kolejne 12,5 mm do tyłu.
      2. Naszkicuj prostokąty na tych płaszczyznach. Przeciągnij piramidalny korpus pomiędzy, ustawiając kąty około 20° i 37° od poziomu.
      3. Dodaj gwintowany otwór M1.6 w ogonie w pobliżu struktury cementującej.
      4. Utwórz szkic na końcu ogona i narysuj profil jaskółczy ogon.
      5. Wyciągnij ten profil o 8 mm.
5. Weryfikacja nieingerencji w obiektyw.
   1. Sprawdź całą konstrukcję implantu, w tym okienko obserwacyjne i jaskółczy ogon, aby upewnić się, że nie ma mechanicznej ingerencji w obiektyw mikroskopu. Sprawdź, czy nie ma zakłóceń w woluminie utworzonym w kroku 1.3.3.
      UWAGA: Ten etap weryfikacji ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że obiektyw może być ustawiany i przesuwany zgodnie z wymaganiami bez przeszkód.
6. Usuń zbędny materiał z ogona implantu, aby zminimalizować wagę i zmniejszyć potencjalny dyskomfort dla zwierzęcia.
   1. Utwórz szkic w płaszczyźnie pasa rozdzielającego i narysuj na nim trójkątne wycięcia, aby utworzyć strukturę kratownicy po wyciągnięciu przez wyciągnięcie z bryły ogona.
   2. Powtórz w płaszczyźnie prostopadłej.
7. Sprawdź maksymalne przemieszczenie za pomocą symulacji metodą elementów skończonych (MES) w celu analizy właściwości mechanicznych implantu w różnych warunkach.
   UWAGA: Ta symulacja pomaga w przewidywaniu maksymalnego przemieszczenia i naprężeń w obrębie implantu podczas użytkowania, zapewniając jego niezawodność.
   1. Włącz dodatek do symulacji oprogramowania CAD.
   2. Na pasku narzędzi Symulacja utwórz nowe badanie statyczne. Przejdź do zakładki Symulacja (jeśli jest widoczna) lub przejdź do punktu menu Symulacja | Badanie. W oknie dialogowym Badanie wybierz Statyczny jako typ badania. Kliknij przycisk OK, aby utworzyć nowe badanie (Rysunek uzupełniający S5).
      UWAGA: Ten typ badania jest odpowiedni do analizy odkształceń i naprężeń pod obciążeniami statycznymi, zgodnie z oczekiwaniami w zastosowaniu implantu.
   3. Wybierz materiał na implant, który pasuje do rzeczywistego składu implantu (Ti6Al4V).
   4. Zdefiniuj stałe wiązania, aby zasymulować punkty mocowania implantu, w których stykałby się on z mocowaniem na jaskółczy ogon. Zdefiniuj górną powierzchnię jaskółczego ogona jako stałą.
   5. Określ obciążenie pionowe na dolnej powierzchni implantu. Ustaw siłę pionową 1 N.
   6. Wygeneruj siatkę. Doprecyzować siatkę w obszarach, w których spodziewane jest duże naprężenie lub odkształcenie (rysunek uzupełniający S6). W tym celu należy kliknąć prawym przyciskiem myszy na elemencie siatki drzewa badania i wybrać opcję Utwórz siatkę... W oknie dialogowym Siatka dostosuj gęstość siatki za pomocą suwaka lub aktywując pole Sterowanie siatką , aby niezależnie ustawić maksymalny i minimalny rozmiar elementu. Kliknij przycisk OK , aby wygenerować siatkę.
      UWAGA: Oprogramowanie automatycznie generuje początkową siatkę do badania, ale w celu uzyskania dokładniejszych wyników siatka może zostać udoskonalona w celu wybrania drobniejszej siatki, szczególnie w obszarach, które są krytyczne dla stabilności implantu (takich jak okno obserwacyjne). Drobniejsze zazębienie w tych obszarach poprawia dokładność symulacji poprzez uchwycenie lokalnych koncentracji naprężeń.
   7. Rozpocznij analizę statyczną, aby obliczyć przemieszczenie, naprężenia i rozkład odkształceń na implantach.
   8. Przeanalizuj wyniki. Zbadaj wykres przemieszczenia, aby zidentyfikować obszary maksymalnego odkształcenia. Ten wykres pokazuje, jak bardzo implant odkształciłby się pod przyłożonymi obciążeniami, podkreślając wszelkie obszary zagrożone nadmiernym ruchem. Upewnij się, że odkształcenie wewnątrz okienka obserwacyjnego nie przekracza 3 mikronów.
8. Na koniec zaprojektuj osłonę ochronną, aby chronić okno obserwacyjne, gdy nie jest używane. Ta pokrywa chroni odsłoniętą kość przed zanieczyszczeniami środowiskowymi i uszkodzeniami fizycznymi.

2. Leczenie na myszach, znieczulenie i chirurgiczne wszczepienie implantu głowy

UWAGA: W tym przypadku można użyć samców lub samic, myszy C57BL/6 lub transgeniczne w wieku od 7 do 12 tygodni, jak pokazano. Aby wywołać kolonizację BM białaczką, wygenerowane komórki białaczkowe, jak opisali Horton i ^wsp.12, podaje się dożylnie 2-3 tygodnie przed obrazowaniem. Aby zagwarantować zdrowie rany, należy stosować techniki sterylne.

1. Pod maską zmontuj sterylne narzędzia chirurgiczne (nożyczki i pęsetę), trymer i materiały eksploatacyjne, w tym żel do oczu, sól fizjologiczną, środek dezynfekujący, cement dentystyczny, waciki chłonne i chusteczki czyszczące. Włącz sterylizator koralików.
2. Umieść mysz w anestezjologicznej komorze indukcyjnej i napełnij ją 3-4% izofluranem i tlenem atmosferycznym. Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone (sprawdź, czy nie ma utraty odruchu prostowania oraz głębszego i wolniejszego wzorca oddychania), przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy maski znieczulającej i obniż stężenie izofluranu do 1,5-2%. Leki przeciwbólowe należy podawać podskórnie (buprenorfina, 0,01 mg/kg) 30 minut przed zabiegiem.
3. Umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C i wizualnie monitoruj częstość oddechów. Opcjonalnie: W przypadku myszy z patologicznym fenotypem należy dodać koc przetrwania, aby utrzymać odpowiednią temperaturę przez cały czas znieczulenia.
4. Leki przeciwbólowe należy podawać podskórnie (Buprecare, 0,01 mg/kg) 30 minut przed zabiegiem.
5. Ogol głowę myszy elektryczną maszynką do golenia.
6. Dodaj kroplę żelu okulistycznego na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia, upewniając się, że żel nie kapie na skórę głowy.
7. Wyczyść mysz, aby usunąć wszelkie resztki włosów z obszaru operacyjnego. Przetrzyj górną część skóry głowy środkiem dezynfekującym na bawełnianej chusteczce. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie włosy, aby uniknąć artefaktów obrazowania, a także ryzyka infekcji rany.
8. Używaj kleszczy i nożyczek wysterylizowanych wcześniej w autoklawie. W celu ponownego użycia podczas zabiegu włóż je do sterylizatora perełkowego na co najmniej 30 s przed użyciem. Wykonaj małe nacięcie w centralnej części skóry głowy, aby odsłonić centralny szew kostny. Postępuj zgodnie z nim, aby zdefiniować prawidłowy obszar obrazowania o długości i szerokości. Ostrożnie usuń kawałek skóry głowy, podnieś skórę między uszami za pomocą kleszczy i wykonaj małe nacięcie z tyłu głowy. Trzymając skórę do góry, przełóż nożyczki pod skórą i ostrożnie wytnij poza obszar obrazowania.
9. Usuń tkankę łączną między czaszką a skórą głowy. Przetrzyj odsłoniętą kość sterylnym PBS na waciku. Szybko przystąp do mocowania implantu głowy do czaszki myszy, aby uniknąć długotrwałego odsłonięcia kości czaszki (<10 min).
10. Przygotuj pastę z wystarczającą ilością cementu dentystycznego na szalce Petriego zgodnie z instrukcjami producenta i szybko nałóż ją na spód implantu mocującego głowę.
11. Nie dostając się cementu dentystycznego do obszaru obrazowania, umieść uchwyt na głowę na odsłoniętej czaszce myszy, a następnie poczekaj, aż się zatnieje.
12. Po związaniu (zwykle w ciągu 3-5 minut) dodaj kilka kropli PBS o temperaturze 37 °C do komory obrazowania, aby utrzymać nawodnienie czaszki.

3. Obrazowanie za pomocą mikroskopu dwufotonowego

1. Przed rozpoczęciem operacji włącz laser i pozwól mu się rozgrzać, aby się ustabilizował. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Wybierz odpowiedni obiektyw (25x/0,95 zanurzenia w wodzie dla tego eksperymentu).
2. Użyj pionowego statywu mikroskopowego typu fix-stage, który ma wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić weterynaryjną płytkę stykową z podkładką grzewczą, którą należy przesuwać integralnie ze stolikiem xy. Użyj solidnej aluminiowej płytki stykowej optycznej jako platformy do zamocowania implantu głowy i maski stereotaktycznej. Połącz elastyczne węże i ich łączniki związane z wstrzykiwaniem i ekstrakcją izofluranu z maską w klatce mikroskopu.
3. Skonfiguruj ustawienia akwizycji, aby skanować szybko: format 512 x 512 pikseli; prędkość 600 Hz; i współczynnik powiększenia 1.
4. Dostosuj linię laserową do 880 nm, aby móc wykrywać SHG, GFP i tdTOMATO o tej samej długości fali wzbudzenia.
5. Wyłącz światło w pomieszczeniu i zamknij prawidłowo skrzynkę wokół statywu mikroskopu przed aktywacją detektorów NDD i określ bramki detekcji spektralnej: PMT1, do wykrywania SHG [388 - 431 nm]; HyD2, dla GFP [485 - 548 nm] i HyD3 dla tdTOMATO [551 - 645 nm]. Pozostaw przesunięcie na 0.
6. Utwórz nowy zestaw danych projektu i zmień jego nazwę zgodnie z określonym eksperymentem.
7. Po przymocowaniu implantu mocującego głowę do czaszki myszy (potwierdzonego przez utwardzenie cementu), włącz izofluran w kierunku stereotaktycznej maski mikroskopu.
8. Szybko przyłóż mysz do mikroskopu. Ostrożnie włóż zęby myszy do maski, aby umożliwić przenikanie izofluranu przez nos myszy, unosząc nos jedną ręką.
9. Trzymając mysz jedną ręką, drugą ręką delikatnie wsuń jaskółczy ogon implantu mocującego głowę do uchwytu mocującego i zabezpiecz go pół obrotu pokrętła śrubowego.
10. Wprowadź sondę doodbytniczą z dodatkiem żelu na bazie wody do monitorowania temperatury i dodaj krople okulistyczne do oczu myszy.
11. Napełnij komorę obrazowania głowicy dużą ilością żelu na bazie wody lub PBS i opuść obiektyw zanurzenia w wodzie, aby całkowicie go zanurzyć, aby uzyskać optymalne wzbudzenie i detekcję sygnałów generowanych przez wzbudzenie dwufotonowe.
12. Przesuń stolik x-y i dysk z, aby skupić się na centralnej kości w bliźnie rusztowania.
    UWAGA: Wygodne jest używanie okularów mikroskopu i lampy metalohalogenkowej jako źródła światła, filtrowanego przez trójpasmowy filtr emisji wzbudzenia. Brak przekroju optycznego uniemożliwia uzyskanie wyraźnego obrazu; Ale przy nabraniu wprawy centralna część czaszki jest łatwo rozpoznawalna.
13. Po zidentyfikowaniu tkanki, oznaczonej powierzchnią kości i żyłą centralną, wyłącz lampę metalohalogenkową i zamknij okna klatki mikroskopu, aby chronić detektory HyD i umożliwić przejście lasera na podczerwień (IR).
14. Ustaw wzmocnienie PMT/SHG na 850 V (jego liniowy zakres roboczy) i ustaw wzmocnienia HyD na 100%. Zwiększaj moc lasera IR aż do uzyskania obrazu o zakresie dynamicznym 200 poziomów szarości (przy 8 bitowych detektorach dynamicznych) na najniższym z trzech kanałów. Zmniejsz wzmocnienia innych detektorów, jeśli różnice emisji są zbyt duże lub jeśli występuje nasycenie, korzystając z trybu "pod dolną" tabelą przeglądową (LUT).
    UWAGA: W naszym przypadku moc lasera na poziomie 30% wystarczyła do uzyskania kontrastu we wszystkich kanałach.
15. W oprogramowaniu do akwizycji wyszukaj obszar zbudowany z kieszonek BM (GFP⁺, tdTOMATO⁺) zamkniętych w powierzchniach kostnych (SHG).
16. Aby znaleźć różne zwroty z inwestycji, aktywuj LAS NAVIGATOR i utwórz przegląd całego regionu za pomocą trybu spiralnego. Przerwij akwizycję, gdy uzyskana powierzchnia jest wystarczająco duża. Zapisz przegląd, scal go i zmień jego nazwę: w przypadku obrazowania podłużnego będzie to obraz referencyjny.
    UWAGA: Uważaj, aby nie wygenerować zbyt dużej spirali, ponieważ może to spowodować kontakt uchwytu urządzenia z obiektywem.
17. Zapisz niektóre pozycje ROI, klikając ikonę pojedynczego obrazu i zmień nazwę każdej pozycji na liście zadań. Wykonaj zrzut ekranu, aby nałożyć względne położenie różnych zwrotów akcji na poprzednio zapisany przegląd.
    UWAGA: Ten zrzut ekranu będzie niezbędny do zastąpienia ROI w obrazowaniu podłużnym, ponieważ oprogramowanie do akwizycji nie pozwala na przywołanie tej grupy pozycji w wersji używanej w tym eksperymencie.
18. Aby uzyskać wolumin stosu z, wybierz tryb stosu z, zdefiniuj rozmiar kroku na poziomie 3 μm i odznacz opcję tego samego rozmiaru stosu dla wszystkich regionów. Wybierz pierwszą pozycję, zdefiniuj górną i dolną pozycję, sprawdź rozmiar kroku Z i kliknij na przedefiniuj stos. Ikona sześcianu pojawi się obok nazwy stanowiska na liście pozycji. Powtórz ten krok dla wszystkich pozycji różnych ROI.
19. Naciśnij pobierz i zapisz obrazy (trzy kanały z-stack z ~50 planami) w odpowiednim folderze. Ten krok oznacza T_ctrl eksperymentu; Sprawdź, czy parametry akwizycji są prawidłowe (uzyskaj prawidłowy zakres dynamiki w trzech kanałach, unikaj w miarę możliwości nasycenia sygnału i sprawdź czas akwizycji dla pełnego cyklu).
20. Aby zmierzyć cechę dynamiczną (w tym przypadku przepuszczalność naczyń krwionośnych), uzyskaj timelapse.
    1. W tej konfiguracji trzy detektory umożliwiają jednoczesne obrazowanie trzech kanałów; jeśli do eksperymentu wymagany jest czwarty kanał (w tym przypadku monitorowanie dekstranu), aktywuj tryb sekwencyjny i dodaj drugą sekwencję akwizycji. Dostosuj linię lasera IR na 820 nm , aby móc wzbudzić fluorofor Dextran Cy5. Zmień zakres wykrywania Hyd2 na [650 - 744 nm] i wyłącz pozostałe czujniki. Wybierz między trybami pozyskiwania stosów .
       UWAGA: Domyślnie druga sekwencja akwizycji ma takie same parametry jak sekwencja 1.
    2. Przed rozpoczęciem timelapse należy uruchomić akwizycję wszystkich pozycji, aby upewnić się, że czas nagrywania nie przekracza 3 minut (biorąc pod uwagę dodanie trybu sekwencyjnego), minimalnego czasu wymaganego do wykrycia wycieku dekstranu.
    3. Przed wstrzyknięciem dekstranu należy zmienić tryb akwizycji na xyzt. W module t ustaw przedział czasowy na 3 min , a czas trwania na 1 h.
21. Wstrzyknąć dożylnie 100 μl Dekstranu 70 KDa-TRITC (lub 500 KDa-Cy5) w dawce 3 mg/mysz i rozpocząć pozyskiwanie.
22. Po pobraniu zapisz zestaw danych w odpowiednim folderze.
    UWAGA: Podczas tych licznych kroków należy często monitorować częstotliwość i temperaturę oddychania myszy i w razie potrzeby dostosować przepływ izofluranu. Idealnie byłoby, gdyby temperatura, EKG i częstość oddechów mogły być rejestrowane i uwzględniane jako metadane eksperymentu.

4. Odzyskiwanie myszy

1. Po zakończeniu sesji obrazowania wyłącz detektor HyDs w oprogramowaniu do akwizycji i włącz skrzynkę grzewczą myszy (37 °C). Otwórz klatkę mikroskopu, podnieś obiektyw i wyjmij sondę doodbytniczą z myszy. Następnie delikatnie wysuń jaskółczy ogon implantu mocującego głowę z uchwytu mocującego i przesuń mysz z maski stereotaktycznej mikroskopu do maski chirurgicznej na poduszce grzewczej.
2. Wyłączyć jednostkę izofluranu pod mikroskopem i wyłączyć poduszkę grzewczą.
3. Delikatnie usuń żel na bazie wody lub PBS z czaszki myszy za pomocą sterylnego wacika.
4. Dodaj żel wewnątrzzakładowy, aby utrzymać wilgotność czaszki między sesjami obrazowania, jak opisano wcześniej¹³.
5. Zamknij obszar obrazowania implantu głowy specjalną osłoną i ostrożnie zabezpiecz go śrubą.
6. Umieść mysz w komorze grzewczym w temperaturze 37 °C i poczekaj, aż się obudzi. Przynieś mysz do obiektu dla zwierząt i umieść ją w czystej klatce z hydrożelem i wzbogaceniem. Należy codziennie monitorować zwierzęta, aby wykryć wszelkie oznaki bólu lub infekcji, w takim przypadku należy podawać Buprecare codziennie. Aby zachować wilgotność kalwaryczną, zmieniaj żel doogniskowy 2 razy w tygodniu.
   UWAGA: Wybierz wysoką klatkę z kartonowymi schronieniami i materiałem gniazdowym i upewnij się, że umieszczasz myszy w osobnych klatkach.

5. Akwizycje długoterminowe

UWAGA: Mysz może być ponownie zobrazowana w ciągu następnych dni. Należy jednak pamiętać, aby nie powtarzać więcej niż trzech sesji obrazowania w tygodniu, aby uniknąć niepożądanych skutków powtarzającego się znieczulenia, takich jak suchość oczu lub nadmierne zmęczenie, a także niewydolność oddechowa i hipotermia.

1. Aby ponownie zobrazować mysz z już zainstalowanym uchwytem na głowę, wykonaj krok 2.2 i umieść niewielką kroplę żelu okulistycznego na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
2. Postępuj zgodnie z sekcją 3 aż do kroku 3.16, aby uzyskać obraz ogólny.
   UWAGA: Korzystanie z tytanowego implantu głowicy bez konieczności zmiany wysokości lub kąta położenia uchwytu bardzo ułatwia znalezienie ogólnego obszaru zainteresowania.
3. W razie potrzeby wyrównaj poprzedni i nowy obraz za pomocą modułu Otwórz obraz i wyrównaj.
4. Otwórz obraz zrzutu ekranu z kroku 3.17, aby zaznaczyć pozycje w ich pierwotnym miejscu.
   UWAGA: Stosowanie kontrastu SHG jest bardzo przydatne, zwłaszcza gdy spodziewasz się przebudowy naczyń krwionośnych i związanych z nimi komórek wyrażających GFP.
5. Zdobądź z-stacki i timelapsy w taki sam sposób, jak opisano w krokach 3.18-3.22.

6. Kwantyfikacja parametrów naczyniowych

1. Parametry naczyniowe
   1. Aby otworzyć obrazy wygenerowane za pomocą oprogramowania (pliki .lif) w IMARIS, najpierw przekonwertuj je do formatu ".ims" za pomocą konwertera plików. Otwórz plik ".ims" z IMARIS, sprawdź metadane (skale X, Y, Z) i wybierz moduł Filament . Wybierz opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie.
   2. Aby uzyskać lepszą wizualizację podczas generowania filamentu, przejdź do Ustawień (symbol liścia), wybierz Linia w stylu i pozostaw liczbę pikseli na wartości domyślnej (1). Zaznacz pola Pokaż dendryty, w tym Punkt początkowy, Punkty rozgałęzienia i Punkty końcowe. Usuń zaznaczenie opcji Pokaż grzbiet.
   3. W obszarze rysowania (symbol pędzla) wybierz Metoda AutoPath; 5 μm jako średnicę i źródło kanału powiązane z naczyniem (w tym przypadku TRITC-Dekstran). Na koniec zaznacz automatyczne wyśrodkowanie i automatyczną średnicęr.
   4. Rozpocznij rysowanie włókien, używając shift + prawy przycisk myszy , aby wybrać punkt początkowy gałęzi i shift + lewy przycisk myszy , aby wybrać punkt końcowy gałęzi.
      UWAGA: Punkt początkowy jest w kolorze jasnoniebieskim, punkty rozgałęzień są w kolorze czerwonym lub ciemnoniebieskim, a punkty końcowe są w kolorze zielonym.
   5. Aby ustawić odpowiednią średnicę filamentu podczas rysowania, użyj przycisku przewijania myszy.
   6. Aby połączyć dwa włókna z różnymi punktami końcowymi, utwórz nowy punkt początkowy między nimi i połącz go w każdym punkcie końcowym.
      UWAGA: W ten sposób w punktach rozgałęzień pojawiają się zielone punkty końcowe.
   7. Po utworzeniu drzewa naczyniowego wróć do ustawień i upewnij się, że liczba punktów początkowych, rozgałęziających i końcowych jest prawidłowa. Wybierz stożek , aby zwizualizować średnice i zweryfikować ich wygląd.
   8. Jeśli średnica filamentu (lub połączenie) wydaje się nieprawidłowa, przejdź do Edytuj (symbol ołówka), wybierz filament do usunięcia prawym przyciskiem myszy i kliknij Usuń. Ponownie narysuj filament, regulując średnicę filamentu za pomocą przycisku przewijania myszy.
   9. Aby wyodrębnić wszystkie wygenerowane dane statystyczne i zapisać je, kliknij na ikonę Statystyka | eksportuj wszystkie statystyki do pliku-(ikona wielu dyskietek na dole ekranu).
      UWAGA: Aby uniknąć potencjalnie nieprawidłowych włókien nieodpowiadających naczyniom, do analizy statystycznej włączono tylko włókna dłuższe niż 20 μm.
2. Kwantyfikacja nieszczelności
   UWAGA: Aby otworzyć obrazy wygenerowane za pomocą oprogramowania (plik .lif) w IMARIS, najpierw przekonwertuj je do formatu ".ims" za pomocą konwertera plików.
   1. Aby scalić obrazy zrobione przed i po wstrzyknięciu dekstranu w tym samym szeregu czasowym, przejdź do trybu Surpass, kliknij zarówno pierwszy obraz (T_ctrl , przed wstrzyknięciem dekstranu), jak i obraz poklatkowy (czas 1, 60 min), aby je otworzyć, a następnie połącz je, klikając Edytuj i dodaj punkty czasowe.
      UWAGA: Aby skorygować ewentualny dryf 3D, wykonaj kroki 6.2.2-6.2.7 za pomocą funkcji mostu między Fidżi a IMARIS. Zainstaluj następujące wtyczki na Fidżi: "IMARIS_Bridge96.jar" i "IMARISBridgeUtils.jar". Rejestracja dryfu 3D odbywa się za pomocą "StackReg Pluging" (już dostępnego na Fidżi). Jeśli nie jest to konieczne, przejdź do kroku 6.2.8
   2. Aby wykonać korekcję dryfu 3D, otwórz Fidżi, aby zmostkować obrazy z IMARIS, klikając Wtyczki | IMARIS | Zdjęcie z IMARIS.
   3. Na Fidżi wybierz Wtyczki | Rejestracja | Prawidłowy dryf 3D.
   4. W nowych oknach, które się pojawią, wybierz odpowiedni kanał do rejestracji.
      UWAGA: W tym przypadku był to Nestin-GFP, ale mógł to być dowolny kanał podkreślający nieruchome obiekty i wysoki stosunek sygnału do tła.
   5. Aby poprawić wykrywanie małych dryfów, wybierz opcję Obliczanie wielu skal czasowych, Korekcja dryfu pikseli poniżej pikseli i Ulepszanie obrazów krawędzi, a pozostałe ustawienia pozostaw jako domyślne.
   6. Aby zmostkować poprawiony obraz do IMARIS, wybierz go i kliknij Wtyczki | IMARIS | Obraz do IMARIS.
   7. Zapisz go w odpowiednim folderze, klikając Plik | Zapisz jako.
   8. Aby zobrazować wszystkie pozyskane kanały, kliknij Edytuj | Pokaż regulację wyświetlacza. Wybierz kanał dekstranu i czas 1 (klatka 2 u dołu ekranu).
   9. Utwórz nową powierzchnię definiującą światło naczyniowe w punkcie czasowym 1 , zaznaczając pole wyboru dodaj nową powierzchnię (niebieski obiekt)
   10. Na tablecie Surface 1 przejdź do pozycji Właściwości i usuń zaznaczenie wszystkich parametrów w obszarze Ustawienia algorytmu. Kliknij następny krok (niebieska strzałka)
   11. Wybierz kanał naczyniowy (w tym przypadku dekstran) w obszarze kanał źródłowy i zaznacz opcję Wygładzanie i odejmowanie tła. Pozostaw wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi. Kliknij następny krok (niebieska strzałka).
   12. Dostosuj wartość progu do wyglądu powierzchni pod względem grubości i pokrycia wszystkich dodatnich obszarów. Kliknij następny krok (niebieska strzałka).
   13. Wyklucz nieokreślone powierzchnie (głównie małe kropki) za pomocą domyślnego filtru Liczba wokseli. Kliknij ostatni krok (zielona strzałka).
   14. W razie potrzeby kontynuuj ręczne dostosowywanie powierzchni, klikając edytuj (ikona ołówka) w Ustawieniach parametrów. Aby wybrać obiekt do usunięcia, kliknij go lewym przyciskiem myszy i usuń, wybierając opcję usuń. Jeśli obiekt, który ma zostać usunięty, jest sortowany z innym obiektem, rozłącz dwie oddzielone części powierzchni, klikając shift + kliknięcie w lewo między nimi i wybierając opcję Wytnij powierzchnię. Powtórz ten krok tyle razy, ile to konieczne.
   15. Na koniec połącz wszystkie segmenty za pomocą trybu zaznaczania (ikona celu po prawej stronie) i naciśnij control + przewijanie , aby odzyskać wszystkie obiekty. Gdy wszystkie są zaznaczone, kliknij lewym przyciskiem myszy i kliknij ujednolicić.
   16. Aby wygenerować powierzchnię odniesienia, skopiuj tę powierzchnię do innych punktów czasowych. Wybierz powierzchnię globalną i zduplikuj ją, klikając przycisk Duplikuj i zmień jej nazwę na Wewnątrznaczyniowa.
   17. Wybierz powierzchnię Wewnątrznaczyniowa i kliknij opcję Duplikuj do wszystkich punktów czasowych.
   18. Podziel sygnał dekstranu, aby rozróżnić obszary wewnątrznaczyniowe (IN) i zewnątrznaczyniowe (OUT). Aby utworzyć kanał IN dla wszystkich punktów czasowych, kliknij na powierzchnię Wewnątrznaczyniowy | Edycja (przycisk ołówka) | Zamaskuj wszystko.
   19. W obszarze Wybór kanału wybierz odpowiedni kanał i zaznacz opcję Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski. W Ustawieniach maski zaznacz tylko Stała wewnątrz/na zewnątrz z ustawioną liczbą wokseli na zewnątrz powierzchni na 0. Na koniec zaznacz również Zastosuj do wszystkich punktów czasowych.
   20. W opcji Dopasowanie wyświetlania domyślnie tworzony jest nowy kanał o zamaskowanej nazwie. Zmień jego nazwę na .
   21. Aby utworzyć wyjście kanału dla wszystkich punktów czasowych, powtórz kroki 6.2.18-6.2.20, ale wybierz opcję Ustaw woksele wewnątrz powierzchni na 0. Zmień nazwę tego nowego kanału na OUT.
   22. Aby wyodrębnić dane statystyczne, kliknij ikonę Statystyka | Eksportuj wszystkie statystyki do pliku (ikona wielu dyskietek na dole ekranu)
   23. Aby przeanalizować nieszczelność, podziel kanał sumy intensywności na zewnątrz przez kanał sumy intensywności wewnątrz dla każdego punktu czasowego.

Wyniki

Na rycinach 1 i 2 pokazano model CAD tytanowego implantu mocującego głowę umieszczonego na zeskanowanej czaszce myszy, który został zaprojektowany tak, aby podążać za anatomiczną strukturą czaszki i zapewnić lekkie i biokompatybilne urządzenie, które jest w stanie mocno trzymać się stolika mikroskopu, zapewniając stabilność na poziomie komórkowym. Postępując zgodnie z tym protokołem krok po kroku, implant jest stabilnie przymocowany do czaszki myszy i może być mocno przymocowany do uchwytu mikroskopu za pomocą jaskółczego ogona, co pozwala na płaski obszar obrazowania w celu zatrzymania płynów i obserwacji przyżyciowej w czasie. Można go zamknąć pokrywą, aby zminimalizować wszelkie uszkodzenia lub infekcje rany, umożliwiając wielokrotne obrazowanie tego samego obszaru tkanki przez tygodnie. Po przebudzeniu mysz nosząca implant głowy może swobodnie chodzić, jeść i mieć regularną rutynę.

Rycina 3 przedstawia widok skanu kafelkowego naczynia naczyniowego BM zbudowanego z niejednorodnych naczyń włosowatych, w tym tętniczek, naczyń włosowatych przejściowych i sinusoid. Naczynia są osadzone w złożonym mikrośrodowisku tkankowym w bliskim kontakcie z powierzchnią kości i okołonaczyniowymi komórkami mezenchymalnymi. Podczas rozwoju białaczki pojedyncze izolowane komórki białaczkowe można wykryć w mikrośrodowisku BM w bliskim sąsiedztwie naczyń, a ich wszczepienie zwiększa się z czasem, wypełniając kalwarię w późnych stadiach choroby.

Rysunek 4 pokazuje, w jaki sposób obrazy uzyskane za pomocą tego protokołu mogą dostarczyć danych ilościowych, które można analizować za pomocą metod statystycznych. Pokazujemy, jak segmentować naczynia za pomocą filamentu IMARIS oraz mierzyć długość i średnicę fragmentów naczyniowych, a także ich prostoliniowość. Można również ocenić korelację tych parametrów.

Rycina 5 przedstawia obrazowanie podłużne dwóch różnych pozycji BM kalwarycznego podczas progresji AML w dniach 4, 7 i 10, przy czym dzień 10 jest związany z ~50% wszczepieniem BM z komórkami białaczkowymi, mierzonymi za pomocą cytometrii przepływowej (nie pokazano). Możemy zaobserwować istotną przebudowę wielkości istniejących wcześniej naczyń, a także tworzenie się nowych naczyń w określonych obszarach związanych z miejscową utratą kości.

Wreszcie, na rycinie 6, pokazujemy, w jaki sposób przepuszczalność naczyń może być mierzona jako parametr dynamiczny z obrazowaniem poklatkowym pokazującym zdolność różnych barier naczyniowych do zatrzymywania barwnika fluorescencyjnego w czasie.

Rysunek 1: Projekt i produkcja biokompatybilnego uchwytu na głowę na bazie tytanu. (A) Części implantu in situ: 1 pierścień obserwacyjny, 2 elementy cementujące, 3 kotwice stabilizujące, 4 ogony, 5 jaskółczy ogon, 6 otworów gwintowanych, 7 Bregma. (B) Połączenie implantu głowy z uchwytem: 8 korpusów mocujących, 9 zacisków, 10 dźwigni mimośrodowych, 11 struktur, 12 obiektywów mikroskopowych. (C) Odkształcenie implantu pod wpływem obciążenia za pomocą symulacji MES, gdzie maksymalne przemieszczenie wynosi 0,23 μm przy sile 0,04 N. (D) Zabezpieczenie pokrywy i jej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Przygotowanie myszy do obrazowania przyżyciowego. (A) Widok implantu głowy i obszaru obrazowania naświetlonego chirurgicznie przed obrazowaniem. (B) Implant głowy trwale przymocowany do czaszki myszy. (C) Mysz obudzona w klatce rekonwalescencji z zamkniętą pokrywą na implancie głowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Obrazowanie przyżyciowe naczyń kalwarii. (A) projekcja z obrazu skanu kafelka naczynia nazębnego oznaczonego przez cdh5-DSRED. (B) Powiększ przedstawione obszary, aby opisać różne typy naczyń oznaczonych strzałkami, tętniczki czerwonymi strzałkami, naczynia włosowate przejściowe oznaczone pomarańczowymi strzałkami, sinusoidy oznaczone żółtymi strzałkami. (i) oraz (ii) projekcje z tkanki X μm; (iii) pojedynczy plasterek. (C) Pojedyncze wycinki kilku pól widzenia naczyń BM, przedstawiające powierzchnię kości (SHG), komórki okołonaczyniowe (nes-GFP⁺) i światło naczyń krwionośnych (dextran-TRITC). (D) Nisza naczyniowa związana z progresją AML. Reprezentatywne wycinki wczesnych (górnych) i późnych (dolnych) punktów czasowych rozwoju AML. Białaczka MLL-AF9 jest oznaczona tdTOMATO (czerwone strzałki), podczas gdy naczynia są oznaczone pdgfb-GFP (zielone strzałki), powierzchnia kości SHG, a makrofagi na żółto (autofluorescencja, żółta gwiazdka). Podziałka = 200 μm (A), 40 μm (B,D-dolny panel), 50 μm (C). Skróty: BM = szpik kostny; GFP = białko zielonej fluorescencji; AML = ostra białaczka szpikowa; EC = Komórki śródbłonka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Kwantyfikacja parametrów naczyniowych. (A) Pomiar parametrów naczyniowych za pomocą filamentu IMARIS w reprezentatywnym występie z naczyń szpiku kostnego znakowanych dekstranem TRITC. Pokazane są reprezentacje linii i stożków. (B) Kwantyfikacja parametrów naczynia na obrazie pokazanym w A. (C) Korelacja między parametrami naczyniowymi wykazująca odwrotną korelację między prostoliniowością a długością naczynia (ujemna, Spearman r = -3523; p < 0,0001; R² = 0,2102) w stosunku do średnicy (dodatnia; Włócznik r = 0,4110; p < 0,0001; R² = 0,1299). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Obrazowanie podłużne dwóch różnych pozycji BM kalwarii nad rozwojem AML. Komórki śródbłonka wyściełające naczynia są oznaczone cdh5-GFP, powierzchnia kości SHG, a makrofagi na żółto (autofluorescencja). Pokazano przebudowę istniejących naczyń (czerwone strzałki) i tworzenie nowych naczyń (żółte strzałki). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przepuszczalność naczyń krwionośnych. (A) Schematy pomiaru przepuszczalności naczyń za pomocą narzędzia powierzchniowego IMARIS. (B) Rzut Z tego samego obszaru zobrazowany wzdłużnie w ciągu 1 godziny. (C) Kwantyfikacja przepuszczalności naczyń w obszarach, jak pokazano w A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Preparowana czaszka. W płaszczyźnie środkowej utwórz oś styczną do kalwarii, a następnie zapisz przygotowaną czaszkę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Plany w rozstawie 2 mm. Jak stworzyć zestaw równomiernie rozmieszczonych płaszczyzn (odstęp 2 mm) w poprzek czaszki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Obserwowalny kontur powierzchni. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i utwórz splajn w kształcie gruszki od AP +6,5 do -2,6 mm szerokości przy AP 0,0. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S4: Obserwacja vindow. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i narysuj kształt C o grubości 0,5 mm łączący się z oknem obserwacji . Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S5: Kliknij nowe badanie. Przejdź do zakładki Symulacja (jeśli jest widoczna) lub przejdź do punktu menu Symulacja | Badanie. W oknie dialogowym Badanie wybierz Statyczny jako typ badania. Kliknij przycisk OK , aby utworzyć nowe badanie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S6: Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby utworzyć siatkę. Rozdrobnić siatkę w obszarach, w których spodziewane jest duże naprężenie lub odkształcenie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Główną zaletą mikroskopii przyżyciowej jest jej zdolność do uchwycenia dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym w ich naturalnym środowisku, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod obrazowania histologicznego i ex vivo. Poprzez bezpośrednią obserwację BM kalwarii przy użyciu zaawansowanych technik obrazowania w połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, jak opisano w tym protokole, naukowcy mogą badać nie tylko parametry funkcjonalne naczyń krwionośnych ^8,14, ale także procesy podłużne, takie jak wszczepienie i migracja komórek białaczkowych ^6,15, proliferacja i aktywność metaboliczna^16,17 zachowanie znaczenia fizjologicznego i unikanie artefaktów związanych z utrwalaniem i przetwarzaniem tkanek.

Zalety obrazowania przyżyciowego BM calvaria w porównaniu z alternatywnymi miejscami kostnymi obejmują łatwy dostęp, przezroczystość kości czaszki pozwalającą na lepszą wizualizację bez uszkodzenia kości, stabilność kości calwarii minimalizującą artefakty ruchu tkanek oraz odtwarzalność u zwierząt doświadczalnych ułatwiającą porównanie między różnymi grupami eksperymentalnymi. Możliwość odzyskania zwierząt i wykonania obrazowania podłużnego pozwala również na zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniu. Warto wspomnieć, że ponieważ zaobserwowano specyficzne dla szczepu różnice we wzorcach wzrostu naczyń czaszki i wynikającej z tego osteogenezie¹⁸, ważne jest, aby wziąć to pod uwagę podczas projektowania konkretnego implantu do obrazowania dla pożądanego szczepu myszy, aby umożliwić doskonałą zgodność anatomiczną i dostęp do pożądanego miejsca obrazowania.

Inną ważną kwestią, o której należy wspomnieć, są potencjalne różnice we właściwościach naczyniowych i krwiotwórczych w obrębie kości kalwarycznej BM w porównaniu z innymi kośćmi, co do niedawna było słabo zbadanym pytaniem. Nowe badania sugerują zlokalizowane funkcje różnych kości, przy czym BM kalwarii różni się od innych kości pod względem hematopoezy, struktury i funkcji kości i naczyń krwionośnych 19,20,21,22,23, a także odpowiedzi na patologie neurologiczne 24. Różnice te muszą być dalej badane i brane pod uwagę przed uogólnieniem konkretnych ustaleń dotyczących kalwarii.

Zaprojektowanie i skonstruowanie implantu do obrazowania jest kluczowym krokiem w tej eksperymentalnej konfiguracji, począwszy od wyboru materiału. Biokompatybilne implanty odgrywają kluczową rolę w badaniach biomedycznych, ułatwiając szeroki wachlarz zastosowań, od inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej po systemy dostarczania leków i urządzenia do monitorowania in vivo . Wybór materiału na implant głowy przystosowany do obrazowania przyżyciowego ma kluczowe znaczenie. Idealnie byłoby, gdyby materiał wykazywał doskonałą biokompatybilność, właściwości mechaniczne odpowiednie do zapewnienia minimalnej elastyczności i ogólnej stabilności, a wreszcie zdolność do integracji w czaszce bez wywoływania stanu zapalnego. Tytan jest idealny ze względu na dobrą tolerancję w organizmie zwierzęcia, bez wywoływania działań niepożądanych w kontakcie z tkankami biologicznymi, a także ze względu na odporność na korozję, zapewniając długotrwałą stabilność nawet w przypadku wystawienia na działanie płynów ustrojowych lub roztworów eksperymentalnych. Ponadto jego wytrzymałość mechaniczna sprawia, że jest odporny na odkształcenia i pękanie. Pomimo swojej wytrzymałości, tytan ma stosunkowo niską gęstość, co skutkuje lekkimi urządzeniami do obrazowania przyżyciowego, które minimalizują obciążenie zwierząt doświadczalnych i badaczy. Wreszcie, jego wszechstronność w produkcji pozwala na dostosowanie urządzeń do obrazowania przyżyciowego do konkretnych wymagań eksperymentalnych, takich jak rozmiar, kształt i funkcjonalność.

W tym przypadku zaprojektowaliśmy biokompatybilny implant do mocowania głowy przy użyciu oprogramowania CAD do modelowania parametrycznego z wbudowanymi funkcjami analizy elementów skończonych (MES), w szczególności SolidWorks. Takie podejście umożliwia precyzyjne, iteracyjne dostosowanie do wymagań strukturalnych i przestrzennych implantu, zapewniając zarówno zgodność anatomiczną, jak i odporność mechaniczną. Darmowe alternatywy, takie jak FreeCAD, oferują podobne funkcje modelowania i symulacji. Podstawowe dane wejściowe w procesie projektowania obejmują model anatomiczny czaszki myszy o wysokiej rozdzielczości, model obiektywu mikroskopu oraz model systemu mocowania, które razem informują o wymiarach i konfiguracji implantu. Końcowym wynikiem jest niezależny od platformy plik siatki, zwykle w formacie STL lub STEP, kompatybilny z większością programów do drukowania 3D.

Pierwszym krokiem jest uchwycenie szczegółowych cech anatomicznych głowy myszy za pomocą technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikrotomografia komputerowa in vivo . Takie podejście zapewnia najwyższą szczegółowość anatomiczną i dokładność, uchwycając mikrostruktury czaszki. Skanowanie 3D przygotowanej, nagiej czaszki może być również opcją. Ta metoda, wykorzystująca skanery laserowe lub skanery światła strukturalnego, jest powszechnie stosowana na preparowanej czaszce i zapewnia dokładne kontury powierzchni, choć z mniejszą ilością szczegółów wewnętrznych w porównaniu z mikrotomografią komputerową. W przeciwnym razie modele anatomiczne można pobrać z publikacji i baz danych open source²⁵ lub DigiMorph {https://www.digimorph.org/specimens/Mus_musculus/}. Chociaż modele te są wygodne, mogą nie mieć szczegółów specyficznych dla próbki, dlatego często konieczne są korekty dla konkretnego zwierzęcia w badaniu, takie jak skalowanie do rzeczywistej odległości Bregma-Lambda. Pozyskane dane są następnie wykorzystywane do stworzenia precyzyjnego modelu 3D czaszki myszy, który służy jako podstawowy szablon do projektu implantu.

Aby przymocować implant do czaszki, zaprojektowano strukturę cementową, która pokrywa pozostałą powierzchnię czaszki, która nie jest zajęta przez okno obserwacyjne. Struktura ta musi zapewniać solidne punkty mocowania, unikając jednocześnie krytycznych cech anatomicznych. Struktura cementująca ma wiele otworów, aby zapewnić optymalną polimeryzację cementu pod implantem poprzez dyfuzję. Dodatkowo ściany konstrukcji cementowej mają mały kąt pochylenia, co pozwala cementowi bezpiecznie zakotwić się do tych skośnych ścian. Ogon implantu, który rozciąga się od głównego korpusu do systemu mocowania, jest zaprojektowany. Element ten ma kluczowe znaczenie dla wyrównania i stabilizacji implantu podczas obserwacji, a jego konstrukcja musi uwzględniać dostępną przestrzeń i ograniczenia anatomiczne głowy myszy. Wreszcie, mechanizm jaskółczego ogona jest zintegrowany z konstrukcją implantu, co ułatwia zakładanie i odłączanie implantu od systemu mocowania. Ta cecha zwiększa praktyczność i użyteczność implantu podczas wielokrotnych obserwacji. Mechanizm jaskółczego ogona zapewnia powtarzalne utrwalanie w celu łatwego pobierania obserwowanych tkanek do powtarzających się sesji obrazowania.

Czytelnicy rozważający przyjęcie obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym kości kalwarycznej powinni dokładnie ocenić swoje cele badawcze i wymagania eksperymentalne, aby określić, czy ta metoda jest odpowiednia dla ich badań. Chociaż mikroskopia przyżyciowa oferuje niezrównany wgląd w hematopoezę, regulację mikrośrodowiska tkanek i dynamikę naczyń krwionośnych in vivo, wiąże się również z pewnymi wyzwaniami i ograniczeniami technicznymi. Naukowcy powinni być przygotowani do sprostania tym wyzwaniom poprzez staranne projektowanie eksperymentów, optymalizację parametrów obrazowania i wykorzystanie odpowiednich kontroli. Ponadto badacze powinni wziąć pod uwagę dostępność specjalistycznego sprzętu do obrazowania, wiedzę specjalistyczną w zakresie technik znakowania fluorescencyjnego oraz zasoby obliczeniowe do analizy obrazu. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym kości kalczastej ma ogromny potencjał w zakresie pogłębiania naszej wiedzy na temat hematopoezy i biologii naczyniowej, oferując unikalne okno na dynamiczne procesy zachodzące w mikrośrodowisku BM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amira	Thermo ScientificTM
Znieczulenie			Izofluran 2% do 3%
Maska anestezjologiczna (wykrywanie zwierząt)	Minerve (Minerve)
Jednostka anestezjologiczna	Minerve (Minerve)
Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdPomidor)Hze	Laboratoria Jacksona	MGI:3809523
Kalwaria	Metria	https://ymetry.com/site/head-fixation-implants/44-mouse-head-fixation-implant-for-calvaria.html
Cement dentystyczny	Kemdent powiedział:	SŁOŃCE527
Dekstran 500 kDa-Cy5	Tebu-bio	DX500-S5-1	3 mg/mysz
Dekstran 70 kDa-TRITC	Sigma	Zobacz materiał T1162	3 mg/mysz
Środek odkażający	MP-Labo	Dermidyna-60ml
Elektryczna maszynka do golenia	Eskularny	Isis
Żel pod oczy	Żel okryl	10gr
Fidżi	https://imagej.net/software/fiji/downloads	v 17 30 maja
Wtyczki Fiji do mostka z Imaris	https://imagej.net/software/fiji/downloads	Imaris_Bridge96.jar ; ImarisBridgeUtils.jar
Skrzynka grzewcza	Daktyle i	Ogrzewanie
Poduszka grzewcza do zabiegu chirurgicznego	Minerve (Minerve)
Obrazowa poduszka grzewcza i sonda doodbytnicza	F. Haer
Imaris v9.6.0	Instrumenty oksfordzkie
Żel Intrasite	Chinoksia	2390766
Oprogramowanie LAS AF	Księga Leica	LAS X 3.5.7.23225
Lekarstwo			Buprecare, 0,01 mg/kg
Obiektyw HCX IRAPO L 25x/0,95 WODA	Księga Leica	506374
Bufor soli fizjologicznej (PBS 1x)	Sigma	Zobacz materiał P4417	Sterylizuj w autoklawie
SP8 DIVE FALCON Mikroskop wielofotonowy	Księga Leica
Maska stereotoksyczna	Minerve (Minerve)	1201261
Koraliki do sterylizatora	Sigma	Z742555
Narzędzia chirurgiczne	Moria	4877A; 2183
Koc survivalowy	ZABEZPIECZONY	11006
Waciki / Chusteczki higieniczne			Sterylizuj w autoklawie
Strzykawka 1 ml 26 g	BD Plastipak	305501
Regulator temperatury	F. Haer	40-90-5D-02
Myszy Tg(Nes-EGFP)33Enik	Laboratoria Jacksona	MGI:5523870
Myszy Tg(Pdgfb-icre/ERT2)1Frut	Laboratoria Jacksona	MGI:3793852
Myszy Tg(Cdh5-cre/ERT2)1Rha	Laboratoria Jacksona	MGI:3848982
Żel do ultradźwięków	Laboratoria firmy Parker	Aquasonic 100