Artykuł metodologiczny

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 października 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ekosystemach makroskalowych, takich jak lasy deszczowe czy rafy koralowe, przestrzenna lokalizacja organizmów jest podstawą naszego zrozumienia ekologii społeczności. Podobnie w świecie mikrobiologicznym ekosystemy w mikroskali są dalekie od przypadkowej i jednorodnej mieszanki organizmów i siedlisk. Dostęp do przestrzennego rozmieszczenia mikroorganizmów ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania i ekologii mikrobioty, ponieważ gatunki współżyjące z innymi organizmami są bardziej skłonne do interakcji i wzajemnego wpływania na swoją fizjologię.

Międzykrólestwowy ekosystem mikrobiologiczny jest sercem kolonii mrówek hodujących grzyby, które uprawiają grzyby podstawczakowe jako źródło pożywienia. Mrówki Attine żerują na różnych podłożach (głównie roślinnych), metabolizowanych przez uprawiane grzyby, tworząc gąbczastą strukturę, "ogród mikrobiologiczny", który działa jak zewnętrzne jelito. Ogród jest splecioną siatką strzępek grzybów, które rosną poprzez metabolizowanie podłoża, otwierając nisze dla charakterystycznej i przystosowanej mikrobioty. Uważa się, że mikrobiota przyczynia się do degradacji substratu i wzrostu grzybów, chociaż jej organizacja przestrzenna nie została jeszcze ustalona.

Tutaj opisujemy, jak wykorzystujemy skaningową mikroskopię elektronową (SEM) do zbadania, z niespotykaną dotąd szczegółowością, organizacji przestrzennej mikrobioty i biofilmu w różnych systemach hodowli grzybów mrówek. Obrazowanie SEM dostarczyło opisu struktury przestrzennej i organizacji mikrobioty. Projekt SEM ujawnił, że mikrobiota często gromadzi się w biofilmach, które są szeroko rozpowszechnioną strukturą krajobrazów mikrobiologicznych w kulturze grzybów. Przedstawiamy protokoły stosowane do naprawy, odwadniania, suszenia, napylania powłoki i obrazowania tak złożonej społeczności. Protokoły te zostały zoptymalizowane pod kątem radzenia sobie z delikatnymi i niejednorodnymi próbkami, zawierającymi biomasę roślinną i grzybową, a także mikrobiotę i biofilm.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekosystemy składają się z organizmów połączonych ze sobą procesami w określonym miejscu geograficznym (tj. w środowisku). Organizmy z czasem wchodzą w interakcje ze swoim środowiskiem, z czego wyłaniają się złożone i niejednorodne wzorce przestrzenne. Wzorce przestrzenne decydują o różnorodności i stabilności ekologicznej, a ostatecznie o funkcjonowaniu ekosystemu1,2,3,4. W ekosystemach w skali makro, takich jak tereny podmokłe, sawanny, rafy koralowe i suche ekosystemy, wzorce przestrzenne są skorelowane z przepływem i koncentracją zasobów. Umożliwienie optymalizacji zasobów, niejednorodności przestrzennej i wzorców skutkuje bardziej odpornymi ekosystemami niż ekosystemy jednorodne2. Lokalizacja przestrzenna organizmów będących podstawą ekologii zbiorowej przekłada się również na świat mikrobiologiczny.

Ekosystemy mikrobiologiczne, dalekie od organizmów losowo i jednorodnie wymieszanych w mikrosiedliskach, wykazują wzorce przestrzenne określające większość ich funkcjonowania5,6,7. Od felietonów Winogradsky'ego po mikrobiotę związaną ze środowiskiem i gospodarzem, ekosystemy te są niejednorodnie zorganizowane w przestrzeni, a układy przestrzenne wywołują różne reakcje fenotypowe. Gatunki żyjące w konkubinacie są bardziej skłonne do interakcji i wzajemnego wpływania na swoją fizjologię. W ten sposób organizacja przestrzenna społeczności, bardziej niż jej skład sam w sobie, wyznacza właściwości ekosystemu i nisze ekologiczne5,7,8. Ilustrując te koncepcje, zmiany we wzorcach przestrzennych wydają się być skorelowane z patologicznym postępem płytek nazębnych, próchnicy, chorób dziąseł9,10, nieswoiste zapalenie jelit11, mukowiscydoza infekcje płuc, przewlekłe infekcje ran12,13, rak jelita grubego i gruczolaki14.

W ramach zakresu biogeografii mikrobiologicznej (badanie rozmieszczenia różnorodności biologicznej i wzorców w czasie i przestrzeni w mikroskali), wiedza o ekosystemach mikrobiologicznych jest ogromnie korzystna dzięki zrozumieniu ich wzorców przestrzennych6,13,15,16,17. Przyjrzeliśmy się wzorcom przestrzennym ekosystemu mikrobiologicznego zbudowanego przez owady, znajdującego się w rdzeniu kolonii charyzmatycznych mrówek attine (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Znajduje się tam "ogród mikrobiologiczny", skupiony wokół grzyba podstawczaka z plemienia Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) lub z rodziny Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Ogród jest gąbczastą strukturą wyłaniającą się ze splecionej siatki strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie głównie roślinnego substratu włączonego przez mrówki (ryc. 1). Mogą to być, w zależności od rodzajów attine: suche części roślin, frass i tusze owadów, świeżo ścięte liście, nasiona i części kwiatowe23,24. Analogicznie do zewnętrznego jelita roślinożernego, ogród enzymatycznie i chemicznie przekształca oporne polimery w labilne zasoby odżywcze, dostarczając mrówkom niezbędnych aminokwasów, lipidów i rozpuszczalnych cukrów21,25,26,27,28.

Analizy ultrastrukturalne, enzymatyczne i transkryptomiczne przeprowadzone dla ogrodów z rodzajów Atta i Acromyrmex do przycinania liści sugerują, że te środowiska tworzą kontinuum degradacji substratu i plam odżywczych26,29,30,31,32. Młode części ogrodu są zwykle ciemniejsze ze względu na świeżo wkomponowane podłoże po rozdrobnieniu. Te niedawno dodane substraty są często kolonizowane od krawędzi, które zostały przecięte przez robotnice mrówek i zaszczepione grudkami grzybni. Rozchodzące się promieniście od krawędzi cięcia strzępki grzybów rozprzestrzeniają się po podłożu29,32,33. Obfitość strzępek zwiększa się wraz z postępem degradacji substratu, co skutkuje białawymi i metabolicznie aktywnymi regionami30,31,32. Starsze regiony, z bardziej zdegradowanym podłożem i obfitą mikrobiotą29,32, mają tendencję do prezentowania brązowawych odcieni i wyższej wilgotności. Pracownicy usuwają fragmenty tego regionu, rozdzielając je na hałdy odpadów, skąd pobierają również podłoża, które szkodzą symbiontowi grzybowemu34,35,36. Hałdy odpadów, choć fizycznie oderwane od ogrodu, są miejscem ciągłej degradacji podłoża i obiegu składników odżywczych przez licznie zamieszkującą mikrobiotę29,32,37,38,39.

Mikrobiota składająca się głównie z Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas i Serratia, również zamieszkuje ogród, najwyraźniej będąc wspólną dla różnych systemów hodowli grzybów attyny. Kodując szlaki metaboliczne, które mogą uzupełniać metabolizm grzybów, mikrobiota potencjalnie uczestniczy w fizjologicznych reakcjach ogrodu40,41,42,43,44. Nie tylko dane metagenomiczne wykazały, że mikrobiota tam była41,42, ale także analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) kultury grzybów mrówek tnących liście wykazała głównie bakterie w kształcie pręcików na podłożu roślinnym32. Chociaż bakterie (w tym szczepy celulolityczne) zostały wyizolowane z całego ogrodu, zostały one uwidocznione tylko w starszych częściach ogrodu i na stosach odpadów, a także w początkowym granulie niesionym przez królowe założycielki29,32. Nie było również pewne, czy mikrobiota może tworzyć biofilmy in vivo (tj. w ogrodzie i na odpadach), jak sugeruje ich zdolność metaboliczna42 i obserwowane in vitro44.

Tutaj zastosowaliśmy SEM, aby lepiej zrozumieć organizację przestrzenną mikrobioty w regionach ogrodowych, szczegółowo opisując fizyczne interakcje mikrobiota-substrat i mikrobiota-strzępki. Dostarczając obrazy o większej głębi ogniskowej, SEM umożliwia obserwację trójwymiarowych struktur mikroskopijnych w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając dokładną analizę wzorców przestrzennych mikrobioty ogrodowej. Szczegółowo opisujemy etapy utrwalania, odwadniania, suszenia, napylania i obrazowania takich niejednorodnych i delikatnych próbek na bazie grzybów. Usuwając etap postfiksacji za pomocą tetratlenku osmu (OsO4) i skracając czas odwadniania, uprościliśmy protokoły32,33,45 do przygotowania próbek ogrodowych i odpadów do analizy SEM. Ten dostosowany protokół zachowuje wzorce strukturalne strzępek, a także organizację przestrzenną mikrobioty i biofilmu, i może być stosowany do innych delikatnych ekosystemów mikrobiologicznych i biofilmów.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Ogrody mikrobiologiczne Attine. Ogród jest strukturą przypominającą gąbkę, powstałą ze splecionej siatki strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie głównie roślinnego podłoża włączonego przez mrówki. W ogrodzie znajduje się również mikrobiota, która koduje szlaki metaboliczne, które mogą uzupełniać metabolizm grzybów. Dane metagenomiczne i wcześniejsza analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej wykazały jego obecność, chociaż mieliśmy niewielką wiedzę na temat jego organizacji przestrzennej i fizycznych interakcji z substratem i strzępkami grzybów. Wykorzystaliśmy SEM, aby odkryć organizację przestrzenną mikrobioty i biofilmu oraz wzorce. Ilustracje autorstwa Mariany Barcoto (ogród i mikrobiota zaadaptowane z Barcoto i Rodrigues 94) oraz zdjęcia Mariany Barcoto i Enzo Sorrentino. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek kolonii polowych

UWAGA: Podczas zbierania kolonii mrówek, przed zebraniem należy zatwierdzić, że uzyskano wszystkie wymagane przez lokalne przepisy pozwolenia. W naszym przypadku zezwolenie na zbieranie #74585 zostało wydane przez Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Gdy próbki pochodzą z kolonii laboratoryjnej, przejdź do sekcji 2.

  1. Zlokalizuj i oznacz kolonię. Wykop rów otaczający obszar gniazda, aż komora ogrodowa zostanie odsłonięta (Rysunek 2A).
    UWAGA: Niektóre gatunki attyn mogą budować swoje kolonie pod ściółką z liści lub wewnątrz zgniłych kłód. W takich przypadkach należy ostrożnie obrócić ściółkę lub ostrożnie połamać kłody w celu pobrania próbek. Szczegółowe informacje na temat lokalizowania, zbierania i utrzymywania żywych kolonii różnych gatunków mrówek attine można znaleźć w Sosa-Calvo et al.46.
  2. Otwórz komorę ogrodową na boki, aby ziemia nie spadła na powierzchnię ogrodu. Ostrożnie zbierz próbki ogrodowe za pomocą kleszczy entomologicznych, łyżki lub skimmera kuchennego, w zależności od wielkości ogrodu.
    UWAGA: Pamiętaj, aby wysterylizować narzędzia przed zebraniem. Podczas zbierania ogrodów mrówek tnących liście noś rękawice z grubej tkaniny, aby zapobiec (lub przynajmniej złagodzić) ugryzienia pracowników. W przypadku innych gatunków attine rękawice z tkaniny są opcjonalne.
  3. Przenieś próbki ogrodowe do czystego plastikowego pojemnika zawierającego warstwę tynku w celu zrównoważenia wilgotności w ogrodzie. Po przeniesieniu robotnic ogrodowych i mrówek hermetycznie zamknij odbiornik, aby uniknąć wysuszenia próbki. Próbki ogrodowe należy przechowywać w temperaturze 23–25 °C do czasu przetworzenia.
  4. Zamknij wykop wcześniej usuniętą ziemią.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Protokół przygotowania próbki. (A) Pobieranie próbek z kolonii polowych. (B) Przetwarzanie próbek. (C) Krótkie podstawy i przebieg przygotowania próbki: 1. Utrwalenie: w celu wzmocnienia i zachowania struktury próbki. 2. Odwodnienie: zawartość wody w próbkach jest wymieniana na etanol. 3. Suszenie w punkcie krytycznym: ciekły CO2 zastępuje etanol i jest odparowywany. 4. Montaż: próbka wyświetlana do analizy. 5. Napylanie złotem: zapobiega ładowaniu próbki. 6. Obrazowanie. Ilustracje i zdjęcia autorstwa Mariany Barcoto. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Odczynniki

UWAGA: Pamiętaj, że następujące rozwiązania powinny być przygotowane wcześniej.

  1. Przygotować 0,2 M bufor kakodylanu sodu. W tym celu rozpuść 42,8 g kakodylanu sodu w 800 ml wody destylowanej, mieszając aż do rozpuszczenia i ustabilizowania pH na poziomie 7,2 (w razie potrzeby dostosuj pH za pomocą kwasu solnego). Uzupełnić objętość roztworu do 1 l, dodając wodę destylowaną. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C (przez ~1 miesiąc).
    UWAGA: Aldehyd glutarowy i paraformaldehyd są toksyczne i należy się z nimi obchodzić w okapie. Podczas pracy z takimi odczynnikami należy nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne przez cały czas.
  2. Przygotuj utrwalacz Karnovsky'ego (zmodyfikowany z Karnovsky'ego)47. W tym celu dodać 10 ml 25% wodnego roztworu aldehydu glutarowego i 10 ml 20% wodnego roztworu paraformaldehydu do 25 ml 0,2 M buforu kakodylanu sodu i wymieszać. Dodać 1 ml 0,1 M chlorku wapnia (CaCl2) i uzupełnić objętość do 100 ml przez dodanie wody destylowanej. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 miesiąca).
    UWAGA: Utrwalacz Karnovsky'ego jest szkodliwy w przypadku wdychania i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Dlatego unikaj wdychania oparów, używając tylko na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym miejscu. Podczas pracy z roztworem należy nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne
    3. .
  3. Używając absolutnego etanolu (klasa analityczna), przygotuj 30%, 50%, 70% i 90% roztwory etanolu w wodzie destylowanej; wymagany jest również 100% etanol.

3. Utrwalenie próbki

UWAGA: Utrwalacze twardnieją i zachowują próbki, zachowując cechy morfologiczne. Aldehydy (takie jak paraformaldehyd i aldehyd glutarowy) są niekoagulantami utrwalającymi typu sieciowego, indukującymi wiązania krzyżowe w obrębie i między białkami a kwasami nukleinowymi48.

  1. Usuń robotnice, jaja, poczwarki i larwy z próbek ogrodowych za pomocą kleszczy entomologicznych (Rysunek 2B). Odsuń fragmenty ogrodowe nie większe niż 5 mm3. Dodaj fragmenty do probówki o pojemności 2 ml (Rysunek 2C).
  2. Do probówek zawierających próbki użyj szklanej pipety Pasteura, aby dodać ~1 ml roztworu utrwalającego Karnovsky'ego (upewnij się, że próbka jest całkowicie pokryta). Wymieszać przez delikatne mieszanie, aby próbka mogła się namoczyć i inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny przed kontynuowaniem przetwarzania próbki (Rysunek 2C.1).
    UWAGA: W przypadku, gdy następujące etapy odwadniania nie zostaną przeprowadzone bezpośrednio po utrwaleniu, protokół może zostać wstrzymany na tym etapie, a próbki mogą być przechowywane przez ~1 rok w temperaturze 4 °C.
    Sugerujemy użycie szklanej pipety Pasteura, ponieważ składa się ona z materiału obojętnego i jest łatwiejsza do czyszczenia w celu późniejszego ponownego użycia. Materiał ogrodowy jest wysoce hydrofobowy, ma tendencję do unoszenia się nad powierzchnią roztworu utrwalającego. Zwykle potrzeba do 5 minut, aby całkowicie zanurzyć się w utrwalaczu. Upewnij się, że utrwalacz zakrywa fragmenty ogrodu, ponieważ jego objętość ma tendencję do zmniejszania się, gdy wchodzi w pory próbki. Empirycznie zweryfikowaliśmy, że po namoczeniu próbki i zmoczeniu, jej składniki (w szczególności delikatna grzybnia) stały się podatne na rozdrobnienie po dalszym wymieszaniu. Dlatego zalecamy unikanie potrząsania próbkami w jak największym stopniu.

4. Odwodnienie próbki

UWAGA: Seria mycia etanolem stopniowo zamienia wodę w próbkach na etanol. Ważne jest, aby zacząć od roztworu etanolu o niskim stężeniu (patrz poniżej), aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia lub zapadnięcia się tak delikatnych próbek49.

  1. Całkowicie usunąć roztwór utrwalający Karnovsky'ego za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie zakłócić próbki (Rysunek 2C.1).
    UWAGA: Wyrzuć utrwalacz Karnovsky'ego w pojemniku odpowiednio oznaczonym do zarządzania pozostałościami toksycznych substancji chemicznych.
  2. Natychmiast po usunięciu utrwalacza dodać 1 ml 30% etanolu, uważając, aby nie zakłócić próbki, i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 2C.2).
    UWAGA: Próbki należy zawsze moczyć w roztworze. Upewnij się, że szybko wymieniasz roztwory podczas serii stopniowego mycia etanolem. Gdy ogród traci swój porowaty wygląd i agreguje się na dnie probówki, 1 ml etanolu zwykle wystarcza do pokrycia próbki (gdy próbka nie jest większa niż 5 mm3). Jeżeli jednak próbki nie są całkowicie pokryte, należy dodawać etanol do momentu, aż próbka zostanie całkowicie pokryta.
  3. Całkowicie usuń 30% etanolu za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Dokładnie wyrzuć 30% etanolu.
    UWAGA: W przypadku całej serii stopniowego mycia etanolem należy wyrzucić etanol do pojemnika odpowiednio oznakowanego w celu zarządzania pozostałościami toksycznych substancji chemicznych.
  4. Dodaj 1 ml 50% etanolu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuń 50% etanolu za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie naruszyć próbki. Dokładnie wyrzuć 50% etanolu.
  5. Dodaj 1 ml 70% etanolu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuń 70% etanolu za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo wyrzuć 70% etanolu.
    UWAGA: Na etapie mycia 70% etanolem użytkownik może w razie potrzeby wstrzymać protokół, ponieważ probówki z próbkami mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C, gdy materiał nie zostanie natychmiast przetworzony.
  6. Dodaj 1 ml 90% etanolu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuń 90% etanolu za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie zakłócić próbki. Dokładnie wyrzuć 90% etanolu.
  7. Dodaj 1 ml 100% etanolu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuń 100% etanol za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie zakłócić próbki. Dokładnie wyrzuć 100% etanolu.
  8. Za pomocą kleszczyków i/lub szpatułki ostrożnie przenieść próbki do pojemników na próbki do suszarki w punkcie krytycznym (CPD), zawierających etykiety identyfikacyjne próbek (wykonane wcześniej na papierze i ołówku). Aby uniknąć wysuszenia próbek, przenoszenie odbywa się za pomocą pojemnika umieszczonego na szalce Petriego pokrytej 100% etanolem.
  9. Nałożyć pokrywki na pojemniki i zanurzyć je w szklanej zlewce z podziałką zawierającą 100% etanolu w ilości wystarczającej do zanurzenia pojemników. Przykryj szklaną zlewkę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej; Następnie odpowiednio wyrzuć 100% etanolu.
  10. Przenieść pojemniki na próbki do innej szklanej zlewki miarowej zawierającej wystarczającą ilość 100% etanolu do zanurzenia pojemników. Przykryj szklaną zlewkę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej; Następnie przenieść pojemniki na próbki do suszarki w punkcie krytycznym.
    UWAGA: Po serii mycia szklane pipety i zlewki należy obficie przepłukać wodą destylowaną, a resztki wody należy wyrzucić do pojemnika odpowiednio oznakowanego pod kątem zarządzania pozostałościami toksycznych substancji chemicznych. Po spłukaniu szklane przedmioty można umyć neutralnym detergentem, spłukać wodą z kranu i wysuszyć na powietrzu.

5. Suszenie w punkcie krytycznym

UWAGA: Suszarka punktu krytycznego wymienia etanol w próbkach na ciekły dwutlenek węgla (CO2), który odparowuje z próbki przy wyższej temperaturze i ciśnieniu. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi takich procedur.

  1. Włącz sprzęt.
  2. Otwórz komorę, umieść w niej pojemniki na próbki i dodaj 100% etanolu, aż pokryje pojemniki. Zamknij komorę.
  3. Aktywuj opcję Cool i poczekaj, aż temperatura osiągnie 10 °C.
  4. Otwórz zawór butli CO2 i aktywuj opcję mieszadła.
  5. Aktywuj opcję CO2 in, zawsze sprawdzając komorę, aby sprawdzić, ile CO2 już ją napełniło. Gdy komora jest prawie napełniona, wyłącz opcję CO2 in i aktywuj opcję Wymiana, pozostawiając ją aktywną, aż będzie wystarczająca ilość CO2 tylko do przykrycia pojemników. Upewnij się, że pojemniki są zawsze pokryte CO2 (tj. wyłącz opcję Exchange, zanim cały CO2 opuści komorę). Powtórz krok 5.5 6 razy.
  6. Aktywuj CO2 po raz ostatni i napełnij komorę, aż pojemniki zostaną przykryte.
  7. Aktywuj opcję Podgrzewanie i wyłącz opcję Mieszadło. Zamknij zawór butli CO2
    8. .
  8. Poczekaj, aż temperatura wzrośnie do 35 °C, a następnie aktywuj opcję Wyjście gazu.
    UWAGA: W temperaturze około 30 °C komora osiąga ciśnienie 70-80 bar, osiągając punkt krytyczny, w którym ciecz znika.
  9. Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 1 bar, cała zawartość gazu została usunięta. Otwórz komorę i wyjmij pojemniki.
  10. Wyłącz urządzenie.

6. Montaż

  1. Przygotuj uchwyty na próbki SEM (tj. aluminiowe klocki; Rysunek 2C.4).
    1. Owiń kikuty kawałkiem folii aluminiowej, przykrywając tylko górę, aby ułatwić czyszczenie kikutów po analizie.
    2. Zidentyfikuj odcinki, wpisując kod/numer próbki na spodzie uchwytu, gwarantując identyfikację tego, co jest umieszczone na górze.
    3. Zakryj górną część dwustronną taśmą węglową. Umieść kikuty w uchwycie na próbki.
  2. Otworzyć pokrywę pojemnika na próbkę i ostrożnie przenieść wysuszoną próbkę na szklaną szalkę Petriego za pomocą kleszczy i szpatułki.
    UWAGA: Krytyczne ogrody suszone punktowo mają tendencję do aglomeracji, tworząc silnie upakowane próbki, które należy ostrożnie rozdzielić jako fragmenty o rozmiarze nie większym niż 1 mm3.
  3. Ostrożnie umieść fragmenty na lepkiej powierzchni króćca pokrytego taśmą. Gdy fragment ogrodu dotknie taśmy, bardzo trudno jest go (ponownie) przesunąć, dlatego należy uważać, aby nie umieścić go w niechcianych miejscach lub pozycjach. Dodaj do dziewięciu fragmentów na kikut.
  4. Powtórzyć kroki 6.2 i 6.3 dla każdej próbki.

7. Napylanie złotem

UWAGA: Wymagane jest pokrycie próbki, aby zapobiec jej obciążeniu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi regulacji ustawień, takich jak ciśnienie gazu roboczego (0,5 × 10-1 mm Hg ciśnienia gazu w tym protokole), czas rozpylania (220 s), grubość warstwy złota (~120 A), prąd (50 mA) i voltage zasilanie. Rozpylanie ma tendencję do podążania za wspólnym przepływem pracy, chociaż sprzęt różnych producentów może działać nieco inaczej.

  1. Otwórz odchylane ramię docelowe i umieść króćce na stole do pobierania próbek.
  2. Zamknij odchylane ramię docelowe i sprawdź, czy osłona przeciwodłamkowa szklanej komory próżniowej jest prawidłowo osadzona.
  3. Otwórz zawór butli z argonem i włącz główny wyłącznik zasilania.
  4. Śledź wzrost podciśnienia na wyświetlaczu urządzenia, aż osiągnie znak 0.5 × 10-1 mm Hg na wyświetlaczu; następnie aktywuj płukanie. Powtórz operację 5x.
  5. Włącz system cyrkulacji wody, aktywuj opcję HV On i otwórz pokrywę ze złotej folii. Upewnij się, że kolor plazmy jest różowawy. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, ustaw 220 s rozpylania przy napięciu 50 mA, które osadzi warstwę złota o wartości ~120 A (12 nm).
  6. HV On jest automatycznie wyłączany. Wyłącz system cyrkulacji wody i zamknij pokrywę ze złotej folii.
  7. Wyłącz główny wyłącznik zasilania, aby powietrze mogło dostać się do komory próżniowej. W przypadku próbek ogrodowych i odpadów powtórz kroki 7.1-7.7 3x.
    UWAGA: Jeśli obrazowanie nie nastąpi natychmiast po przygotowaniu próbki, należy przechowywać kikuty w hermetycznym pojemniku wypełnionym warstwą krzemionki, aby uniknąć ponownego nawodnienia próbek.

8. Obrazowanie

UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi regulacji ustawień SEM, takich jak średnica apertury obiektywu, napięcie robocze, wyrównanie systemu wiązki elektronów, wyrównanie osiowe i stygmatory.

  1. Umieść króćce w uchwycie na próbkę, robiąc notatki na temat pozycji każdej próbki.
    UWAGA: Podczas wkładania lub wyjmowania uchwytu na sample należy nosić rękawiczki i utrzymywać uchwyt w jak największej czystości.
  2. Uruchom oprogramowanie operacyjne z pulpitu.
  3. Wybierz ustawienia instrumentu. Wizualizacja próbek ogrodowych o średnicy apertury obiektywu 30 μm (tj. w drugim etapie), pracujących w wysokiej próżni, wykrywających sygnały z elektronów wtórnych (SED), przyspieszających napięcie 20 kV, odległości roboczej 15 - 20 mm, prądu sondy 40,0 (w trybie wysokiego prądu) i zmieniając powiększenie w zależności od próbki.
  4. Postępując zgodnie z instrukcjami nawigacji, naciśnij ikonę odpowietrznika i poczekaj, aż komora próbki zostanie odpowietrzona. Pasek postępu wskazuje stan próżni.
  5. Po osiągnięciu ciśnienia atmosferycznego otwórz komorę na próbkę i ostrożnie włóż uchwyt próbki.
  6. Delikatnie zamknij drzwiczki komory i naciśnij ikonę Evac, aby opróżnić urządzenie, śledząc stan podciśnienia na pasku postępu. System nawigacji pokaże pozycję ruchomej sceny i dostarczy wykres uchwytu po zakończeniu ruchu. Naciśnij ikonę aparatu, aby nagrać zdjęcie uchwytu, aby uzyskać widok z góry, który pomoże nawigować między próbkami podczas obrazowania.
  7. Naciśnij ikonę obserwacji, aby włączyć działo elektronowe i poczekaj, aż obraz się uformuje. Użyj ręcznego interfejsu użytkownika (sterowanie ręczne), aby ręcznie przesunąć oś Z na odpowiednią wysokość (w oparciu o wysokość próbki i wyznaczoną odległość roboczą).
    UWAGA: Aby przedłużyć żywotność żarnika wolframowego, wstrzymaj funkcję obserwacji, gdy nie jest aktywnie obrazowany.
  8. Użyj opcji wyświetlanych na ekranie lub ręcznego elementu sterującego, aby zmienić szybkość rastrowania i położenie obrazu. Przesuń stolik, aby uzyskać dokładny widok próbki, wykorzystując funkcję RDC do skupienia się na określonych obszarach. Obserwując docelową (lub interesującą) strukturę, dostosuj odpowiednio powiększenie, ostrość, jasność, kontrast i stygmatyzację. Skoryguj stygmatyzację, korzystając z ręcznego interfejsu użytkownika, aby przesunąć scenę w kierunkach X i Y.
    1. Dostosuj powiększenie w zakresie od 100x do 700x, aby zobrazować ogólne aspekty ogrodu (takie jak gęstość strzępek, podłoże i wzorce kolonizacji).
    2. Dostosuj powiększenie w zakresie od 700x do 1,500x, aby uwidocznić wzorce przestrzenne mikrobioty.
    3. Dostosuj powiększenie w zakresie od 1 500x do 3 000x, aby obserwować interakcje fizyczne między mikrobiotą a biofilmem.
    4. Dostosuj powiększenie w zakresie od 3,000x do 4,000x, aby ustawić ostrość na określonych skupiskach drobnoustrojów.
  9. Aby zapisać obraz, użyj funkcji Zamroź, kliknij ikonę Zdjęcie i ustaw ścieżkę do pliku. Standardowo należy przeanalizować co najmniej trzy fragmenty ogrodu, obrazując każdy z nich we wszystkich zakresach powiększeń wymienionych w kroku 8.8. Daje to co najmniej 12 obrazów na próbkę, chociaż więcej obrazów może wymagać bardziej szczegółowych opisów. Sugerujemy, że 15-25 obrazów na próbkę, w zakresie wszystkich powiększeń w kroku 8.8, zwykle dostarcza drobnych szczegółów do opisu próbki.
    UWAGA: Raster i zapisanie obrazu trwa kilka sekund, podczas których należy unikać jakichkolwiek wibracji na ruchomym stole SEM.
  10. Po zakończeniu obrazowania naciśnij opcję Vent, aby odpowietrzyć komorę, śledząc stan próżni przez pasek postępu. Ostrożnie wyjmij uchwyt, delikatnie zamknij drzwiczki komory i naciśnij przycisk Evac, aby ewakuować komorę.
  11. Jak tylko ewakuacja zostanie zakończona, wyjdź z oprogramowania operacyjnego.
  12. Dostosuj jasność i kontrast, aby poprawić wizualizację za pomocą edytora obrazów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiliśmy uproszczony protokół do wizualizacji składników próbek z ogrodu i odpadów z ogrodu attine, takich jak strzępki grzybów, podłoże, mikrobiota i biofilmy. Projekt SEM poszerzył naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób ogród i odpady stanowią rusztowanie dla wzorców strukturalnych mikrobioty (Rysunek 3). W ogrodach attynowych strzępki grzybów są rozgałęzionymi strukturami pokrywającymi część powierzchni podłoża. Ponieważ strzępki grzybów są zwykle bardzo wrażliwe na odwodnienie i pękanie, użytkownik może kierować się aspektem strzępek, aby ocenić wyniki przygotowania próbki. Jak również zaobserwowano w poprzednich pracach32,33,45, strzępki mają kształt rurowy; nienaruszone, rurkowe strzępki wskazują na skuteczne przygotowanie próbki (Rysunek 3A i Rysunek 4C). Gdy strzępki mają kształt wstęgi, takie spłaszczenie jest prawdopodobnie artefaktem techniki (Rysunek 4C).

Powierzchnie podłoża roślinnego można rozpoznać po warstwach naskórka i naskórka, a także aparatach szparkowych i włoskach. Takie struktury są bardziej rozpoznawalne, gdy substraty nie są jeszcze skolonizowane przez strzępki grzybów i mikrobiotę (Rysunek 3A i Rysunek 4C). Kiedy podłoże jest skolonizowane, mikrobiota i/lub strzępki grzybów pokrywają jego powierzchnię w taki sposób, że określone struktury roślinne nie są łatwo dostrzegalne (Rysunek 3A). Mikrobiota może kolonizować zarówno strzępki grzybów, jak i podłoże, z których każdy ma pozornie odrębną organizację przestrzenną. W Rysunek 3, takie wzorce przestrzenne zostały schematycznie zilustrowane i zapakowane w odpowiednie obrazy SEM, gdzie zostały zidentyfikowane; Może to ułatwić powiązanie wyników SEM z ich interpretacją.

Mikrobiota kolonizująca hipofy jest rzadziej obserwowana, a jeśli zostanie znaleziona, składa się z komórek pręcików lub kokoidów występujących pojedynczo lub w małych grupach przyczepionych do powierzchni strzępki. Matrycę egzopolisacharydową biofilmu (EPS), wyglądającą jak struktura "koronkowej tkaniny", można zaobserwować otaczające strzępki w małych kępkach (Ryc. 3A). Dość powszechna jest mikrobiota kolonizująca substrat, występująca w ogrodach różnych gatunków mrówek attine. Wzorce kolonizacji wydają się być do pewnego stopnia definiowane przez etapy degradacji substratu. W związku z tym, kolonizując jeszcze niezdegradowane substraty, mikrobiota może występować jako pojedyncze komórki lub gromadzić się w małych grupach. Mikrobiota może pokrywać warstwy podłoża, gdy wykazuje ono mikroskopijne oznaki degradacji (tj. gdy warstwy kutykularne/naskórkowe roślin i inne struktury roślinne nie są dostrzegalne, a bruzdy i wgłębienia są obfite).

W tych "matach mikrobiologicznych" morfologia komórek jest bardziej rozpoznawalna, gdy matryca EPS jest nieobecna. W przypadkach, gdy komórki drobnoustrojów są osadzone w matrycy EPS, ich morfologia nie jest łatwa do odróżnienia. Zgodnie z ich organizacją przestrzenną, scharakteryzowaliśmy biofilmy jako "rozproszone" lub jako "trójwymiarowe". Kiedy biofilm jest rozprowadzany, komórki drobnoustrojów i matryca EPS sporadycznie pokrywają powierzchnię podłoża, tworząc płaską warstwę o grubości 1-3 komórek (Rysunek 3B). Gdy biofilm jest trójwymiarowy, komórki drobnoustrojów i matryca EPS gromadzą się, tworząc klastry o grubości kilku komórek. Regiony ogrodowe zbudowane ze zniszczonych substratów (takich jak stare ogrody i odpady) dają schronienie mikrobiocie w bruzdach i wgłębieniach, gdzie tworzą gęste zbiorowiska (Rysunek 3C). W szczególności w ekstensywnie zdegradowanych podłożach w próbkach odpadów występuje obfita mikrobiota, najbardziej zróżnicowana morfologicznie spośród wszystkich regionów. Drożdże dodają tej społeczności większej złożoności, fizycznie wchodząc w interakcję z prokariotami za pośrednictwem biofilmu. W próbkach odpadów Atta sexdens i Acromyrmex sp. zaobserwowano, że matryce EPS tworzą rzucającą się w oczy włóknistą siatkę otaczającą prokariota w kształcie pałeczek i kokoidów, a także wrzecionowate i kuliste drożdże (Rysunek 3C).

Wynikająca z przeplatającej się siatki strzępek, gąbczasta struktura ogrodu wymaga dodatkowego rozpylania, aby pokryć próbkę bardziej równomiernie. Takie kroki pozwalają uniknąć rozpraszania elektronów, które zniekształca obraz i utrudnia jego rozdzielczość (Rysunek 4A). Etapy przygotowania próbek pozwoliły zachować większość struktury ogrodu, odsłaniając rozmieszczenie przestrzenne i organizację mikrobioty. Warto jednak powtórzyć, że struktury takie jak strzępki grzybów i matryca EPS są bardzo wrażliwe na odwodnienie i bardzo trudne do zachowania, zwłaszcza w przypadku SEM. Struktura strzępek była stosunkowo dobrze zachowana, jednak uzasadnione jest uznanie, że biofilm uwidoczniony w niektórych próbkach ogrodowych może być pozbawiony niektórych składników strukturalnych matrycy EPS. Chociaż w niektórych próbkach zachowała się gładka zewnętrzna warstwa polisacharydów otaczająca mikrobiotę (Ryc. 3A, B), niektóre z nich zachowały cechy morfologiczne mikrobioty, ale nie miały matrycy EPS. Nie jest jednak jasne, czy matryca EPS była rzeczywiście nieobecna, czy też została usunięta podczas przygotowywania próbki.

Z jednej strony, usunięcie gładkiej warstwy biofilmu utrudnia zrozumienie dokładnej struktury biofilmu. Z drugiej strony ujawnia morfologię, organizację przestrzenną i interakcje fizyczne komórek żyjących pod warstwą, co jest naszym głównym celem badawczym. Wcześniejsze badania wykazały zachowanie zarówno strzępek grzybów, jak i matrycy biofilmu poprzez zastosowanie pary tetratlenku osmu (OsO4) jako głównego utrwalacza44,50,51,52,53,54. Następnie przeprowadziliśmy eksperyment porównawczy, w którym utrwaliliśmy świeże próbki ogrodowe za pomocą pary OsO4, która najwyraźniej zachowała gładki wygląd biofilmów (Rysunek 4B). Metoda ta spowodowała jednak znaczne spłaszczenie strzępek i mikrobioty. To spłaszczenie spowodowało utratę ogólnych aspektów przestrzennych ogrodu opisanego wcześniej29,33,32,45, ograniczając w ten sposób dalsze badania nad wzorcami strukturalnymi ogrodu. Utrwalanie za pomocą OsO4 utrudniało zarówno rozróżnienie morfologii i rozmieszczenia drobnoustrojów, jak i odróżnienie struktur komórkowych od artefaktów technicznych, komplikując w ten sposób interpretację danych.

figure-results-1
Rysunek 3: Wzorce architektoniczne mikrobioty. Mikrobiota kolonizuje strzępki grzybów i podłoże w odrębnej organizacji przestrzennej. Takie wzorce przestrzenne zostały schematycznie zilustrowane i umieszczone w odpowiednich obrazach SEM, gdzie zostały zidentyfikowane (ograniczone na rysunku białymi kwadratami): (A) Mikrobiota kolonizująca hiphal składa się z izolowanych lub małych grup komórek, przy czym w niektórych próbkach wykrywalna jest matryca egzopolisacharydowa biofilmu. (B) Mikrobiota kolonizująca substrat rozprzestrzenia się po całym podłożu, przy czym matryca EPS pokrywa komórki w taki sposób, że ich morfologia nie jest łatwa do odróżnienia. (C) Mikrobiota kolonizująca substrat tworząca trójwymiarowe grupy, tworzące biofilmy mono lub wielomorfologiczne, w niektórych przypadkach świadczące o macierzy EPS. Ilustracje: Mariana Barcoto. Skrót: EPS = matryca egzopolisacharydowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Bezowocne obrazowanie. Obrazy niskiej jakości dające nieefektywne wyniki i/lub utrudniające interpretację wzorców architektonicznych. (A) Rozpraszanie elektronów zniekształca obraz, utrudniając jego rozdzielczość, a w konsekwencji identyfikację morfologii. Obserwowano to często w próbkach napylanych tylko raz i było zmniejszane przez dodatkowe powlekanie. (B) Utrwalanie świeżych próbek ogrodowych za pomocą pary tetratlenku osmu (OsO4) jako głównego utrwalacza44,50,51,52,53,54 najwyraźniej zachował gładki wygląd biofilmów. Spowodowało to jednak rozległe strzępki i spłaszczenie mikrobioty, uszkadzając wzorce architektoniczne ogrodów. (C) Przygotowanie próbki przy użyciu utrwalacza Karnovsky'ego dało obrazy wyższej jakości w porównaniu z preparatami wykorzystującymi OsO4, zachowując większość struktury strzępek, rozmieszczenie mikrobioty i wzorce przestrzenne ogrodów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEM wykorzystuje wiązkę elektronów do skanowania próbki, generując jej powiększony obraz, dzięki czemu można wizualizować trójwymiarowe mikrostruktury w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ SEM działa w warunkach wysokiej próżni, wymagane jest usunięcie do/więcej niż 99% wody z próbek. Wewnątrz komory próżniowej SEM częściowo uwodnione próbki mogą ulec odwodnieniu i zapadnięciu się, oprócz rozpraszania elektronów. W przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości w SEM przygotowanie próbki powinno obejmować procedury usuwania wody przy jednoczesnym utrzymaniu zmian objętości i morfologii na minimalnym poziomie, a także powlekanie zapobiegające ładowaniu podczas obrazowania 55,56,57.

Po pierwsze, próbka jest chemicznie utrwalana poprzez sieciowanie jej białek i kwasów nukleinowych, co uzyskuje się za pomocą różnych technik. Szeroko stosowana metoda polega na połączeniu aldehydu glutarowego i formaldehydu (lub paraformaldehydu) w buforze, takim jak piperazyno-1,4-bis [kwas 2-etanosulfonowy] (PIPES); Kwas N-[2-hydroksyetylo]-piperazyno-N′-2-etanosulfonowy (HEPES); sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS); lub kakodylan sodu. Utrwalenie chemiczne wzmacnia próbkę, zachowując jej strukturę do wysuszenia. W zależności od ich charakteru, próbki mogą wymagać wtórnego utrwalenia (w tetratlenku osmu), a nawet trzeciorzędowego (w octanie uranylu). Po drugie, próbki muszą być odwodnione. Ponieważ suszenie powietrzem powoduje rozległe zapadanie się drobnych struktur, powszechną alternatywną techniką jest suszenie w punkcie krytycznym (CPD). W CPD próbka nie jest poddawana napięciu powierzchniowemu, co zapobiega tworzeniu się artefaktów. Z jednej strony woda osiąga punkt krytyczny przy ciśnieniu 228,5 bara i temperaturze 374 °C, co łatwo zniszczyłoby próbkę. Z drugiej strony punkt krytyczny CO2 wynosi 73,8 bara i 31 °C, co uzasadnia jego stosowanie jako płynu przejściowego. Przy zwiększaniu temperatury CO2 przekształca się w postać gazową i usuwa z próbki 58,59,60,61,62,63. Po trzecie, próbki nieprzewodzące powinny być powlekane, aby zapobiec ich ładowaniu i zwiększyć uzysk elektronów wtórnych, co w konsekwencji przyczynia się do uzyskania ostrych sygnałów obrazu64.

Przedstawiony tutaj protokół łączy procedury konserwacji próbekgrzybów 32,33,45,65,66,67,68 i biofilmów 69,70, upraszczając jednak proces poprzez usunięcie etapów postfiksacji i skrócenie czasu odwadniania. Udało się jednak zachować delikatną strukturę ogrodu, szczegółowo opisując fizyczne interakcje mikrobioty i odsłaniając strukturę przestrzenną biofilmu. Przestrzenne gromadzenie mikrobioty ma zasadnicze znaczenie zarówno dla ustanawiania interakcji, jak i wyznaczania ich wzorców regulacyjnych. Dystrybucja przestrzenna kształtuje dynamikę społeczną drobnoustrojów, z której mogą wyłonić się wewnętrzne właściwości. Są one niezbędne, aby poradzić sobie ze zmiennością i złożonością, z jakimi borykają się ekosystemy mikrobiologiczne 71,72,73. Nasze odkrycia wzmacniają mikrobiotę integrującą wzorce strukturalne ogrodu, wspierając jej przypuszczalny udział w reakcjach fizjologicznych 32,42,43,44. Dostarczyliśmy dowodów in situ, że biofilmy są istotne dla interakcji mikrobiologicznych w kulturze grzybów attynowych42,44. Biofilmy to złożone i niejednorodne systemy wielokomórkowe, w których mikroorganizmy osadzone w samowydzielającej się matrycy EPS tworzą sieci społeczne. Kooperatywnie i/lub antagonistycznie, interakcje w obrębie biofilmu determinują otwieranie, zajmowanie i modyfikację nisz 71,72,73,74. Projekt SEM umożliwił lepsze zrozumienie organizacji przestrzennej mikrobioty w różnych regionach ogrodu, szczegółowo opisując fizyczne interakcje między mikrobiotą a substratem oraz mikrobiotą i strzępkami, a jednocześnie uprościł metody przyszłych badań w tej dziedzinie.

Badania nad mikrobiotą ogrodową cieszą się coraz większym zainteresowaniem, koncentrując się w szczególności na procesach, które mogą kształtować skład tych wyjątkowych zbiorowisk75,76, a także ich funkcję i interakcje 42,43,44. Interakcje między roślinami bakteryjnymi i grzybowymi mogą pomóc grzybowi w rozpuszczaniu fosforanów, wytwarzaniu sideroforów oraz degradacji celulozy i chityny. Takie interakcje, które mogą zachodzić jako kontinuum wzajemności-antagonizmu, mogą regulować funkcjonowanie ogrodu44. Podejście metodologiczne, które tu prezentujemy, pozwala na spojrzenie in situ na wymiar strukturalny, w którym mogą zachodzić interakcje. Podkreślono w nim, że podobnie jak większość przebadanych już ekosystemów mikrobiologicznych, ogrody attynowe są wzorzyste, niejednorodnie zorganizowane w przestrzeni 5,7,8. Projekt SEM zapewnił już perspektywę przestrzenną in situ dotyczącą dynamiki mikrobioty w różnych społecznościach związanych z gospodarzami, takich jak sinice77, skóra humbaka78, grzyby66, parzydełka79, ludzkie jelita80, porosty81, przyczyniając się również do opisu plastisfery (nowego ekosystemu wywodzącego się antropogenicznie)82. W każdym z tych badań stosowano jednak nieco odrębną metodę etapowego przygotowania próbki.

Próbki ogrodowe są bardzo delikatne i niejednorodne, z strzępkami grzybów uważanymi za przystosowane do tego, aby nie tracić wody26, oprócz zróżnicowanego zestawu wbudowanych substratów24, mikrobioty i jej biofilmu. Jednak dostosowany przez nas protokół przygotowania próbki zachował większość takich struktur i pozwolił nam rozszerzyć charakterystykę struktury przestrzennej mikrobioty. Uważamy, że fiksacja na rozwiązaniu Karnovsky'ego jest krytycznym krokiem w protokole, ponieważ trójwymiarowy aspekt tak delikatnej próbki może się w tym momencie zapaść i/lub spłaszczyć. Złożone próbki na bazie grzybów są zwykle przygotowywane do SEM przez utrwalenie aldehydem glutarowym i utrwalenie za pomocą OsO4 65,66,67,68. Doniesiono jednak, że połączenie aldehydów (paraformaldehydu i aldehydu glutarowego) poprawia zachowanie biofilmu dla SEM69,70. Metody konserwacji biofilmów mogą również obejmować 0,15% błękitu alkijskiego lub 0,15% czerwieni rutenowej do początkowego utrwalacza Karnovsky'ego, a także 1% kwasu garbnikowego do 1% osmu do postfiksacji. Mocowanie ogrodów i odpadów za pomocą Karnovsky'ego i postfixingu za pomocą OsO4 zakonserwowało bakterie w starych próbkach ogrodowych i odpadowych, choć nie wykazało biofilmu32. Ponieważ w naszych próbkach struktura ogrodu, mikrobiota i biofilmy zostały zachowane bez etapu postfiksacji osmu zastosowanego w poprzednich protokołach 32,33,69,70, woleliśmy uprościć protokół, usuwając ten krok. OsO4 jest utleniaczem stosowanym do utrwalania (zwłaszcza) lipidowych składników komórek83. Ponieważ jest silnie, OsO4 może powodować poważne oparzenia w kontakcie ze skórą i błonami śluzowymi, a także uszkadzać drogi oddechowe lub pokarmowe w przypadku wdychania lub spożycia84,85. Usuwając OsO4 po fiksacji, protokół konsekwentnie zmniejsza liczbę toksycznych regentów, którymi można manipulować.

Sugerujemy również serię mycia etanolem zamiast acetonu, który może być zbyt ostry dla delikatnych próbek86. Seria mycia etanolem z 10-minutowymi krokami upraszcza również poprzednie protokoły SEM45 bez ograniczania rozdzielczości obrazu. Poza tym empirycznie zweryfikowaliśmy, że dodatkowe etapy rozpylania renderowały obrazy o wyższej jakości, co było spójne dla próbek ogrodowych wszystkich badanych przez nas gatunków. Takie dodatkowe etapy prawdopodobnie pokrywały próbki bardziej równomiernie, ponieważ rozpraszanie elektronów było znacznie częstsze w próbkach pokrytych tylko raz (ryc. 4A). W związku z tym zachęcamy do przyszłych prac nad testowaniem dodatków i warunków, które mogłyby zapewnić ulepszony protokół wizualizacji biofilmu w próbkach ogrodowych.

SEM to potężne narzędzie do szczegółowego określania morfologii komórkowej mikrobioty i rozmieszczenia przestrzennego EPS na powierzchniach, ujawniając topografię i teksturę próbek ogrodowych w wysokiej rozdzielczości i powiększeniu 70,87. Nie zapewnia jednak dyskryminacji taksonomicznej członków społeczności, a co za tym idzie, nie mamy rozróżnienia, kto jest gdzie. Ponadto, pomimo dużej głębokości ogniskowej SEM, nie informuje on o trójwymiarowych cechach próbki. Aby uzyskać pełny opis ogrodu mikrobiologicznego attyny, w tym biogeografię taksonomiczną i trójwymiarową rozdzielczość przestrzenną, analizę SEM można uznać za pierwszą procedurę w technikach obrazowania krokowego próbek ogrodowych. W celu uzyskania rozdzielczości taksonomicznej, SEM można połączyć z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH)88,89 i jej wariantami, takimi jak FISH o wysokiej rozdzielczości filogenetycznej (HiPR-FISH)90, znakowanie kombinatoryczne i obrazowanie spektralne FISH (CLASI-FISH)9,91 oraz projekcje 3D92. Trójwymiarowa analiza mikrostruktury może być bardziej szczegółowo opisana za pomocą mikrotomografii rentgenowskiej (X-ray μCT)93. Do tej pory SEM umożliwił nam szczegółową obserwację organizacji przestrzennej mikrobioty wokół strzępek oraz na powierzchni podłoża, bruzd i wgłębień. Takie wzorce mikrobiologiczne budują naszą wiedzę na temat przypuszczalnych interakcji mikrobiologicznych w ogrodach attyńskich. Wierzymy, że przedstawione przez nas etapy przygotowawcze mogą być szeroko stosowane do udoskonalenia badań nad mikrobiologiczną organizacją przestrzenną w innych delikatnych ekosystemach mikrobiologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) za wsparcie finansowe (Grant #2019/03746-0). MOB dziękuje za stypendium doktoranckie otrzymane od FAPESP (proces 2021/08013-0) i Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (CAPES) - Kod finansowy 001. AR dziękuje również Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) za stypendium badawcze (#305269/2018). Autorzy chcieliby podziękować Marci Reginie de Moura Aouada i Antonio Teruyoshi Yabuki za pomoc w testach pilotażowych w celu przygotowania próbki, Renato Barbosa Salaroli za pomoc techniczną oraz Enzo Sorrentino za pomoc w sesji zdjęciowej. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach autoryzacji dostępu do dziedzictwa genetycznego #SISGen AA39A6D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 2 mlAxygenMCT-200-C-BRADo utrwalania i odwadniania próbek
Bezwodny chlorek wapniaMerckC4901CaCl2 bezwodny do przygotowania Karnovsky' s fixative
Suszarka do punktów krytycznychLeicaEM CPD 300Do suszenia w punkcie krytycznym
Dwustronna taśma przewodząca z włókna węglowego, 12 mm (W) X 5 m (L)Mikroskopia elektronowaSciences 77819-12Do montażu próbek
Kleszcze entomologiczneBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Alkohol etylowy (=etanol), czysty (≥ 99,5%)Sigma-Aldrich459836Do odwodnienia
KleszczeBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Szklana zlewkaBrak konkretnego dostawcyDo odwodnienia
Szklana szalka PetriegoBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Pipeta szklanaBrak konkretnego dostawcyDo utrwalania i odwadniania próbek
Aldehyd glutarowy (wodny aldehyd glutarowy klasy EM 25%)Nauki o mikroskopii elektronowej16220Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz
Złoty cel Ted Pella, Inc.8071Do napylania powłoki złotem
Kwas solnySigma-Aldrich 320331Do regulacji roztworów pH
Edytor obrazówPhotoshopdowolna wersjaAby dostosować obrazy
Paraformaldehyd (paraformaldehyd 20% roztwór wodny klasy EM)Mikroskopia elektronowa Nauki15713Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz
Odbiorca propilenuBrak konkretnego dostawcyDo utrzymania żywych kolonii mrówek
Skaningowy mikroskop elektronowyJEOL IT300 SEMDo obrazowania próbek 
Kakodylan sodu trójwodnySigma-AldrichC0250Do przygotowania buforu kakodylanu sodu
SzpatułkaBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami
ogrodowymi Pojemniki na próbki o średnicy 15 mm x wysokości 10 mmTed Pella, Inc.4591Do suszenia w punkcie krytycznym
Powlekarka napylającaBaltec SCD 050Do pokrycia złotym
Króćcem (mocowanie aluminiowe, kołek płaski) 12,7 mm x 8 mm Mikroskopia elektronowaSciences 75520Do mocowania próbek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
  2. Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
  3. Schmitz, O. J. Spatial dynamics and ecosystem functioning. PLOS Biol. 8 (5), e1000378(2010).
  4. Pringle, R. M., Doak, D. F., Brody, A. K., Jocqué, R., Palmer, T. M. Spatial pattern enhances ecosystem functioning in an African savanna. PLOS Biol. 8 (5), e1000377(2010).
  5. Wimpenny, J. W. Spatial order in microbial ecosystems. Biol Rev. 56 (3), 295-342 (1981).
  6. Martiny, J. B. H., et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev. Microbiol. 4 (2), 102-112 (2006).
  7. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nat Rev Microbiol. 22 (2), 105-118 (2024).
  8. Lamont, R. J., Hajishengallis, G., Koo, H. Social networking at the microbiome-host interface. Infec Immun. 91 (9), e00124-e00223 (2023).
  9. Welch, J. L. M., Rossetti, B. J., Rieken, C. W., Dewhirst, F. E., Borisy, G. G. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (6), E791-E800 (2016).
  10. Kim, D., et al. Spatial mapping of polymicrobial communities reveals a precise biogeography associated with human dental caries. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (22), 12375-12386 (2020).
  11. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  12. Ibberson, C. B., Barraza, J. P., Holmes, A. L., Cao, P., Whiteley, M. Precise spatial structure impacts antimicrobial susceptibility of S. aureus in polymicrobial wound infections. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (51), e2212340119(2022).
  13. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  14. Dejea, C. M., et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (51), 18321-18326 (2014).
  15. Hanson, C. A., Fuhrman, J. A., Horner-Devine, M. C., Martiny, J. B. Beyond biogeographic patterns: processes shaping the microbial landscape. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 497-506 (2012).
  16. Adade, E. E., Al Lakhen, K., Lemus, A. A., Valm, A. M. Recent progress in analyzing the spatial structure of the human microbiome: Distinguishing biogeography and architecture in the oral and gut communities. Curr Opin Endocr. 18, 275-283 (2021).
  17. Mony, C., Bohannan, B. J., Leibold, M. A., Peay, K., Vandenkoornhuyse, P. Microbial landscape ecology: Highlights on the invisible corridors. Front Ecol Evol. 9, 753213(2021).
  18. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  19. Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R., Mueller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. 266 (5191), 1691-1694 (1994).
  20. Mueller, U. G., Rehner, S. A., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in ants. Science. 281 (5385), 2034-2038 (1998).
  21. Mueller, U. G., Gerardo, N. M., Aanen, D. K., Six, D. L., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36, 563-595 (2005).
  22. Dentinger, B. T., Lodge, D. J., Munkacsi, A. B., Desjardin, D. E., McLaughlin, D. J. Phylogenetic placement of an unusual coral mushroom challenges the classic hypothesis of strict coevolution in the Apterostigma pilosum group ant-fungus mutualism. Evolution. 63 (8), 2172-2178 (2009).
  23. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 5435-5440 (2008).
  24. de Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J. Forage collection, substrate preparation, and diet composition in fungus-growing ants. Ecol Entomol. 35 (3), 259-269 (2010).
  25. Martin, M. M. The biochemical basis of the fungus-attine ant symbiosis: A complex symbiosis is based upon integration of the carbon and nitrogen metabolisms of the two organisms. Science. 169 (3940), 16-20 (1970).
  26. Grell, M. N., et al. The fungal symbiont of Acromyrmex leaf-cutting ants expresses the full spectrum of genes to degrade cellulose and other plant cell wall polysaccharides. BMC Genomics. 14, 928(2013).
  27. Lange, L., Grell, M. N. The prominent role of fungi and fungal enzymes in the ant-fungus biomass conversion symbiosis. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 4839-4851 (2014).
  28. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6 (4), 389-395 (2014).
  29. Craven, S. E., Dix, M. W., Michaels, G. E. Attine fungus gardens contain yeasts. Science. 169 (3941), 184-186 (1970).
  30. De Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J., Tunlid, A. Symbiotic adaptations in the fungal cultivar of leaf-cutting ants. Nat Commun. 5 (1), 5675(2014).
  31. Aylward, F. O., et al. Enrichment and broad representation of plant biomass-degrading enzymes in the specialized hyphal swellings of Leucoagaricus gongylophorus, the fungal symbiont of leaf-cutter ants. PLoS One. 10 (8), e0134752(2015).
  32. Moreira-Soto, R. D., Sanchez, E., Currie, C. R., Pinto-Tomás, A. A. Ultrastructural and microbial analyses of cellulose degradation in leaf-cutter ant colonies. Microbiology. 163 (11), 1578-1589 (2017).
  33. Erthal Jr, M., Silva, C. P., Cooper, R. M., Samuels, R. I. Hydrolytic enzymes of leaf-cutting ant fungi. Comp Biochem. 152 (1), 54-59 (2009).
  34. North, R. D., Jackson, C. W., Howse, P. E. Communication between the fungus garden and workers of the leaf-cutting ant, Atta sexdens rubropilosa, regarding choice of substrate for the fungus. Physiol Entomol. 24 (2), 127-133 (1999).
  35. Herz, H., Hölldobler, B., Roces, F. Delayed rejection in a leaf-cutting ant after foraging on plants unsuitable for the symbiotic fungus. Behav Ecol. 19 (3), 575-582 (2008).
  36. Schiøtt, M., De Fine Licht, H. H., Lange, L., Boomsma, J. J. Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 40(2008).
  37. Bot, A. N., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethol Ecol Evol. 13 (3), 225-237 (2001).
  38. Scott, J. J., et al. Microbial community structure of leaf-cutter ant fungus gardens and refuse dumps. PLOS One. 5 (3), e9922(2010).
  39. Lewin, G. R., et al. Cellulose-enriched microbial communities from leaf-cutter ant (Atta colombica) refuse dumps vary in taxonomic composition and degradation ability. PLOS One. 11 (3), e0151840(2016).
  40. Suen, G., et al. An insect herbivore microbiome with high plant biomass-degrading capacity. PLOS Genet. 6 (9), e1001129(2010).
  41. Aylward, F. O., et al. Convergent bacterial microbiotas in the fungal agricultural systems of insects. MBio. 5 (6), e02077(2014).
  42. Barcoto, M. O., et al. Fungus-growing insects host a distinctive microbiota apparently adapted to the fungiculture environment. Sci Rep. 10 (1), 12384(2020).
  43. Francoeur, C. B., et al. Bacteria contribute to plant secondary compound degradation in a generalist herbivore system. mBio. 11, e02146-e02220 (2020).
  44. Martiarena, M. J. S., Deveau, A., Montoya, Q. V., Flórez, L. V., Rodrigues, A. The hyphosphere of leaf-cutting ant cultivars is enriched with helper bacteria. Microb Ecol. 86 (3), 1773-1788 (2023).
  45. Leal-Dutra, C. A., et al. Evidence that the domesticated fungus Leucoagaricus gongylophorus recycles its cytoplasmic contents as nutritional rewards to feed its leafcutter ant farmers. IMA Fungus. 14 (1), 19(2023).
  46. Sosa-Calvo, J., Jesovnik, A., Okonski, E., Schultz, T. R. Locating, collecting, and maintaining colonies of fungus-farming ants (Hymenoptera: Myrmicinae: Attini). Sociobiology. 62 (2), 300-320 (2015).
  47. Karnovsky, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-138 (1965).
  48. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Myers, R. B., Grizzle, W. E. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24 (3), 173-190 (2001).
  49. Gusnard, D., Kirschner, R. H. Cell and organelle shrinkage during preparation for scanning electron microscopy: effects of fixation, dehydration and critical point drying. J Microsc. 110 (1), 51-57 (1977).
  50. Surman, S. B., et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms. J Microbiol Methods. 25 (1), 57-70 (1996).
  51. Augustin, J. O., et al. Yet more "weeds" in the garden: fungal novelties from nests of leaf-cutting ants. PLOS One. 8 (12), e82265(2013).
  52. Montoya, Q. V., Martiarena, M. J. S., Polezel, D. A., Rodrigues, A. More pieces to a huge puzzle: Two new Escovopsis species from fungus gardens of attine ants. MycoKeys. 46, 97(2019).
  53. Varanda-Haifig, S. S., et al. Nature of the interactions between hypocrealean fungi and the mutualistic fungus of leaf-cutter ants. Antonie van Leeuwenhoek. 110, 593-605 (2017).
  54. Custodio, B. C., Rodrigues, A. Escovopsis kreiselii specialization to its native hosts in the fungiculture of the lower attine ant Mycetophylax morschi. Antonie van Leeuwenhoek. 112, 305-317 (2019).
  55. Schröttner, H., Schmied, M., Scherer, S. Comparison of 3D surface reconstruction data from certified depth standards obtained by SEM and an Infinite Focus Measurement Machine (IFM). Microchim Acta. 155, 279-284 (2006).
  56. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of scanning electron microscopy (SEM). Scanning microscopy for nanotechnology: Techniques and applications. Zhou, W., Wang, Z. L. , Springer. New York, NY. 1-40 (2007).
  57. Kannan, M. Scanning electron microscopy: Principle, components and applications. A Textbook on Fundamentals and Applications of Nanotechnology. Raja, K., Subramanian, K. S., Kannan, M. , Daya Publishing House. 81-92 (2018).
  58. Ruffolo, J. J. Jr Critical point drying of protozoan cells and other biological specimens for scanning electron microscopy: apparatus and methods of specimen preparation. Trans Am Microsc. 93 (1), 124-131 (1974).
  59. Echlin, P. Recent advances in specimen coating techniques for electron microscopy. Scanning Electron Microscopy 1981/1. , IITRI. Chicago. 79-90 (1981).
  60. Ris, H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded sections. J Cell Biol. 100 (5), 1474-1487 (1985).
  61. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical-point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech. 26 (6), 489-495 (1993).
  62. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J. 38 (11), 775-788 (2005).
  63. Kirk, S. E., Skepper, J. N., Donald, A. M. Application of environmental scanning electron microscopy to determine biological surface structure. J Microsc. 233 (2), 205-224 (2009).
  64. Kemmenoe, B. H., Bullock, G. R. Structure analysis of sputter-coated and ion-beam sputter-coated films: a comparative study. J Microsc. 132 (2), 153-163 (1983).
  65. Kinden, D. A., Brown, M. F. Technique for scanning electron microscopy of fungal structures within plant cells. Phytopathology. 65, 74-76 (1975).
  66. Masaphy, S., Levanon, D., Tchelet, R., Henis, Y. Scanning electron microscope studies of interactions between Agaricus bisporus (Lang) Sing hyphae and bacteria in casing soil. Appl Environ Microbiol. 53 (5), 1132-1137 (1987).
  67. Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Scanning electron microscopy of ectomycorrhizae potential and limitations. Scanning Microsc. 1 (3), 58(1987).
  68. Visen, A., Singh, P. N., Chakraborty, B., Singh, A., Bisht, T. S. Scanning electron microscopy indicates Pseudomonad strains facilitate AMF mycorrhization in litchi (Litchi chinensis Sonn.) air-layers and improving survivability, growth and leaf nutrient status. Curr Res Microb Sci. 2, 100063(2021).
  69. Fleeman, R. M., Mikesh, M., Davies, B. W. Investigating Klebsiella pneumoniae biofilm preservation for scanning electron microscopy. Access Microbiol. 5 (2), 000470-000473 (2023).
  70. Wells, M., Mikesh, M., Gordon, V. Structure-preserving fixation allows scanning electron microscopy to reveal biofilm microstructure and interactions with immune cells. J Microsc. 293 (1), 59-68 (2024).
  71. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  72. Madsen, J. S., et al. Coexistence facilitates interspecific biofilm formation in complex microbial communities. Environ Microbiol. 18 (8), 2565-2574 (2016).
  73. Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burmølle, M. Bacterial social interactions and the emergence of community-intrinsic properties. Curr Opin Microbiol. 42, 104-109 (2018).
  74. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 247-260 (2019).
  75. Bringhurst, B., Allert, M., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Environments and hosts structure the bacterial microbiomes of fungus-gardening ants and their symbiotic fungus gardens. Microb Ecol. 86 (2), 1374-1392 (2023).
  76. Bringhurst, B., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Symbiosis, dysbiosis and the impact of horizontal exchange on bacterial microbiomes in higher fungus-gardening ants. Sci Rep. 14 (1), 3231(2024).
  77. Vargas, S., et al. Body-plan reorganization in a sponge correlates with microbiome change. Mol Biol Evol. 40 (6), msad138(2023).
  78. Apprill, A., et al. Humpback whale populations share a core skin bacterial community: towards a health index for marine mammals. PLOS One. 9 (3), e90785(2014).
  79. Fraune, S., et al. Bacteria-bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance. ISME J. 9 (7), 1543-1556 (2015).
  80. Gowen, R., Gamal, A., Di Martino, L., McCormick, T. S., Ghannoum, M. A. Modulating the microbiome for Crohn's disease treatment. Gastroenterology. 164 (5), 828-840 (2023).
  81. Moya, P., et al. Molecular phylogeny and ultrastructure of the lichen microalga Asterochloris mediterranea sp. nov. from Mediterranean and Canary Islands ecosystems. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (6), 1838-1854 (2015).
  82. Zettler, E. R., Mincer, T. J., Amaral-Zettler, L. A. Life in the "plastisphere": microbial communities on plastic marine debris. Environ Sci Technol. 47 (13), 7137-7146 (2013).
  83. Porter, K. R., Kallman, F. The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy. Exp Cell Res. 4 (1), 127-141 (1953).
  84. Ligon, J. J., Abraham, J. L., Boyd, A. S. Traumatic osmium tetroxide inoculation. J Am Acad Dermatol. 45 (6), 949-952 (2001).
  85. Friedova, N., et al. Osmium absorption after osmium tetroxide skin and eye exposure. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 429-433 (2020).
  86. Fratesi, S. E., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. J Sediment. 74 (6), 858-867 (2004).
  87. Dassanayake, R. P., et al. Identification of a reliable fixative solution to preserve the complex architecture of bacterial biofilms for scanning electron microscopy evaluation. PLOS One. 15 (5), e0233973(2020).
  88. Desiro, A., et al. Detection of a novel intracellular microbiome hosted in arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J. 8 (2), 257-270 (2014).
  89. Morales, D. P., et al. Advances and challenges in fluorescence in situ hybridization for visualizing fungal endobacteria. Front Microbiol. 13, 892227(2022).
  90. Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
  91. Valm, A. M., Welch, J. L. M., Borisy, G. G. CLASI-FISH: principles of combinatorial labeling and spectral imaging. Syst Appl Microbiol. 35 (8), 496-502 (2012).
  92. Fernandez-Brime, S., Muggia, L., Maier, S., Grube, M., Wedin, M. Bacterial communities in an optional lichen symbiosis are determined by substrate, not algal photobionts. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz012(2019).
  93. Schluter, S., Eickhorst, T., Mueller, C. W. Correlative imaging reveals holistic view of soil microenvironments. Environ Sci Technol. 53 (2), 829-837 (2018).
  94. Barcoto, M. O., Rodrigues, A. Lessons from insect fungiculture: from microbial ecology to plastics degradation. Front Microbiol. 13, 812143(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ogrody grzyb wbiofilmy mikrobiologiczneorganizacja przestrzenna mikrobiotystrz pki grzyb wstruktura biofilmuprzygotowanie pr beksuszenie w punkcie krytycznymnapylanie warstwy przewodz cej

Powiązane artykuły