Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 października 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

W tym artykule

Podsumowanie

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Streszczenie

W ekosystemach makroskalowych, takich jak lasy deszczowe czy rafy koralowe, przestrzenna lokalizacja organizmów jest podstawą naszego zrozumienia ekologii społeczności. Podobnie w świecie mikrobiologicznym ekosystemy w mikroskali są dalekie od przypadkowej i jednorodnej mieszanki organizmów i siedlisk. Dostęp do przestrzennego rozmieszczenia mikroorganizmów ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania i ekologii mikrobioty, ponieważ gatunki współżyjące z innymi organizmami są bardziej skłonne do interakcji i wzajemnego wpływania na swoją fizjologię.

Międzykrólestwowy ekosystem mikrobiologiczny jest sercem kolonii mrówek hodujących grzyby, które uprawiają grzyby podstawczakowe jako źródło pożywienia. Mrówki Attine żerują na różnych podłożach (głównie roślinnych), metabolizowanych przez uprawiane grzyby, tworząc gąbczastą strukturę, "ogród mikrobiologiczny", który działa jak zewnętrzne jelito. Ogród jest splecioną siatką strzępek grzybów, które rosną poprzez metabolizowanie podłoża, otwierając nisze dla charakterystycznej i przystosowanej mikrobioty. Uważa się, że mikrobiota przyczynia się do degradacji substratu i wzrostu grzybów, chociaż jej organizacja przestrzenna nie została jeszcze ustalona.

Tutaj opisujemy, jak wykorzystujemy skaningową mikroskopię elektronową (SEM) do zbadania, z niespotykaną dotąd szczegółowością, organizacji przestrzennej mikrobioty i biofilmu w różnych systemach hodowli grzybów mrówek. Obrazowanie SEM dostarczyło opisu struktury przestrzennej i organizacji mikrobioty. Projekt SEM ujawnił, że mikrobiota często gromadzi się w biofilmach, które są szeroko rozpowszechnioną strukturą krajobrazów mikrobiologicznych w kulturze grzybów. Przedstawiamy protokoły stosowane do naprawy, odwadniania, suszenia, napylania powłoki i obrazowania tak złożonej społeczności. Protokoły te zostały zoptymalizowane pod kątem radzenia sobie z delikatnymi i niejednorodnymi próbkami, zawierającymi biomasę roślinną i grzybową, a także mikrobiotę i biofilm.

Wprowadzenie

Ekosystemy składają się z organizmów połączonych procesami w określonej lokalizacji geograficznej (tj. w środowisku). Organizmy wchodzą w interakcje ze swoim środowiskiem w czasie, w wyniku czego wyłaniają się złożone i heterogeniczne wzorce przestrzenne. Wzorowanie przestrzenne determinuje różnorodność i stabilność ekologiczną, a w konsekwencji funkcjonowanie ekosystemu1,2,3,4. W ekosystemach w skali makro, takich jak tereny podmokłe, sawanny, rafy koralowe i ekosystemy aridowe, wzorce przestrzenne są skorelowane z przepływem i koncentracją zasobów. Umożliwiając optymalizację zasobów, heterogeniczność i wzorowanie przestrzenne prowadzą do powstania ekosystemów bardziej odpornych niż ekosystemy homogeniczne2. Przestrzenna lokalizacja organizmów, stanowiąca podstawę ekologii wspólnot, przekłada się również na świat drobnoustrojów.

Ekosystemy mikrobiologiczne, zamiast być organizmami wymieszanymi w sposób losowy i jednorodny w obrębie mikrośrodowisk, wykazują wzorce przestrzenne, które w znacznym stopniu definiują ich funkcjonowanie5,6,7. Od kolumn Winogradskiego po mikrobiotę środowiskową i związaną z gospodarzem, ekosystemy te są zorganizowane przestrzennie w sposób niejednorodny, a ich układy przestrzenne wywołują różne odpowiedzi fenotypowe. Gatunki współbytujące z większym prawdopodobieństwem wchodzą w interakcje i wpływają na swoją fizjologię. Zatem przestrzenna organizacja społeczności, w większym stopniu niż sam skład per se, określa właściwości ekosystemu i nisze ekologiczne5,7,8. Ilustrując te koncepcje, zmiany we wzorcach przestrzennych wydają się być skorelowane z patologicznym przebiegiem zmian w płytce nazębnej, próchnicą, chorobami dziąseł9,10, nieswoistymi zapaleniami jelit11, infekcjami płuc w mukowiscydozie, przewlekłymi infekcjami ran12,13, rakiem jelita grubego oraz gruczolakami14.

W ramach biogeografii mikroorganizmów (badania nad rozkładem i wzorcami różnorodności biologicznej w przestrzeni i czasie w mikroskali), wiedza na temat ekosystemów mikrobowych jest w ogromnym stopniu wzbogacana dzięki zrozumieniu ich wzorców przestrzennych6,13,15,16,17. Przeanalizowaliśmy wzorce przestrzenne ekosystemu mikrobowego stworzonego przez owady, który znajduje się w centrum kolonii charakterystycznych mrówek attin hodujących grzyby (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Znajduje się tam „mikrobowy ogród”, skupiony wokół grzyba podstawczakowego z plemienia Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) lub z rodziny Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Ogród jest gąbczastą strukturą wyłaniającą się ze splecionej sieci strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie dostarczanego przez mrówki substratu, składającego się głównie z materiałów roślinnych (Rysunek 1). W zależności od rodzaju mrówek attin, mogą to być: suche części roślin, odchody i zwłoki owadów, świeżo odcięte liście, nasiona oraz części kwiatowe23,24. Podobnie jak zewnętrzny układ pokarmowy roślinożerca, ogród enzymatycznie i chemicznie przekształca trudnorozkładalne polimery w łatwo przyswajalne zasoby odżywcze, zapewniając mrówkom niezbędne aminokwasy, lipidy i cukry rozpuszczalne21,25,26,27,28.

Analizy ultrastrukturalne, enzymatyczne i transkryptomiczne przeprowadzone dla ogrodów grzybowych generów tnących liście Atta i Acromyrmex sugerują, że środowiska te tworzą kontinuum degradacji podłoża i plam odżywczych26,29,30,31,32. Młode części ogrodu mają tendencję do bycia ciemniejszymi ze względu na świeżo włączone, pofragmentowane podłoże. Te niedawno dodane podłoża są często kolonizowane od krawędzi, które zostały przecięte przez robotnice mrówek i zaszczepione grudkami grzybni. Strzałkując od przeciętych krawędzi, strzępki grzyba rozprzestrzeniają się po podłożu29,32,33. Obfitość strzępek wzrasta w miarę postępu degradacji podłoża, co prowadzi do powstania białawych i metabolicznie aktywnych obszarów30,31,32. Starsze regiony, z bardziej zdegradowanym podłożem i obfitą mikrobiotą29,32, wykazują tendencję do przyjmowania brązowych odcieni i wyższej wilgotności. Robotnice usuwają fragmenty tego regionu, oddzielając je w pryzmach odpadów, do których przenoszą również podłoża szkodliwe dla symbionta grzybowego34,35,36. Pryzmy odpadów, choć fizycznie oddzielone od ogrodu, są miejscem ciągłej degradacji podłoża i cyklu nutrientów prowadzonego przez obfitą mikrobiotę mieszkańców29,32,37,38,39.

W ogrodzie bytuje również mikrobiota składająca się głównie z Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas oraz Serratia, która najwyraźniej jest wspólna dla różnych systemów uprawy grzybów u mrówek z podrodziny Attina. Kodując szlaki metaboliczne, które mogłyby uzupełniać metabolizm grzybów, mikrobiota ta potencjalnie uczestniczy w odpowiedziach fizjologicznych ogrodu40,41,42,43,44. Dane metagenomiczne nie tylko wskazały na obecność mikrobioty41,42, ale analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) uprawy grzybów mrówek tnących liście wykazała obecność głównie bakterii pałeczkowatych na podłożu roślinnym32. Choć bakterie (w tym szczepy celulolityczne) wyizolowano z całego ogrodu, wizualizowano je jedynie w starszych częściach ogrodu i w pryzach odpadów, a także w początkowej grudce przenoszonej przez królowe założycielki29,32. Nie było również pewności, czy mikrobiota może tworzyć biofilmy in vivo (tj. w ogrodzie i odpadach), co sugerowały ich możliwości metaboliczne42 oraz obserwacje in vitro44.

W niniejszej pracy wykorzystano SEM w celu dalszego zrozumienia przestrzennej organizacji mikrobioty w obrębie obszarów ogrodu, szczegółowo analizując fizyczne oddziaływania mikrobioty z podłożem oraz mikrobioty z strzępkami. Dzięki uzyskaniu obrazów o większej głębi ostrości, SEM umożliwia obserwację trójwymiarowych struktur mikroskopowych w wysokiej rozdzielczości, co pozwala na gruntowną analizę wzorców przestrzennych mikrobioty ogrodowej. Szczegółowo opisujemy etapy utrwalania, odwadniania, suszenia, napylania i obrazowania tak heterogenicznych i delikatnych próbek opartych na grzybach. Poprzez usunięcie etapu postfiksacji przy użyciu czwartotlenku osmu (OsO4) oraz skrócenie czasu odwadniania, uprościliśmy protokoły32,33,45 przygotowania próbek z ogrodu i odpadów do analizy SEM. Ten zmodyfikowany protokół zachowuje strukturalne wzorce strzępek, a także przestrzenną organizację mikrobioty i biofilmu, i może zostać zastosowany do innych delikatnych ekosystemów mikrobiologicznych i biofilmów.

Koncepcja interakcji mikrobiologicznych w ogrodzie mrówek attinowych; ilustracja mikroskopowa z analizą biofilmu.
Rysunek 1: Mikrobiologiczne ogrody mrówek attinowych. Ogród to gąbczasta struktura powstała z przeplatającej się sieci strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie substratu pochodzenia głównie roślinnego dostarczanego przez mrówki. W ogrodzie bytuje również mikrobiota, która koduje szlaki metaboliczne mogące uzupełniać metabolizm grzyba. Dane metagenomiczne oraz wcześniejsze analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wskazywały na jej obecność, choć dysponowaliśmy ograniczoną wiedzą na temat jej organizacji przestrzennej oraz fizycznych interakcji z substratem i strzępkami grzyba. Zastosowaliśmy SEM, aby odsłonić organizację przestrzenną i strukturę mikrobioty oraz biofilmu. Ilustracje: Mariana Barcoto (ogród i mikrobiota zaadaptowane z Barcoto i Rodrigues 94), zdjęcia: Mariana Barcoto i Enzo Sorrentino. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek z kolonii terenowych

UWAGA: Podczas zbierania kolonii mrówek należy upewnić się, że przed rozpoczęciem pobierania uzyskano wszystkie zezwolenia wymagane przez lokalne ustawodawstwo. W naszym przypadku zezwolenie na pobieranie nr 74585 zostało wydane przez Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Jeśli próbki pochodzą z kolonii laboratoryjnej, należy przejść do sekcji 2.

  1. Zlokalizuj i zaznacz kolonię. Wykop rów wokół obszaru gniazda, aż do odsłonięcia komory ogrodowej (Rycina 2A).
    UWAGA: Niektóre gatunki mrówek z rodzaju attine mogą budować kolonie pod ściółką liściową lub wewnątrz próchniejących kłód. W takich przypadkach należy ostrożnie odsunąć ściółkę lub ostrożnie rozłupać kłody, aby pobrać próbki. Szczegółowe informacje na temat lokalizacji, pobierania i utrzymywania żywych kolonii różnych gatunków mrówek attine znajdują się w pracy Sosa-Calvo et al.46.
  2. Otwórz komorę ogrodową od boku, aby zapobiec wpadaniu gleby na powierzchnię ogrodu. Ostrożnie pobierz próbki z ogrodu, używając pęsety entomologicznej, łyżki lub sitka kuchennego, w zależności od wielkości ogrodu.
    UWAGA: Pamiętaj o wysterylizowaniu narzędzi przed pobieraniem próbek. Podczas pobierania ogrodów mrówek tnących należy założyć grube rękawice materiałowe, aby zapobiec (lub przynajmniej ograniczyć) ugryzienia robotnic. W przypadku innych gatunków attine rękawice materiałowe są opcjonalne.
  3. Przenieś próbki z ogrodu do czystego plastikowego pojemnika zawierającego warstwę gipsu w celu zbilansowania wilgotności ogrodu. Po przeniesieniu ogrodu i robotnic hermetycznie zamknij pojemnik, aby zapobiec wyschnięciu próbki. Próbki z ogrodu przechowuj w temperaturze 23-25 °C do czasu przetworzenia.
  4. Zasyp rów wcześniej usuniętą glebą.

Schemat wykopalisk kolonii mrówek i przygotowania próbek do SEM: fiksacja, odwodnienie, suszenie, obrazowanie.
Rysunek 2: Protokół przygotowania próbek. (A) Pobieranie próbek z kolonii terenowych. (B) Przetwarzanie próbek. (C) Krótki opis podstaw i przebiegu przygotowania próbek: 1. Fiksacja: w celu wzmocnienia i utrwalenia struktury próbki. 2. Odwodnienie: wymiana zawartości wody w próbkach na etanol. 3. Suszenie w punkcie krytycznym: ciekły CO2 zastępuje etanol, a następnie zostaje odparowany. 4. Montaż: umieszczenie próbki do analizy. 5. Napylanie złotem: zapobieganie ładowaniu się próbki. 6. Obrazowanie. Ilustracje i zdjęcia autorstwa Mariany Barcoto. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Odczynniki

UWAGA: Należy pamiętać, że poniższe roztwory powinny zostać przygotowane wcześniej.

  1. Przygotować 0,2 M bufor kdakodylanowy sodu. W tym celu rozpuścić 42,8 g kdakodylanu sodu w 800 mL wody destylowanej, mieszając do czasu rozpuszczenia i stabilizacji pH na poziomie 7,2 (w razie potrzeby skorygować pH za pomocą kwasu solnego). Uzupełnić objętość roztworu do 1 L, dodając wodę destylowaną. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C (przez ok. 1 miesiąc).
    OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd i paraformaldehyd są toksyczne i powinny być obsługiwane w dygestorium. Podczas pracy z takimi odczynnikami należy przez cały czas nosić rękawiczki nitrylowe i okulary ochronne.
  2. Przygotować utrwalacz Karnovskiego (zmodyfikowany według Karnovskiego)47. W tym celu dodać 10 mL 25% wodnego roztworu glutaraldehydu i 10 mL 20% wodnego roztworu paraformaldehydu do 25 mL 0,2 M buforu kdakodylanowego sodu i wymieszać. Dodać 1 mL 0,1 M chlorku wapnia (CaCl2) i uzupełnić objętość do 100 mL, dodając wodę destylowaną. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C (do 1 miesiąca).
    OSTRZEŻENIE: Utrwalacz Karnovskiego jest szkodliwy przy wdychaniu i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Należy unikać wdychania oparów i stosować go wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Podczas pracy z roztworem należy przez cały czas nosić rękawiczki nitrylowe i okulary ochronne.
  3. Używając etanolu bezwodnego (cz.da.), przygotować w wodzie destylowanej roztwory etanolu o stężeniach 30%, 50%, 70% i 90%; wymagany jest również etanol 100%.

3. Fixacja próbek

UWAGA: Utrwalacze utwardzają i konserwują próbki, zachowując ich cechy morfologiczne. Aldehydy (takie jak paraformaldehyd i glutaraldehyd) są niekoagulującymi utrwalaczami typu sieciującego, które indukują tworzenie wiązań krzyżowych w obrębie białek i kwasów nukleinowych oraz pomiędzy nimi48.

  1. Usuń robotnice, jaja, poczwarki i larwy z próbek ogrodowych, używając pincety entomologicznej (Rysunek 2B). Oddziel fragmenty ogrodu nie większe niż 5 mm3. Umieść fragmenty w probówce o pojemności 2 mL (Rysunek 2C).
  2. Do probówek zawierających próbki dodaj za pomocą szklanej pipety Pasteura ~1 mL roztworu fiksatywy Karnovsky'ego (upewnij się, że próbka jest całkowicie przykryta). Wymieszaj poprzez delikatne wstrząsanie, aby pomóc próbce nasiąknąć, i inkubuj w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 h przed dalszym przetwarzaniem próbek (Rysunek 2C.1).
    UWAGA: Jeśli kolejne etapy dehydratacji nie będą przeprowadzane natychmiast po fiksacji, protokół można przerwać na tym etapie, a próbki można przechowywać przez ~1 rok w temperaturze 4 °C.
    Sugerujemy użycie szklanej pipety Pasteura, ponieważ składa się ona z materiału obojętnego i jest łatwiejsza do oczyszczenia w celu ponownego użycia. Materiał ogrodowy jest silnie hydrofobowy i ma tendencję do pływania na powierzchni roztworu fiksatywy. Pełne nasiąknięcie w fiksatywie zajmuje zazwyczaj do 5 min. Upewnij się, że fiksatywa pokrywa fragmenty ogrodu, ponieważ jej objętość ma tendencję do zmniejszania się w miarę wnikania w pory próbki. Empirycznie zweryfikowaliśmy, że po nasiąknięciu i zawilgoceniu próbki, jej składniki (w szczególności delikatna grzybnia) stały się podatne na uszkodzenia podczas dalszego mieszania. Dlatego zalecamy unikanie wstrząsania próbek w miarę możliwości.

4. Odwodnienie próbki

UWAGA: Seria płukań etanolem stopniowo zastępuje wodę w próbkach etanolem. Ważne jest, aby rozpocząć od roztworu etanolu o niskim stężeniu (patrz poniżej), aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia lub zapadnięcia się tak delikatnych próbek49.

  1. Całkowicie usunąć roztwór utrwalający Karnovsky'ego za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie uszkodzić próbki (Rysunek 2C.1).
    UWAGA: Utylizować utrwalacz Karnovsky'ego w pojemniku odpowiednio oznakowanym do zarządzania toksycznymi odpadami chemicznymi.
  2. Natychmiast po usunięciu utrwalacza dodać 1 mL 30% etanolu, uważając, aby nie uszkodzić próbki, i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej (Rysunek 2C.2).
    UWAGA: Próbki muszą być przez cały czas zanurzone w roztworze. Należy szybko wymieniać roztwory podczas serii stopniowego przemywania etanolem. W miarę jak tkanka traci swoją porowatość i agreguje się na dnie probówki, 1 mL etanolu zazwyczaj wystarcza do pokrycia próbki (jeśli próbka nie jest większa niż 5 mm3). Jeśli jednak próbki nie są całkowicie przykryte, należy dodać etanol, aż zostaną w pełni zanurzone.
  3. Całkowicie usunąć 30% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 30% etanol.
    UWAGA: Przez całą serię stopniowego przemywania etanolem, etanol należy utylizować w pojemniku odpowiednio oznakowanym do zarządzania toksycznymi odpadami chemicznymi.
  4. Dodać 1 mL 50% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 50% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 50% etanol.
  5. Dodać 1 mL 70% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 70% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 70% etanol.
    UWAGA: Na etapie przemywania 70% etanolem można w razie potrzeby przerwać protokół, ponieważ probówki z próbkami można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, jeśli materiał nie zostanie natychmiast przetworzony.
  6. Dodać 1 mL 90% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 90% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 90% etanol.
  7. Dodać 1 mL 100% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 100% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 100% etanol.
  8. Używając pęsety i/lub szpatułki, ostrożnie przenieść próbki do pojemników na preparaty do suszarki punktu krytycznego (CPD), zawierających etykiety identyfikacyjne próbek (wykonane wcześniej ołówkiem na papierze). Aby zapobiec wysychaniu próbek, przeniesienie to wykonuje się z pojemnikiem umieszczonym w szalce Petriego wypełnionej 100% etanolem.
  9. Zamknąć pojemniki pokrywkami i zanurzyć je w miarkowanym zlewku szklanym zawierającym wystarczającą ilość 100% etanolu, aby całkowicie zakryć pojemniki. Przykryć zlewek i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie prawidłowo zutylizować 100% etanol.
  10. Przenieść pojemniki z preparatami do innego miarkowanego zlewka szklanego zawierającego wystarczającą ilość 100% etanolu, aby zanurzyć pojemniki. Przykryć zlewek i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść pojemniki z preparatami do suszarki punktu krytycznego.
    UWAGA: Po serii przemywania szklane pipety i zlewki należy obficie wypłukać wodą destylowaną, a pozostałą wodę zutylizować w pojemniku odpowiednio oznakowanym do zarządzania toksycznymi odpadami chemicznymi. Po płukaniu przedmioty szklane można myć neutralnym detergentem, płukać wodą z kranu i suszyć na powietrzu.

5. Suszenie punktem krytycznym

UWAGA: Suszarka punktu krytycznego zastępuje etanol w próbkach ciekłym dwutlenkiem węgla (CO2), który odparowuje z próbki w wyższej temperaturze i pod wyższym ciśnieniem. Należy stosować się do instrukcji producenta dotyczących takich procedur.

  1. Włącz urządzenie.
  2. Otwórz komorę, umieść w niej pojemniki z próbkami i dolej 100% etanolu, aż pokryje on pojemniki. Zamknij komorę.
  3. Aktywuj Fajnie opcji i poczekaj, aż temperatura osiągnie 10 °C.
  4. Otwórz CO2 zawór butli i uruchomić Mieszadło opcja
  5. Aktywuj CO2 w opcja, przy ciągłym sprawdzaniu komory w celu weryfikacji ilości CO2 już go wypełnił. Gdy komora zostanie prawie całkowicie wypełniona, należy wyłączyć CO2 Wewnątrz opcja i aktywuj Wymiana opcja, utrzymując go w stanie aktywnym do momentu osiągnięcia odpowiedniego poziomu CO2 wyłącznie w celu przykrycia pojemników. Należy upewnić się, że pojemniki są stale przykryte CO22 (t.j. dezaktywować) Wymiana opcja przed wszystkimi CO2 opuściła komorę). Powtórz krok 5.5 6 razy.
  6. Aktywuj CO2 w po raz ostatni wypełnij komorę, aż pojemniki zostaną całkowicie przykryte.
  7. Aktywuj Ciepło opcja i dezaktywuj Mieszadło opcja. Zamknij CO2 zawór butli
  8. Odczekać do czasu, aż temperatura wzrośnie do 35 °C; następnie aktywuj Odgazowanie opcja
    UWAGA: Około 30 °Ckomora osiąga ciśnienie 70–80 bar, osiągając punkt krytyczny, w którym ciecz znika.
  9. Gdy ciśnienie w komorze osiągnie wartość 1 bar, oznacza to usunięcie całej zawartości gazu. Otwórz komorę i wyjmij pojemniki.
  10. Wyłączyć urządzenie.

6. Montowanie

  1. Przygotować uchwyty do próbek SEM (tj. aluminiowe stuby; Rysunek 2C.4).
    1. Owinąć stuby kawałkiem folii aluminiowej, zakrywając tylko górną część, aby ułatwić czyszczenie stubu po analizie.
    2. Oznaczyć stuby, wpisując kod/numer próbki na spodzie uchwytu, aby zapewnić identyfikację materiału umieszczonego na górze.
    3. Pokryć górną część dwustronną taśmą węglową. Umieścić stuby w uchwycie na próbki.
  2. Otworzyć pokrywę pojemnika z próbkami i ostrożnie przenieść wysuszoną próbkę do szklanej szalki Petriego za pomocą pęsety i szpatułki.
    UWAGA: Ogrody poddane suszeniu w punkcie krytycznym mają tendencję do aglomeracji, tworząc bardzo zwarte próbki, które należy ostrożnie rozdzielić na fragmenty o rozmiarze nie większym niż 1 mm3.
  3. Ostrożnie umieścić fragmenty na lepkim podłożu taśmy na stubie. Gdy fragment ogrodu dotknie taśmy, jego (prze)suniecie jest bardzo trudne, dlatego należy uważać, aby nie umieścić go w niepożądanych miejscach lub pozycjach. Na jednym stubie można umieścić do dziewięciu fragmentów.
  4. Powtórzyć kroki 6.2 i 6.3 dla każdej próbki.

7. Napylanie złota

UWAGA: Powlekanie próbki jest wymagane w celu zapobiegania jej ładowaniu. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta przy ustawianiu parametrów takich jak ciśnienie gazu roboczego (w niniejszym protokole ciśnienie gazu wynosi 0,5 × 10-1 mm Hg), czas napylania (220 s), grubość warstwy złota (~120 Å), natężenie prądu (50 mA) oraz napięcie zasilania. Proces napylania zazwyczaj przebiega według wspólnego schematu, choć urządzenia różnych producentów mogą działać nieco inaczej.

  1. Otwórz zawiasowe ramię uchwytu i umieść stuby na stole preparatowym.
  2. Zamknij ruchome ramię uchwytu próbki i sprawdź, czy osłona przeciwodłamkowa szklanej komory próżniowej jest prawidłowo osadzona.
  3. Otwórz zawór butli z argonem i włącz główny przełącznik zasilania.
  4. Obserwuj wzrost próżni na wyświetlaczu urządzenia, aż osiągnie ona wartość 0,5 × 10-1 oznaczenie mm Hg na wyświetlaczu; następnie aktywuj PłukaniePowtórz operację 5 razy.
  5. Włącz system cyrkulacji wody, aktywuj wybraną opcję HV włączonei otwórz pokrywkę z folii złotej. Potwierdź, że plazma ma różowy kolor. Aby przeprowadzić ten protokół, ustaw czas rozpylania na 220 s przy napięciu 50 mA, co pozwoli na naniesienie warstwy złota o grubości ~120 Å (12 nm).
  6. HV włączone zostaje automatycznie wyłączone. Wyłączyć system cyrkulacji wody i zamknąć pokrywę z pozłocanej folii.
  7. Wyłącz główny przełącznik zasilania, umożliwiając dostanie się powietrza do komory próżniowej. W przypadku próbek ogrodowych i odpadów powtórz kroki 7.1–7.7 trzykrotnie.
    UWAGA: Jeśli obrazowanie nie odbędzie się bezpośrednio po przygotowaniu próbek, należy przechowywać uchwyty w szczelnym pojemniku wypełnionym warstwą żelu krzemionkowego, aby uniknąć rehydratacji próbek.

8. Obrazowanie

UWAGA: Należy przestrzegać instrukcji producenta dotyczących regulacji ustawień SEM, takich jak średnica przysłony obiektywu, napięcie robocze, ustawienie systemu wiązki elektronowej, osiowanie oraz stygmatory.

  1. Umieść krążki w uchwycie na próbki, notując pozycję każdej z nich.
    UWAGA: Podczas wkładania lub wyjmowania uchwytu na próbkę należy używać rękawiczek i dbać o maksymalną czystość uchwytu.
  2. Uruchom oprogramowanie operacyjne z pulpitu.
  3. Wybierz ustawienia instrumentu. Wizualizuj próbki z ogrodu za pomocą średnica apertury obiektywu z 30 µm (tj. w drugiej fazie), działając w wysoka próżnia, wykrywając sygnały z elektronów wtórnych (Sedymentacja), napięcie przyspieszające z 20 kV, odległość robocza z 15 – 20 mm, prąd sondy z 40.0 (w trybie wysokiego natężenia prądu), a powiększenie dostosowując do próbki.
  4. Postępując zgodnie z instrukcjami nawigacji, należy nacisnąć przycisk Odpowietrzanie ikonę i poczekaj na odbarczenie komory na próbkę. Pasek postępu wskazuje stan próżni.
  5. Po osiągnięciu ciśnienia atmosferycznego należy otworzyć komorę na próbkę i ostrożnie włożyć uchwyt na próbkę.
  6. Ostrożnie zamknij drzwi komory i naciśnij Ewakuacja ikona służąca do odpompowania powietrza z instrumentu, z możliwością śledzenia stanu próżni na pasku postępu. System nawigacji wyświetli pozycję przesuwanego stolika i przedstawi schemat uchwytu po zakończeniu ruchu. Naciśnij Kamera ikona służąca do wykonania zdjęcia uchwytu w widoku z góry, co ułatwi nawigację pomiędzy próbkami podczas obrazowania.
  7. Naciśnij Obserwacja ikona uruchomienia działa armatki elektronowej i oczekiwanie na uformowanie się obrazu. Użyj Ręczny interfejs użytkownika (sterowanie ręczne) w celu ręcznego przesunięcia osi Z na odpowiednią wysokość (w zależności od wysokości próbki i określonej odległości roboczej).
    UWAGA: Aby przedłużyć żywotność włókna wolframowego, należy wstrzymać Obserwacja funkcjonować w czasie, gdy nie odbywa się aktywne obrazowanie.
  8. Użyj opcji wyświetlonych na ekranie lub sterowania ręcznego, aby zmienić szybkość skanowania rastrowego i pozycja obrazuPrzesuń stolik, aby uzyskać dokładny podgląd próbki, wykorzystując RDC funkcja umożliwiająca skupienie się na konkretnych obszarach. Podczas obserwacji docelowej (lub interesującej) struktury należy dostosować powiększenie, ostrość, jasność, kontrast, i stygmatyzacja odpowiednio. Poprawna stygmatyzacja przy użyciu Ręczny interfejs użytkownika do przesuwania stolika w kierunkach X i Y.
    1. Dostosuj powiększenie w zakresie od 100x do 700x, aby zwizualizować ogólne aspekty hodowli (takie jak gęstość strzępek, podłoże i wzorce kolonizacji).
    2. Dostosuj powiększenie w zakresie od 700x do 1500x, aby zwizualizować przestrzenne wzorce mikrobioty.
    3. Dostosuj powiększenie w zakresie od 1 500x do 3 000x, aby zaobserwować oddziaływania fizyczne między mikrobiotą a biofilmem.
    4. Ustaw powiększenie w zakresie od 3 000x do 4 000x, aby skupić się na konkretnych skupiskach drobnoustrojów.
  9. Aby zapisać obraz, należy użyć Zamrażanie funkcja, kliknij w Zdjęcie ikona, a następnie ustaw ścieżkę do pliku. Standardowo należy przeanalizować co najmniej trzy fragmenty ogrodu, obrazując każdy z nich we wszystkich zakresach powiększeń wymienionych w kroku 8.8. Przynosi to co najmniej 12 obrazów na próbkę, choć większa liczba obrazów może pozwolić na bardziej szczegółowe opisy. Sugerujemy, że 15–25 obrazów na próbkę, obejmujących wszystkie powiększenia z kroku 8.8, zazwyczaj dostarcza precyzyjnych szczegółów niezbędnych do opisu próbki.
    UWAGA: Rasteryzacja i zapisywanie obrazu trwają kilka sekund, podczas których należy unikać jakichkolwiek wibracji stołu antywibracyjnego SEM.
  10. Po zakończeniu obrazowania naciśnij przycisk Otwór odpowietrzający opcja odpowietrzenia komory, śledząc status próżni na pasku postępu. Ostrożnie wyjmij uchwyt, delikatnie zamknij drzwiczki komory i naciśnij Ewakuacja aby opróżnić komorę z powietrza.
  11. Po zakończeniu ewakuacji wyjdź z oprogramowania operacyjnego.
  12. Dostosuj jasność i kontrast za pomocą edytora obrazów, aby poprawić wizualizację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiliśmy uproszczony protokół wizualizacji składników próbek ogrodów i odpadów mrówek z rodzaju Atta, takich jak strzępki grzybni, substrat, mikrobiota oraz biofilmy. SEM pozwolił na lepsze zrozumienie sposobu, w jaki ogród i odpady kształtują strukturalne wzorce mikrobioty (Rysunek 3). W ogrodach mrówek z rodzaju *Attine*, strzępki grzybniowe są strukturami rozgałęzionymi, pokryваjącymi fragmenty powierzchni podłoża. Ponieważ strzępki grzybniowe wykazują dużą wrażl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SEM wykorzystuje wiązkę elektronów do skanowania próbki, generując jej powiększony obraz, dzięki czemu można wizualizować trójwymiarowe mikrostruktury w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ SEM działa w warunkach wysokiej próżni, wymagane jest usunięcie do/więcej niż 99% wody z próbek. Wewnątrz komory próżniowej SEM częściowo uwodnione próbki mogą ulec odwodnieniu i zapadnięciu się, oprócz rozpraszania elektronów. W przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości w SEM przygotowanie próbki powinno obejmować procedury usuwan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) za wsparcie finansowe (Grant #2019/03746-0). MOB dziękuje za stypendium doktoranckie otrzymane od FAPESP (proces 2021/08013-0) i Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (CAPES) - Kod finansowy 001. AR dziękuje również Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) za stypendium badawcze (#305269/2018). Autorzy chcieliby podziękować Marci Reginie de Moura Aouada i Antonio Teruyoshi Yabuki za pomoc w testach pilotażowych w celu przygotowania próbki, Renato Barbosa Salaroli za pomoc techniczną oraz Enzo Sorrentino za pomoc w sesji zdjęciowej. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach autoryzacji dostępu do dziedzictwa genetycznego #SISGen AA39A6D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 2 mlAxygenMCT-200-C-BRADo utrwalania i odwadniania próbek
Bezwodny chlorek wapniaMerckC4901CaCl2 bezwodny do przygotowania Karnovsky' s fixative
Suszarka do punktów krytycznychLeicaEM CPD 300Do suszenia w punkcie krytycznym
Dwustronna taśma przewodząca z włókna węglowego, 12 mm (W) X 5 m (L)Mikroskopia elektronowaSciences 77819-12Do montażu próbek
Kleszcze entomologiczneBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Alkohol etylowy (=etanol), czysty (≥ 99,5%)Sigma-Aldrich459836Do odwodnienia
KleszczeBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Szklana zlewkaBrak konkretnego dostawcyDo odwodnienia
Szklana szalka PetriegoBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Pipeta szklanaBrak konkretnego dostawcyDo utrwalania i odwadniania próbek
Aldehyd glutarowy (wodny aldehyd glutarowy klasy EM 25%)Nauki o mikroskopii elektronowej16220Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz
Złoty cel Ted Pella, Inc.8071Do napylania powłoki złotem
Kwas solnySigma-Aldrich 320331Do regulacji roztworów pH
Edytor obrazówPhotoshopdowolna wersjaAby dostosować obrazy
Paraformaldehyd (paraformaldehyd 20% roztwór wodny klasy EM)Mikroskopia elektronowa Nauki15713Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz
Odbiorca propilenuBrak konkretnego dostawcyDo utrzymania żywych kolonii mrówek
Skaningowy mikroskop elektronowyJEOL IT300 SEMDo obrazowania próbek 
Kakodylan sodu trójwodnySigma-AldrichC0250Do przygotowania buforu kakodylanu sodu
SzpatułkaBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami
ogrodowymi Pojemniki na próbki o średnicy 15 mm x wysokości 10 mmTed Pella, Inc.4591Do suszenia w punkcie krytycznym
Powlekarka napylającaBaltec SCD 050Do pokrycia złotym
Króćcem (mocowanie aluminiowe, kołek płaski) 12,7 mm x 8 mm Mikroskopia elektronowaSciences 75520Do mocowania próbek

Bibliografia

  1. Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
  2. Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
  3. Schmitz, O. J. Spatial dynamics and ecosystem functioning. PLOS Biol. 8 (5), e1000378(2010).
  4. Pringle, R. M., Doak, D. F., Brody, A. K., Jocqué, R., Palmer, T. M. Spatial pattern enhances ecosystem functioning in an African savanna. PLOS Biol. 8 (5), e1000377(2010).
  5. Wimpenny, J. W. Spatial order in microbial ecosystems. Biol Rev. 56 (3), 295-342 (1981).
  6. Martiny, J. B. H., et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev. Microbiol. 4 (2), 102-112 (2006).
  7. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nat Rev Microbiol. 22 (2), 105-118 (2024).
  8. Lamont, R. J., Hajishengallis, G., Koo, H. Social networking at the microbiome-host interface. Infec Immun. 91 (9), e00124-e00223 (2023).
  9. Welch, J. L. M., Rossetti, B. J., Rieken, C. W., Dewhirst, F. E., Borisy, G. G. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (6), E791-E800 (2016).
  10. Kim, D., et al. Spatial mapping of polymicrobial communities reveals a precise biogeography associated with human dental caries. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (22), 12375-12386 (2020).
  11. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  12. Ibberson, C. B., Barraza, J. P., Holmes, A. L., Cao, P., Whiteley, M. Precise spatial structure impacts antimicrobial susceptibility of S. aureus in polymicrobial wound infections. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (51), e2212340119(2022).
  13. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  14. Dejea, C. M., et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (51), 18321-18326 (2014).
  15. Hanson, C. A., Fuhrman, J. A., Horner-Devine, M. C., Martiny, J. B. Beyond biogeographic patterns: processes shaping the microbial landscape. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 497-506 (2012).
  16. Adade, E. E., Al Lakhen, K., Lemus, A. A., Valm, A. M. Recent progress in analyzing the spatial structure of the human microbiome: Distinguishing biogeography and architecture in the oral and gut communities. Curr Opin Endocr. 18, 275-283 (2021).
  17. Mony, C., Bohannan, B. J., Leibold, M. A., Peay, K., Vandenkoornhuyse, P. Microbial landscape ecology: Highlights on the invisible corridors. Front Ecol Evol. 9, 753213(2021).
  18. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  19. Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R., Mueller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. 266 (5191), 1691-1694 (1994).
  20. Mueller, U. G., Rehner, S. A., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in ants. Science. 281 (5385), 2034-2038 (1998).
  21. Mueller, U. G., Gerardo, N. M., Aanen, D. K., Six, D. L., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36, 563-595 (2005).
  22. Dentinger, B. T., Lodge, D. J., Munkacsi, A. B., Desjardin, D. E., McLaughlin, D. J. Phylogenetic placement of an unusual coral mushroom challenges the classic hypothesis of strict coevolution in the Apterostigma pilosum group ant-fungus mutualism. Evolution. 63 (8), 2172-2178 (2009).
  23. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 5435-5440 (2008).
  24. de Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J. Forage collection, substrate preparation, and diet composition in fungus-growing ants. Ecol Entomol. 35 (3), 259-269 (2010).
  25. Martin, M. M. The biochemical basis of the fungus-attine ant symbiosis: A complex symbiosis is based upon integration of the carbon and nitrogen metabolisms of the two organisms. Science. 169 (3940), 16-20 (1970).
  26. Grell, M. N., et al. The fungal symbiont of Acromyrmex leaf-cutting ants expresses the full spectrum of genes to degrade cellulose and other plant cell wall polysaccharides. BMC Genomics. 14, 928(2013).
  27. Lange, L., Grell, M. N. The prominent role of fungi and fungal enzymes in the ant-fungus biomass conversion symbiosis. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 4839-4851 (2014).
  28. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6 (4), 389-395 (2014).
  29. Craven, S. E., Dix, M. W., Michaels, G. E. Attine fungus gardens contain yeasts. Science. 169 (3941), 184-186 (1970).
  30. De Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J., Tunlid, A. Symbiotic adaptations in the fungal cultivar of leaf-cutting ants. Nat Commun. 5 (1), 5675(2014).
  31. Aylward, F. O., et al. Enrichment and broad representation of plant biomass-degrading enzymes in the specialized hyphal swellings of Leucoagaricus gongylophorus, the fungal symbiont of leaf-cutter ants. PLoS One. 10 (8), e0134752(2015).
  32. Moreira-Soto, R. D., Sanchez, E., Currie, C. R., Pinto-Tomás, A. A. Ultrastructural and microbial analyses of cellulose degradation in leaf-cutter ant colonies. Microbiology. 163 (11), 1578-1589 (2017).
  33. Erthal Jr, M., Silva, C. P., Cooper, R. M., Samuels, R. I. Hydrolytic enzymes of leaf-cutting ant fungi. Comp Biochem. 152 (1), 54-59 (2009).
  34. North, R. D., Jackson, C. W., Howse, P. E. Communication between the fungus garden and workers of the leaf-cutting ant, Atta sexdens rubropilosa, regarding choice of substrate for the fungus. Physiol Entomol. 24 (2), 127-133 (1999).
  35. Herz, H., Hölldobler, B., Roces, F. Delayed rejection in a leaf-cutting ant after foraging on plants unsuitable for the symbiotic fungus. Behav Ecol. 19 (3), 575-582 (2008).
  36. Schiøtt, M., De Fine Licht, H. H., Lange, L., Boomsma, J. J. Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 40(2008).
  37. Bot, A. N., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethol Ecol Evol. 13 (3), 225-237 (2001).
  38. Scott, J. J., et al. Microbial community structure of leaf-cutter ant fungus gardens and refuse dumps. PLOS One. 5 (3), e9922(2010).
  39. Lewin, G. R., et al. Cellulose-enriched microbial communities from leaf-cutter ant (Atta colombica) refuse dumps vary in taxonomic composition and degradation ability. PLOS One. 11 (3), e0151840(2016).
  40. Suen, G., et al. An insect herbivore microbiome with high plant biomass-degrading capacity. PLOS Genet. 6 (9), e1001129(2010).
  41. Aylward, F. O., et al. Convergent bacterial microbiotas in the fungal agricultural systems of insects. MBio. 5 (6), e02077(2014).
  42. Barcoto, M. O., et al. Fungus-growing insects host a distinctive microbiota apparently adapted to the fungiculture environment. Sci Rep. 10 (1), 12384(2020).
  43. Francoeur, C. B., et al. Bacteria contribute to plant secondary compound degradation in a generalist herbivore system. mBio. 11, e02146-e02220 (2020).
  44. Martiarena, M. J. S., Deveau, A., Montoya, Q. V., Flórez, L. V., Rodrigues, A. The hyphosphere of leaf-cutting ant cultivars is enriched with helper bacteria. Microb Ecol. 86 (3), 1773-1788 (2023).
  45. Leal-Dutra, C. A., et al. Evidence that the domesticated fungus Leucoagaricus gongylophorus recycles its cytoplasmic contents as nutritional rewards to feed its leafcutter ant farmers. IMA Fungus. 14 (1), 19(2023).
  46. Sosa-Calvo, J., Jesovnik, A., Okonski, E., Schultz, T. R. Locating, collecting, and maintaining colonies of fungus-farming ants (Hymenoptera: Myrmicinae: Attini). Sociobiology. 62 (2), 300-320 (2015).
  47. Karnovsky, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-138 (1965).
  48. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Myers, R. B., Grizzle, W. E. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24 (3), 173-190 (2001).
  49. Gusnard, D., Kirschner, R. H. Cell and organelle shrinkage during preparation for scanning electron microscopy: effects of fixation, dehydration and critical point drying. J Microsc. 110 (1), 51-57 (1977).
  50. Surman, S. B., et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms. J Microbiol Methods. 25 (1), 57-70 (1996).
  51. Augustin, J. O., et al. Yet more "weeds" in the garden: fungal novelties from nests of leaf-cutting ants. PLOS One. 8 (12), e82265(2013).
  52. Montoya, Q. V., Martiarena, M. J. S., Polezel, D. A., Rodrigues, A. More pieces to a huge puzzle: Two new Escovopsis species from fungus gardens of attine ants. MycoKeys. 46, 97(2019).
  53. Varanda-Haifig, S. S., et al. Nature of the interactions between hypocrealean fungi and the mutualistic fungus of leaf-cutter ants. Antonie van Leeuwenhoek. 110, 593-605 (2017).
  54. Custodio, B. C., Rodrigues, A. Escovopsis kreiselii specialization to its native hosts in the fungiculture of the lower attine ant Mycetophylax morschi. Antonie van Leeuwenhoek. 112, 305-317 (2019).
  55. Schröttner, H., Schmied, M., Scherer, S. Comparison of 3D surface reconstruction data from certified depth standards obtained by SEM and an Infinite Focus Measurement Machine (IFM). Microchim Acta. 155, 279-284 (2006).
  56. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of scanning electron microscopy (SEM). Scanning microscopy for nanotechnology: Techniques and applications. Zhou, W., Wang, Z. L. , Springer. New York, NY. 1-40 (2007).
  57. Kannan, M. Scanning electron microscopy: Principle, components and applications. A Textbook on Fundamentals and Applications of Nanotechnology. Raja, K., Subramanian, K. S., Kannan, M. , Daya Publishing House. 81-92 (2018).
  58. Ruffolo, J. J. Jr Critical point drying of protozoan cells and other biological specimens for scanning electron microscopy: apparatus and methods of specimen preparation. Trans Am Microsc. 93 (1), 124-131 (1974).
  59. Echlin, P. Recent advances in specimen coating techniques for electron microscopy. Scanning Electron Microscopy 1981/1. , IITRI. Chicago. 79-90 (1981).
  60. Ris, H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded sections. J Cell Biol. 100 (5), 1474-1487 (1985).
  61. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical-point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech. 26 (6), 489-495 (1993).
  62. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J. 38 (11), 775-788 (2005).
  63. Kirk, S. E., Skepper, J. N., Donald, A. M. Application of environmental scanning electron microscopy to determine biological surface structure. J Microsc. 233 (2), 205-224 (2009).
  64. Kemmenoe, B. H., Bullock, G. R. Structure analysis of sputter-coated and ion-beam sputter-coated films: a comparative study. J Microsc. 132 (2), 153-163 (1983).
  65. Kinden, D. A., Brown, M. F. Technique for scanning electron microscopy of fungal structures within plant cells. Phytopathology. 65, 74-76 (1975).
  66. Masaphy, S., Levanon, D., Tchelet, R., Henis, Y. Scanning electron microscope studies of interactions between Agaricus bisporus (Lang) Sing hyphae and bacteria in casing soil. Appl Environ Microbiol. 53 (5), 1132-1137 (1987).
  67. Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Scanning electron microscopy of ectomycorrhizae potential and limitations. Scanning Microsc. 1 (3), 58(1987).
  68. Visen, A., Singh, P. N., Chakraborty, B., Singh, A., Bisht, T. S. Scanning electron microscopy indicates Pseudomonad strains facilitate AMF mycorrhization in litchi (Litchi chinensis Sonn.) air-layers and improving survivability, growth and leaf nutrient status. Curr Res Microb Sci. 2, 100063(2021).
  69. Fleeman, R. M., Mikesh, M., Davies, B. W. Investigating Klebsiella pneumoniae biofilm preservation for scanning electron microscopy. Access Microbiol. 5 (2), 000470-000473 (2023).
  70. Wells, M., Mikesh, M., Gordon, V. Structure-preserving fixation allows scanning electron microscopy to reveal biofilm microstructure and interactions with immune cells. J Microsc. 293 (1), 59-68 (2024).
  71. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  72. Madsen, J. S., et al. Coexistence facilitates interspecific biofilm formation in complex microbial communities. Environ Microbiol. 18 (8), 2565-2574 (2016).
  73. Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burmølle, M. Bacterial social interactions and the emergence of community-intrinsic properties. Curr Opin Microbiol. 42, 104-109 (2018).
  74. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 247-260 (2019).
  75. Bringhurst, B., Allert, M., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Environments and hosts structure the bacterial microbiomes of fungus-gardening ants and their symbiotic fungus gardens. Microb Ecol. 86 (2), 1374-1392 (2023).
  76. Bringhurst, B., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Symbiosis, dysbiosis and the impact of horizontal exchange on bacterial microbiomes in higher fungus-gardening ants. Sci Rep. 14 (1), 3231(2024).
  77. Vargas, S., et al. Body-plan reorganization in a sponge correlates with microbiome change. Mol Biol Evol. 40 (6), msad138(2023).
  78. Apprill, A., et al. Humpback whale populations share a core skin bacterial community: towards a health index for marine mammals. PLOS One. 9 (3), e90785(2014).
  79. Fraune, S., et al. Bacteria-bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance. ISME J. 9 (7), 1543-1556 (2015).
  80. Gowen, R., Gamal, A., Di Martino, L., McCormick, T. S., Ghannoum, M. A. Modulating the microbiome for Crohn's disease treatment. Gastroenterology. 164 (5), 828-840 (2023).
  81. Moya, P., et al. Molecular phylogeny and ultrastructure of the lichen microalga Asterochloris mediterranea sp. nov. from Mediterranean and Canary Islands ecosystems. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (6), 1838-1854 (2015).
  82. Zettler, E. R., Mincer, T. J., Amaral-Zettler, L. A. Life in the "plastisphere": microbial communities on plastic marine debris. Environ Sci Technol. 47 (13), 7137-7146 (2013).
  83. Porter, K. R., Kallman, F. The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy. Exp Cell Res. 4 (1), 127-141 (1953).
  84. Ligon, J. J., Abraham, J. L., Boyd, A. S. Traumatic osmium tetroxide inoculation. J Am Acad Dermatol. 45 (6), 949-952 (2001).
  85. Friedova, N., et al. Osmium absorption after osmium tetroxide skin and eye exposure. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 429-433 (2020).
  86. Fratesi, S. E., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. J Sediment. 74 (6), 858-867 (2004).
  87. Dassanayake, R. P., et al. Identification of a reliable fixative solution to preserve the complex architecture of bacterial biofilms for scanning electron microscopy evaluation. PLOS One. 15 (5), e0233973(2020).
  88. Desiro, A., et al. Detection of a novel intracellular microbiome hosted in arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J. 8 (2), 257-270 (2014).
  89. Morales, D. P., et al. Advances and challenges in fluorescence in situ hybridization for visualizing fungal endobacteria. Front Microbiol. 13, 892227(2022).
  90. Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
  91. Valm, A. M., Welch, J. L. M., Borisy, G. G. CLASI-FISH: principles of combinatorial labeling and spectral imaging. Syst Appl Microbiol. 35 (8), 496-502 (2012).
  92. Fernandez-Brime, S., Muggia, L., Maier, S., Grube, M., Wedin, M. Bacterial communities in an optional lichen symbiosis are determined by substrate, not algal photobionts. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz012(2019).
  93. Schluter, S., Eickhorst, T., Mueller, C. W. Correlative imaging reveals holistic view of soil microenvironments. Environ Sci Technol. 53 (2), 829-837 (2018).
  94. Barcoto, M. O., Rodrigues, A. Lessons from insect fungiculture: from microbial ecology to plastics degradation. Front Microbiol. 13, 812143(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ogrody grzybówbiofilmy mikrobiologiczneorganizacja przestrzenna mikrobiotystrzępki grzybówstruktura biofilmuprzygotowanie próbeksuszenie w punkcie krytycznymnapylanie warstwy przewodzącej
Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.