Artykuł metodologiczny

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 października 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

W tym artykule

Podsumowanie

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Streszczenie

W ekosystemach makroskalowych, takich jak lasy deszczowe czy rafy koralowe, przestrzenna lokalizacja organizmów jest podstawą naszego zrozumienia ekologii społeczności. Podobnie w świecie mikrobiologicznym ekosystemy w mikroskali są dalekie od przypadkowej i jednorodnej mieszanki organizmów i siedlisk. Dostęp do przestrzennego rozmieszczenia mikroorganizmów ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania i ekologii mikrobioty, ponieważ gatunki współżyjące z innymi organizmami są bardziej skłonne do interakcji i wzajemnego wpływania na swoją fizjologię.

Międzykrólestwowy ekosystem mikrobiologiczny jest sercem kolonii mrówek hodujących grzyby, które uprawiają grzyby podstawczakowe jako źródło pożywienia. Mrówki Attine żerują na różnych podłożach (głównie roślinnych), metabolizowanych przez uprawiane grzyby, tworząc gąbczastą strukturę, "ogród mikrobiologiczny", który działa jak zewnętrzne jelito. Ogród jest splecioną siatką strzępek grzybów, które rosną poprzez metabolizowanie podłoża, otwierając nisze dla charakterystycznej i przystosowanej mikrobioty. Uważa się, że mikrobiota przyczynia się do degradacji substratu i wzrostu grzybów, chociaż jej organizacja przestrzenna nie została jeszcze ustalona.

Tutaj opisujemy, jak wykorzystujemy skaningową mikroskopię elektronową (SEM) do zbadania, z niespotykaną dotąd szczegółowością, organizacji przestrzennej mikrobioty i biofilmu w różnych systemach hodowli grzybów mrówek. Obrazowanie SEM dostarczyło opisu struktury przestrzennej i organizacji mikrobioty. Projekt SEM ujawnił, że mikrobiota często gromadzi się w biofilmach, które są szeroko rozpowszechnioną strukturą krajobrazów mikrobiologicznych w kulturze grzybów. Przedstawiamy protokoły stosowane do naprawy, odwadniania, suszenia, napylania powłoki i obrazowania tak złożonej społeczności. Protokoły te zostały zoptymalizowane pod kątem radzenia sobie z delikatnymi i niejednorodnymi próbkami, zawierającymi biomasę roślinną i grzybową, a także mikrobiotę i biofilm.

Wprowadzenie

Ekosystemy składają się z organizmów połączonych procesami w określonej lokalizacji geograficznej (tj. w środowisku). Organizmy wchodzą w interakcje ze swoim środowiskiem w czasie, w wyniku czego wyłaniają się złożone i heterogeniczne wzorce przestrzenne. Wzorowanie przestrzenne determinuje różnorodność i stabilność ekologiczną, a w konsekwencji funkcjonowanie ekosystemu1,2,3,4. W ekosystemach w skali makro, takich jak tereny podmokłe, sawanny, rafy koralowe i ekosystemy aridowe, wzorce przestrzenne są skorelowane z przepływem i koncentracją zasobów. Umożliwiając optymalizację zasobów, heterogeniczność i wzorowanie przestrzenne prowadzą do powstania ekosystemów bardziej odpornych niż ekosystemy homogeniczne2. Przestrzenna lokalizacja organizmów, stanowiąca podstawę ekologii wspólnot, przekłada się również na świat drobnoustrojów.

Ekosystemy mikrobiologiczne, zamiast być organizmami wymieszanymi w sposób losowy i jednorodny w obrębie mikrośrodowisk, wykazują wzorce przestrzenne, które w znacznym stopniu definiują ich funkcjonowanie5,6,7. Od kolumn Winogradskiego po mikrobiotę środowiskową i związaną z gospodarzem, ekosystemy te są zorganizowane przestrzennie w sposób niejednorodny, a ich układy przestrzenne wywołują różne odpowiedzi fenotypowe. Gatunki współbytujące z większym prawdopodobieństwem wchodzą w interakcje i wpływają na swoją fizjologię. Zatem przestrzenna organizacja społeczności, w większym stopniu niż sam skład per se, określa właściwości ekosystemu i nisze ekologiczne5,7,8. Ilustrując te koncepcje, zmiany we wzorcach przestrzennych wydają się być skorelowane z patologicznym przebiegiem zmian w płytce nazębnej, próchnicą, chorobami dziąseł9,10, nieswoistymi zapaleniami jelit11, infekcjami płuc w mukowiscydozie, przewlekłymi infekcjami ran12,13, rakiem jelita grubego oraz gruczolakami14.

W ramach biogeografii mikroorganizmów (badania nad rozkładem i wzorcami różnorodności biologicznej w przestrzeni i czasie w mikroskali), wiedza na temat ekosystemów mikrobowych jest w ogromnym stopniu wzbogacana dzięki zrozumieniu ich wzorców przestrzennych6,13,15,16,17. Przeanalizowaliśmy wzorce przestrzenne ekosystemu mikrobowego stworzonego przez owady, który znajduje się w centrum kolonii charakterystycznych mrówek attin hodujących grzyby (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Znajduje się tam „mikrobowy ogród”, skupiony wokół grzyba podstawczakowego z plemienia Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) lub z rodziny Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Ogród jest gąbczastą strukturą wyłaniającą się ze splecionej sieci strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie dostarczanego przez mrówki substratu, składającego się głównie z materiałów roślinnych (Rysunek 1). W zależności od rodzaju mrówek attin, mogą to być: suche części roślin, odchody i zwłoki owadów, świeżo odcięte liście, nasiona oraz części kwiatowe23,24. Podobnie jak zewnętrzny układ pokarmowy roślinożerca, ogród enzymatycznie i chemicznie przekształca trudnorozkładalne polimery w łatwo przyswajalne zasoby odżywcze, zapewniając mrówkom niezbędne aminokwasy, lipidy i cukry rozpuszczalne21,25,26,27,28.

Analizy ultrastrukturalne, enzymatyczne i transkryptomiczne przeprowadzone dla ogrodów grzybowych generów tnących liście Atta i Acromyrmex sugerują, że środowiska te tworzą kontinuum degradacji podłoża i plam odżywczych26,29,30,31,32. Młode części ogrodu mają tendencję do bycia ciemniejszymi ze względu na świeżo włączone, pofragmentowane podłoże. Te niedawno dodane podłoża są często kolonizowane od krawędzi, które zostały przecięte przez robotnice mrówek i zaszczepione grudkami grzybni. Strzałkując od przeciętych krawędzi, strzępki grzyba rozprzestrzeniają się po podłożu29,32,33. Obfitość strzępek wzrasta w miarę postępu degradacji podłoża, co prowadzi do powstania białawych i metabolicznie aktywnych obszarów30,31,32. Starsze regiony, z bardziej zdegradowanym podłożem i obfitą mikrobiotą29,32, wykazują tendencję do przyjmowania brązowych odcieni i wyższej wilgotności. Robotnice usuwają fragmenty tego regionu, oddzielając je w pryzmach odpadów, do których przenoszą również podłoża szkodliwe dla symbionta grzybowego34,35,36. Pryzmy odpadów, choć fizycznie oddzielone od ogrodu, są miejscem ciągłej degradacji podłoża i cyklu nutrientów prowadzonego przez obfitą mikrobiotę mieszkańców29,32,37,38,39.

W ogrodzie bytuje również mikrobiota składająca się głównie z Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas oraz Serratia, która najwyraźniej jest wspólna dla różnych systemów uprawy grzybów u mrówek z podrodziny Attina. Kodując szlaki metaboliczne, które mogłyby uzupełniać metabolizm grzybów, mikrobiota ta potencjalnie uczestniczy w odpowiedziach fizjologicznych ogrodu40,41,42,43,44. Dane metagenomiczne nie tylko wskazały na obecność mikrobioty41,42, ale analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) uprawy grzybów mrówek tnących liście wykazała obecność głównie bakterii pałeczkowatych na podłożu roślinnym32. Choć bakterie (w tym szczepy celulolityczne) wyizolowano z całego ogrodu, wizualizowano je jedynie w starszych częściach ogrodu i w pryzach odpadów, a także w początkowej grudce przenoszonej przez królowe założycielki29,32. Nie było również pewności, czy mikrobiota może tworzyć biofilmy in vivo (tj. w ogrodzie i odpadach), co sugerowały ich możliwości metaboliczne42 oraz obserwacje in vitro44.

W niniejszej pracy wykorzystano SEM w celu dalszego zrozumienia przestrzennej organizacji mikrobioty w obrębie obszarów ogrodu, szczegółowo analizując fizyczne oddziaływania mikrobioty z podłożem oraz mikrobioty z strzępkami. Dzięki uzyskaniu obrazów o większej głębi ostrości, SEM umożliwia obserwację trójwymiarowych struktur mikroskopowych w wysokiej rozdzielczości, co pozwala na gruntowną analizę wzorców przestrzennych mikrobioty ogrodowej. Szczegółowo opisujemy etapy utrwalania, odwadniania, suszenia, napylania i obrazowania tak heterogenicznych i delikatnych próbek opartych na grzybach. Poprzez usunięcie etapu postfiksacji przy użyciu czwartotlenku osmu (OsO4) oraz skrócenie czasu odwadniania, uprościliśmy protokoły32,33,45 przygotowania próbek z ogrodu i odpadów do analizy SEM. Ten zmodyfikowany protokół zachowuje strukturalne wzorce strzępek, a także przestrzenną organizację mikrobioty i biofilmu, i może zostać zastosowany do innych delikatnych ekosystemów mikrobiologicznych i biofilmów.

Koncepcja interakcji mikrobiologicznych w ogrodzie mrówek attinowych; ilustracja mikroskopowa z analizą biofilmu.
Rysunek 1: Mikrobiologiczne ogrody mrówek attinowych. Ogród to gąbczasta struktura powstała z przeplatającej się sieci strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie substratu pochodzenia głównie roślinnego dostarczanego przez mrówki. W ogrodzie bytuje również mikrobiota, która koduje szlaki metaboliczne mogące uzupełniać metabolizm grzyba. Dane metagenomiczne oraz wcześniejsze analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wskazywały na jej obecność, choć dysponowaliśmy ograniczoną wiedzą na temat jej organizacji przestrzennej oraz fizycznych interakcji z substratem i strzępkami grzyba. Zastosowaliśmy SEM, aby odsłonić organizację przestrzenną i strukturę mikrobioty oraz biofilmu. Ilustracje: Mariana Barcoto (ogród i mikrobiota zaadaptowane z Barcoto i Rodrigues 94), zdjęcia: Mariana Barcoto i Enzo Sorrentino. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Pobieranie próbek z kolonii terenowych

UWAGA: Podczas zbierania kolonii mrówek należy upewnić się, że przed rozpoczęciem pobierania uzyskano wszystkie zezwolenia wymagane przez lokalne ustawodawstwo. W naszym przypadku zezwolenie na pobieranie nr 74585 zostało wydane przez Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). Jeśli próbki pochodzą z kolonii laboratoryjnej, należy przejść do sekcji 2.

  1. Zlokalizuj i zaznacz kolonię. Wykop rów wokół obszaru gniazda, aż do odsłonięcia komory ogrodowej (Rycina 2A).
    UWAGA: Niektóre gatunki mrówek z rodzaju attine mogą budować kolonie pod ściółką liściową lub wewnątrz próchniejących kłód. W takich przypadkach należy ostrożnie odsunąć ściółkę lub ostrożnie rozłupać kłody, aby pobrać próbki. Szczegółowe informacje na temat lokalizacji, pobierania i utrzymywania żywych kolonii różnych gatunków mrówek attine znajdują się w pracy Sosa-Calvo et al.46.
  2. Otwórz komorę ogrodową od boku, aby zapobiec wpadaniu gleby na powierzchnię ogrodu. Ostrożnie pobierz próbki z ogrodu, używając pęsety entomologicznej, łyżki lub sitka kuchennego, w zależności od wielkości ogrodu.
    UWAGA: Pamiętaj o wysterylizowaniu narzędzi przed pobieraniem próbek. Podczas pobierania ogrodów mrówek tnących należy założyć grube rękawice materiałowe, aby zapobiec (lub przynajmniej ograniczyć) ugryzienia robotnic. W przypadku innych gatunków attine rękawice materiałowe są opcjonalne.
  3. Przenieś próbki z ogrodu do czystego plastikowego pojemnika zawierającego warstwę gipsu w celu zbilansowania wilgotności ogrodu. Po przeniesieniu ogrodu i robotnic hermetycznie zamknij pojemnik, aby zapobiec wyschnięciu próbki. Próbki z ogrodu przechowuj w temperaturze 23-25 °C do czasu przetworzenia.
  4. Zasyp rów wcześniej usuniętą glebą.

Schemat wykopalisk kolonii mrówek i przygotowania próbek do SEM: fiksacja, odwodnienie, suszenie, obrazowanie.
Rysunek 2: Protokół przygotowania próbek. (A) Pobieranie próbek z kolonii terenowych. (B) Przetwarzanie próbek. (C) Krótki opis podstaw i przebiegu przygotowania próbek: 1. Fiksacja: w celu wzmocnienia i utrwalenia struktury próbki. 2. Odwodnienie: wymiana zawartości wody w próbkach na etanol. 3. Suszenie w punkcie krytycznym: ciekły CO2 zastępuje etanol, a następnie zostaje odparowany. 4. Montaż: umieszczenie próbki do analizy. 5. Napylanie złotem: zapobieganie ładowaniu się próbki. 6. Obrazowanie. Ilustracje i zdjęcia autorstwa Mariany Barcoto. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Odczynniki

UWAGA: Należy pamiętać, że poniższe roztwory powinny zostać przygotowane wcześniej.

  1. Przygotować 0,2 M bufor kdakodylanowy sodu. W tym celu rozpuścić 42,8 g kdakodylanu sodu w 800 mL wody destylowanej, mieszając do czasu rozpuszczenia i stabilizacji pH na poziomie 7,2 (w razie potrzeby skorygować pH za pomocą kwasu solnego). Uzupełnić objętość roztworu do 1 L, dodając wodę destylowaną. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C (przez ok. 1 miesiąc).
    OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd i paraformaldehyd są toksyczne i powinny być obsługiwane w dygestorium. Podczas pracy z takimi odczynnikami należy przez cały czas nosić rękawiczki nitrylowe i okulary ochronne.
  2. Przygotować utrwalacz Karnovskiego (zmodyfikowany według Karnovskiego)47. W tym celu dodać 10 mL 25% wodnego roztworu glutaraldehydu i 10 mL 20% wodnego roztworu paraformaldehydu do 25 mL 0,2 M buforu kdakodylanowego sodu i wymieszać. Dodać 1 mL 0,1 M chlorku wapnia (CaCl2) i uzupełnić objętość do 100 mL, dodając wodę destylowaną. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C (do 1 miesiąca).
    OSTRZEŻENIE: Utrwalacz Karnovskiego jest szkodliwy przy wdychaniu i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Należy unikać wdychania oparów i stosować go wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Podczas pracy z roztworem należy przez cały czas nosić rękawiczki nitrylowe i okulary ochronne.
  3. Używając etanolu bezwodnego (cz.da.), przygotować w wodzie destylowanej roztwory etanolu o stężeniach 30%, 50%, 70% i 90%; wymagany jest również etanol 100%.

3. Fixacja próbek

UWAGA: Utrwalacze utwardzają i konserwują próbki, zachowując ich cechy morfologiczne. Aldehydy (takie jak paraformaldehyd i glutaraldehyd) są niekoagulującymi utrwalaczami typu sieciującego, które indukują tworzenie wiązań krzyżowych w obrębie białek i kwasów nukleinowych oraz pomiędzy nimi48.

  1. Usuń robotnice, jaja, poczwarki i larwy z próbek ogrodowych, używając pincety entomologicznej (Rysunek 2B). Oddziel fragmenty ogrodu nie większe niż 5 mm3. Umieść fragmenty w probówce o pojemności 2 mL (Rysunek 2C).
  2. Do probówek zawierających próbki dodaj za pomocą szklanej pipety Pasteura ~1 mL roztworu fiksatywy Karnovsky'ego (upewnij się, że próbka jest całkowicie przykryta). Wymieszaj poprzez delikatne wstrząsanie, aby pomóc próbce nasiąknąć, i inkubuj w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 h przed dalszym przetwarzaniem próbek (Rysunek 2C.1).
    UWAGA: Jeśli kolejne etapy dehydratacji nie będą przeprowadzane natychmiast po fiksacji, protokół można przerwać na tym etapie, a próbki można przechowywać przez ~1 rok w temperaturze 4 °C.
    Sugerujemy użycie szklanej pipety Pasteura, ponieważ składa się ona z materiału obojętnego i jest łatwiejsza do oczyszczenia w celu ponownego użycia. Materiał ogrodowy jest silnie hydrofobowy i ma tendencję do pływania na powierzchni roztworu fiksatywy. Pełne nasiąknięcie w fiksatywie zajmuje zazwyczaj do 5 min. Upewnij się, że fiksatywa pokrywa fragmenty ogrodu, ponieważ jej objętość ma tendencję do zmniejszania się w miarę wnikania w pory próbki. Empirycznie zweryfikowaliśmy, że po nasiąknięciu i zawilgoceniu próbki, jej składniki (w szczególności delikatna grzybnia) stały się podatne na uszkodzenia podczas dalszego mieszania. Dlatego zalecamy unikanie wstrząsania próbek w miarę możliwości.

4. Odwodnienie próbki

UWAGA: Seria płukań etanolem stopniowo zastępuje wodę w próbkach etanolem. Ważne jest, aby rozpocząć od roztworu etanolu o niskim stężeniu (patrz poniżej), aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia lub zapadnięcia się tak delikatnych próbek49.

  1. Całkowicie usunąć roztwór utrwalający Karnovsky'ego za pomocą szklanej pipety, uważając, aby nie uszkodzić próbki (Rysunek 2C.1).
    UWAGA: Utylizować utrwalacz Karnovsky'ego w pojemniku odpowiednio oznakowanym do zarządzania toksycznymi odpadami chemicznymi.
  2. Natychmiast po usunięciu utrwalacza dodać 1 mL 30% etanolu, uważając, aby nie uszkodzić próbki, i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej (Rysunek 2C.2).
    UWAGA: Próbki muszą być przez cały czas zanurzone w roztworze. Należy szybko wymieniać roztwory podczas serii stopniowego przemywania etanolem. W miarę jak tkanka traci swoją porowatość i agreguje się na dnie probówki, 1 mL etanolu zazwyczaj wystarcza do pokrycia próbki (jeśli próbka nie jest większa niż 5 mm3). Jeśli jednak próbki nie są całkowicie przykryte, należy dodać etanol, aż zostaną w pełni zanurzone.
  3. Całkowicie usunąć 30% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 30% etanol.
    UWAGA: Przez całą serię stopniowego przemywania etanolem, etanol należy utylizować w pojemniku odpowiednio oznakowanym do zarządzania toksycznymi odpadami chemicznymi.
  4. Dodać 1 mL 50% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 50% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 50% etanol.
  5. Dodać 1 mL 70% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 70% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 70% etanol.
    UWAGA: Na etapie przemywania 70% etanolem można w razie potrzeby przerwać protokół, ponieważ probówki z próbkami można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, jeśli materiał nie zostanie natychmiast przetworzony.
  6. Dodać 1 mL 90% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 90% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 90% etanol.
  7. Dodać 1 mL 100% etanolu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć 100% etanol szklaną pipetą, uważając, aby nie uszkodzić próbki. Prawidłowo zutylizować 100% etanol.
  8. Używając pęsety i/lub szpatułki, ostrożnie przenieść próbki do pojemników na preparaty do suszarki punktu krytycznego (CPD), zawierających etykiety identyfikacyjne próbek (wykonane wcześniej ołówkiem na papierze). Aby zapobiec wysychaniu próbek, przeniesienie to wykonuje się z pojemnikiem umieszczonym w szalce Petriego wypełnionej 100% etanolem.
  9. Zamknąć pojemniki pokrywkami i zanurzyć je w miarkowanym zlewku szklanym zawierającym wystarczającą ilość 100% etanolu, aby całkowicie zakryć pojemniki. Przykryć zlewek i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie prawidłowo zutylizować 100% etanol.
  10. Przenieść pojemniki z preparatami do innego miarkowanego zlewka szklanego zawierającego wystarczającą ilość 100% etanolu, aby zanurzyć pojemniki. Przykryć zlewek i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść pojemniki z preparatami do suszarki punktu krytycznego.
    UWAGA: Po serii przemywania szklane pipety i zlewki należy obficie wypłukać wodą destylowaną, a pozostałą wodę zutylizować w pojemniku odpowiednio oznakowanym do zarządzania toksycznymi odpadami chemicznymi. Po płukaniu przedmioty szklane można myć neutralnym detergentem, płukać wodą z kranu i suszyć na powietrzu.

5. Suszenie punktem krytycznym

UWAGA: Suszarka punktu krytycznego zastępuje etanol w próbkach ciekłym dwutlenkiem węgla (CO2), który odparowuje z próbki w wyższej temperaturze i pod wyższym ciśnieniem. Należy stosować się do instrukcji producenta dotyczących takich procedur.

  1. Włącz urządzenie.
  2. Otwórz komorę, umieść w niej pojemniki z próbkami i dolej 100% etanolu, aż pokryje on pojemniki. Zamknij komorę.
  3. Aktywuj Fajnie opcji i poczekaj, aż temperatura osiągnie 10 °C.
  4. Otwórz CO2 zawór butli i uruchomić Mieszadło opcja
  5. Aktywuj CO2 w opcja, przy ciągłym sprawdzaniu komory w celu weryfikacji ilości CO2 już go wypełnił. Gdy komora zostanie prawie całkowicie wypełniona, należy wyłączyć CO2 Wewnątrz opcja i aktywuj Wymiana opcja, utrzymując go w stanie aktywnym do momentu osiągnięcia odpowiedniego poziomu CO2 wyłącznie w celu przykrycia pojemników. Należy upewnić się, że pojemniki są stale przykryte CO22 (t.j. dezaktywować) Wymiana opcja przed wszystkimi CO2 opuściła komorę). Powtórz krok 5.5 6 razy.
  6. Aktywuj CO2 w po raz ostatni wypełnij komorę, aż pojemniki zostaną całkowicie przykryte.
  7. Aktywuj Ciepło opcja i dezaktywuj Mieszadło opcja. Zamknij CO2 zawór butli
  8. Odczekać do czasu, aż temperatura wzrośnie do 35 °C; następnie aktywuj Odgazowanie opcja
    UWAGA: Około 30 °Ckomora osiąga ciśnienie 70–80 bar, osiągając punkt krytyczny, w którym ciecz znika.
  9. Gdy ciśnienie w komorze osiągnie wartość 1 bar, oznacza to usunięcie całej zawartości gazu. Otwórz komorę i wyjmij pojemniki.
  10. Wyłączyć urządzenie.

6. Montowanie

  1. Przygotować uchwyty do próbek SEM (tj. aluminiowe stuby; Rysunek 2C.4).
    1. Owinąć stuby kawałkiem folii aluminiowej, zakrywając tylko górną część, aby ułatwić czyszczenie stubu po analizie.
    2. Oznaczyć stuby, wpisując kod/numer próbki na spodzie uchwytu, aby zapewnić identyfikację materiału umieszczonego na górze.
    3. Pokryć górną część dwustronną taśmą węglową. Umieścić stuby w uchwycie na próbki.
  2. Otworzyć pokrywę pojemnika z próbkami i ostrożnie przenieść wysuszoną próbkę do szklanej szalki Petriego za pomocą pęsety i szpatułki.
    UWAGA: Ogrody poddane suszeniu w punkcie krytycznym mają tendencję do aglomeracji, tworząc bardzo zwarte próbki, które należy ostrożnie rozdzielić na fragmenty o rozmiarze nie większym niż 1 mm3.
  3. Ostrożnie umieścić fragmenty na lepkim podłożu taśmy na stubie. Gdy fragment ogrodu dotknie taśmy, jego (prze)suniecie jest bardzo trudne, dlatego należy uważać, aby nie umieścić go w niepożądanych miejscach lub pozycjach. Na jednym stubie można umieścić do dziewięciu fragmentów.
  4. Powtórzyć kroki 6.2 i 6.3 dla każdej próbki.

7. Napylanie złota

UWAGA: Powlekanie próbki jest wymagane w celu zapobiegania jej ładowaniu. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta przy ustawianiu parametrów takich jak ciśnienie gazu roboczego (w niniejszym protokole ciśnienie gazu wynosi 0,5 × 10-1 mm Hg), czas napylania (220 s), grubość warstwy złota (~120 Å), natężenie prądu (50 mA) oraz napięcie zasilania. Proces napylania zazwyczaj przebiega według wspólnego schematu, choć urządzenia różnych producentów mogą działać nieco inaczej.

  1. Otwórz zawiasowe ramię uchwytu i umieść stuby na stole preparatowym.
  2. Zamknij ruchome ramię uchwytu próbki i sprawdź, czy osłona przeciwodłamkowa szklanej komory próżniowej jest prawidłowo osadzona.
  3. Otwórz zawór butli z argonem i włącz główny przełącznik zasilania.
  4. Obserwuj wzrost próżni na wyświetlaczu urządzenia, aż osiągnie ona wartość 0,5 × 10-1 oznaczenie mm Hg na wyświetlaczu; następnie aktywuj PłukaniePowtórz operację 5 razy.
  5. Włącz system cyrkulacji wody, aktywuj wybraną opcję HV włączonei otwórz pokrywkę z folii złotej. Potwierdź, że plazma ma różowy kolor. Aby przeprowadzić ten protokół, ustaw czas rozpylania na 220 s przy napięciu 50 mA, co pozwoli na naniesienie warstwy złota o grubości ~120 Å (12 nm).
  6. HV włączone zostaje automatycznie wyłączone. Wyłączyć system cyrkulacji wody i zamknąć pokrywę z pozłocanej folii.
  7. Wyłącz główny przełącznik zasilania, umożliwiając dostanie się powietrza do komory próżniowej. W przypadku próbek ogrodowych i odpadów powtórz kroki 7.1–7.7 trzykrotnie.
    UWAGA: Jeśli obrazowanie nie odbędzie się bezpośrednio po przygotowaniu próbek, należy przechowywać uchwyty w szczelnym pojemniku wypełnionym warstwą żelu krzemionkowego, aby uniknąć rehydratacji próbek.

8. Obrazowanie

UWAGA: Należy przestrzegać instrukcji producenta dotyczących regulacji ustawień SEM, takich jak średnica przysłony obiektywu, napięcie robocze, ustawienie systemu wiązki elektronowej, osiowanie oraz stygmatory.

  1. Umieść krążki w uchwycie na próbki, notując pozycję każdej z nich.
    UWAGA: Podczas wkładania lub wyjmowania uchwytu na próbkę należy używać rękawiczek i dbać o maksymalną czystość uchwytu.
  2. Uruchom oprogramowanie operacyjne z pulpitu.
  3. Wybierz ustawienia instrumentu. Wizualizuj próbki z ogrodu za pomocą średnica apertury obiektywu z 30 µm (tj. w drugiej fazie), działając w wysoka próżnia, wykrywając sygnały z elektronów wtórnych (Sedymentacja), napięcie przyspieszające z 20 kV, odległość robocza z 15 – 20 mm, prąd sondy z 40.0 (w trybie wysokiego natężenia prądu), a powiększenie dostosowując do próbki.
  4. Postępując zgodnie z instrukcjami nawigacji, należy nacisnąć przycisk Odpowietrzanie ikonę i poczekaj na odbarczenie komory na próbkę. Pasek postępu wskazuje stan próżni.
  5. Po osiągnięciu ciśnienia atmosferycznego należy otworzyć komorę na próbkę i ostrożnie włożyć uchwyt na próbkę.
  6. Ostrożnie zamknij drzwi komory i naciśnij Ewakuacja ikona służąca do odpompowania powietrza z instrumentu, z możliwością śledzenia stanu próżni na pasku postępu. System nawigacji wyświetli pozycję przesuwanego stolika i przedstawi schemat uchwytu po zakończeniu ruchu. Naciśnij Kamera ikona służąca do wykonania zdjęcia uchwytu w widoku z góry, co ułatwi nawigację pomiędzy próbkami podczas obrazowania.
  7. Naciśnij Obserwacja ikona uruchomienia działa armatki elektronowej i oczekiwanie na uformowanie się obrazu. Użyj Ręczny interfejs użytkownika (sterowanie ręczne) w celu ręcznego przesunięcia osi Z na odpowiednią wysokość (w zależności od wysokości próbki i określonej odległości roboczej).
    UWAGA: Aby przedłużyć żywotność włókna wolframowego, należy wstrzymać Obserwacja funkcjonować w czasie, gdy nie odbywa się aktywne obrazowanie.
  8. Użyj opcji wyświetlonych na ekranie lub sterowania ręcznego, aby zmienić szybkość skanowania rastrowego i pozycja obrazuPrzesuń stolik, aby uzyskać dokładny podgląd próbki, wykorzystując RDC funkcja umożliwiająca skupienie się na konkretnych obszarach. Podczas obserwacji docelowej (lub interesującej) struktury należy dostosować powiększenie, ostrość, jasność, kontrast, i stygmatyzacja odpowiednio. Poprawna stygmatyzacja przy użyciu Ręczny interfejs użytkownika do przesuwania stolika w kierunkach X i Y.
    1. Dostosuj powiększenie w zakresie od 100x do 700x, aby zwizualizować ogólne aspekty hodowli (takie jak gęstość strzępek, podłoże i wzorce kolonizacji).
    2. Dostosuj powiększenie w zakresie od 700x do 1500x, aby zwizualizować przestrzenne wzorce mikrobioty.
    3. Dostosuj powiększenie w zakresie od 1 500x do 3 000x, aby zaobserwować oddziaływania fizyczne między mikrobiotą a biofilmem.
    4. Ustaw powiększenie w zakresie od 3 000x do 4 000x, aby skupić się na konkretnych skupiskach drobnoustrojów.
  9. Aby zapisać obraz, należy użyć Zamrażanie funkcja, kliknij w Zdjęcie ikona, a następnie ustaw ścieżkę do pliku. Standardowo należy przeanalizować co najmniej trzy fragmenty ogrodu, obrazując każdy z nich we wszystkich zakresach powiększeń wymienionych w kroku 8.8. Przynosi to co najmniej 12 obrazów na próbkę, choć większa liczba obrazów może pozwolić na bardziej szczegółowe opisy. Sugerujemy, że 15–25 obrazów na próbkę, obejmujących wszystkie powiększenia z kroku 8.8, zazwyczaj dostarcza precyzyjnych szczegółów niezbędnych do opisu próbki.
    UWAGA: Rasteryzacja i zapisywanie obrazu trwają kilka sekund, podczas których należy unikać jakichkolwiek wibracji stołu antywibracyjnego SEM.
  10. Po zakończeniu obrazowania naciśnij przycisk Otwór odpowietrzający opcja odpowietrzenia komory, śledząc status próżni na pasku postępu. Ostrożnie wyjmij uchwyt, delikatnie zamknij drzwiczki komory i naciśnij Ewakuacja aby opróżnić komorę z powietrza.
  11. Po zakończeniu ewakuacji wyjdź z oprogramowania operacyjnego.
  12. Dostosuj jasność i kontrast za pomocą edytora obrazów, aby poprawić wizualizację.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiliśmy uproszczony protokół wizualizacji składników próbek ogrodów i odpadów mrówek z rodzaju Atta, takich jak strzępki grzybni, substrat, mikrobiota oraz biofilmy. SEM pozwolił na lepsze zrozumienie sposobu, w jaki ogród i odpady kształtują strukturalne wzorce mikrobioty (Rysunek 3). W ogrodach mrówek z rodzaju *Attine*, strzępki grzybniowe są strukturami rozgałęzionymi, pokryваjącymi fragmenty powierzchni podłoża. Ponieważ strzępki grzybniowe wykazują dużą wrażliwość na odwodnienie i przerwanie, użytkownik może kierować się ich wyglądem przy ocenie efektów przygotowania próbek. Jak zaobserwowano również w poprzednich pracach32,33,45, strzępki wykazują postać rurkowatą; nienaruszone, rurkowate strzępki świadczą o prawidłowym przygotowaniu próbki (Rycina 3A i Rycina 4C). W przypadku strzępek w kształcie wstążki, takie spłaszczenie może być artefaktem zastosowanej techniki (Rycina 4C).

Powierzchnie podłoża roślinnego mogą być rozpoznawane po warstwach kutykuli i epidermy, a także po aparatach szparkowych i trichomach. Struktury te są bardziej rozpoznawalne, gdy podłoża nie zostały jeszcze skolonizowane przez strzępki grzybni i mikrobiotę (Rycina 3A oraz Rycina 4C). W przypadku skolonizowania podłoża, mikrobiota i/lub strzępki grzybni pokrywają jego powierzchnię w taki sposób, że poszczególne struktury roślinne nie są łatwo rozróżnialne (Rycina 3A). Mikrobiota może kolonizować albo strzępki grzybni, albo podłoże, przy czym każda z tych opcji wykazuje pozornie odmienną organizację przestrzenną. Na Rycini 3 schematycznie przedstawiono takie wzorce przestrzenne i obramowano je na odpowiednich obrazach SEM, na których zostały zidentyfikowane; może to ułatwić powiązanie wyników SEM z ich interpretacją.

Mikrobiota kolonizująca strzępki jest rzadziej obserwowana, a gdy występuje, składa się z komórek prątkowatych lub kokoidnych, występujących pojedynczo lub w małych grupach przytwierdzonych do powierzchni strzępki. Macierz egzopolisacharydowa (EPS) biofilmu, przypominająca strukturę „koronkowej tkaniny”, może być widoczna wokół strzępek w postaci małych skupisk (Rycina 3A). Znacznie częściej spotykana jest mikrobiota kolonizująca podłoże, występująca w ogrodach różnych gatunków mrówek z rodzaju attine. Wzorce kolonizacji wydają się być w pewnym stopniu zdefiniowane przez etapy rozkładu podłoża. Zatem podczas kolonizacji podłoży jeszcze niedegradowanych, mikrobiota może występować jako pojedyncze komórki lub gromadzić się w małych grupach. Mikrobiota może tworzyć warstwę na podłożu, gdy wykazuje ono mikroskopijne oznaki rozkładu (t.j. gdy warstwy kutykularne/epidermalne roślin oraz inne struktury roślinne nie są już rozróżnialne, a występują liczne bruzdy i wgłębienia).

W tych „matach mikrobiologicznych” morfologia komórek jest bardziej rozpoznawalna w przypadku braku macierzy EPS. W sytuacjach, gdy komórki mikrobiologiczne są zatopione w macierzy EPS, ich morfologia nie jest łatwo rozróżnialna. Ze względu na organizację przestrzenną scharakteryzowano biofilmy jako „rozprzestrzenione” lub „trójwymiarowe”. Gdy biofilm jest rozprzestrzeniony, komórki mikrobiologiczne i macierz EPS przerywanym sposobem pokrywają powierzchnię podłoża, tworząc płaską warstwę o grubości 1-3 komórek (Rysunek 3B). Gdy biofilm jest trójwymiarowy, komórki mikrobiologiczne i macierz EPS spiętrzają się, tworząc skupiska o grubości wielu komórek. Obszary ogrodowe składające się z zdegradowanych podłoży (takich jak stary ogród i odpady) chronią mikrobiotę w swoich bruzdach i wgłębieniach, gdzie tworzy ona grube społeczności (Rysunek 3C). W szczególności silnie zdegradowane podłoża w próbkach odpadów goszczą obfitą mikrobiotę, która jest najbardziej zróżnicowana morfologicznie spośród wszystkich regionów. Drożdże zwiększają złożoność tej społeczności, wchodząc w fizyczne interakcje z prokariotami poprzez biofilm. W próbkach odpadów Atta sexdens i Acromyrmex sp. zaobserwowano macierze EPS tworzące wyraźną sieć włókien otaczającą pałeczkowate i kokoidalne prokarioty, a także wrzecionowate i sferyczne drożdże (Rysunek 3C).

Ze względu na splątaną sieć strzępek, gąbczasta struktura ogrodu wymaga dodatkowego napylania, aby bardziej równomiernie pokryć próbkę. Takie kroki pozwalają uniknąć rozpraszania elektronów, które zniekształca obraz i pogarsza jego rozdzielczość (Rysunek 4A). Etapy przygotowania próbek pozwoliły zachować większość struktury ogrodu, ujawniając rozkład przestrzenny i organizację mikrobioty. Warto jednak powtórzyć, że struktury takie jak strzępki grzybów i macierz EPS są bardzo wrażliwe na odwodnienie i bardzo trudne do zachowania, zwłaszcza w przypadku SEM. Struktura strzępek została zachowana stosunkowo dobrze, jednak można przyjąć, że biofilm wizualizowany w niektórych próbkach ogrodu mógł być pozbawiony niektórych komponentów strukturalnych macierzy EPS. Chociaż w niektórych próbkach zachowała się gładka, zewnętrzna warstwa polisacharydów otaczająca mikrobiotę (Rysunek 3A, B), w innych zachowano cechy morfologiczne mikrobioty, ale nie było macierzy EPS. Nie jest jednak jasne, czy macierz EPS rzeczywiście była nieobecna, czy została usunięta podczas przygotowania próbki.

Z jednej strony usunięcie gładkiej warstwy biofilmu utrudnia zrozumienie jego dokładnej struktury. Z drugiej strony pozwala ono na ujawnienie morfologii, organizacji przestrzennej i oddziaływań fizycznych komórek bytujących pod tą warstwą, co stanowi główny cel naszych badań. Wcześniejsze prace zgłaszały zachowanie zarówno strzępek grzybowych, jak i macierzy biofilmu dzięki zastosowaniu oparów czterotlenku osmu (OsO4) jako głównego utrwalacza44,50,51,52,53,54. Przeprowadziliśmy zatem eksperyment porównawczy, utrwalając świeże próbki ogrodów za pomocą oparów OsO4 , co najwyraźniej zachowało gładki aspekt biofilmów (Rycina 4B). Metoda ta spowodowała jednak znaczne spłaszczenie strzępek i mikrobioty. Spłaszczenie to doprowadziło do utraty ogólnych aspektów przestrzennych ogrodów opisanych wcześniej29,33,32,45, co ograniczyło dalsze badania nad wzorcami strukturalnymi ogrodów. Utrwalanie za pomocą OsO4  utrudniło zarówno rozróżnienie morfologii i rozmieszczenia drobnoustrojów, jak i odróżnienie struktur komórkowych od artefaktów technicznych, co skomplikowało interpretację danych.

Kolonizacja strzępek, rozprzestrzenianie się na podłożu, trójwymiarowe klastry na podłożu; SEM, strzępki grzybni, macierz EPS biofilmu.
Rycina 3: Wzorce architektoniczne mikrobioty. Mikrobiota kolonizuje albo strzępki grzybni, albo podłoże w odrębnej organizacji przestrzennej. Takie wzorce przestrzenne przedstawiono schematycznie i obramowano na odpowiadających im obrazach SEM, na których zostały zidentyfikowane (oznaczone na rycinie białymi kwadratami): (A) mikrobiota kolonizująca strzępki składa się z pojedynczych komórek lub małych grup komórek, przy czym w niektórych próbkach wykrywalna jest egzosakarydowa macierz biofilmu. (B) mikrobiota kolonizująca podłoże rozprzestrzenia się w całym podłożu, a macierz EPS pokrywa komórki w taki sposób, że ich morfologia nie jest łatwo rozróżnialna. (C) mikrobiota kolonizująca podłoże tworząca trójwymiarowe grupy, stanowiące biofilmy mono- lub multi-morfologiczne, w niektórych przypadkach z widoczną macierzą EPS. Ilustracje: Mariana Barcoto. Skrót: EPS = macierz egzosakarydowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy SEM z rozproszeniem elektronów; tekstura biofilmu w porównaniu utrwalaczy. Analiza struktury strzępek.
Rysunek 4: Obrazowanie nieefektywne. Obrazy niskiej jakości dające nieskuteczne wyniki i/lub utrudniające interpretację wzorców architektonicznych. (A) Rozproszenie elektronów zniekształca obraz, pogarszając jego rozdzielczość i w konsekwencji utrudniając identyfikację morfologii. Zjawisko to często obserwowano w próbkach napylonych tylko raz; zostało ono zredukowane poprzez dodatkowe napylanie. (B) Utrwalanie świeżych próbek ogrodowych za pomocą parą tetratlenku osmu (OsO4) jako głównego utrwalacza44,50,51,52,53,54 najwyraźniej zachowało gładki aspekt biofilmów. Jednakże spowodowało to rozległe spłaszczenie strzępek i mikrobioty, niszcząc architektoniczne wzorce ogrodowe. (C) Przygotowanie próbek z użyciem utrwalacza Karnovskiego pozwoliło uzyskać obrazy wyższej jakości w porównaniu z preparatami z użyciem OsO4, zachowując większość struktury strzępek, rozmieszczenie mikrobioty oraz przestrzenne wzorce ogrodów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

SEM wykorzystuje wiązkę elektronów do skanowania próbki, generując jej powiększony obraz, dzięki czemu można wizualizować trójwymiarowe mikrostruktury w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ SEM działa w warunkach wysokiej próżni, wymagane jest usunięcie do/więcej niż 99% wody z próbek. Wewnątrz komory próżniowej SEM częściowo uwodnione próbki mogą ulec odwodnieniu i zapadnięciu się, oprócz rozpraszania elektronów. W przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości w SEM przygotowanie próbki powinno obejmować procedury usuwania wody przy jednoczesnym utrzymaniu zmian objętości i morfologii na minimalnym poziomie, a także powlekanie zapobiegające ładowaniu podczas obrazowania 55,56,57.

Po pierwsze, próbka jest chemicznie utrwalana poprzez sieciowanie jej białek i kwasów nukleinowych, co uzyskuje się za pomocą różnych technik. Szeroko stosowana metoda polega na połączeniu aldehydu glutarowego i formaldehydu (lub paraformaldehydu) w buforze, takim jak piperazyno-1,4-bis [kwas 2-etanosulfonowy] (PIPES); Kwas N-[2-hydroksyetylo]-piperazyno-N′-2-etanosulfonowy (HEPES); sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS); lub kakodylan sodu. Utrwalenie chemiczne wzmacnia próbkę, zachowując jej strukturę do wysuszenia. W zależności od ich charakteru, próbki mogą wymagać wtórnego utrwalenia (w tetratlenku osmu), a nawet trzeciorzędowego (w octanie uranylu). Po drugie, próbki muszą być odwodnione. Ponieważ suszenie powietrzem powoduje rozległe zapadanie się drobnych struktur, powszechną alternatywną techniką jest suszenie w punkcie krytycznym (CPD). W CPD próbka nie jest poddawana napięciu powierzchniowemu, co zapobiega tworzeniu się artefaktów. Z jednej strony woda osiąga punkt krytyczny przy ciśnieniu 228,5 bara i temperaturze 374 °C, co łatwo zniszczyłoby próbkę. Z drugiej strony punkt krytyczny CO2 wynosi 73,8 bara i 31 °C, co uzasadnia jego stosowanie jako płynu przejściowego. Przy zwiększaniu temperatury CO2 przekształca się w postać gazową i usuwa z próbki 58,59,60,61,62,63. Po trzecie, próbki nieprzewodzące powinny być powlekane, aby zapobiec ich ładowaniu i zwiększyć uzysk elektronów wtórnych, co w konsekwencji przyczynia się do uzyskania ostrych sygnałów obrazu64.

Przedstawiony tutaj protokół łączy procedury konserwacji próbekgrzybów 32,33,45,65,66,67,68 i biofilmów 69,70, upraszczając jednak proces poprzez usunięcie etapów postfiksacji i skrócenie czasu odwadniania. Udało się jednak zachować delikatną strukturę ogrodu, szczegółowo opisując fizyczne interakcje mikrobioty i odsłaniając strukturę przestrzenną biofilmu. Przestrzenne gromadzenie mikrobioty ma zasadnicze znaczenie zarówno dla ustanawiania interakcji, jak i wyznaczania ich wzorców regulacyjnych. Dystrybucja przestrzenna kształtuje dynamikę społeczną drobnoustrojów, z której mogą wyłonić się wewnętrzne właściwości. Są one niezbędne, aby poradzić sobie ze zmiennością i złożonością, z jakimi borykają się ekosystemy mikrobiologiczne 71,72,73. Nasze odkrycia wzmacniają mikrobiotę integrującą wzorce strukturalne ogrodu, wspierając jej przypuszczalny udział w reakcjach fizjologicznych 32,42,43,44. Dostarczyliśmy dowodów in situ, że biofilmy są istotne dla interakcji mikrobiologicznych w kulturze grzybów attynowych42,44. Biofilmy to złożone i niejednorodne systemy wielokomórkowe, w których mikroorganizmy osadzone w samowydzielającej się matrycy EPS tworzą sieci społeczne. Kooperatywnie i/lub antagonistycznie, interakcje w obrębie biofilmu determinują otwieranie, zajmowanie i modyfikację nisz 71,72,73,74. Projekt SEM umożliwił lepsze zrozumienie organizacji przestrzennej mikrobioty w różnych regionach ogrodu, szczegółowo opisując fizyczne interakcje między mikrobiotą a substratem oraz mikrobiotą i strzępkami, a jednocześnie uprościł metody przyszłych badań w tej dziedzinie.

Badania nad mikrobiotą ogrodową cieszą się coraz większym zainteresowaniem, koncentrując się w szczególności na procesach, które mogą kształtować skład tych wyjątkowych zbiorowisk75,76, a także ich funkcję i interakcje 42,43,44. Interakcje między roślinami bakteryjnymi i grzybowymi mogą pomóc grzybowi w rozpuszczaniu fosforanów, wytwarzaniu sideroforów oraz degradacji celulozy i chityny. Takie interakcje, które mogą zachodzić jako kontinuum wzajemności-antagonizmu, mogą regulować funkcjonowanie ogrodu44. Podejście metodologiczne, które tu prezentujemy, pozwala na spojrzenie in situ na wymiar strukturalny, w którym mogą zachodzić interakcje. Podkreślono w nim, że podobnie jak większość przebadanych już ekosystemów mikrobiologicznych, ogrody attynowe są wzorzyste, niejednorodnie zorganizowane w przestrzeni 5,7,8. Projekt SEM zapewnił już perspektywę przestrzenną in situ dotyczącą dynamiki mikrobioty w różnych społecznościach związanych z gospodarzami, takich jak sinice77, skóra humbaka78, grzyby66, parzydełka79, ludzkie jelita80, porosty81, przyczyniając się również do opisu plastisfery (nowego ekosystemu wywodzącego się antropogenicznie)82. W każdym z tych badań stosowano jednak nieco odrębną metodę etapowego przygotowania próbki.

Próbki ogrodowe są bardzo delikatne i niejednorodne, z strzępkami grzybów uważanymi za przystosowane do tego, aby nie tracić wody26, oprócz zróżnicowanego zestawu wbudowanych substratów24, mikrobioty i jej biofilmu. Jednak dostosowany przez nas protokół przygotowania próbki zachował większość takich struktur i pozwolił nam rozszerzyć charakterystykę struktury przestrzennej mikrobioty. Uważamy, że fiksacja na rozwiązaniu Karnovsky'ego jest krytycznym krokiem w protokole, ponieważ trójwymiarowy aspekt tak delikatnej próbki może się w tym momencie zapaść i/lub spłaszczyć. Złożone próbki na bazie grzybów są zwykle przygotowywane do SEM przez utrwalenie aldehydem glutarowym i utrwalenie za pomocą OsO4 65,66,67,68. Doniesiono jednak, że połączenie aldehydów (paraformaldehydu i aldehydu glutarowego) poprawia zachowanie biofilmu dla SEM69,70. Metody konserwacji biofilmów mogą również obejmować 0,15% błękitu alkijskiego lub 0,15% czerwieni rutenowej do początkowego utrwalacza Karnovsky'ego, a także 1% kwasu garbnikowego do 1% osmu do postfiksacji. Mocowanie ogrodów i odpadów za pomocą Karnovsky'ego i postfixingu za pomocą OsO4 zakonserwowało bakterie w starych próbkach ogrodowych i odpadowych, choć nie wykazało biofilmu32. Ponieważ w naszych próbkach struktura ogrodu, mikrobiota i biofilmy zostały zachowane bez etapu postfiksacji osmu zastosowanego w poprzednich protokołach 32,33,69,70, woleliśmy uprościć protokół, usuwając ten krok. OsO4 jest utleniaczem stosowanym do utrwalania (zwłaszcza) lipidowych składników komórek83. Ponieważ jest silnie, OsO4 może powodować poważne oparzenia w kontakcie ze skórą i błonami śluzowymi, a także uszkadzać drogi oddechowe lub pokarmowe w przypadku wdychania lub spożycia84,85. Usuwając OsO4 po fiksacji, protokół konsekwentnie zmniejsza liczbę toksycznych regentów, którymi można manipulować.

Sugerujemy również serię mycia etanolem zamiast acetonu, który może być zbyt ostry dla delikatnych próbek86. Seria mycia etanolem z 10-minutowymi krokami upraszcza również poprzednie protokoły SEM45 bez ograniczania rozdzielczości obrazu. Poza tym empirycznie zweryfikowaliśmy, że dodatkowe etapy rozpylania renderowały obrazy o wyższej jakości, co było spójne dla próbek ogrodowych wszystkich badanych przez nas gatunków. Takie dodatkowe etapy prawdopodobnie pokrywały próbki bardziej równomiernie, ponieważ rozpraszanie elektronów było znacznie częstsze w próbkach pokrytych tylko raz (ryc. 4A). W związku z tym zachęcamy do przyszłych prac nad testowaniem dodatków i warunków, które mogłyby zapewnić ulepszony protokół wizualizacji biofilmu w próbkach ogrodowych.

SEM to potężne narzędzie do szczegółowego określania morfologii komórkowej mikrobioty i rozmieszczenia przestrzennego EPS na powierzchniach, ujawniając topografię i teksturę próbek ogrodowych w wysokiej rozdzielczości i powiększeniu 70,87. Nie zapewnia jednak dyskryminacji taksonomicznej członków społeczności, a co za tym idzie, nie mamy rozróżnienia, kto jest gdzie. Ponadto, pomimo dużej głębokości ogniskowej SEM, nie informuje on o trójwymiarowych cechach próbki. Aby uzyskać pełny opis ogrodu mikrobiologicznego attyny, w tym biogeografię taksonomiczną i trójwymiarową rozdzielczość przestrzenną, analizę SEM można uznać za pierwszą procedurę w technikach obrazowania krokowego próbek ogrodowych. W celu uzyskania rozdzielczości taksonomicznej, SEM można połączyć z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH)88,89 i jej wariantami, takimi jak FISH o wysokiej rozdzielczości filogenetycznej (HiPR-FISH)90, znakowanie kombinatoryczne i obrazowanie spektralne FISH (CLASI-FISH)9,91 oraz projekcje 3D92. Trójwymiarowa analiza mikrostruktury może być bardziej szczegółowo opisana za pomocą mikrotomografii rentgenowskiej (X-ray μCT)93. Do tej pory SEM umożliwił nam szczegółową obserwację organizacji przestrzennej mikrobioty wokół strzępek oraz na powierzchni podłoża, bruzd i wgłębień. Takie wzorce mikrobiologiczne budują naszą wiedzę na temat przypuszczalnych interakcji mikrobiologicznych w ogrodach attyńskich. Wierzymy, że przedstawione przez nas etapy przygotowawcze mogą być szeroko stosowane do udoskonalenia badań nad mikrobiologiczną organizacją przestrzenną w innych delikatnych ekosystemach mikrobiologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) za wsparcie finansowe (Grant #2019/03746-0). MOB dziękuje za stypendium doktoranckie otrzymane od FAPESP (proces 2021/08013-0) i Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (CAPES) - Kod finansowy 001. AR dziękuje również Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) za stypendium badawcze (#305269/2018). Autorzy chcieliby podziękować Marci Reginie de Moura Aouada i Antonio Teruyoshi Yabuki za pomoc w testach pilotażowych w celu przygotowania próbki, Renato Barbosa Salaroli za pomoc techniczną oraz Enzo Sorrentino za pomoc w sesji zdjęciowej. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach autoryzacji dostępu do dziedzictwa genetycznego #SISGen AA39A6D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 2 mlAxygenMCT-200-C-BRADo utrwalania i odwadniania próbek
Bezwodny chlorek wapniaMerckC4901CaCl2 bezwodny do przygotowania Karnovsky' s fixative
Suszarka do punktów krytycznychLeicaEM CPD 300Do suszenia w punkcie krytycznym
Dwustronna taśma przewodząca z włókna węglowego, 12 mm (W) X 5 m (L)Mikroskopia elektronowaSciences 77819-12Do montażu próbek
Kleszcze entomologiczneBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Alkohol etylowy (=etanol), czysty (≥ 99,5%)Sigma-Aldrich459836Do odwodnienia
KleszczeBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Szklana zlewkaBrak konkretnego dostawcyDo odwodnienia
Szklana szalka PetriegoBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami ogrodowymi
Pipeta szklanaBrak konkretnego dostawcyDo utrwalania i odwadniania próbek
Aldehyd glutarowy (wodny aldehyd glutarowy klasy EM 25%)Nauki o mikroskopii elektronowej16220Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz
Złoty cel Ted Pella, Inc.8071Do napylania powłoki złotem
Kwas solnySigma-Aldrich 320331Do regulacji roztworów pH
Edytor obrazówPhotoshopdowolna wersjaAby dostosować obrazy
Paraformaldehyd (paraformaldehyd 20% roztwór wodny klasy EM)Mikroskopia elektronowa Nauki15713Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz
Odbiorca propilenuBrak konkretnego dostawcyDo utrzymania żywych kolonii mrówek
Skaningowy mikroskop elektronowyJEOL IT300 SEMDo obrazowania próbek 
Kakodylan sodu trójwodnySigma-AldrichC0250Do przygotowania buforu kakodylanu sodu
SzpatułkaBrak konkretnego dostawcyDo manipulowania próbkami
ogrodowymi Pojemniki na próbki o średnicy 15 mm x wysokości 10 mmTed Pella, Inc.4591Do suszenia w punkcie krytycznym
Powlekarka napylającaBaltec SCD 050Do pokrycia złotym
Króćcem (mocowanie aluminiowe, kołek płaski) 12,7 mm x 8 mm Mikroskopia elektronowaSciences 75520Do mocowania próbek

Bibliografia

  1. Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
  2. Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
  3. Schmitz, O. J. Spatial dynamics and ecosystem functioning. PLOS Biol. 8 (5), e1000378(2010).
  4. Pringle, R. M., Doak, D. F., Brody, A. K., Jocqué, R., Palmer, T. M. Spatial pattern enhances ecosystem functioning in an African savanna. PLOS Biol. 8 (5), e1000377(2010).
  5. Wimpenny, J. W. Spatial order in microbial ecosystems. Biol Rev. 56 (3), 295-342 (1981).
  6. Martiny, J. B. H., et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev. Microbiol. 4 (2), 102-112 (2006).
  7. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nat Rev Microbiol. 22 (2), 105-118 (2024).
  8. Lamont, R. J., Hajishengallis, G., Koo, H. Social networking at the microbiome-host interface. Infec Immun. 91 (9), e00124-e00223 (2023).
  9. Welch, J. L. M., Rossetti, B. J., Rieken, C. W., Dewhirst, F. E., Borisy, G. G. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (6), E791-E800 (2016).
  10. Kim, D., et al. Spatial mapping of polymicrobial communities reveals a precise biogeography associated with human dental caries. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (22), 12375-12386 (2020).
  11. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  12. Ibberson, C. B., Barraza, J. P., Holmes, A. L., Cao, P., Whiteley, M. Precise spatial structure impacts antimicrobial susceptibility of S. aureus in polymicrobial wound infections. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (51), e2212340119(2022).
  13. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  14. Dejea, C. M., et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (51), 18321-18326 (2014).
  15. Hanson, C. A., Fuhrman, J. A., Horner-Devine, M. C., Martiny, J. B. Beyond biogeographic patterns: processes shaping the microbial landscape. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 497-506 (2012).
  16. Adade, E. E., Al Lakhen, K., Lemus, A. A., Valm, A. M. Recent progress in analyzing the spatial structure of the human microbiome: Distinguishing biogeography and architecture in the oral and gut communities. Curr Opin Endocr. 18, 275-283 (2021).
  17. Mony, C., Bohannan, B. J., Leibold, M. A., Peay, K., Vandenkoornhuyse, P. Microbial landscape ecology: Highlights on the invisible corridors. Front Ecol Evol. 9, 753213(2021).
  18. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  19. Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R., Mueller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. 266 (5191), 1691-1694 (1994).
  20. Mueller, U. G., Rehner, S. A., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in ants. Science. 281 (5385), 2034-2038 (1998).
  21. Mueller, U. G., Gerardo, N. M., Aanen, D. K., Six, D. L., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36, 563-595 (2005).
  22. Dentinger, B. T., Lodge, D. J., Munkacsi, A. B., Desjardin, D. E., McLaughlin, D. J. Phylogenetic placement of an unusual coral mushroom challenges the classic hypothesis of strict coevolution in the Apterostigma pilosum group ant-fungus mutualism. Evolution. 63 (8), 2172-2178 (2009).
  23. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 5435-5440 (2008).
  24. de Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J. Forage collection, substrate preparation, and diet composition in fungus-growing ants. Ecol Entomol. 35 (3), 259-269 (2010).
  25. Martin, M. M. The biochemical basis of the fungus-attine ant symbiosis: A complex symbiosis is based upon integration of the carbon and nitrogen metabolisms of the two organisms. Science. 169 (3940), 16-20 (1970).
  26. Grell, M. N., et al. The fungal symbiont of Acromyrmex leaf-cutting ants expresses the full spectrum of genes to degrade cellulose and other plant cell wall polysaccharides. BMC Genomics. 14, 928(2013).
  27. Lange, L., Grell, M. N. The prominent role of fungi and fungal enzymes in the ant-fungus biomass conversion symbiosis. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 4839-4851 (2014).
  28. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6 (4), 389-395 (2014).
  29. Craven, S. E., Dix, M. W., Michaels, G. E. Attine fungus gardens contain yeasts. Science. 169 (3941), 184-186 (1970).
  30. De Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J., Tunlid, A. Symbiotic adaptations in the fungal cultivar of leaf-cutting ants. Nat Commun. 5 (1), 5675(2014).
  31. Aylward, F. O., et al. Enrichment and broad representation of plant biomass-degrading enzymes in the specialized hyphal swellings of Leucoagaricus gongylophorus, the fungal symbiont of leaf-cutter ants. PLoS One. 10 (8), e0134752(2015).
  32. Moreira-Soto, R. D., Sanchez, E., Currie, C. R., Pinto-Tomás, A. A. Ultrastructural and microbial analyses of cellulose degradation in leaf-cutter ant colonies. Microbiology. 163 (11), 1578-1589 (2017).
  33. Erthal Jr, M., Silva, C. P., Cooper, R. M., Samuels, R. I. Hydrolytic enzymes of leaf-cutting ant fungi. Comp Biochem. 152 (1), 54-59 (2009).
  34. North, R. D., Jackson, C. W., Howse, P. E. Communication between the fungus garden and workers of the leaf-cutting ant, Atta sexdens rubropilosa, regarding choice of substrate for the fungus. Physiol Entomol. 24 (2), 127-133 (1999).
  35. Herz, H., Hölldobler, B., Roces, F. Delayed rejection in a leaf-cutting ant after foraging on plants unsuitable for the symbiotic fungus. Behav Ecol. 19 (3), 575-582 (2008).
  36. Schiøtt, M., De Fine Licht, H. H., Lange, L., Boomsma, J. J. Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 40(2008).
  37. Bot, A. N., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethol Ecol Evol. 13 (3), 225-237 (2001).
  38. Scott, J. J., et al. Microbial community structure of leaf-cutter ant fungus gardens and refuse dumps. PLOS One. 5 (3), e9922(2010).
  39. Lewin, G. R., et al. Cellulose-enriched microbial communities from leaf-cutter ant (Atta colombica) refuse dumps vary in taxonomic composition and degradation ability. PLOS One. 11 (3), e0151840(2016).
  40. Suen, G., et al. An insect herbivore microbiome with high plant biomass-degrading capacity. PLOS Genet. 6 (9), e1001129(2010).
  41. Aylward, F. O., et al. Convergent bacterial microbiotas in the fungal agricultural systems of insects. MBio. 5 (6), e02077(2014).
  42. Barcoto, M. O., et al. Fungus-growing insects host a distinctive microbiota apparently adapted to the fungiculture environment. Sci Rep. 10 (1), 12384(2020).
  43. Francoeur, C. B., et al. Bacteria contribute to plant secondary compound degradation in a generalist herbivore system. mBio. 11, e02146-e02220 (2020).
  44. Martiarena, M. J. S., Deveau, A., Montoya, Q. V., Flórez, L. V., Rodrigues, A. The hyphosphere of leaf-cutting ant cultivars is enriched with helper bacteria. Microb Ecol. 86 (3), 1773-1788 (2023).
  45. Leal-Dutra, C. A., et al. Evidence that the domesticated fungus Leucoagaricus gongylophorus recycles its cytoplasmic contents as nutritional rewards to feed its leafcutter ant farmers. IMA Fungus. 14 (1), 19(2023).
  46. Sosa-Calvo, J., Jesovnik, A., Okonski, E., Schultz, T. R. Locating, collecting, and maintaining colonies of fungus-farming ants (Hymenoptera: Myrmicinae: Attini). Sociobiology. 62 (2), 300-320 (2015).
  47. Karnovsky, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-138 (1965).
  48. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Myers, R. B., Grizzle, W. E. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24 (3), 173-190 (2001).
  49. Gusnard, D., Kirschner, R. H. Cell and organelle shrinkage during preparation for scanning electron microscopy: effects of fixation, dehydration and critical point drying. J Microsc. 110 (1), 51-57 (1977).
  50. Surman, S. B., et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms. J Microbiol Methods. 25 (1), 57-70 (1996).
  51. Augustin, J. O., et al. Yet more "weeds" in the garden: fungal novelties from nests of leaf-cutting ants. PLOS One. 8 (12), e82265(2013).
  52. Montoya, Q. V., Martiarena, M. J. S., Polezel, D. A., Rodrigues, A. More pieces to a huge puzzle: Two new Escovopsis species from fungus gardens of attine ants. MycoKeys. 46, 97(2019).
  53. Varanda-Haifig, S. S., et al. Nature of the interactions between hypocrealean fungi and the mutualistic fungus of leaf-cutter ants. Antonie van Leeuwenhoek. 110, 593-605 (2017).
  54. Custodio, B. C., Rodrigues, A. Escovopsis kreiselii specialization to its native hosts in the fungiculture of the lower attine ant Mycetophylax morschi. Antonie van Leeuwenhoek. 112, 305-317 (2019).
  55. Schröttner, H., Schmied, M., Scherer, S. Comparison of 3D surface reconstruction data from certified depth standards obtained by SEM and an Infinite Focus Measurement Machine (IFM). Microchim Acta. 155, 279-284 (2006).
  56. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of scanning electron microscopy (SEM). Scanning microscopy for nanotechnology: Techniques and applications. Zhou, W., Wang, Z. L. , Springer. New York, NY. 1-40 (2007).
  57. Kannan, M. Scanning electron microscopy: Principle, components and applications. A Textbook on Fundamentals and Applications of Nanotechnology. Raja, K., Subramanian, K. S., Kannan, M. , Daya Publishing House. 81-92 (2018).
  58. Ruffolo, J. J. Jr Critical point drying of protozoan cells and other biological specimens for scanning electron microscopy: apparatus and methods of specimen preparation. Trans Am Microsc. 93 (1), 124-131 (1974).
  59. Echlin, P. Recent advances in specimen coating techniques for electron microscopy. Scanning Electron Microscopy 1981/1. , IITRI. Chicago. 79-90 (1981).
  60. Ris, H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded sections. J Cell Biol. 100 (5), 1474-1487 (1985).
  61. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical-point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech. 26 (6), 489-495 (1993).
  62. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J. 38 (11), 775-788 (2005).
  63. Kirk, S. E., Skepper, J. N., Donald, A. M. Application of environmental scanning electron microscopy to determine biological surface structure. J Microsc. 233 (2), 205-224 (2009).
  64. Kemmenoe, B. H., Bullock, G. R. Structure analysis of sputter-coated and ion-beam sputter-coated films: a comparative study. J Microsc. 132 (2), 153-163 (1983).
  65. Kinden, D. A., Brown, M. F. Technique for scanning electron microscopy of fungal structures within plant cells. Phytopathology. 65, 74-76 (1975).
  66. Masaphy, S., Levanon, D., Tchelet, R., Henis, Y. Scanning electron microscope studies of interactions between Agaricus bisporus (Lang) Sing hyphae and bacteria in casing soil. Appl Environ Microbiol. 53 (5), 1132-1137 (1987).
  67. Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Scanning electron microscopy of ectomycorrhizae potential and limitations. Scanning Microsc. 1 (3), 58(1987).
  68. Visen, A., Singh, P. N., Chakraborty, B., Singh, A., Bisht, T. S. Scanning electron microscopy indicates Pseudomonad strains facilitate AMF mycorrhization in litchi (Litchi chinensis Sonn.) air-layers and improving survivability, growth and leaf nutrient status. Curr Res Microb Sci. 2, 100063(2021).
  69. Fleeman, R. M., Mikesh, M., Davies, B. W. Investigating Klebsiella pneumoniae biofilm preservation for scanning electron microscopy. Access Microbiol. 5 (2), 000470-000473 (2023).
  70. Wells, M., Mikesh, M., Gordon, V. Structure-preserving fixation allows scanning electron microscopy to reveal biofilm microstructure and interactions with immune cells. J Microsc. 293 (1), 59-68 (2024).
  71. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  72. Madsen, J. S., et al. Coexistence facilitates interspecific biofilm formation in complex microbial communities. Environ Microbiol. 18 (8), 2565-2574 (2016).
  73. Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burmølle, M. Bacterial social interactions and the emergence of community-intrinsic properties. Curr Opin Microbiol. 42, 104-109 (2018).
  74. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 247-260 (2019).
  75. Bringhurst, B., Allert, M., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Environments and hosts structure the bacterial microbiomes of fungus-gardening ants and their symbiotic fungus gardens. Microb Ecol. 86 (2), 1374-1392 (2023).
  76. Bringhurst, B., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Symbiosis, dysbiosis and the impact of horizontal exchange on bacterial microbiomes in higher fungus-gardening ants. Sci Rep. 14 (1), 3231(2024).
  77. Vargas, S., et al. Body-plan reorganization in a sponge correlates with microbiome change. Mol Biol Evol. 40 (6), msad138(2023).
  78. Apprill, A., et al. Humpback whale populations share a core skin bacterial community: towards a health index for marine mammals. PLOS One. 9 (3), e90785(2014).
  79. Fraune, S., et al. Bacteria-bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance. ISME J. 9 (7), 1543-1556 (2015).
  80. Gowen, R., Gamal, A., Di Martino, L., McCormick, T. S., Ghannoum, M. A. Modulating the microbiome for Crohn's disease treatment. Gastroenterology. 164 (5), 828-840 (2023).
  81. Moya, P., et al. Molecular phylogeny and ultrastructure of the lichen microalga Asterochloris mediterranea sp. nov. from Mediterranean and Canary Islands ecosystems. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (6), 1838-1854 (2015).
  82. Zettler, E. R., Mincer, T. J., Amaral-Zettler, L. A. Life in the "plastisphere": microbial communities on plastic marine debris. Environ Sci Technol. 47 (13), 7137-7146 (2013).
  83. Porter, K. R., Kallman, F. The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy. Exp Cell Res. 4 (1), 127-141 (1953).
  84. Ligon, J. J., Abraham, J. L., Boyd, A. S. Traumatic osmium tetroxide inoculation. J Am Acad Dermatol. 45 (6), 949-952 (2001).
  85. Friedova, N., et al. Osmium absorption after osmium tetroxide skin and eye exposure. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 429-433 (2020).
  86. Fratesi, S. E., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. J Sediment. 74 (6), 858-867 (2004).
  87. Dassanayake, R. P., et al. Identification of a reliable fixative solution to preserve the complex architecture of bacterial biofilms for scanning electron microscopy evaluation. PLOS One. 15 (5), e0233973(2020).
  88. Desiro, A., et al. Detection of a novel intracellular microbiome hosted in arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J. 8 (2), 257-270 (2014).
  89. Morales, D. P., et al. Advances and challenges in fluorescence in situ hybridization for visualizing fungal endobacteria. Front Microbiol. 13, 892227(2022).
  90. Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
  91. Valm, A. M., Welch, J. L. M., Borisy, G. G. CLASI-FISH: principles of combinatorial labeling and spectral imaging. Syst Appl Microbiol. 35 (8), 496-502 (2012).
  92. Fernandez-Brime, S., Muggia, L., Maier, S., Grube, M., Wedin, M. Bacterial communities in an optional lichen symbiosis are determined by substrate, not algal photobionts. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz012(2019).
  93. Schluter, S., Eickhorst, T., Mueller, C. W. Correlative imaging reveals holistic view of soil microenvironments. Environ Sci Technol. 53 (2), 829-837 (2018).
  94. Barcoto, M. O., Rodrigues, A. Lessons from insect fungiculture: from microbial ecology to plastics degradation. Front Microbiol. 13, 812143(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ogrody grzybówbiofilmy mikrobiologiczneorganizacja przestrzenna mikrobiotystrzępki grzybówstruktura biofilmuprzygotowanie próbeksuszenie w punkcie krytycznymnapylanie warstwy przewodzącej
Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.