Method Article

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

DOI:

10.3791/67340

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1The 2nd Dental Center, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Stomatology, Zhang Zhiyuan Academician Work Station, Hainan, Western Central Hospital, 3Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby modelować wady rozwojowe twarzoczaszki spowodowane niedoborem witaminy A (VAD), wyraziliśmy dominująco-ujemną mutację receptora retinoidowego w osteoblastach, aby specyficznie hamować aktywność transkrypcyjną RAR u myszy. Takie podejście pozwoliło nam zbadać wpływ VAD na hipomineralizację czaszki, deformację żuchwy i hipoplazję obojczyka w przypadkach klinicznych. W tym badaniu tomografia mikrokomputerowa (mikroCT) obszaru czaszkowo-szczękowo-twarzowego myszy stanowiła cenne narzędzie do badania wzrostu i rozwoju tego modelu zwierzęcego. Ręczne szacowanie obrazów jest zarówno czasochłonne, jak i niedokładne. Dlatego w tym miejscu przedstawiamy proste, wydajne i dokładne podejście do segmentacji i ilościowego oznaczania obrazów mikrotomografii komputerowej każdej kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej. Oprogramowanie MicroCT wykorzystano do przekrojenia żuchwy, kości czołowej, kości ciemieniowej, kości nosowej, kości przedszczękowej, szczęki, kości międzyciemieniowej i kości potylicznej myszy oraz zmierzenia ich odpowiedniej długości i szerokości. Ta metoda segmentacji może być stosowana do badania wzrostu i rozwoju w biologii rozwoju, biomedycynie i innych pokrewnych naukach oraz pozwala naukowcom analizować wpływ mutacji genetycznych na poszczególne kości twarzoczaszki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skomplikowany rozwój ludzkiej czaszki i twarzy obejmuje wyrafinowany proces morfogenetyczny 3D, misternie zarządzany przez liczne geny. Geny te odgrywają kluczową rolę w regulacji skomplikowanych wzorów, proliferacji i różnicowania tkanek pochodzących z różnych źródeł embrionalnych. Ten wysoce skoordynowany proces podkreśla złożoność wzrostu i rozwoju ludzkiej twarzoczaszki. Wady rozwojowe twarzoczaszki (w tym rozszczep wargi i podniebienia, zamykanie szwów czaszkowych i hipoplazja twarzy) występujące w wyniku nieprawidłowości rozwojowych stanowią ponad jedną trzecią wszystkich wrodzonych wad wrodzonych. Jako powszechnie stosowane zwierzę modelowe w badaniach biomedycznych, mysz ma złożoną i delikatną strukturę kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej, która jest bardzo podobna do ludzkiej kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej pod względem anatomii i fizjologii. Badania nad biologią rozwoju czaszkowo-szczękowo-twarzowego przeszły długą drogę w ostatnich latach wraz z pojawieniem się nowych technik w genetyce myszy, zwłaszcza w przypadku wad rozwojowych1.

Kwas retinowy (RA) jest in vivo metabolitem witaminy A2. Niedobór witaminy A (VAD) wiąże się z szeregiem poważnych zaburzeń wieloukładowych, takich jak słaba przebudowa kości, złamania, a także wady rozwojowe twarzoczaszki i wady rozwojowe układu kostnego charakteryzujące się karłowatością3,4 . Receptory retinoidowe (RAR) są kluczowymi czynnikami transkrypcyjnymi w sygnalizacji retinoidowej5. Zaprojektowano dominująco-ujemnego mutanta RARα403 (dnRARα) o nazwie6 i ustalono model myszy, w którym osteoblasty wyrażały dnRARα. Spowodowało to, że myszy wykazywały karłowatość, deformacje twarzoczaszki, niepełną budowę kości korowej i zwiększeną, ale słabo przebudowaną kość beleczkową.

Tomografia mikrokomputerowa (microCT) ma ogromny potencjał do badania wad rozwojowych czaszkowo-szczękowo-twarzowych. Posiada zdolność wykrywania i śledzenia ewolucji zarówno wrodzonych, jak i nabytych nieprawidłowości szkieletowych w modelach gryzoni. Analiza obrazowania mikrotomografią komputerową umożliwia dogłębną eksplorację zaburzeń wzrostu twarzoczaszki w genetycznie zmodyfikowanych modelach myszy7,8 . Co więcej, obrazowanie 3D jawi się jako istotne narzędzie do wyznaczania cech morfologicznych, ułatwiając dostosowane do potrzeb podejścia do analizy i wizualizacji9. Mikro-CT została wykorzystana w kilku badaniach do analizy fenotypów twarzoczaszki, w tym do definiowania anatomicznych punktów orientacyjnych u ludzi i myszy oraz analizy wolumetrycznej każdej kości twarzoczaszki10,11,12. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę opartą na technologii mikrotomografii komputerowej do separacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych myszy, aby umożliwić lepszą ocenę i analizę rozwoju szkieletu czaszkowo-szczękowo-twarzowego myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzegaliśmy wszystkich odpowiednich przepisów etycznych dotyczących testów i badań na zwierzętach. Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Doradczy ds. Opieki nad Zwierzętami i Badań Naukowych Szanghajskiego Dziewiątego Szpitala Ludowego, Szkoły Medycznej Uniwersytetu Jiaotong w Szanghaju.

Zarówno szczep Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26dn/dn), jak i szczep myszy Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361) używane tutaj były utrzymywane na tle C57BL/6. MyszyR26 dn/dn skrzyżowano z myszami OsxCre w celu wygenerowania OSXCre; MyszyR26 dn/dn. Wszystkie myszy były hodowane i utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).

1. Hodowla myszy

UWAGA: F oznacza liczbę pokoleń myszy; N oznacza liczbę pokoleń krycia między myszami zygotycznymi a myszami tła. Tak więc F2 + N reprezentuje drugie pokolenie, a także wszelkie kolejne programy hodowlane myszy. F0 oznacza myszy podstawowe.

  1. Połącz dojrzałego płciowo samca myszy z parą samic myszy w porównywalnym wieku. Rozpocznij codzienne kontrole nowonarodzonych szczeniąt po początkowym okresie 18 dni. Po zidentyfikowaniu ciężarnych samic należy je w razie potrzeby odizolować, aby zapewnić optymalną opiekę matki. W przypadku, gdy w ciągu miesiąca od początkowego parowania nie zaobserwuje się żadnych ciąż, rozważ naprzemienne umieszczanie samca myszy w różnych konfiguracjach hodowlanych, aby ułatwić zapłodnienie.
  2. Skrzyżowanie myszyR26 dn/dnz myszami OSXCre (F0). Przytnij ogony w celu genotypowania i zachowaj samca OSXCre; R26dn/+myszy w klatkach do osiągnięcia dojrzałości płciowej, czyli do ~6 tygodnia życia (F1).
  3. Krzyżówka: sześciotygodniowy samiec OSXCre; R26dn/+myszy z żeńskimi myszamiR26 dn/dn(F2). Przytnij ogony do genotypowania i zastąp stare myszy hodowlane młodszymi myszami z czasem (F2+N).

2. Przygotowanie

  1. Przygotuj cztery pary 4-tygodniowych OsxCre, OSXCre; R26dn/+ oraz OSXCre; MyszyR26 dn/dn. Indywidualnie poddaj myszy eutanazji poprzez podanie uduszenia dwutlenkiem węgla.
    UWAGA: Aby zapewnić skuteczną eutanazję, natężenie przepływu CO2 powinno być dostosowane tak, aby przemieszczało około 30% objętości klatki co minutę. Na przykład w klatce o wymiarach 45 cm x 30 cm x 30 cm zalecane jest natężenie przepływu 40 l/min.
  2. Przetnij szyję myszy nożyczkami, trzymając jej ciało, pozostawiając nienaruszoną czaszkę.
    UWAGA: Aby uzyskać kompletną czaszkę, otwórz usta myszy, przetnij wzdłuż kącika ust nożyczkami okulistycznymi, pociągnij obie ręce na obie strony i obróć, aby oderwać skórę głowy myszy.
  3. Zanurz czaszki myszy w 4% paraformaldehydzie na 48 godzin, a następnie przechowuj je w 70% etanolu.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.
  4. Skan pobranych czaszek za pomocą mikrotomografu komputerowego - rozdzielczość: 4,5 μm; napięcie: 70 kV; prąd: 114 μA; filtr: 0,5 mm Al; krok obrotu: 0,5°.
  5. Przechowuj obrazy tomografii komputerowej. Obrazy w formacie DICOM są wybierane do importu do oprogramowania i analizowane.

3. Obrazowanie mikrotomografią komputerową i rekonstrukcja 3D

UWAGA: Wszystkie kości użyte w tym badaniu zostały ręcznie podzielone na segmenty.

  1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na stronie MASKI i wybierz opcję Nowa maska; pojawi się nowa warstwa o nazwie Zielona.
  2. Wybierz zakres progowy 671-2 566 na stronie Progowanie, która zostanie wyświetlona. Powtórz ten proces dla wszystkich powiązanych warstw. (Rysunek 1A).
  3. Użyj narzędzia Gumka w menu Edycja, aby ręcznie wymazać kości przyczepione do żuchwy w każdej warstwie na płaszczyźnie strzałkowej 2D (Rysunek 1B).
  4. Wybierz obszar żuchwy na płaszczyźnie strzałkowej 2D po kliknięciu opcji Region Growing (Rysunek 1C).
    UWAGA: Upewnij się, że obszar żuchwy jest całkowicie zaznaczony w każdej warstwie; W przeciwnym razie spowoduje to niepełną żuchwę po rekonstrukcji.
  5. Kliknij na nowo utworzoną warstwę Żuchwa na stronie MASKI i wybierz Oblicz 3D z menu rozwijanego (Rysunek 1D).
  6. W interfejsie obiektów 3D kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Żuchwa, a następnie kliknij polecenie Właściwości. Kliknij, aby zmienić kolor. Oznacz kolorami wszystkie modele 3D zrekonstruowane z różnymi kośćmi.
  7. Kliknij Zmierz w lewym górnym rogu i wybierz odległość z wyświetlonego menu rozwijanego. Oblicz długość, zaznaczając punkty na obrazie 3D (Rysunek 1E).
    UWAGA: Punktem odniesienia do pomiaru szerokości kości jest najszersza część kości.
  8. W interfejsie obiektów 3D kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Żuchwa, a następnie kliknij polecenie Właściwości. Moduł Properties-Info-Volume do odczytu zrekonstruowanych wartości objętości dla każdego bloku kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej. (Rysunek 1F).
  9. Zmierz żuchwę, kość czołową, kość ciemieniową, kość nosową, kość przedszczękową, szczękę, kość międzyciemieniową i kość potyliczną w taki sam sposób jak powyżej i oznacz je indywidualnie różnymi kolorami.

4. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj analizę statystyczną przy użyciu wybranego oprogramowania. Wykonaj dwustronne testy t-Studenta (n = 4/grupa).
  2. W przypadku wszystkich wykresów należy użyć słupków błędów do przedstawienia odchyleń standardowych. Rozważ, że wartości P < 0,05 są statystycznie istotne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szeroko zakrojone badania podkreślają wieloaspektowy wpływ mutacji genetycznych na wzrost, rozwój i układy narządów myszy. Kompleksowa ocena kości twarzoczaszki u zmutowanych myszy wymaga metod wykraczających poza analizę pojedynczej tkanki lub obrazu 2D ze względu na ich ograniczenia. Dlatego wyjaśnienie rozwoju kości twarzoczaszki ma ogromne znaczenie dla badania zaburzeń twarzoczaszki u ludzi.

Ta metoda dostarcza użytecznego ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroCT to potężne narzędzie do uzyskiwania realistycznych i izotropowych informacji 3D z gęstych i nieprzezroczystych próbek biologicznych o rozdzielczości mikrometrowej. Dane uzyskane z mikrotomografii komputerowej są kalibrowane pod kątem geometrii i intensywności, co czyni ją szczególnie przydatną w badaniach ilościowych 13,14,15,16,17. Służy do badania mi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (824MS152).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oprogramowanie GraphPad Prism 6.01GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgia/
Osterix-Cre (OsxCre) //z Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα Szczep 403//z Uniwersytetu Columbia, USA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502(2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8(2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633(2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Craniomaxillofacial MalformationsMicrocomputed TomographyCraniofacial BonesMouse ModelBone SegmentationMandibular DeformityCranial HypomineralizationRAR MutationOsteoblastsSkeletal Defects

Related Articles