Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe i izolacja bakterii jelitowych rozszczepiających glikozydy C

944 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

28 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie ustanawia zestaw standardowych procedur operacyjnych (SOP) do skutecznego badania przesiewowego i izolowania bakterii jelitowych zdolnych do rozszczepiania C-glikozydów.

Streszczenie

C-glikozydy są powszechnie spotykane w roślinach leczniczych i wykazują dużą różnorodność strukturalną wraz z różnymi aktywnościami biologicznymi, w tym przeciwbakteryjnymi, przeciwzapalnymi, przeciwwirusowymi, przeciwutleniającymi i przeciwnowotworowymi. W glikozydach C anomeryczny węgiel ugrupowania cukrowego jest bezpośrednio połączony z aglikonem poprzez wiązanie węgiel-węgiel. W porównaniu z O-glikozydami, C-glikozydy są strukturalnie stabilne i odporne na kwasy i enzymy. W związku z tym są zazwyczaj niełamliwe, co skutkuje słabą wchłanialnością i niską biodostępnością. Co ciekawe, niektóre bakterie jelitowe mogą rozszczepiać wiązania glikozydowe C-C, zapewniając specyficzne i przyjazne dla środowiska biologiczne podejście do degradacji glikozydów C. W tym badaniu opracowano zestaw standardowych procedur operacyjnych (SOP) do badań przesiewowych bakterii jelitowych zdolnych do rozszczepiania wiązań glikozydowych C-C w oparciu o model biotransformacji związków naturalnych. Standardowe procedury operacyjne obejmują przygotowanie i wzbogacenie bakterii jelitowych, badania przesiewowe zorientowane na aktywność oraz walidację aktywności w pożywce o niskiej zawartości węgla. Metodologia ta stanowi podstawowe odniesienie dla naukowców dążących do wyizolowania i zbadania tych wyspecjalizowanych bakterii funkcjonalnych.

Wprowadzenie

C-glikozydy to grupa związków charakteryzujących się bezpośrednim powiązaniem grup glikozylowych z aglikonami poprzez wiązania C-C1. W naturze orientyna, witeksyna, pueraryna i ich pochodne są powszechnie identyfikowane jako C-glikozydy2. Związki te są często znajdowane w roślinach leczniczych, takich jak Trollius chinensis3 oraz u zwierząt, takich jak Styela plicata4. Badania wykazały, że związki te zapewniają korzyści zdrowotne i wykazują różne aktywności biologiczne, w tym przeciwbakteryjne5,6,7, przeciwzapalne8,9,10,11,12, antiviral3, 12,13, przeciwutleniacz14,15,16, oraz działania przeciwnowotworowe17.

Ze względu na powiązanie grup glikozylowych ze szkieletem poprzez wiązania C-C, związki te wykazują wysoką stabilność i odporność na hydrolizę kwasową i enzymatyczną18, co prowadzi do słabej nasiąkliwości i niskiej biodostępności19. Ograniczenie to wpływa na rozwój i wykorzystanie glikozydów C. Jednak leki zawierające glikozydy C, często podawane doustnie, są deglikozylowane przez specyficzne enzymy, wytwarzając silniejsze bioaktywne aglikony20,21,22,23. Podczas gdy własne enzymy gospodarza nie są w stanie deglikozydować glikozydów C, doniesiono, że bakterie jelitowe metabolizują niektóre typy. Na przykład niektóre bakterie jelitowe przekształcają mangiferynę w noratyriol, który wykazuje większą siłę działania jako środek przeciwcukrzycowy lub przeciwnowotworowy24. Pomimo tych odkryć, scharakteryzowano tylko ograniczoną liczbę bakterii zdolnych do rozszczepiania C-glikozydów, a mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają słabo poznane. Skuteczne i standaryzowane badania przesiewowe tych bakterii poprawią zrozumienie ich funkcji i przyspieszą rozwój glikozydów C.

Metoda przesiewowa została z czasem rozwinięta i udoskonalona do dojrzałego systemu. Podstawowe podejścia obejmują wzbogacanie, badania przesiewowe zorientowane na aktywność i walidację aktywności w niskoemisyjnych podłożach źródłowych. Metoda ta ułatwia izolację czystych szczepów docelowych, a także identyfikację gatunków, danych genomowych i cech docelowych mikroorganizmów. Za pomocą tego systemu można skutecznie przesiewać i izolować bakterie jelitowe zdolne do rozszczepiania glikozydów C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przeprowadzone eksperymenty przestrzegały lokalnych, krajowych i międzynarodowych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego, odpowiednich do konkretnych zagrożeń bezpieczeństwa biologicznego związanych z każdym szczepem. Próbki kału pobrano od zdrowych ochotników, którzy nie przyjmowali żadnych leków przez co najmniej tydzień. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Budowa modelu transformacji bakteryjnej ludzkiego jelita in vitro

  1. Przygotowanie ogólnego podłoża beztlenowego (GAM)25
    1. Przygotowanie roztworu A
      1. Połącz 10,0 g tryptonu, 10,0 g peptonu proteozy, 3,0 g peptonu sojowego, 13,5 g surowicy trawiennej w proszku, 1,2 g ekstraktu z wątroby w proszku, 2,2 g ekstraktu z wołowiny i 5,0 g ekstraktu drożdżowego w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
      2. Dodaj 500 ml wody destylowanej i mieszaj pod ogrzewaniem, aż substancje całkowicie się rozpuszczą.
    2. Przygotowanie roztworu B
      1. Przygotować roztwór B zgodnie z tą samą procedurą co roztwór A, z wyjątkiem połączenia 3,0 g glukozy, 5,0 g skrobi rozpuszczalnej, 2,5 g wodorofosforanu dipotasu i 3,0 g chlorku sodu w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml.
    3. Przygotowanie roztworu C
      1. Przygotować roztwór C zgodnie z tą samą procedurą, co roztwory A i B, z wyjątkiem połączenia 0,3 g chlorowodorku L-cysteiny i 0,3 g tioglikolanu sodu w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml.
      2. Wymieszać wszystkie trzy roztwory w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1000 ml, dostosować pH do 7,2 za pomocą 10% roztworu wodorotlenku sodu i dodać wodę destylowaną, aby uzyskać końcową objętość 1000 ml.
      3. Rozprowadzić pożywkę do kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotowanie stałego ogólnego podłoża beztlenowego
      1. Dodaj 1%-2% agaru do płynnego podłoża GAM i podgrzewaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Rozprowadzić do kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
    5. Przygotowanie niskoemisyjnej pożywki źródłowej
      1. Przygotuj niskoemisyjną pożywkę źródłową, stosując tę samą procedurę co GAM, ale pomiń ekstrakt drożdżowy, glukozę i skrobię rozpuszczalną.
  2. Przygotowanie mieszanej flory jelitowej człowieka
    1. Zbierz 1-2 g świeżego kału ludzkiego w jednorazowej sterylnej probówce do pobierania kału wypełnionej gazowym azotem. Natychmiast uszczelnij rurkę. Dodać 5 ml pożywki GAM, zamknąć i wyhodować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w sterylnym inkubatorze beztlenowym.
      UWAGA: Użyj miernika tlenu do monitorowania poziomu tlenu w inkubatorze beztlenowym i w razie potrzeby zastąp gazowy azot w celu utrzymania warunków beztlenowych.
  3. Aktywacja mieszanej flory jelitowej człowieka
    1. Po 24 godzinach przenieść 0,5 ml zawiesiny bakterii jelitowych człowieka do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 4,5 ml świeżej pożywki GAM.
    2. Uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w celu uzyskania aktywnej mieszanej flory jelitowej człowieka.
  4. Przygotowanie roztworów referencyjnych
    1. Zważyć po 5 mg orientyny i luteoliny i rozpuścić je oddzielnie w 1 ml DMSO w celu przygotowania roztworów referencyjnych orientyny i luteoliny o stężeniu 5 mg/ml.
  5. Badania przesiewowe aktywnej flory jelitowej zdolnej do rozszczepiania glikozydów C
    1. Zmieszać 260 μl aktywowanej flory jelitowej z 6 ml świeżej pożywki niskoemisyjnej zawierającej 40 μl roztworu referencyjnego orientyny i inkubować w temperaturze 37 °C.
    2. Uwzględnij grupę kontrolną (6 ml niskowęglowej pożywki, 40 μl roztworu referencyjnego orientyny i 260 μl soli fizjologicznej) oraz grupę ślepą (6 ml niskowęglowej pożywki źródłowej, 40 μl zwykłej soli fizjologicznej i 260 μl aktywowanej flory jelitowej).
      UWAGA: Wszystkie badania należy wykonać trzykrotnie w inkubatorze beztlenowym.
  6. Obróbka wstępna roztworów transformacyjnych
    1. Po 24 godzinach i 48 godzinach odpipetować 1 ml roztworów reakcyjnych do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 13 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia bakterii.
    2. Dodać 200 μl sklarowanego osadu do 600 μl metanolu, wymieszać i odwirować przy 13 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia białek.
  7. Wykrywanie produktów przemian
    1. Przefiltrować supernatant za pomocą mikroporowatej membrany 0,22 μm i przeanalizować filtrat za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Przeprowadzić analizę HPLC na urządzeniu wyposażonym w kolumnę C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
    2. Utrzymywać temperaturę pieca kolumnowego na poziomie 40 °C, przy natężeniu przepływu 1 ml/min. Stosować acetonitryl jako fazę ruchomą A i 0,1% kwas mrówkowy w wodzie oczyszczonej jako fazę ruchomą B.
      UWAGA: Zastosuj liniowy system gradientu w następujący sposób: 5%-55% A w 0-20 min, 55%-95% A w 20-25 min, 95%-5% A w 25-30 min i 5% A w 30-32 min.

2. Izolacja pojedynczych szczepów z flory bakteryjnej jelit człowieka

  1. Aktywacja mieszanej flory bakteryjnej jelit człowieka
    1. Aktywować mieszaną ludzką florę bakteryjną jelit zdolną do rozszczepiania orientyny, jak opisano w kroku 1.3, w celu uzyskania aktywowanego roztworu ludzkiej flory bakteryjnej
      2. jelit.
  2. Przygotowanie pełnych płyt GAM
    1. Rozpuść przygotowaną stałą pożywkę GAM przez ogrzewanie i wlej ją do jednorazowych sterylnych szalek Petriego w inkubatorze beztlenowym. Pozostawić podłoże do zastygnięcia, aby przygotować stałe płytki GAM.
  3. Wstępne badania przesiewowe pojedynczych szczepów z flory bakteryjnej jelit człowieka
    1. Odpipetować 100 μl aktywowanego roztworu bakteryjnego do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml soli fizjologicznej.
    2. Wprowadzić odpowiednią objętość roztworu bakteryjnego na szalkę Petriego za pomocą jednorazowego pierścienia do zaszczepiania. Zamknij naczynie i inkubuj je w inkubatorze beztlenowym.
  4. Obserwacja morfologii kolonii
    1. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C obserwuj wielkość, morfologię i kolor kolonii na płytce.
  5. Dobór poszczególnych kolonii w celu uzyskania pojedynczych szczepów
    1. Wybierz odrębne pojedyncze kolonie bakteryjne i hoduj je w 10 ml probówkach do mikrowirówek zawierających 4,5 ml świeżej pożywki GAM. Inkubować w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu uzyskania pojedynczych szczepów.
  6. Weryfikacja aktywności pojedynczego szczepu
    1. Sprawdź aktywność pojedynczych szczepów zgodnie z opisem w krokach 1.5, 1.6 i 1.7. Przeprowadź weryfikację aktywności za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i znakowania płytek25.
  7. Oczyszczanie pojedynczych szczepów z flory bakteryjnej jelit człowieka
    1. Oczyść aktywny pojedynczy szczep zgodnie z opisem w kroku 2.1. Sprawdź jego aktywność poprzez eksperymenty transformacyjne z orientin, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 1.5, 1.6 i 1.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Próbki kału od dziesięciu zdrowych ochotników przebadano za pomocą eksperymentów transformacyjnych, w wyniku czego jedna próbka wykazała aktywność w deglikozylacji orientyny. Wynik ten potwierdził możliwość przesiewowego wyboru aktywnych próbek. Aktywną próbkę wyizolowano metodą kreskowania płytek. Na podstawie morfologii i charakterystyki kolonii wybrano do dalszej analizy około 18 pojedynczych kolonii bakteryjnych o żółtym lub białym zabarwieniu, zróżnicowanych kształtach i nierównych brzegach. Spośród nich tylko jedna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ustalono standardową procedurę operacyjną (SOP) do badań przesiewowych ludzkich bakterii jelitowych zdolnych do rozszczepiania C-glikozydów. Za pomocą tych procedur udało się uzyskać czysty szczep aktywny, a jego właściwości deglikozylacyjne potwierdzono za pomocą testów transformacyjnych. SOP składa się z przygotowania i wzbogacenia bakterii jelitowych, badań przesiewowych zorientowanych na aktywność oraz walidacji aktywności w niskoemisyjnym podłożu.

Najważniejszym aspektem procesu badań prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin 82374134.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylThermo Fisher ScientificF2408R205
Inkubator beztlenowyShanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTDYQX-II
Ekstrakt z wołowinyBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
Surowica trawienna w proszkuBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-087BR
Dipotassium Fosforan wodoruBeijing Chemical WorksM26298AR
Jednorazowa sterylna probówka do zbierania stolcaLang Fu Co., LTD5 ml
Wody Destylowanej, Pekiński Uniwersytet Tradycyjnej Medycyny
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861V
Rurka AR EPBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 ml/1,5 ml
Wirówka EppendorfEppendorf AG5418
GlukozaBeijing Chemical WorksGC205003AR
Wysokowydajny chromatograf cieczowyShimadzu CorporationLC-20
Wysokociśnieniowy sterylizator parowySanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 Kolumna chromatograficznaAgela Technologies Co., LTD4,6 mm i czasy; 250 mm, 5 &mikro;
m Chlorowodorek L-cysteinyBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
Ekstrakt z wątroby w proszkuBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
LuteolinNarodowe Instytuty Kontroli>98%
Mieszadło magnetyczneIka Werke Co., LTDRCT basic
MetanolThermo Fisher Scientific20240901312
Membrana filtracyjna AR MilliporeSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0,22 &mikro; L i razy; 50 mm
OrientinYishiming (Pekin) Biotechnology Co., LTD19120601>98%
peptonuBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
Szalka PetriegoBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD150 mm
Chlorek soduBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008
AR TioglikolansoduShanghai Jianglai Biotechnology Co., LTDJ031S219019AR
Skrobia rozpuszczalnaBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765BR
Pepton sojowyPekin Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptonAgela Technologies Co., LTD1685787BR
Myjka ultradźwiękowaKun Shan Instrumenty ultradźwiękowe Co., LTDKQ-500DE
Ekstrakt drożdżowyBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-014BR
HPLC Wydział BiofarmaceutykiChińskiej Żywności i Leków

Bibliografia

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030(2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924(2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609(2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407(2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162(2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263(2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882(2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rozszczepianie C-glikozydówprzesiew bakteriologicznyizolacja bakteriimedium o niskiej zawartości węglainkubacja beztlenowawysokosprawna chromatografia cieczowaflora jelitowa człowiekamorfologia koloniiaktywność deglikozylowania
Badania przesiewowe i izolacja bakterii jelitowych rozszczepiających glikozydy C
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.