Multimodalne badanie przebudowy układu sercowo-naczyniowego u myszy: czterowymiarowe obrazowanie ultrasonograficzne i spektrometria mas

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania w czterowymiarowym obrazowaniu ultrasonograficznym in vivo i obrazowaniu spektrometrii mas ex vivo do oceny biomechanicznych i biomolekularnych zmian w mysim układzie sercowo-naczyniowym. Technika ta jest stosowana do analizy przebudowy serca w chirurgicznie wywołanym zawale mięśnia sercowego i zmianach naczyniowych u starzejących się zwierząt.

Streszczenie

Choroby układu krążenia (CVD) są główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Uszkodzenia układu sercowo-naczyniowego mogą być spowodowane narażeniem środowiskowym, urazem, toksycznością leków lub wieloma innymi czynnikami. W rezultacie tkanka serca i naczynia krwionośne ulegają zmianom strukturalnym i wykazują zmniejszoną funkcję. Uszkodzenie i wynikającą z niego przebudowę można wykryć i określić ilościowo za pomocą obrazowania ultrasonograficznego (US) na poziomie narządu i obrazowania spektrometrii mas (MSI) na poziomie molekularnym. Manuskrypt ten opisuje innowacyjną metodologię badania patofizjologii serca u myszy, sprzężenie czterowymiarowego (4D) obrazowania ultrasonograficznego in vivo i analizy z MSI serca wspomaganej matrycą ex vivo (MADLI). Ultrasonografia 4D może zapewnić dynamiczne pomiary objętościowe, w tym przemieszczenie promieniowe, odkształcenie powierzchni i odkształcenie podłużne przez cały cykl pracy serca. W układzie naczyniowym MSI i ultradźwięki są wykorzystywane do oceny składu ścian naczyń, hemodynamiki i dynamiki ścian naczyń. Metodologia może być dostosowana do badania niezliczonych chorób sercowo-naczyniowych poprzez dostosowanie interesujących wskaźników funkcjonalnych i/lub zmiany protokołu MALDI MSI do docelowych cząsteczek. MALDI MSI może być stosowany do badania lipidów, małych metabolitów, peptydów i glikanów. Protokół ten określa zastosowanie MALDI MSI do nieukierunkowanej analizy lipidomicznej oraz zastosowanie obrazowania ultradźwiękowego w hemodynamice i biomechanice układu sercowo-naczyniowego.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia (CVD) są główną przyczyną zgonów na całym świecie¹. Zapobieganie i leczenie chorób układu krążenia wymaga dogłębnego zrozumienia adaptacji molekularnych do sił biomechanicznych i wynikających z nich zmian właściwości mechanicznych. W całym układzie sercowo-naczyniowym siły biomechaniczne odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu i strukturze tkanki². Siły te wpływają na właściwości mechaniczne tkanki sercowo-naczyniowej (CV), co czyni je wskaźnikami zdrowia i choroby^3,4,5,6. Aby zapobiegać, diagnozować i leczyć choroby układu krążenia, kluczowe jest opracowanie metod zrozumienia i obserwacji procesów inicjacji i progresji choroby. Obrazowanie biomedyczne odgrywa kluczową rolę w generowaniu wglądu fizjologicznego i mechanistycznego, a nowe technologie obrazowania i techniki analizy są stale rozwijane. Protokół ten przedstawia metodologię łączenia dwóch technik obrazowania i analizy układu sercowo-naczyniowego w celu walidacji potencjału tych metod obrazowania w chorobie niedokrwiennej serca i starzeniu się naczyń.

Badacze zajmujący się biomechaniką często podchodzą do badania biomechaniki poprzez kombinację metod in vivo, ex vivo i in silico. Wcześniejsze badania z zakresu biomechaniki molekularnej koncentrowały się głównie na białkach⁷ (w szczególności białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, kolagenie i elastynie ze względu na ich wpływ na właściwości biomechaniczne), a prace nad połączeniem biomechaniki obrazowania in vivo z badaniami molekularnymi ograniczały się do histologii i immunohistochemii. Chociaż podejścia te mogą dostarczyć wielu wskaźników molekularnych i przyniosły proponowane mechanizmy przebudowy ECM i komórek, zazwyczaj ograniczają się one odpowiednio do obecnie dostępnych barwników lub przeciwciał. W tej dziedzinie badań brakuje dużych klas cząsteczek, np. lipidów. Chociaż te klasy molekularne mogą, ale nie muszą, być zaangażowane mechanicznie, ważne jest zrozumienie wynikających z nich adaptacji molekularnych, ponieważ cząsteczki te mogą być potencjalnymi celami zarówno dla markerów diagnostycznych, jak i terapii. Można stosować techniki chemii analitycznej, takie jak chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS); Jednak orientacja przestrzenna cząsteczek w tych technikach zostaje utracona. Dzięki obrazowaniu metodą spektrometrii mas (MSI) rozkład przestrzenny cząsteczek pozostaje nienaruszony, a wiele typów analitów (klas cząsteczek) można obrazować za pomocą odcinków szeregowych. MSI to potężne narzędzie analityczne do badania rozkładów przestrzennych prawie wszystkich typów cząsteczek w tkance biologicznej, w tym metabolitów, lipidów, glikanów, peptydów i leków o małej masie cząsteczkowej⁸. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) MSI to rodzaj MSI, który doskonale nadaje się do analizy mas cząsteczkowych w zakresie 50-8000 Da, opartej na odkryciach. MALDI-MSI to technika jonizacji, która nakłada na próbkę matrycę pochłaniającą energię lasera, aby wspomóc jonizację interesujących analitów. Takie podejście zapobiega ograniczeniu się do jednego celu molekularnego i może wykorzystywać narzędzia bioinformatyczne do określenia, które cząsteczki mają wpływ na właściwości biomechaniczne i przebudowę.

Ultrasonografia czterowymiarowa (4DUS) to nieinwazyjna metoda in vivo, przydatna zarówno do czasowej, jak i przestrzennej charakterystyki serca. 4DUS wykorzystuje serię pętli filmowych o wysokiej liczbie klatek na sekundę z różnych płaszczyzn, kompilując je w zestaw danych 3D, który zawiera informacje czasowe. Pozwala to na bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację złożonych zmian kształtu 3D komór serca w cyklu pracy serca bez polegania na założeniach geometrycznych, jak jest to wymagane w tradycyjnej echokardiografii 2D. 4DUS pozwala na obliczanie wskaźników funkcjonalnych in vivo na podstawie złożonego kształtu i ruchu serca^9,10, a MALDI MSI pozwala na przestrzenne badanie cząsteczek biologicznych w tkance serca ex vivo¹¹. Aby w pełni zrozumieć zmiany w sercu związane z CVD, należy zbadać zarówno mechanizmy mechaniczne, jak i molekularne. W związku z tym zaproponowano połączoną metodologię badania patofizjologii mysiego serca, sprzężenie obrazowania i analizy 4DUS z MALDI MSI lipidów w sercu. Metodologia ta została zademonstrowana w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Biomechanika naczyń krwionośnych również odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji układu krążenia². Usztywnienie naczyń krwionośnych, które jest związane ze starzeniem się, jest czynnikiem ryzyka CVD¹². Zmiany biomechaniczne i hemodynamiczne w naczyniach można obrazować za pomocą ultradźwięków. Skład molekularny ścianek naczyń jest ważnym składnikiem biomechaniki, a także jest wyjątkowo wrażliwy na siły hemodynamiczne. Na przykład oscylacyjne naprężenie ścinające ścianę jest związane z rozwojem blaszki miażdżycowej³. W dalszej kolejności zostaną przedstawione wstępne dane dotyczące mechaniki naczyń krwionośnych i hemodynamiki u zwierząt w podeszłym wieku.

Zespół jest zainteresowany związkiem między biomechaniką a składem molekularnym w różnych stanach chorobowych. Przedkliniczne obrazowanie ultrasonograficzne i MSI służą do określenia przestrzennego rozkładu zmian molekularnych w tkance i związanych z nimi zmian biomechanicznych, które zachodzą podczas progresji choroby. Niniejszy raport szczegółowo opisuje te metodologie i przedstawia wstępne dane dotyczące serca i układu naczyniowego głowy/szyi.

Protokół

Opisane eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane za zgodą University of Tennessee, Knoxville Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Obrazowanie ultrasonograficzne¹³

1. Konfiguracja i przygotowanie zwierząt
   1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy sprawdzić poziom znieczulenia izofluranem i w razie potrzeby uzupełnić go. Sprawdź poziom tlenu w butli przed włączeniem gazu. Zważ węgiel drzewny i zapisz go na pojemniku.
   2. Skonfiguruj przestrzeń obrazowania, umieszczając materiały eksploatacyjne w pobliżu platformy obrazowania. Materiały obejmują wstępnie przyciętą taśmę, krem do depilacji, gazę, waciki, wodę autoklawowaną, lubrykant do rogówki, żel smarujący, sondę temperatury doodbytniczą, przewody elektrod, żel do ultradźwięków, żel do elektrod (jeśli dotyczy) i lampę grzewczą (Rysunek 1A).
   3. Włącz ultrasonograf i zainicjuj silnik (system jest również w stanie zbierać dane obrazowe 4DUS). Skonfiguruj nowy eksperyment w systemie ultrasonograficznym: wybierz Nowe badanie lub Nowa seria i wypełnij informacje o myszy. Włącz tablet w celu monitorowania fizjologicznego.
   4. Sprawdź zawór odcinający, aby upewnić się, że przepływ jest otwarty do skrzynki indukcyjnej i zamknięty do stożka nosowego. Wstępnie napełnij pojemnik indukcyjny znieczulenia, włączając tlen do 1 l/min na parowniku i przekręcając pokrętło na 3%-5%.
   5. Wyjmij mysz z klatki obudowy.
   6. Umieść mysz w pudełku indukcyjnym, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone izofluranem w zakresie 3%-5%.
   7. Przełącz kurek, aby zmienić przepływ na stożek nosowy na płytce do obrazowania ultrasonograficznego. Obróć pokrętło izofluranu w zakresie 1%-2%.
   8. Wyjmij mysz z pudełka indukcyjnego i zważ zwierzę. Zapisz wagę zwierzęcia.
   9. Umieść mysz w pozycji leżącej na płytce obrazowej.
   10. Nałóż lubrykant rogówkowy na oczy zwierzęcia.
   11. Jeśli futro jest obecne, usuń sierść z obszaru obrazowania za pomocą dostępnego w handlu kremu do depilacji i bawełnianych wacików. Wytrzyj krem ze skóry wodą na gąbkach, aby usunąć nadmiar kremu do depilacji ze skóry i zapobiec poparzeniom.
   12. Przewody do elektrokardiografii (EKG) należy wprowadzić podskórnie po obu stronach klatki piersiowej i kończyny tylnej, w zależności od ułożenia zwierzęcia.
       1. Po włożeniu przytrzymaj przewody EKG na miejscu za pomocą taśmy. Jeśli odprowadzenia EKG nie są używane (tj. odprowadzenia EKG nie są włożone), monitoruj EKG za pomocą płytki do obrazowania zwierząt.
       2. W celu przewodzenia elektrycznego od skóry do płytki, umieść przewodzący żel na płytce i przytrzymaj kończyny zwierzęcia na miejscu.
   13. Przytrzymaj kończyny zwierzęcia na miejscu za pomocą taśmy lub elastycznej opaski umieszczonej wokół płytki i nad kończynami (Rysunek 1B).
   14. Użyj żelu smarującego, aby włożyć sondę temperatury doodbytniczej i zabezpiecz sondę taśmą.
   15. Sprawdź sygnały EKG, oddechu i temperatury na tablecie. Upewnij się, że tętno wynosi ~350-600 uderzeń na minutę, oddech ~50-100 oddechów/min, a temperatura w odbycie między 35-37 °C. W razie potrzeby dostosuj poziom izofluranu.
   16. W razie potrzeby włącz lampę grzewczą (np. żarówkę grzewczą na podczerwień o mocy 250 W)¹⁴ i dostosuj wysokość, aby utrzymać temperaturę rdzenia (Rysunek 1C).
       1. Umieść lampę grzewczą nie bliżej niż 12 cali od zwierzęcia. W przypadku wstępnych badań mających na celu określenie optymalnej odległości między żarówką a zwierzęciem, wyreguluj wysokość i zapisz temperaturę skóry za pomocą termometru na podczerwień, która nie powinna przekraczać 42 °C¹⁵.
2. USG serca 4D
   1. Umieść przetwornik w uchwycie w pozycji półzablokowanej.
   2. Zorientuj wypukłą kropkę na przetworniku z niebieską kropką na ekranie. Konwencja polega na umieszczeniu kropki w kierunku prawej strony zwierzęcia.
   3. Obróć przetwornik tak, aby był zorientowany wzdłuż płaszczyzny strzałkowej myszy z wypukłym wycięciem skierowanym w kierunku ogonowym.
   4. Użyj dźwigni u podstawy płytki ultradźwiękowej, aby przechylić zwierzę. Użyj dźwigni u podstawy przetwornika, aby wyregulować kąt przetwornika.
   5. Nałóż dużą ilość żelu ultradźwiękowego na brzuszną powierzchnię klatki piersiowej w celu sprzężenia akustycznego między powierzchnią skóry a przetwornikiem. Upewnij się, że nie ma pozostałego futra przed połączeniem.
   6. Opuść przetwornik, aby zetknąć się z żelem ultradźwiękowym.
   7. Dokonuj mikroregulacji za pomocą pokręteł X/Y u podstawy płytki lub przesuń całą płytkę, aby uzyskać duże regulacje.
   8. Upewnij się, że widok przymostkowy w długiej osi obejmuje wierzchołek, drogę odpływu lewej komory i aortę wyrównaną poziomo na ekranie, aby uzyskać dokładniejszy obraz krótkiej osi (Rysunek 2A, B).
   9. Wybierz opcję Nazwij obraz w dolnym rogu, aby zapisać obraz w bieżącej serii.
   10. Obróć przetwornik o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przełączyć się na przymostkowy widok krótkiej osi (Rysunek 2C).
       UWAGA: Aby uzyskać najlepszą jakość obrazu 4D, użytkownicy powinni starać się ustawić silnik krokowy wzdłuż przymostkowej osi długiej komory, która nie zawsze jest bezpośrednio równoległa do mostka. Serce/LV często znajduje się pod kątem w lewo w dół.
   11. Upewnij się, że lewa komora jest widoczna po prawej stronie ekranu, a prawa komora znajduje się po lewej stronie ekranu (Rysunek 2D).
   12. Jeśli mysz ma stabilny rytm oddechowy, naciśnij pole EKG w lewym górnym rogu obrazu, aby włączyć bramkowanie oddechowe dla obrazu 4D. Jeśli nie jest stabilny, wykonaj ten krok podczas przetwarzania końcowego.
   13. Wybierz sześcian w lewym górnym rogu ekranu, aby skonfigurować obraz 4D.
   14. Zresetuj przetwornik przed dostosowaniem pozycji Start i Stop przetwornika.
   15. Dostosuj pozycję początkową do pozycji tuż poniżej wierzchołka, a pozycję stop do łuku aorty.
   16. Ustaw rozmiar kroku na 0,08-0,13 mm i częstotliwość odświeżania na 200-300 Hz.
       UWAGA: Mniejsze rozmiary kroków mogą zapewnić lepszą rozdzielczość obrazu do analizy, ale wydłużą czas akwizycji. Większe rozmiary kroków są dopuszczalne, jeśli dane są zbierane z prawie idealnym wyrównaniem lewej komory i minimalna lub żadna zmiana orientacji nie jest wymagana podczas analizy. Rozważ zwiększenie liczby klatek na sekundę podczas pracy ze zwierzętami o wyższym tętnie (>450 uderzeń na minutę).
   17. Upewnij się, że parametry życiowe i sygnał EKG są stale stabilne (>350 uderzeń na minutę i oddech powyżej 50 resp/min) przed przystąpieniem do skanowania.
   18. Po zakończeniu skanowania i przetwarzania włącz opcję Zapisz dane EKV/4D do przetwarzania końcowego i Bramkowanie oddychania.
   19. Wybierz pozycję Obraz nazwy w prawym dolnym rogu i dołącz identyfikator myszy w nazwie.
   20. Aby sprawdzić jakość obrazu, naciśnij Więcej elementów sterujących i wybierz Załaduj do 4D.
   21. Przejrzyj każdy płaski widok serca, upewniając się, że środek serca nie porusza się przez cały cykl pracy serca. Ruch środka wskazuje na zmienność EKG i/lub bramkowania oddechowego, a tym samym komplikuje proces analizy. Ponownie wyreguluj monitory i powtórz skanowanie, jeśli to konieczne.
3. Analiza ultrasonograficzna 4D serca
   1. Przejdź do przeglądarki badania. Eksportuj wszystkie obrazy 2D B-Mode do Vevo Lab i eksportuj dane 4D jako inny typ pliku, wybierając format danych ".raw" na dysk twardy.
      UWAGA: Przybornik graficznego interfejsu użytkownika 4D używany w tej pracy nie jest obecnie publicznie dostępny. Aby uzyskać dostęp i uzyskać szczegółowe instrukcje, skontaktuj się z dr Craigiem Goergenem z Purdue University.
   2. Przeprowadź alternatywną analizę danych 4D za pomocą oprogramowania VevoLab. Aby skorzystać z tego frameworka, wyeksportuj dane 4D z maszyny do plików Vevo Lab.
4. Obrazowanie naczyń krwionośnych
   1. W przypadku obrazów tętnic szyjnych w trybie B należy umieścić przetwornik ultrasonograficzny równolegle do tętnic szyjnych, w pobliżu linii środkowej.
   2. Gdy tętnica szyjna jest widoczna, przesuń przetwornik nad górę, aby znaleźć rozwidlenie tętnicy szyjnej.
   3. Gdy zostanie znaleziony wyraźny obraz rozwidlenia tętnicy szyjnej, ustaw wzmocnienie na 35 dB i uchwyć obraz w trybie B.
      1. Ustawienie przetwornika pod kątem w lewo lub w prawo może poprawić obraz. Dostosuj kąt przetwornika lub stolika tak, aby naczynie zainteresowania nie było bezpośrednio równoległe do przetwornika. Pozwala to na utrzymanie kąta Dopplera poniżej 60°. W przeciwnym razie może być konieczne przesunięcie o +/- 15°.
   4. Przełącz na tryb Dopplera fali pulsacyjnej, aby uzyskać pomiary prędkości.
   5. Umieścić objętość próbki na środku naczynia. Dostosuj kąt kursora tak, aby był równoległy do tętnicy szyjnej. Następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiary prędkości i zapisz, aby je nagrać.
   6. Aby uzyskać obraz żył szyjnych w trybie B, umieść przetwornik ultrasonograficzny równolegle do żył szyjnych. Żyły szyjne są przednie i boczne w stosunku do tętnic szyjnych.
   7. Po zlokalizowaniu żyły szyjnej przesuń przetwornik do miejsca, w którym łączą się wewnętrzna i zewnętrzna żyła szyjna. Po znalezieniu wyraźnego obrazu ustaw wzmocnienie na 35 dB i uchwyć obraz w trybie B.
   8. Przełącz się w tryb Dopplera fali pulsacyjnej, aby uzyskać pomiary prędkości.
   9. Umieścić objętość próbki na środku naczynia. Dostosuj kąt kursora tak, aby był równoległy do żyły szyjnej. Następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pomiary prędkości i zapisz, aby je nagrać.
5. Analiza ultrasonograficzna naczyń krwionośnych
   1. Po zebraniu obrazów w trybie B i pomiarach dopplerowskich fal pulsacyjnych, zmierz średnice i prędkości za pomocą oprogramowania.
   2. Po załadowaniu obrazów do oprogramowania wybierz pakiet naczyniowy.
   3. Wybierz każdą stronę naczynia, aby uzyskać pełną średnicę.
   4. W przypadku tętnicy szyjnej należy wykonać pomiary średnicy w skurczu i rozkurczu, korzystając z opcji średnicy w pakiecie naczyniowym.
   5. Wykonaj pomiary prędkości za pomocą opcji prędkości w pakiecie naczyniowym.
   6. W przypadku tętnicy szyjnej należy wybrać najwyższy pik do pomiaru prędkości w skurczu i najniższy pik do pomiaru prędkości w rozkurczu.
   7. Użyj wartości średnic, aby obliczyć składową obwodową tensora odkształcenia Lagrange'a Greena, korzystając z następującego równania:
      (1)
      gdzie D_s oznacza średnicę podczas skurczu, a D_d oznacza średnicę podczas rozkurczu.
   8. W przypadku żyły szyjnej wybierz dowolne punkty w całym cyklu, aby uzyskać pomiar prędkości.

2. Eutanazja i pobieranie tkanek

1. Przygotuj łódeczki z folii aluminiowej do błyskawicznego zamrażania tkanek (Rysunek 3).
2. Pod koniec badania należy poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie izofluranu w stężeniu 5% i obustronną odmę opłucnową lub zwichnięcie szyjki macicy (tylko badanie kardiologiczne).
3. Używając kleszczy do namiotowania skóry, przetnij skórę namiotu nożyczkami nad szyją w celu unaczynienia lub tuż pod mostkiem w przypadku serca.
4. Przetnij warstwy skóry i mięśni, aby odsłonić naczynia krwionośne lub przetnij kość, aby odsłonić serce.
5. Za pomocą rozwarstwienia za pomocą wacików odizoluj serce lub naczynia krwionośne od otaczających tkanek, w tym tłuszczu. Pamiętaj, aby oddzielić naczynie szyjne od nerwu. Usuń serce i naczynia za pomocą narzędzi chirurgicznych.
   UWAGA: Szwy mogą być używane do usuwania naczyń krwionośnych poprzez zszywanie bliższej i dalszej części przed usunięciem naczyń.
6. Umieść chusteczkę na wstępnie oznakowanej łodzi z folii aluminiowej i umieść łódź w ciekłym azocie (Rysunek 3).
7. Przechowywać tkankę w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji. Chusteczkę transportować suchym lodem, aby utrzymać temperaturę.

3. Obrazowanie metodą spektrometrii mas

1. Kriosekcja i optymalna temperatura cięcia (OCT) montaż na szkiełkach
   1. Ustaw temperaturę kriostatu na -25 °C i włóż ostrze.
   2. Przygotuj metalowy uchwyt, nakładając OCT i pozwalając mu zamarznąć w kriostacie.
   3. Przymocuj podstawę serca do przygotowanego metalowego uchwytu za pomocą OCT (Rysunek 4A). Nie pozwól, aby OCT dotykał obszaru próbki będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ OCT zanieczyści widma masowe (zanieczyszczenie glikolem polietylenowym [PEG]) i obniży interesujące sygnały lipidowe.
      UWAGA: Możliwość wykonania montażu wodnego w celu uniknięcia zanieczyszczenia próbki. Zapoznaj się z poniższym protokołem dodatkowym, aby uzyskać instrukcje.
   4. Opierając się na znaczeniu wyrównania przestrzennego w tej metodologii, użyj skalowanego cyfrowego renderowania serca dostarczonego przez MATLAB GUI, aby pokierować sekcjami (Rysunek 4B).
   5. Policz każdy obrót (10 μm) podczas cięcia i zanotuj głębokość w milimetrach dla każdego arkusza, który ma być zamontowany na szkiełku.
      UWAGA: Konieczne jest śledzenie określonych lokalizacji w sercu lub układzie krwionośnym, aby uzyskać dokładne dopasowanie do cyfrowego renderowania danych ultrasonograficznych dostarczanych przez MATLAB.
   6. Rozmrozić skrawki tkanek (o grubości 10 μm) na szkiełkach mikroskopowych.
      UWAGA: Rodzaj szkiełek będzie zależał od użytego spektrometru masowego. Każdy slajd zawiera po jednym fragmencie z każdego obszaru serca. Wymagane są co najmniej trzy suwaki (tryb jonów dodatnich, tryb jonów ujemnych, dodatkowy).
   7. Dla n = 1/grupę, przekrój serce przez długą oś, aby uwidocznić zmiany molekularne od wierzchołka do podstawy.
   8. W przypadku układu naczyniowego zanurz tkankę w żelatynie i błyskawicznie zamroź przed sekcją¹¹.
   9. Przechowuj preparaty w kopertach do slajdów w temperaturze -80°C do czasu eksperymentów obrazowania metodą spektrometrii mas.
   10. W przypadku przeprowadzania chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) w celu dalszej identyfikacji i ilościowego określenia lipidów lub metabolitów, należy przeciąć seryjne odcinki tkanek o wielkości ~ 60-100 μm i zebrać je do probówek o pojemności 0,5-2 ml przed zamrożeniem.
2. Kriosekcja i osadzanie chusteczek wodnych na szkiełkach
   1. Napełnić zlewkę wodą z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i odłożyć na bok za pomocą strzykawek o pojemności 5 ml i 1 ml.
   2. Ustaw temperaturę kriostatu na -25 °C i włóż ostrze.
   3. Umieść parę kleszczy w kriostacie, aby ostygły przed montażem.
   4. Pobrać 5 ml wody HPLC do strzykawki i umieścić ją w kriostacie.
   5. Tuż przed całkowitym zamrożeniem strzykawki wylej wodę na metalowy uchwyt i pozwól mu całkowicie zamarznąć.
   6. Pobrać 1 ml wody do HPLC i umieścić strzykawkę w kriostacie.
   7. Po około 30-60 s umieść małą kropkę częściowo zestalonej wody na środku uchwytu. Natychmiast chwyć serce kleszczami i umieść je w kropce, zanim całkowicie zamarznie. Przytrzymaj serce na miejscu, aż otaczająca woda całkowicie zamarznie.
      UWAGA: Serce może być zamontowane na wierzchołku lub podstawie, w zależności od regionu zainteresowania. W tym badaniu podstawa zostanie zamontowana z wierzchołkiem skierowanym na zewnątrz.
   8. Wykonaj pozostałe kroki dla tej metody zgodnie z opisem w kroku 3.1.
3. Aplikacja Matrix
   1. Wyjąć szkiełko z zamrażarki i umieścić je w eksykatorze, aż szkiełko wyschnie.
   2. Włącz opryskiwacz HTX M3+, otwórz aplikację HTX na laptopie i wybierz metodę na środku ekranu. Standardowe stężenia w matrycy można znaleźć w zapisanych metodach (metody po lewej stronie ekranu > OI_usermethods > matrycy).
      1. W tym celu należy ustawić temperaturę dyszy na 75 °C, natężenie przepływu na 100 μl/min, a ciśnienie na 10 psi.
   3. Zapisz nazwę próbki, polaryzację, matrycę, rozpuszczalnik i stężenie w notatniku laboratoryjnym. Obliczyć ilość matrycy potrzebną na stężenie (np. 5 ml przy 10 mg/ml = 50 mg matrycy).
   4. Zrobić rozpuszczalnik (np. 70% MeOH).
      1. Do tej pracy należy przygotować 40 mg/ml roztworu matrycy kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) dla trybu dodatniego i 10 mg/ml roztworu matrycy 9-aminoakrydyny (9AA) dla trybu ujemnego. Wykonaj obie matryce z 70% rozpuszczalnikiem MeOH. W przypadku innych popularnych matryc i parametrów natryskiwania wykonaj kroki 3.3.2.
   5. Zważyć matrycę i dodać matrycę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Upewnij się, że kwota jest zbliżona do wymaganej kwoty obliczonej w kroku 3.3.3, ale nie musi być dokładna. Obliczyć ilość rozpuszczalnika na podstawie zmierzonej masy.
   6. Dodać rozpuszczalnik do stożkowej probówki za pomocą pipety.
      UWAGA: Objętość jest oparta na masie zmierzonej w kroku 3.3.5.
   7. Sonikować mieszaninę przez 10 minut. Podczas gdy matryca jest poddawana sonikacji, należy zdjąć szkiełko z eksykatora.
   8. Otwórz tackę opryskiwacza, umieść suwak w lewym dolnym rogu i przyklej krawędzie.
      UWAGA: Złóż jeden koniec taśmy, aby ułatwić usunięcie.
   9. Wybierz obszar rozpylania próbki. Zamknij tacę.
   10. Użyć strzykawki i filtra i wlać matrycę do strzykawki, a następnie przefiltrować matrycę przez strzykawkę do fiolki z czarną pokrywką po lewej stronie rozpylacza.
   11. Umieścić fiolkę z powrotem w swoim miejscu na rozpylaczu i włożyć rurkę D-line do fiolki.
       UWAGA: Upewnij się, że probówka nie dotyka dna fiolki i jest całkowicie zanurzona w płynie.
   12. Włącz gaz obojętny i upewnij się, że manometr na opryskiwaczu wskazuje 10 psi. Naciśnij start. Gdy opryskiwacz osiągnie żądaną temperaturę, wybierz start.
   13. Po zakończeniu natryskiwania otwórz tackę, wyjmij próbkę i umieść ją w uchwycie szkiełka MALDI lub z powrotem w eksykatorze ( Rysunek 4C).
   14. Zeskanuj uchwyt na szkiełka MALDI i wsuń go na skanerze lub zrób zdjęcie telefonem. Zapisz zdjęcie na dysku flash do użytku z MSI.
   15. Wybierz odpowiednie mycie lub następny oprysk na opryskiwaczu. Przenieść linię D z fiolki z matrycą do zlewki na odpady podczas mycia.
   16. Rozpyl metanol na tacę i wytrzyj, aby wyczyścić. Wyłącz azot.
4. MALDI MSI
   1. Na komputerze przejdź do Synapt, sprawdź, czy polaryzacja została zmieniona na wymagany tryb i przełącz się, jeśli nie.
   2. Załaduj szkiełko do instrumentu na źródle MALDI i kliknij przycisk ładowania na komputerze za pomocą oprogramowania.
   3. Przenieś obraz (krok 1.2.17) do folderu Obrazy w folderze Projekt.
   4. Przejdź do opcji Obrazowanie HD i otwórz poprzedni projekt (ten, który korzysta z tej samej matrycy).
   5. W notatniku laboratoryjnym rejestruj zakres masy, wychwytuj i przenoś energię zderzeń, energię lasera, tryb neg/pos.
   6. W obrazowaniu HD przejdź do białej ikony strony. Następnie kliknij strzałkę listy rozwijanej i wybierz nową płytę.
   7. Przeglądaj, aby znaleźć obraz w folderze Project > folderze Obrazy i otwórz go.
   8. Zmień typ blachy na MALDI Standard i zdefiniuj krawędzie blachy (wybierz 4 narożniki, które są pokazane poniżej z czerwonymi znakami plus).
      UWAGA: Lewy górny róg służy do nawigacji do każdego rogu. Prawe górne pole służy do wybierania narożników. Dolne pole służy tylko do wizualizacji całego slajdu.
   9. Przejdź do zakładki małego wzoru w lewym górnym rogu i kliknij ołówek lub inne opcje prostokąta lub koła, aby obrysować tkankę. Obrysuj tkankę za pomocą lewych przycisków myszy i prawego przycisku myszy, aby zakończyć.
   10. Domyślny rozmiar piksela to 50 μm. W razie potrzeby zmień.
   11. Kliknij Zapisz jako i przejdź do Project Imaging AcqFolder i oznacz jako nazwę slajdu (format RRRRMMDD). Następnie zapisz.
   12. Kliknij przycisk Mass Lynx w górnej środkowej części, aby wyeksportować do Mass Lynx.
   13. Przejdź do oprogramowania Mass Lynx.
   14. Kliknij Plik> otworzyć folder projektu. Edytuj nazwę pliku i nazwę tekstu na slajdzie (format RRRRMMDD).
   15. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik MS, przeglądaj i wybierz bieżący slajd.
   16. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy plik MS i kliknij Edytuj. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy niebieskie pole.
   17. Przejdź do warunków skanowania. Znajdź ustawienia źródłowe i zmień je na zdefiniowane przez użytkownika. Następnie przejdź do odpowiedniego folderu projektu > pobranego folderu > bieżącym slajdzie > PORZĄDKU.
   18. Zapisz, klikając Zapisz jako i dołącz nazwę slajdu.
   19. Skalibrować przyrząd za pomocą związku odniesienia (np. czerwonego fosforu)
       1. Przejdź do Synapt (Kalibruj). Kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pobieranie danych. Oznacz jako YYYYMMDD_cal1 (np. 20230614_cal1).
       2. Upewnij się, że ma ten sam zakres mas 50 - 2000. Energia lasera może wynosić około 175.
       3. Naciśnij przycisk odtwarzania lasera ognia, a następnie kliknij przycisk Dalej. Niech działa do około 15 lub 20. Kliknij czerwony ogranicznik.
       4. Przejdź do konsoli W Console.
       5. Utwórz kalibrację i kliknij start. W edytorze profilu kalibracji kliknij pozycję Plik > nowy. Wpisz YYYYMMDD_cal1.
       6. Edytuj zakres masy na żądany zakres masy dla projektu (np. 50-2000).
       7. Wybierz kalibrację ręczną. Wybierz tryb rozdzielczości i kliknij edytuj. Wybrać czerwony fosfor jako związek odniesienia.
       8. Kliknij plik z surowymi danymi i przewiń na sam dół (powinno to być to, co właśnie zostało uzyskane).
       9. Przejdź do historii na dole, wybierz Masę Acc > w porządku > w porządku.
       10. Klikaj dalej i dobrze, aż zobaczysz przycisk Start, a następnie naciśnij start.
       11. Przejdź do zielonej kratki i sprawdź, jakie szczyty nie zostały znalezione.
   20. Przejdź do Mass Lynx (Rozpocznij rzeczywisty przebieg dla próbek eksperymentalnych).
   21. Naciśnij przycisk odtwarzania i sprawdź, czy liczba próbek jest prawidłowa
   22. Przejdź do obrazowania HD.
   23. Upewnij się, że rozmiar piksela jest nadal taki, jaki był pierwotnie ustawiony
   24. Przejdź do Synapt, aby sprawdzić polaryzację.
   25. Kliknij przycisk kamery, aby upewnić się, że się porusza i wystrzeliwuje laser.
   26. Sprawdź i upewnij się, że zbiera dane. Uzyskane widmo masy powinno zostać wyświetlone na stronie Synapt.
5. Analiza MS
   1. Do analizy użyj oprogramowania HD Imaging i Mass Lynx.
   2. Przetwarzanie danych obrazowych za pomocą karty Proces w programie Obrazowanie HD.
   3. Wizualizacja obrazów jonów molekularnych, zwanych również obrazami MS, w obrazowaniu HD na karcie Analiza. Mapa cieplna obrazu jonów molekularnych przedstawia intensywność tego jonu m/z w danym obszarze (Rysunek 5). Użyj nakładek obrazów MS, aby pokazać przestrzenny rozkład cząsteczek (Rysunek 6 i Rysunek 7).
   4. Normalizuj dane za pomocą TIC lub odpowiedniej normalizacji obrazowania.
   5. Zidentyfikuj piki m/z, które przestrzennie korelują z obszarami zainteresowania. Uruchom korelację przestrzenną (R > 0,65) w obrazowaniu HD, aby zidentyfikować kolokalizowane szczyty.
   6. Szukaj przypuszczalnej identyfikacji lipidów tych pików za pomocą LipidMaps¹⁶ i METASPACE¹⁷.
   7. Potwierdź adnotacje lipidowe kolejnymi danymi LC-MS. Wykorzystaj Metaboanalyst do analizy statystycznej danych LC-MS.

Wyniki

Opisane powyżej protokoły obrazowania zostały wykorzystane do dwóch wstępnych badań: przebudowy zawału mięśnia sercowego (MI) i starzenia naczyniowego. W eksperymentach kardiologicznych wykonano stałą operację podwiązania tętnic wieńcowych w celu wywołania ostrego zawału mięśnia sercowego^18,19. USG 4D i MALDI MSI wykonywano stopniowo na tej samej tkance, odsłaniając zmiany fizjologiczne i molekularne. Reprezentatywne obrazy jonów molekularnych w sercu z zawałem s...

Dyskusja

Obrazowanie w skali USA może być zależne od operatora, ale wykorzystanie anatomicznych punktów orientacyjnych i odpowiednie szkolenie może ograniczyć stronniczość użytkownika. Ultradźwięki 2D są szczególnie podatne na zmienność między użytkownikami, ponieważ widoki są zależne od kąta, podczas gdy 4DUS jest mniej podatny, ponieważ akwizycja obejmuje całą objętość i jest niezależna od kąta. Ustalono również, że odtwarzalność obrazu jest łatwiejsza do osiągnięcia dzięki regulowanej platformie dla zwierząt i uchwytowi przetw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB)	Supelco,  >99,0% (HPLC)	85707-10MG-F	Substancja o matrycy DHB dla MALDI-MS; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/85707?cm_sp=Insite-_-wimsShippingEmailRecs_wims EmailAPI_wimsGruCrossEntropy-_-wimsEmailAPI10-3
9-aminoakrydyna (9AA)	Supelco,  ≥ 99,5% (HPLC)	92817-1G	Substancja o matrycy 9-aminoakrydynowej dla MALDI-MS; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/92817?srsltid=AfmBOooiQjQ4pWv_XxITkU 4Lkm0UnHXKekGS_ dFl7V40V9QLWoPpNLoc
Aquasonic Żel do ultradźwięków	Parker Laboratories	Parker 01-02	Żel do ultradźwięków; https://www.parkerlabs.com/products/aquasonic-100-ultrasound-transmission-gel/
Stołowe kolby Dewara	TermoNaukowy	4150-2000	Pojemnik na ciekły azot; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4150-4000?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA DHt9sQVc2f-NxN04Nb5Mv F6TZ7GLHWWDEeqDYmEvtKJSQ YHDeVgZ9qylvYaAs27EALw_wcB & source=google_shopping& ISO_ KOD=nas& LANG_CODE=en& ef_id =Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsADHt9 sQVc2f-NxN04Nb5MvF6TZ7GLHWWDE eqDYmEvtKJSQYHDeVgZ9qylvYa As27EALw_wcB:G:s& s_kwcid=AL!3652 !3!716188292869!!! g!2366243726129 !! 21787513085!171591181194& ev_chn =sklep& cid=0se_gaw_30092024_ PBYTXL& źródło=google_shopping & ISO_CODE=nas& LANG_CODE= en& _source=1
Cryostat	Leica Biosystems	serii CM	https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/
Eksykator	VWR	89054-052	https://us.vwr.com/store/product/9104882/desiccator-plastic-ace-glass-incorporated
Epredia MX35 Premier Jednorazowy niskoprofilowy  Mikrotom  Ostrza	Fisher Scientific	3052835	Ostrze kriostatu; https://www.fishersci.com/shop/products/mx35-premier-disposable-low-profile-microtome-blades/3052835
Falcon 15 mL Stożkowe probówki wirówkowe	Fisher Scientific	14-959-53A	Probówki stożkowe; https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/1495953A?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA DHt9sSBcy5n-lhShligJUOX5KKVGn0bt87 8AB2_muOD2PPTue1phpZgeqwa AqgiEALw_wcB& ef_id=Cj0KCQjw pvK4BhDUARIsADHt9sSBcy5n-lhS hligJUOX5KKVGn0bt878AB2_muO D2PPTue1phpZgeqwaAqgiEALw_ wcB:G:s& ppc_id=PLA_goog_20861 45674_81843405034_1495953A__ 386247001345_165426395473886 37329& ev_chn=sklep& s_kwcid=AL!4428!3 !386247001345!!! g!856907751004!& _source=1
Probówki do mikrowirówek Flex-Tubes	Eppendorf	EP022364120	Probówki wirówkowe; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ep022364120?utm_source=google%2Cgoogle&utm _medium=organicshopping%2Ccpc& utm _campaign=21043330280& utm_ content=& gclid=Cj0KCQjwpv K4BhDUARIsADHt9sTHRD35k CHPtfI2A41axodnMVr6a1eBKk zM4bSUYQAyfEKo3UgTAEQa Ap7wEALw_wcB
Gaz Azot	Airgas	N/A
Szkiełka mikroskopowe	Mikroskopia elektronowa Sciences	71873-02	https://www.emsdiasum.com/positive-charge-microscope-slides
Ciekły azot Gaz	powietrzny	Nie dotyczy
Spektrometr masowy	Wody	Synapt G2-Si	https://www.waters.com/waters/en_US/SYNAPT-G2-Si-Mass-Spectrometry/nav.htm?locale=en_mkcid=1000251Foodety%3C/a%3E&cid=134740653&bcid= 134528734
Opryskiwacz matrycowy	HTX Technologies	M3+	https://www.htximaging.com/htx-m3-sprayer
Metanol (HPLC), >99,9%	Fisher Chemical	A4524	Metanol; https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-hplc-fisher-chemical-9/A4524?crossRef=A4524#?keyword=A4524
Przedkliniczny system ultrasonograficzny	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100; Vevo F2 zastąpił Vevo 3100 w produkcji. System zawiera parownik izofluranu i pudełko indukcyjne.
Reynolds	Wrap N/A	N/A	Folia aluminiowa
Signagel  Żel elektrodowy	Parker Laboratories	Parker 15-60	Żel przewodzący elektrody; https://www.parkerlabs.com/products/signagel-electrode-gel/
Sterylna galaretka smarująca	Medline	MDS032273Z	Żel smarujący; https://www.medline.com/ce/product/Sterile-Lubricating-Jelly/Lubricating-Jelly/Z05-PF03664?sku=MDPMDS032273H
Narzędzia chirurgiczne: nożyczki, kleszcze/pęsety, szwy	Narzędzia Fine Science	11252-00, 11050-10, 14016-14, 14084-08, 15000-08	info@finescience.com
Gąbki chirurgiczne 200 sztuk – Gaziki Niesterylne -Gąbka opatrunkowa do opatrunku pierwszej pomocy – Tkana medyczna nieprzywierająca, nieprzywierająca siatka do szorowania	Medpride	B08RZGQ5GW	Gaza; https://www.amazon.com/Medpride-Surgical-Sponges-200-Pack/dp/B08RZGQ5GW/ref=asc_df_B08RZGQ5GW/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&h vadid=693270340506& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=960915122 2290977669& hvpone=& hvptwo= & hvqmt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9192978& HV targid=PLA-1245491514869& psc= 1& mcid=33f4d647c88630c79116 888d565a63b0
Tissue-Plus Związek OCT	Fisher Scientific	23-730-571	PAŹDZIERNIK; https://www.fishersci.com/shop/products/tissue-plus-o-c-t-compound-2/23730571
Bawełniane waciki i aplikatory z drewnianą rękojeścią	Fisherbrand	22-363-160	Wacik bawełniany; https://www.fishersci.com/shop/products/wood-handled-cotton-swabs-applicators-8/p-7146852