Artykuł metodologiczny

Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną

858 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67350

⸱

27 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania dyspersji młodocianych osobników trzeciego stadium (młodocianych osobników sprzed dauer, JIII.) Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez osmotyczną regulację jonów chlorku potasu (KCl). Metoda ta może stanowić wsparcie techniczne dla badań nad mechanizmami odporności B . xylophilus na stres.

Streszczenie

Kryptobioza to stan, w którym organizmy tracą prawie całą swoją wewnętrzną wodę i wchodzą w anhydrobiozę pod wpływem ekstremalnego stresu środowiskowego. Dyspersyjne młode osobniki trzeciego stadium (młodociane osobniki sprzed dauer, figure-abstract-1) Bursaphelenchus xylophilus mogą wejść w kryptobiozę poprzez odwodnienie i ożywić się po ponownym nawodnieniu, gdy warunki środowiskowe ulegną poprawie. Regulacja osmotyczna ma kluczowe znaczenie dla ich przetrwania w tym procesie. W tym badaniu próbki B. xylophilus pobrano figure-abstract-2 z martwych Pinus massoniana z powodu choroby więdnięcia sosny w Ningbo w prowincji Zhejiang w Chinach. Po zanurzeniu w 8% roztworze figure-abstract-3 chlorku potasu (KCl), B. xylophilus wszedł w stan kryptobiotyczny po stopniowym odwodnieniu spowodowanym zwiększonym zewnętrznym ciśnieniem osmotycznym przez naturalne parowanie wody. figure-abstract-4 B. xylophilus mógł wytrzymać stres niskotemperaturowy w temperaturze -20 °C. figure-abstract-5 B. xylophilus mógł odrodzić się po nawodnieniu, ze wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 92,1%. Proces ten może regulować wnikanie figure-abstract-6 B. xylophilus do kryptobiozy, umożliwiając im odporność na ekstremalne warunki. Ta metoda opisana w naszym badaniu jest prosta i niezawodna, zapewniając wsparcie techniczne w badaniu mechanizmów odporności na stres B. xylophilus.

Wprowadzenie

Choroba więdnięcia sosny jest jedną z najpoważniejszych chorób leśnych w Chinach1. Nicień sosnowiec Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) stanowi poważne zagrożenie dla gatunków sosny, takich jak Pinus massoniana (P. massoniana), rozmnażając się w żywicielu, prowadząc do szybkiego więdnięcia i śmierci. W niesprzyjających warunkach środowiskowych po śmierci żywiciela młodociane osobniki rozrodcze B. xylophilus mogą wejść do młodocianych osobników przed dauerem (figure-introduction-1). Te młode osobniki poszukują wektorów owadów, aby kontynuować przenoszenie i rozprzestrzenianie się, powodując rozległe wymieranie lasów sosnowych2.

Kryptobioza to stan, w którym organizmy tracą prawie całą swoją wewnętrzną wodę i wchodzą w anhydrobiozę pod wpływem ekstremalnego stresu środowiskowego3. W tym procesie organizmy stopniowo odwadniają się, co powoduje zatrzymanie ruchu, zmniejszenie metabolizmu i zawieszenie cyklu życiowego4. W odpowiednich warunkach mogą się zregenerować po ponownym nawodnieniu. Kryptobioza umożliwia organizmom oparcie się ekstremalnym warunkom, takim jak niskie temperatury, i wydłużenie ich życia5. Nicienie, które przetrwały w kryptobiozie przez 30 000 lat, znaleziono w wiecznej zmarzlinieAntarktydy 6.

Wcześniejsze badania wykazały, że nicienie mogą przystosować się do różnych abiotycznych czynników stresogennych – takich jak niska temperatura, susza i wysokie ciśnienie osmotyczne – podczas odwodnienia, dostosowując ich przepuszczalność powierzchniową7. Dodatkowo nicienie mogą zwijać swoje ciała, aby zmniejszyć powierzchnię i zminimalizować tempo utraty wody. Na przykład Caenorhabditis elegans reguluje równowagę osmotyczną, umożliwiając jonom i małym cząsteczkom swobodne przechodzenie przez jego naskórek, podczas gdy większe cząsteczki nie mogą8. figure-introduction-2 B. xylophilus wykazuje również kryptobiozę. Podczas etapów odwodnienia i nawodnienia kryptobiozy, regulacja osmotyczna jest niezbędna do kontrolowania wymiany substancji przez naskórek, co czyni ją kluczową dla wejścia lub powrotu do kryptobiozy9.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę indukcji kryptobiozy u figure-introduction-3 B. xylophilus poprzez regulację osmotyczną. Metoda ta jest prosta, wydajna i wysoce niezawodna, zapewniając wsparcie techniczne w badaniach nad mechanizmami figure-introduction-4 odporności B. xylophilus na stres.

Protokół

1. Kolekcja JIII B. xylophilus

  1. Zbiór zainfekowanych dysków P. massoniana
    UWAGA: Wszystkie procedury były zgodne ze środkami administracyjnymi dla obszaru epidemicznego choroby więdnięcia sosny i zakażonego drewna oraz innymi obowiązującymi przepisami. Jako miejsce pobierania próbek wybrano las P. massoniana zainfekowany przez B. xylophilus w powiecie Xiangshan w mieście Ningbo w prowincji Zhejiang. P. massoniana, który zmarł z powodu choroby więdnięcia sosny, został ścięty w obrębie miejsca, w którym pobrano próbki.
    1. Zbierz okrągłe kłody (o grubości 5 cm) z górnej, środkowej i dolnej części głównego pnia ściętych drzew.
    2. Zebrane okrągłe kłody P. massoniana pokrój w plastry o grubości 0,5-1 cm, a następnie przytnij je w małe paski o długości 2-3 cm.
    3. Umieść małe drewniane paski w szczelnie zamkniętych torebkach i przechowuj je w laboratorium do dalszego wykorzystania.
  2. Ekstrakcja figure-protocol-1 B. xylophilus
    1. Przymocuj gumową rurkę do wąskiego końca szklanego lejka z długą szyjką o przybliżonej średnicy 15 cm. Zabezpiecz gumową rurkę za pomocą szczypcy. Umieść zmontowany lejek na stojaku na lejek.
    2. Zawiń małe drewniane paski całkowicie w jedną warstwę bibuły, a następnie umieść je w lejku. Dodaj wodę destylowaną do lejka, aż wszystkie drewniane paski zostaną zanurzone.
      UWAGA: Po odstawieniu przez 12-24 godziny nicienie wyemigrowały z drewnianych pasków i osiadły na dnie lejka10. Bibuła zapobiegała osiadaniu resztek drewna, jednocześnie umożliwiając nicienie.
    3. Powoli zwolnić kurek szczypcowy na dnie lejka i pozwolić, aby 2000-5000 μl mieszaniny wyciekło do szalki Petriego (5 cm średnicy) w celu przeprowadzenia badania mikroskopowego i identyfikacji morfologicznej.
    4. Zidentyfikuj figure-protocol-2 B. xylophilus , obserwując takie cechy, jak stylety, środkowa opuszka przełyku, kropelki lipidów i "palczaste" kształty ogona11.
    5. Pod mikroskopem przenieś pojedyncze figure-protocol-3 B. xylophilus na szkiełko, odsysając 10 μl płynu wraz z jednym nicieniem za pomocą pipety 10 μl za każdym razem. Powtórz ten proces 30 razy, aby zebrać około 300 μl mieszaniny zawierającej nicienie.
    6. Po ekstrakcji figure-protocol-4 B. xylophilus należy wysterylizować pozostałe paski drewna i zainfekowane materiały drewniane, aby zapobiec dalszemu zanieczyszczeniu.

2. Kontrola procesu regulacji osmotycznej

  1. Przygotowanie mieszaniny do regulacji osmotycznej
    1. Przygotować 8% roztwór wodny KCl.
    2. Za pomocą pipety dodać 10 μl 8% roztworu wodnego KCl do szkiełka zawierającego mieszaninę figure-protocol-5 B. xylophilus, otrzymując około 310 μl mieszaniny nicieni i roztworu KCl.
  2. Regulacja podwyższonego ciśnienia osmotycznego i odwodnienia figure-protocol-6 B. xylophilus
    1. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, pozwalając wodzie naturalnie odparować. Stopniowo zwiększałoby to ciśnienie osmotyczne otaczającego środowiska, powodując odwodnienie nicieni w ciągu około 30-60 minut.
      UWAGA: Operator musi tylko poczekać, aż woda naturalnie odparuje, aż kryształy KCL wytrącą się i obserwować stan nicieni pod mikroskopem. Potrzeba około 30-60 minut, aby 310 μl mieszaniny naturalnie odparowało, aż kryształy KCL wytrącą się.
    2. Obserwuj proces odwodnienia (np. zwijanie się ciała, agregacja itp.) figure-protocol-7 B. xylophilus pod mikroskopem. Kiedy woda całkowicie odparowuje i wytrącają się kryształy KCl, figure-protocol-8 B. xylophilus przestaje się poruszać i wchodzi w kryptobiozę.
  3. Niskotemperaturowe leczenie stresu kryptobiotycznego figure-protocol-9 B. xylophilus
    1. Umieść kryptobiotyczny figure-protocol-10 B. xylophilus w środowisku o stałej temperaturze -20 °C na 24 godziny.
  4. Regulacja obniżonego ciśnienia osmotycznego i nawodnienia figure-protocol-11 B. xylophilus
    1. Dodaj około 300 μl wody destylowanej wokół młodych osobników, które zostały poddane działaniu pipety w niskiej temperaturze. Proces rehydratacji, trwający około 30-60 min, stopniowo obniża ciśnienie osmotyczne otaczającego je środowiska.
    2. Obserwuj proces figure-protocol-12 nawadniania B. xylophilus (np. rozciąganie ciała, wznowienie ruchu itp.) pod mikroskopem. Oblicz wskaźnik przeżycia po 24 godzinach.

Wyniki

W 8% roztworze KCl, gdy woda odparowała, B. xylophilus początkowo wykazywał zauważalne "zwijanie się", figure-results-1 pozostając ruchliwym (ryc. 1A). Gdy woda całkowicie odparowała, nicienie przestały się poruszać i zwinęły się, z wklęsłymi powierzchniami i nagromadzonymi kropelkami lipidów (ryc. 1B), co wskazuje na ich wejście w stan kryptobiotyczny. Po dodaniu wody destylowanej do otaczającego środowiska, nicienie nawodniły się i ożywiły (ryc. 1C). Po odparowaniu wody pojawią się kryształy KCL (rysunek 1D). Rycina 1E przedstawia cechy figure-results-2 morfologiczne B. xylophilus.

Eksperyment z odwodnieniem wykazał, że w początkowym roztworze o stężeniu 8% KCl parowanie wody spowodowało figure-results-3 utratę wody przez B. xylophilus . Po odwodnieniu figure-results-4 B. xylophilus poddano stresowi niskotemperaturowemu w temperaturze -20 °C przez 24 godziny; średni wskaźnik przeżycia wynosił 92,1%11. W porównaniu ze wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 0% w grupie kontrolnej, która nie weszła w stan kryptobiotyczny, powyższe dane sugerują, że odwodnienie może znacznie zwiększyć wskaźnik figure-results-5 przeżycia B. xylophilus w warunkach niskiej temperatury.

Podczas fazy rehydratacji po kryptobiozie figure-results-6 B. xylophilus zaobserwowaliśmy, że 100% nicieni wykazywało "pęcherzyki" in vivo po przeniesieniu z 40% roztworu KCl do wody destylowanej (ryc. 2).

figure-results-7
Rycina 1: Proces odwodnienia-kryptobiozy-ponownego nawodnienia B. xylophilus.figure-results-8 Obraz ten ilustruje proces kryptobiozy u figure-results-9 B. xylophilus, w tym (A) etap odwodnienia, (B) etap kryptobiozy, (C) etap uwodnienia, (D) etap krystalizacji KCL i (E) figure-results-10 B. xylophilus. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rycina 2: Nagromadzenie granulek tłuszczu u nieożywionego figure-results-12 B. xylophilus. Obraz ten przedstawia stan figure-results-13 B. xylophilus po ponownym uwodnieniu, charakteryzujący się obecnością in vivo granulek tłuszczu w kształcie pęcherzyków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym badaniu figure-discussion-1 B. xylophilus został pobrany z martwego P. massoniana w Ningbo w prowincji Zhejiang. Należy zauważyć, że figure-discussion-2 B. xylophilus został wybrany z mieszanej populacji o różnych stadiach rozwojowych. W szczególności wybrano okrągłe kłody o dużym zagęszczeniu B. xylophilus, a następnie przeprowadzono badania figure-discussion-3 przesiewowe B. xylophilus. Zimą, kiedy minimalna dzienna temperatura w prowincji Liaoning wynosi około -20 °C, z martwych Pinus tabuliformis można uzyskać dużą liczbę pojedynczych gwiazd figure-discussion-4 B. xylophilus, co uprościło proces selekcji w tym eksperymencie12.

Podczas procesu kryptobiotycznego powolne tempo odwadniania nicieni korzystnie wpływa na ich przetrwanie i zapobiega strukturalnym uszkodzeniom ich białek13. Czas odwodnienia ma kluczowe znaczenie dla określenia wskaźnika figure-discussion-5 przeżycia B. xylophilus. W tym badaniu zastosowano roztwór KCl o początkowym stężeniu 8%, a jego stężenie zwiększano stopniowo wraz z naturalnym odparowywaniem wody, co pozwoliło figure-discussion-6 B. xylophilus powoli odwodnić się i wejść w kryptobiozę. Jeśli woda odparowuje zbyt szybko lub nicienie są umieszczane bezpośrednio w roztworze KCl o wysokim stężeniu, ich przeżywalność znacznie spada.

Metoda opisana w tym badaniu ma kilka zalet. Materiały eksperymentalne są łatwo dostępne, wymagają jedynie roztworu KCl i wody destylowanej do regulacji odwodnienia i ponownego nawodnienia figure-discussion-7 B. xylophilus. Procedury są proste: odwodnienie nastąpiło poprzez naturalne odparowanie, a nawodnienie osiągnięto przez dodanie wody destylowanej. Cały proces można zakończyć w ciągu 2 godzin. Metoda ta może pochwalić się wysokimi wskaźnikami sukcesu i przeżycia, przy czym większość figure-discussion-8 B. xylophilus wchodzi do kryptobiozy po odwodnieniu, a większość ożywia się po ponownym nawodnieniu, odpowiednio11.

Proponowana metoda ma zastosowanie do regulacji stanu kryptobiotycznego zarówno B. xylophilus, jak figure-discussion-9 i młodocianych osobników dyspersyjnych czwartego stadium (figure-discussion-10)14. Jednak może nie być skuteczny w przypadku rozmnażającego się B. xylophilus.

W ostatnich latach choroba więdnięcia sosny wywoływana przez B. xylophilus rozprzestrzeniła się z południowych Chin na obszary północne. figure-discussion-11 B. xylophilus, który zamieszkuje sosny w tych chłodniejszych północnych regionach, wykazuje większą odporność na zimno15. Proponowana metoda może indukować kryptobiozę u figure-discussion-12 B. xylophilus, zwiększając ich odporność na zimno i suszę. Reasumując, metoda ta może zapewnić wsparcie techniczne w badaniu mechanizmów odporności B. xylophilus na stres i mechanizmu przenoszenia choroby więdnięcia sosny.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Centralną Instytucję Naukową Pożytku Publicznego Basal Research Fund of State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (numer grantu CAFYBB2020ZY001-2), projekty badawcze przedsiębiorstw (202404016-4320) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 32271896).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zjeżdżalnia szklanaTereny biologiczneGS7101-752575 mm i razy; 25 mm i razy; 1 mm
Szklany lejek z długą szyjkąEksperymentalna technologia Nanjing KangluodaN/A150 mm
MikroskopPhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
szalka PetriegoEksperymentalna technologia Nanjing Kangluoda  TB-62493579274550 mm i razy; 50 mm
Szczypta KurkaEksperymentalna technologia Nanjing Kangluoda  TB-62497331174336 mm i razy; 11 mm  &czasy; 55 mm
PipetaEppendorf powiedział:312300001210– 100 &mikro; L
Chlorek potasu (KCL)Solarbio Nauki przyrodniczeZobacz materiał P9921500 gramów
Gumowa rurkaEksperymentalna technologia Nanjing KangluodaTB-6249234570947 mm i czasy; 5 mm
SterylizatorBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Bibuła Nadruk od serca do sercaKlasa M322,5 cm i razy; 21,5 cm

Bibliografia

  1. Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
  2. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
  3. Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
  4. Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
  5. Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
  6. Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
  8. Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
  9. Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
  10. Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
  11. Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
  12. Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
  13. Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
  14. Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
  15. Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukcja kryptobiozynicie sosnym odociane trzeciego stadiumanhydrobiozaprotok odwodnieniastres niskotemperaturowyroztw r chlorku potasuprze ywalno po rehydratacji

Powiązane artykuły