Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowego określania procentu płytek krwi (TF) za pomocą cytometrii przepływu pełnej krwi, oceniając białko: (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Przedstawiono również wskazówki dotyczące oceny trombocytów TF-dodatnich w osoczu bogatym w płytki.

Streszczenie

Podgrupa krążących ludzkich płytek komórkowo przechowuje czynnik tkankowy (TF), kluczowy aktywator kaskady krzepnięcia krwi i powstawania zakrzepów. Po aktywacji płytek krwi TF jest wystawiany na błonę komórkową, gdzie wiąże się z FVII, co ostatecznie prowadzi do powstawania trombiny. Biorąc pod uwagę, że (1) poziom płytek TS-dodatnich wzrasta w różnych warunkach klinicznych, co przyczynia się do fenotypu protrombowego pacjenta, oraz (2) różne leki mogą modulować ekspresję TF związaną z płytkami, cenna jest ustandaryzowana metoda oceny płytek TF-dodatnich, ponieważ jej ocena była w przeszłości kontrowersyjna. Przedstawiamy tutaj protokół pomiaru procentu płytek TF-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej w osoczu pełnym i bogatopłytkowym (PRP)/wypłukanych płytkach. Protokół ten ma na celu szczegółowe instrukcje dotyczące ilościowego określenia procentu trombocytów TF-dodatnich poprzez ocenę białka (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Pierwsza sekcja dostarcza niezbędnych informacji do prawidłowego przeprowadzenia pobierania krwi, aby upewnić się, że procedury przedanalityczne nie wpływają na wyniki. Następnie protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki i procedurach znakowania do analizy cytometrii przepływowej. Szczegółowe kroki stymulacji komórek, oznaczania, utrwalania i permeabilizacji – tam, gdzie to konieczne – zostały przedstawione. Na koniec opisano instrukcje dotyczące ustawień cytometrii przepływowej, aby prawidłowo zidentyfikować populację płytek i analizować zdarzenia TF-dodatnie. Na koniec, metoda obejmuje procedurę przygotowania PRP, jeśli płytki krwi TF-dodatnie mają być mierzone w izolowanych płytkach. Ponieważ tylko część płytek zawiera TF, ważne jest, aby upewnić się, że nie zostaną one utracone podczas etapów wirowania niezbędnych do uzyskania PRP.

Wprowadzenie

Czynnik tkankowy (TF), glikoprotein transbłonowy i kluczowy aktywator kaskady krzepnięcia krwi, jest wyrażany przez podzbiór, ~20%-30%, krążących ludzkich płytek^{krwi 1}, szczególnie tych o większym rozmiarze². Po aktywacji przez klasycznych agonistów płytek, takich jak adenozynodifosforan (ADP) i trombina, płytki krwi odsłaniają funkcjonalnie aktywne TF na swojej powierzchni w sposób zależny od stężenia, co pozwala im wiążyć czynnik VII/VIIa, co ostatecznie prowadzi do generacji trombiny 1,3,4,5,6. Warto zauważyć, że w stanach patologicznych, takich jak choroba wieńcowa (CAD)⁷, ciężki ostry zespół oddechowy-koronawirus-2 (SARS-CoV-2)⁸, migrena z aurą związaną z otworem jajowym (MHA-PFO)⁹, nowotwor¹⁰ oraz sepsa¹¹, liczba płytek krwionośnych TF-dodatnich znacznie wzrasta, przyczyniając się do większego ryzyka zakrzepowowego obserwowanego w tych warunkach klinicznych.

Pomimo tych przekonujących dowodów, wykrywanie trombocytów TF-dodatnich pozostaje przedmiotem debat w środowisku naukowym ^6,12,13. Wyzwania metodologiczne, w tym zmienne przedanalityczne, przygotowanie próbki oraz specyficzność przeciwciał, zostały zasugerowane jako możliwe przyczyny sprzecznych wyników przedstawionych w literaturze 2,4,12,14. Dlatego kluczowe jest ustanowienie standaryzowanego testu opartego na dobrze określonym protokole pomiaru TF w ludzkich płytkach krwi.

W tym kontekście cytometria przepływu pełnej krwi jest jedyną technologią umożliwiającą analizę płytek TF-dodatnich przy minimalnym obsłudze próbek, co jest kluczowe, aby uniknąć utraty tej podgrupy płytek.

W tym artykule proponujemy protokół pomiaru TF związanego z płytkami krwi za pomocą cytometrii przepływu całej krwi, oceniając białko (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Instrukcje są również podawane, jeśli wymagana jest ocena płytek TF-dodatnich w osocze bogatym w płytki krwi (PRP).

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Instytucji (nr 70/24, CE 18.06.24), a wszyscy dawcy krwi uzyskali pisemną świadomą zgodę. Protokół przeprowadzi użytkownika przez siedem głównych kroków (Rysunek 1). Pierwszy krok dotyczy procedury pobierania próbek krwi. Kroki 2 i 3 określają protokół miareczkowania przeciwciał oraz przygotowanie próbki do analizy intrakomórkowej ekspresji TF przy użyciu monoklonalnego przeciwciała (mAb) znakowanego przez fitoerytrynę (PE) αCD142/HTF1. Krok 4 opisuje protokół oceny białka eksponowanego na powierzchni płytek krwi przy użyciu metody pośredniego barwienia αCD142/HTF1 mAb. Ze względu na steryczną utrudnienie fluorochromu, mAb znakowany PE używany do barwienia wewnątrzkomórkowego nie wiąże się z domeną katalityczną białka wystawionego na powierzchnię. Dlatego proponuje się protokół pośredniego barwienia za pomocą wtórnego mAb znakowanego przez Alexa Fluor 633. Kroki 5 i 6 szczegółowo opisują fazy analizy cytometrii przepływowej. Ostatni etap określa procedurę przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP), aby uniknąć utraty dużej subpopulacji płytek krwi. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Odstawienie krwi

UWAGA: Pobieranie krwi z ludzi powinno być przeprowadzane wyłącznie po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej.

1. Pobieranie próbek krwi przez obwodowe pobieranie żył lub igiełkowych z ramienia niedotkniętego infuzjami żylnymi obwodowymi, najlepiej z żyły przedkubitalnej.
   1. Do pobrania żylnych obwodowych pobierania żylnych należy założyć opaski uciskową, a po wprowadzeniu igły motylkowej G19 do żyły usunąć ją, aby zapobiec aktywacji płytek krwi (Rysunek 2).
      UWAGA: Nie używaj igły motylkowej mniejszej niż G21, aby uniknąć aktywacji płytek.
   2. W przypadku pobierania żylnych z użyciem kaniuli igłowej nie zakładaj opaski uciskowej w żadnym momencie podczas pobierania. W razie potrzeby przed podaniem próbki przemyj ją roztworem soli fizjologicznej 0,9%. Zawsze wyrzucaj pierwsze 5 ml krwi przed napełnianiem probówek.
2. Pobierz 2 mL krwi do wakutainera EDTA (do pomiaru liczby komórek). Delikatnie wymieszaj tubkę trzy razy, aby zapewnić pełne połączenie krwi i antykoagulantu.
3. Pobrać krew do wakutainera z cytrynianem sodu o stężeniu 0,129 M w celu analizy ekspresji TF powiązanej z płytkami krwi. Ostrożnie napełnij wakutainer do wskazanego poziomu, aby utrzymać prawidłowy stosunek krwi do antykoagulantów. Delikatnie odwróć rurki pięć razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie krwi z antykoagulantem, zapobiegając powstawaniu skrzepów i hemolizie próbek.
   UWAGA: Zaleca się stosowanie antykoagulantu 0,129 M cytrynianu w celu optymalizacji wykrywania TF powiązanych z płytkami krwi za pomocą klona HTF1 αCD142 mAb. Jeśli konieczne jest wyizolowanie płytek krwi pełnej – należy pobrać drugi wakutainer o stężeniu 0,129 M cytrynianu sodu do przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP).
4. Trzymaj wakuaanty pionowo w tubce. Nie potrząsaj nimi na obracanych ani przechylających się płytach i unikaj pneumatycznych systemów transportowych. Nie trzymaj próbek krwi w lodówce, aby zapobiec aktywacji płytek.
   UWAGA: Próbki krwi powinny być najlepiej przetwarzane w ciągu 15 minut po wycofaniu, jeśli ma być zmierzony kolejny marker aktywacji płytek krwi związany z granulami wraz z TF. W przeciwnym razie próbki powinny być przetwarzane nie później niż 3 godziny od pobrania (Rysunek 3).

2. Dawkowanie przeciwciał przeciwtlenowych (do oceny wewnątrzkomórkowej TF)

UWAGA: Określanie wewnątrzkomórkowo przechowywanych TF przeprowadza się za pomocą mAb PE-αCD142/HTF1.

1. Miareczkowanie przeciwciał za pomocą kulek
   UWAGA: Użycie kulek pozwala zdefiniować właściwą ilość przeciwciał (czyli stężenie przeciwciał powodujące największe rozdzielenie pików fluorescencyjnych między próbkami dodatnimi a ujemnymi). Analiza ta przeprowadza się na dwóch próbkach: jednej naprawdę pozytywnej, drugiej naprawdę negatywnej. Stężenie przeciwciał nie jest podawane przez producenta (patrz Tabela materiałów), dlatego miareczkowanie przeciwciał przeprowadza się przy użyciu pięciu punktów rozcieńczenia.
   1. Wiruj przeciwciało w dawce 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aby przygotować pięć punktów rozcieńczenia przeciwciał, pipetować 40 μL przeciwciał do probówki 1 oraz 20 μL PBS do probówek 2 do 5. Wykonaj cztery kolejne rozcieńczenia seryjne 1:2, przenosząc 20 μL z rurki 1 do rurki 2 i dalej.
   2. Przygotuj jedną probówkę na każdą objętość przeciwciał do testu. Dodaj jedną kroplę ujemnych koralików i jedną kroplę pozytywnych do każdej probówki. Natychmiast dodaj 20 μL każdego rozcieńczenia przeciwciał do probówki i wiru. Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   3. Dodaj 1 ml 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, do każdej probówki i wiru.
   4. Pobierz próbki na cytometrze przepływowym zgodnie z instrukcjami producenta i zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w bramce "kulki". Optymalne stężenie przeciwciał to takie, które zapewnia największą separację między dodatnimi a ujemnymi szczytami.
2. Titracja przeciwciał na płytkach krwi
   UWAGA: Z zasady optymalne stężenie przeciwciał zidentyfikowane za pomocą kulek powinno być weryfikowane na komórkach do barwienia – w tym przypadku na płytkach krwi pełnej krwi.
   1. Fiksacja
      1. Delikatnie odwróć wakutainer z cytrynianem sodu pięć razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykrzep. Przelej 50 μL krwi do probówki o pojemności 1,5 mL, dodaj 950 μL 1% paradehydu (PFA), delikatnie wymieszaj i inkubuj próbkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Wiruj próbkę w 1 500 x g przez 5 minut, z hamulcem, w temperaturze pokojowej.
      3. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet, delikatnie pipetując 1 mL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg^++, pH 7,4.
   2. Permeabilizacja
      1. Przygotuj jedną probówkę dla każdego objętości przeciwciał do badania (zmierz objętość zidentyfikowaną przy miareczce kulek wraz z wyższym i mniejszym rozcieńczeniem, np. 10 μL, 5 μL, 2,5 μL jeśli zidentyfikowana objętość wynosi 5 μL) oraz jedną probówkę do kontroli Fluorescence Minus One (FMO).
      2. Do każdej probówki należy podać 100 μL stałej krwi i wirować je w 1 500 x g przez 5 minut, z hamulcem, w temperaturze pokojowej.
      3. Usuń supernatant, ponownie zawiesij pellet w 100 μL 0,1% Triton-PBS, aby przepuścić próbki, i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Barwienie
      1. Wiruj przeciwciało w stężeniu 17 000 x g przez 5 minut w 4 °C. Dodaj wymagane objętości przeciwciał do każdej probówki zgodnie z ustaleniami w 2.2.2.1 i wymieszaj.
      2. Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej.
      3. Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, do każdej probówki i wymieszaj. Pobierz próbki na cytometrze przepływowym (patrz krok 5).
      4. Oblicz indeks plamy według następującego wzoru¹⁵:
                                
         gdzie MFI_pos to średnia intensywność fluorescencji zdarzeń pozytywnych, MFI_neg to intensywność zdarzeń ujemnych, a SD to odchylenie standardowe populacji ujemnej.
      5. Wybierz najniższe stężenie przeciwciał, które zapewnia najwyższy wskaźnik barwienia.
         UWAGA: W obecnych warunkach eksperymentalnych najwyższy wskaźnik barwienia dla mAb PE-αCD142/HTF1 osiąga się przy użyciu 5 μL przeciwciała.

3. Przygotowanie próbki do analizy ekspresji TF wewnątrzkomórkowej cytometrią przepływową

1. Fiksacja i permeabilizacja całej krwi
   1. W przypadku analizy TF wewnątrzkomórkowej należy utrwalić i przepuszczać krew pełną zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.
2. Procedura barwienia
   UWAGA: W następującym protokole populacja płytek krwi jest identyfikowana za pomocą barwienia αCD61-PerCP. Inne wskaźniki populacji mogą być używane według uznania operatora.
   1. Przygotuj jedną probówkę do kontroli fluorescence minus One (FMO) i jedną do barwienia TF. Do każdej rurki należy dodać 100 μL stałej i permeabilizowanej krwi pełnej wraz z przeciwciałami wymienionymi w Tabeli 1.
   2. Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej.
   3. Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, do każdej probówki i wymieszaj. Przechowuj zabarwione próbki w ciemności do czasu analizy cytometrii przepływowej (patrz krok 5).
      UWAGA: Aby obliczyć macierz kompensacji, przygotuj próbki zgodnie z Tabelą 2.

4. Przygotowanie próbek do analizy ekspresji TF związanej z powierzchnią komórek w płytkach spoczynkowych i aktywowanych

UWAGA: Do wykrywania tlenu tlenowego związanego z powierzchnią komórek należy stosować nieoznakowane αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) oraz Alexa Fluor 633 kozi antymyszy IgG (2 mg/ml) jako przeciwciało wtórne do wykrywania sygnałów. Adenozyna 5'-difosforan (ADP) jest stosowany jako agonista płytek krwi do indukowania ekspozycji na TF na powierzchni komórki. Przeciwciało oznakowane PE jest używane jako wskaźnik populacji płytek krwi, aby zminimalizować przelewanie, co jest kontrolowane przez kompensację sygnału.

1. Barwienie TF
   1. Rozcieńcz αCD142/HTF1 mAb 1:100 w 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, aby uzyskać stężenie robocze 10 μg/mL. Rozcieńcz Alexa Fluor 633 koziego przeciwmysiego IgG 1:10 w 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, aby uzyskać stężenie robocze 200 μg/mL.
   2. Przygotuj trzy probówki i podaj 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, zgodnie z Tabelą 3.
   3. Podawaj 7,5 μL rozcieńczonego αCD142/HTF1 mAb i dodaj 5 μL ADP (200 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM ADP. Delikatnie odwróć wakutainer cytrynianowy 5 razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykrzep, a następnie podaj 5 μL pełnej krwi do każdej probówki. Delikatnie mieszaj próbki.
   4. Inkubuj próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
2. Utrwalanie próbki
   1. Każdą próbkę utrwalaj, dodając 300 μL 1% paradehydu (PFA) i inkubuj próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Oznaczone próbki zafiksowane 1% PFA i przechowywane w temperaturze 4 °C pozostają stabilne do 4 dni.
   2. Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, do każdej probówki i wiruj w 1500 x g przez 5 minut z hamulcem w temperaturze pokojowej.
   3. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 95 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, delikatnie pipetując.
3. Barwienie przeciwciałem wtórnym
   1. Podaj 5 μL rozcieńczonego Alexa Fluor 633 IgG i inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
   2. Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, do każdej probówki i wiruj w 1500 x g przez 5 minut z hamulcem w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 95 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4.
   3. Do każdej probówki należy podać 5 μL αCD41-PE (patrz Tabela 4). Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej.
   4. Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, pH 7,4, do każdej probówki i wymieszaj.
   5. Przechowuj zabarwione próbki w ciemności do analizy cytometrii przepływowej (patrz krok 6).
      UWAGA: Aby obliczyć macierz kompensacji, przygotuj próbki zgodnie z krokami 4.1-4.3 oraz zgodnie z Tabelą 5 i Tabelą 6.

5. Analiza ekspresji TF wewnątrzkomórkowej cytometrią przepływową

UWAGA: Poniższa procedura dotyczy akwizycji na cytometrze przepływowym referencyjnym; dlatego zgłoszone miejsca i wykresy powinny być uznane za reprezentatywne. Protokół ten można zastosować do każdego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości. Włącz cytometr przepływowy na długo przed pobraniem próbki, aby zapewnić stabilność lasera. Dokładnie umyj komorę fluidyczną i przepływową, ponieważ płytki są małe, a wszelkie zanieczyszczenia komórkowe mogą zakłócać wizualizację populacji płytek w wykresie punktowym obszaru rozpraszania przedniego/bocznego (FSC-A/SSC-A). Wykonaj kontrolę jakości przy użyciu kulek QC zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie umyj fluidyki, aby usunąć pozostałości kulek.

1. Konfiguracja przejęcia
   1. Stwórz wykres punktowy FSC-A/SSC-A na skali logarytmicznej wyświetlający Wszystkie zdarzenia (Rysunek 4A). Stwórz wykres kropkowy CD61-A/SSC-A na skali logarytmicznej wyświetlający Wszystkie zdarzenia (rysunek 4B).
   2. Dostosowuj wzmocnienie PE (Y-585) i PerCP (B690) zgodnie z codzienną kontrolą jakości. Ustaw próg około 2000 dla SSC-H i do 1000 dla PerCP (B690-H), aby zobrazować populację płytek. Ustaw przepływ na NISKI.
   3. Narysuj obszar między 10³ a 10⁵ o nazwie "CD61⁺", aby zidentyfikować populację płytek.
   4. Zdobądź pojedyncze metody kontroli barw, aby obliczyć macierz kompensacyjne, a następnie pobierz próbki. Zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w bramce "CD61⁺" (rysunek 4D,E). Zacznij nagrywać 5-10 sekund po rozpoczęciu pobierania próbki.

6. Analiza cytometrii przepływowej ekspresji TF na powierzchni

1. Wykonaj wykres kropkowy FSC-A/SSC-A na skali logarytmicznej z Wszystkimi Zdarzeniami (Rysunek 5A) oraz wykres kropkowy CD41-A/SSSC-A na skali logarytmicznej z Wszystkimi Zdarzeniami (Rysunek 5B).
2. Dostosuj wzmocnienie Alexa Fluor 633 i wzrost PE (Y-585) zgodnie z codzienną kontrolą jakości, ustaw próg około 1000 na SSC-H i na 2500 na PE (Y585-H), aby zwizualizować populację płytek krwi, jak pokazano na Rysunku 5B. Ustaw przepływ na NISKI.
3. Narysuj obszar między 10⁴ a 10⁵ o nazwie "CD41⁺", aby zidentyfikować populację płytek.
4. Zdobądź pojedyncze metody kontroli barw, aby obliczyć macierz kompensacyjne, a następnie pobierz próbki. Zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w bramce "CD41⁺" (rysunek 5D,E). Zacznij nagrywać 5-10 sekund po rozpoczęciu pobierania próbki.

7. Analiza płytek krwi TF-dodatnich w plazmie bogatej w płytki

1. Przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP)
   UWAGA: Izolacja płytek musi być przeprowadzona w temperaturze pokojowej, aby zapobiec aktywacji komórek. Upewnij się, że temperatura odczynników i instrumentów wynosi od 18 °C do 22 °C. Unikaj szybkiego pipetowania i intensywnego potrząsania przez cały proces.
   1. Delikatnie wymieszaj wakutainer o stężeniu 0,129 M sodu 5 razy i zmierz liczbę płytek dwukrotnie na liczniku krwinek, aby obliczyć procent odzyskanych płytek krwi.
      UWAGA: Użyj średniej wartości obu określeń jako stężenia płytek krwi.
   2. Wiruj wakutainer o stężeniu 0,129 M sodu w dawce 100 x g przez 10 minut, bez hamulca, w temperaturze pokojowej (Rysunek 6). Zbierz uzyskany PRP, przelej go do probówki polipropylenowej o pojemności 10 mL i zapisz zebraną objętość.
      UWAGA: Nie używaj rurek polistyrenowych, aby zapobiec aktywacji płytek.
   3. Policz płytki krwi dwukrotnie w PRP za pomocą licznika krwi i obliczaj procent regeneracji płytek krwi w następujący sposób:
      
      UWAGA: Jeśli wyzdrowienie jest niższe niż 65%, populacja płytek krwi nie jest w pełni reprezentatywna dla tej w krwi pełnej krwi. Rozważ wyrzucenie przygotowania.
2. Przygotowanie próbki do analizy cytometrii przepływowej ekspresji TF wewnątrzkomórkowej i powierzchniowej w PRP
   1. Aby analizować intrakomórkową i powierzchniową ekspresję TF w PRP, należy stosować ten sam protokół, co opisany w analizie pełnej krwi (patrz kroki 3-6).

Wyniki

Podsumowanie analizy ekspresji TF związanej z płytkami krwi opisano na diagramie przepływu pokazanym na Rysunku 1. Kroki obejmują: (1) Pobranie krwi: Pobranie krwi z ludzkiej żyły obwodowej, najlepiej z żyły przedkubitalnej, za pomocą igły motylkowej G19 lub kaniuli igłowej bez opaski uciskowej oraz z wakuanerami zawierającymi antyzakrzepły. (2) Przetwarzanie próbek: Przetwarzanie próbek zgodnie z typem oceny TF, która ma być wykonana. (3) Oznaczanie próbek: Oznaczanie próbek konkretnymi przeciwciałami. (4) Analiza cytometrii przepływowej: Analiza próbek w celu wykrycia powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych TF.

Podczas pobierania krwi należy zwrócić szczególną uwagę na zapobieganie aktywacji płytek. W tym celu stosuje się dwie środki ostrożności: usunięcie opaski uciskowej krótko po włożeniu igły do żyły oraz odrzucenie krwi w pierwszym pobranym wakutainerze. Bez użycia opaski uciskowej populacja płytek, pokazana na wykresie kropkowym FSC-A/SSC-A, ma typowy kształt, jak pokazano na rysunku 2A. Natomiast przy użyciu opaski uciskowej właściwości fizyczne populacji płytek krwi powodują wydłużony kształt przypominający morfologię obserwowaną po stymulacji klasycznym agonistą płytek, takim jak ADP (Rysunek 2B,C).

Eksperymenty przeprowadzone w celu oceny stabilności ekspresji TF powiązanej z płytkami krwi w czasie wykazały, że była ona stabilna przez 3 godziny od pobrania krwi (Rysunek 3). Łącząc pomiar ekspresji TF z markerem aktywacji płytek, takim jak P-selektyna, zaleca się jak najszybsze przetworzenie próbki krwi, aby uniknąć degranulacji płytek.

Do analizy wewnątrzkomórkowo przechowywanych TF cała krew jest utrwalana w 1% PFA, permeabilizowana PBS-Triton, a następnie barwiona przeciwciałem znakowanym przez PE. Populacja płytek krwi została zidentyfikowana na wykresie logarytmicznym FSC-A/SSC-A (Rysunek 4 A,D) oraz za pomocą barwienia αCD61 mAb (Rysunek 4 B,E). Wyniki analizy intrakomórkowej TF u zdrowych osób (n = 377) wskazały, że TF występuje w 26,8% ± 4,8% krążących płytek krwi (Rysunek 4F).

Analiza cytometrii przepływowej ekspresji TF związanej z powierzchnią została przeprowadzona w warunkach spoczynku oraz po stymulacji komórek ADP 10 μM. Cała populacja płytek krwi, oznaczona αCD41 mAb, została zidentyfikowana na logarytmicznym wykresie FSC-A/SSC-A (Rysunek 5A,B). Wyniki wykazały, że u zdrowych osób (n = 377) TF wyraża się w 2,8% ± 1,4% spoczynkowych płytek krwi (rysunek 5D-F) i wzrasta do 24,5% ± 5,8% po aktywacji (rysunek 5G-I). TF wyraża się przez podzbiór płytek o największym rozmiarze (rysunek 5D, G, zielone kropki). Ponadto analiza za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wskazuje, że sygnał TF jest związany wyłącznie z dodatnimi zdarzeniami αCD61, a nie z dodatnimi αCD45 (Rysunek 7).

Jak wspomniano wcześniej, TF jest przechowywana w podzbiorze płytek krwi charakteryzujących się największym rozmiarem w całej populacji. Dlatego ważne jest, aby nie tracić tej frakcji płytek podczas przygotowania PRP. Zgodnie z wskazaniami zawartymi w sekcji metody (krok 7) możliwe jest wyizolowanie populacji płytek krwi w PRP, która jest reprezentatywna dla tej obecnej we krwi pełnej krwi. Jak pokazano na Rysunku 6, wykres punktowy cytometrii przepływowej populacji płytek uzyskany przez 100 x g wirowania pełnej krwi jest bardzo podobny do wykresu krwi pełnej pod względem rozkładu FSC (Rysunek 6 A,B). Dla porównania, przy użyciu większej siły i dłuższego czasu wirowania, jak często podawane w literaturze^{12, 14, 16}, populacja odzyskanych płytek krwi ma niższy FSC w porównaniu do krwi pełnej (rysunek 6C), co sugeruje utratę płytek o większych rozmiarach, które są tymi wysoce TF-dodatnimi.

Rysunek 1: Schemat do analizy ekspresji TF powiązanej z płytkami krwiotoplowymi i izolacji płytek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wykresy gęstości populacji płytek krwi analizowane za pomocą cytometrii przepływu całej krwi. (A) Populacja płytek krwi analizowana w próbce krwi pobranej bez opaski uciskowej lub (B) z uciskiem uciskiem. (C) Populacja płytek krwi stymulowana ADP jest raportowana do porównania. WBC: Białe krwinki; RBC: Czerwone krwinki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Stabilność ekspresji TF związanej z powierzchnią komórek w czasie. Ekspresja krwi spoczynkowej związana z trombocytami krwi w spoczynku została przeanalizowana w 4 różnych punktach po pobraniu krwi zgłoszonej na osi x w następujący sposób: T0 = bezpośrednio po pobraniu krwi; T1 = 1 godzina po pobraniu krwi; T2 = 2 godziny po pobraniu krwi; T3 = 3 godziny po pobraniu krwi. Dane podawane są jako średnia ± SD, n = 3. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowo przechowywanych TF. Populacja płytek krwi (czerwona) w krwi pełnej jest identyfikowana na wykresie punktowym FSC/SSC-A (A,D) oraz za pomocą barwienia αCD61 mAb (B,E). Ekspresja TF jest analizowana za pomocą mAb PE-αCD142/HTF1 (zielone kropki). Wykresy histogramowe służą do identyfikacji zdarzeń negatywnych (C) i dodatnich (F). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej płytki krwi TF-dodatniej związanych z powierzchnią. Świeża krew pełna jest oznaczana αCD142/HTF1 mAb, następnie utrwala się 1% PFA i oznaczała wtórnym mAb oraz αCD41 mAb. Populacja płytek krwi (czerwona) w krwi pełnej jest identyfikowana na wykresie punktowym FSC/SSC-A (A,D,G) oraz za pomocą barwienia αCD41 mAb (B,E,H). Ekspresja TF w stanie spoczynku (D-F) oraz po stymulacji ADP (G-I) jest ilościowo określana przez oznakowanie αCD142/HTF1 mAb (zielone kropki). Przedstawiane są reprezentatywne wykresy histogramowe dla próbek ujemnych (C) i dodatnich (F,I). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Wpływ różnych sił wirowania na przygotowanie PRP. (A-C) Analiza cytometrii przepływowej populacji płytek krwi pełnej w krwi pełnej PRP, przygotowana w dawce 100 x g i 350 x g. Zakres referencyjny populacji płytek krwi na FSC-H/SSC-H jest oznaczony przerywanymi liniami. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Ocena ekspresji TF w płytkach krwi i leukocytach za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywne obrazy kanałowe jasnego pola (BF, szary), czynnika tkankowego (TF, zielony), αCD61 (czerwony), αCD45 (szary), barwienia jąder Hoechst (magenta) oraz obrazu kompozytowego (merge), uzyskanego przy 60-krotnym powiększeniu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Identyfikacja probówki	Naprawa/trwała krew pełna (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tabela 1: Protokół barwienia do analizy ekspresji TF wewnątrzkomórkowej cytometrią przepływową.

Identyfikacja probówki	Naprawa/trwała krew pełna (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Nieskażone	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tabela 2: Pojedyncza kontrola barwienia dla matrycy kompensacji wewnątrzkomórkowej ekspresji TF.

Identyfikacja probówki	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Świeża krew pełna (μL)	PFA 1% (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Odpoczynek	87.5	7.5	-	5	300
ADP aktywowane	82.5	7.5	5	5	300

Tabela 3: Protokół barwienia do analizy cytometrii przepływowej ekspresji TF na powierzchni.

Identyfikacja probówki	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Odpoczynek	90	5	5
ADP aktywowane	90	5	5

Tabela 4: Protokół barwienia przeciwciał wtórnych do analizy TF związanej z powierzchnią.

Identyfikacja probówki	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Świeża krew pełna (μL)	PFA 1% (μL)
Nieskażone	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tabela 5: Przygotowanie macierzy kompensacyjnej do analizy TF wewnątrzkomórkowej.

Identyfikacja probówki	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Nieskażone	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tabela 6: Przygotowanie macierzy kompensacyjnej do analizy TF związanej z powierzchnią.

Dyskusja

Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły oceny płytek krwi TF-dodatnich za pomocą cytometrii przepływu krwi, uwzględniając analizę białka wyrażanego zarówno wewnątrz, jak i na powierzchni płytek.

W ciągu ostatnich 20 lat obecność TF w ludzkich płytkach krwi została dobrze udokumentowana 1,2,3,4,5,17,18. Podzbiór płytek, stanowiący 20%-30% całkowitej populacji płytek^{krwi 2}, ekspresjonuje to białko, wzmacniając koncepcję heterogeniczności płytek, która staje się coraz bardziej istotna ^{w tej} dziedzinie^. Warto wspomnieć, że płytki TF-dodatnie mają wysoką średnią objętość płytek, co wcześniej wykazała wysoce czuła cytometria przepływowa². Kluczowe jest uwzględnienie tej cechy, zwłaszcza gdy ekspresję TF musi być analizowana w płytkach krwi wyizolowanych od innych składników krwi. Możliwe jest, że etap wirowania stosowany do izolacji płytek krwi może skutkować utratą dużych płytek^{krwi 2}. Ten problem przedanalityczny jest prawdopodobnie jednym z głównych powodów kontrowersji – która trwała do kilku lat temu – dotyczącej obecności TF w płytkach^{krwi 7,12,13}. Cytometria pełnego przepływu krwi jest w tym zakresie niezwykle użytecznym podejściem, umożliwiającym analizę wszystkich podzbiorów płytek krwi bez konieczności ich izolowania.

Drugim powodem, który skłonił do dyskusji na temat obecności TF w płytkach krwi, był wybór antyludzkiego przeciwciała TF użytego do analizy. Istnieje wiele komercyjnie dostępnych przeciwciał, które zostały wykorzystane do oceny TF związanej z płytkami krwi i które rozpoznają różne epitopy białka. Niektóre przeciwciała, takie jak klony TF9-10H10 ^3,21,22 oraz VIC7 ^1,3, wiążą się z niefunkcjonalnym obszarem TF bez wpływu na wiązanie FVII/FVIIa. Inne przeciwciała, w tym klony VD8 ^1,2,3 oraz HTF1¹⁸ – ten ostatni używany w obecnych protokołach – rozpoznają miejsce katalityczne białka, konkurując z FVII/FVIIa o wiązanie z TF, blokując tym samym jego funkcję prokoagulantną. Ważne jest, aby zauważyć, że w zależności od stanu glikozylacji domeny zewnątrzkomórkowej oraz od konformacji miejsca katalitycznego TF²³, które może być modyfikowane w określonych warunkach (np. podczas aktywacji komórek lub choroby), niektóre z tych przeciwciał mogą różnicowanie rozpoznawać, za pomocą cytometrii przepływowej, powierzchniową ekspresję TF powiązaną z płytkami krwi. Ponadto warunki barwienia, czyli czy próbka do analizy jest świeża, stała i/lub permeabilizowana, mogą wpływać na konformację epitopu, a tym samym na wiązanie antygen-przeciwciało¹⁴.

Kolejnym czynnikiem zasługującym na uwagę jest wybór fluorochromu wiązanego z przeciwciałem. Ponieważ TF jest wyrażane tylko przez 20%-30% populacji płytek krwi, fluorochromy o niskiej emisji wraz z zastosowaniem cytometrów przepływowych o niskiej czułości mogą nie być odpowiednie do rozróżniania sygnałów o niskiej wartości dodatniej. Z tego powodu preferowane są przeciwciała oznaczane jasnymi fluorochromami, takimi jak PE lub APC. Warto jednak zauważyć, że duży rozmiar fluorochromu, takiego jak PE, może utrudniać wiązanie oznakowanego przeciwciała z białkiem²⁴. Aby rozwiązać ten problem, w obecnym protokole barwienie powierzchniowe TF było wykonywane jako pośrednie oznakowanie niesprzężonym αCD142/HTF1 mAb, a następnie ujawniane za pomocą przeciwciała wtórnego. Hamownictwo PE-steryczne nie wpływa na wiązanie αCD142/HTF1 mAb z TF przechowywanymi wewnątrzkomórkowo, gdzie miejsce katalityczne jest bardziej dostępne dla wiązania przeciwciał. Jest jasne, że ocena powierzchniowej ekspresji TF związanej z płytkami krwi poprzez bezpośrednie oznakowanie, w porównaniu do pośredniego, byłoby lepsze – jeśli to możliwe – aby skrócić czas przetwarzania próbki. Takie podejście musi jednak uwzględniać kluczowe kwestie wspomniane powyżej oraz związane ze zdolnością wiązania kilku komercyjnie dostępnych przeciwciał do trombocytów TF, wynikającą z konformacji samego białka, warunków barwienia oraz sterycznej utrudnienia różnych stosowanych fluorochromów. Dlatego, aby uniknąć fałszywie negatywnych wyników, bezpośrednie oznakowanie powierzchniowo eksprimowanych trombocytów związanych z trombocytami wymaga obowiązkowego, starannego procesu optymalizacji. Te aspekty są przedmiotem trwającego badania mające na celu ocenę skuteczności bezpośredniego barwienia różnymi komercyjnie dostępnymi klonami przeciwciał oznaczanych fluorochromami w całości.

Kilka badań wykazało, że ekspresja TF jest podwyższona w różnych stanach patologicznych, charakteryzujących się wysokim ryzykiem zakrzepowym 8,9,10,11,17. Ostatnio przedstawiono dowody na to, że poziomy płytek krwi TF-dodatniej, dokładnie określane analizą cytometrii przepływowej, mogą identyfikować pacjentów sercowo-naczyniowych, którzy mimo optymalnej odpowiedzi na leczenie aspiryną i antagonistami P2Y₁₂, utrzymują wysokie ryzyko zakrzepowe²⁵. Rzeczywiście, TF związane z płytkami krwi jest funkcjonalnie aktywna i potencjalnie może wspierać generację trombin ^1,3,4. W tym kontekście możliwość przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej na kilku mikrolitrach krwi jest istotną zaletą umożliwiającą rozszerzenie analizy TF związanej z płytkami krwi na środowisko kliniczne. W tym celu warto wspomnieć, że walidacja pomiaru TF związanego z naczyniami krwi za pomocą cytometrii przepływowej była celem międzynarodowego projektu, który niedawno koordynowaliśmy przy wsparciu Międzynarodowego Towarzystwa Hemostazy i Zakrzepicy, mający na celu dostarczenie metodologicznych wskazówek do oceny.

W przeciwieństwie do innych klasycznych markerów aktywacji płytek, takich jak P-selektyna i agregaty krwiotekowo-płytkowo-leukocytowe, które muszą być analizowane bezpośrednio po pobieraniu krwi, aby uniknąć artefaktów, ekspresja TF jest znacznie bardziej stabilna. W rzeczywistości próbka krwi może zostać przetworzona w ciągu kilku godzin po pobraniu krwi bez istotnej zmiany w ekspresji trombocytów TF; Ponadto możliwość poprawy próbki i jej późniejszego oznakowania/przetwarzania sprawia, że analiza ta jest odpowiednia dla wielu szpitali i laboratoriów. Warto zauważyć, że choć protokół opisany w tym manuskrypcie jest stosunkowo prosty do wykonania, technika cytometrii przepływowej nadal wymaga specjalistycznego szkolenia technicznego. Z tego powodu technologia zmierza w kierunku coraz prostszych cytometrów przeznaczonych do testów w miejscu opieki.

Podsumowując, proponowany protokół dostarcza metod poprawnej analizy TF powiązanej z płytkami krwi, podkreślając zalety techniki opartej na analizie cytometrii przepływowej w jej określaniu. Ponadto podkreśla zmienne przedanalityczne, które mogą wpływać na analizę tego białka, podkreślając środki zapobiegające ich unikaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenozyna 5'-difosforan (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	Agonista płytek krwi
Alexa Fluor 633 koza &-mysz IgG	Invitrogen	A21052	Przeciwciało wtórne
Biotube 10 mL	Biosigma	BSP048	Do pobierania PRP
Igła motylowa G19	Rozwiązanie PIC	02044019030010	Na odstawienie krwi
Oprogramowanie CytExpert	Beckman Coulter		Analiza danych cytometrii przepływowej
Cytoflex S	Beckman Coulter		Cytometr przepływowy
Lampy Eppendorfa 1,5 mL	Eppendorf	1,20,086	Fiksacja krwi
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Cytometr przepływowy obrazujący
Kaluza Software	Beckman Coulter		Analiza danych cytometrii przepływowej
Paraformaldehyd	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Naprawiać krew i płytki krwi
PerCP-α CD45	BD	345809	Marker populacji leukocytów
PerCP-α CD61	BD	347408	Marker poulacji płytek krwi
PE-α CD142	BD	550312	Przeciwciało przeciwko czynnikowi tkankowemu przeciwludzkiego
PE-α CD41	Beckman Coulter	A07781	Marker poulacji płytek krwi
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS) 1x bez wapnia i magnezu	Gibco	10010-015	Dla przeciwciał i rozcieńczenia próbki
Końcówki Pipeta 10 & mikro; L	Gilson	F161630	Aby przygotować próbki
Końcówki Pipet 1000 & micro; L	Gilson	F161670	Aby przygotować próbki
Końcówki Pipet 200 & micro; L	Gilson	F161930	Aby przygotować próbki
Rurka z okrągłym dnem 5 mL	Corning	352052	Do pozyskiwania cytometrem przepływowym
Chlorek sodu 0,9 %	BD	306575	Do mycia kaniuli igły po odbraniu krwi
Sysmex XN-450	Dasit		Analizator komórek krwi
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Przepuszczanie błony krwinek
Rurki z cytrynianem wakutainerowym 0,129M	BD	363079	Do pobierania krwi
Lampy Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	Do pobierania krwi
Adapter luer wielokrotnych próbek do wakuaana	BD	367300	Na odstawienie krwi
Uchwyt na jednorazowe użycie wakutainera	BD	364815	Na odstawienie krwi
Zestaw koralików Versacomp Antibody Capture	Beckman Coulter	B22804	Miareczkowanie przeciwciał
α CD142 (klon HTF-1)	Invitrogen	16-1429-82	Przeciwciało przeciwko czynnikowi tkankowemu przeciwludzkiego