Artykuł metodologiczny

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

DOI:

10.3791/67360

⸱

4 października 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedwabnik, Bombyx mori, jest ważnym insektem gospodarczym z tysiącletnią historią w Chinach. Tymczasem jedwabnik jest modelowym owadem Lepidoptera z dobrą akumulacją badań podstawowych. Jest to również pierwszy owad z rzędu Lepidoptera, którego kompletny genom został zsekwencjonowany i złożony, co stanowi solidną podstawę do badań funkcjonalnych genów. Chociaż interferencja RNA (RNAi) jest szeroko stosowana w badaniach funkcjonalnych odwrotnych genów, jest oporna na działanie u jedwabników i innych gatunków Lepidoptera. Poprzednie udane badania związane z RNAi mające na celu dostarczenie dwuniciowego RNA (dsRNA) przeprowadzono wyłącznie poprzez wstrzyknięcie. Dostarczanie dsRNA poprzez karmienie nigdy nie jest zgłaszane. W tym artykule opisujemy krok po kroku procedury przygotowania nanocząstek chitozanu/dsRNA, które są podawane larwom jedwabników po spożyciu. Protokół obejmuje (i) wybór odpowiedniego stadium larw jedwabników, (ii) syntezę dsRNA, (iii) przygotowanie nanocząstek chitozan/dsRNA oraz (iv) karmienie larw jedwabników nanocząstkami chitozanu/dsRNA. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, w tym potwierdzenie transkryptu genu i obserwację fenotypu. Karmienie dsRNA jest prostą techniką dla RNAi u larw jedwabników. Ponieważ larwy jedwabników są łatwe w hodowli i wystarczająco duże, aby można je było obsługiwać, stanowi dobry model do zademonstrowania larwalnego RNAi u owadów. Ponadto prostota tej techniki stymuluje większe zaangażowanie uczniów w badania, co sprawia, że larwy jedwabników są idealnym systemem genetycznym do wykorzystania w klasie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedwabnik, Bombyx mori, to owad udomowiony ponad 5000 lat temu w Chinach. Ze względu na swoją zdolność do produkcji jedwabiu, jedwabnik jest ważnym owadem gospodarczym w chińskim rolnictwie i hodowli bydła. Jedwabnik ustępuje tylko muszce owocowej jako owad modelowy. Jako modelowy owad w Lepidoptera, jedwabnik jest łatwy w hodowli, ma duży rozmiar ciała i mnóstwo mutantów. Tymczasem jedwabnik jest pierwszym owadem z rzędu Lepidoptera, którego kompletny genom został zsekwencjonowany1. Wiele baz danych dostarczających informacji dla genome2, transcriptome3, express sequence tag (EST)4, non-codeding RNA5 i microsatellite6 są również dostępne publicznie. Powyższe fakty sprawiają, że jedwabnik jest doskonałym modelem do badań genetycznych.

Interferencja RNA (RNAi) to proces komórkowy, w którym cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) wiążą i tną komplementarny informacyjny RNA (mRNA), osiągając w ten sposób efekt wyciszający docelowego genu. Mechanizm ten jest naturalnie obecny w bakteriach w celu obrony przed inwazją wirusów7. Później odkryto, że RNAi jest konserwowany w zwierzętach, roślinach i drobnoustrojach. Ze względu na silny efekt wyciszania specyficzny dla sekwencji, RNAi jest wykorzystywany w badaniach podstawowych do manipulowania ekspresją genów i badania funkcji genów. RNAi uzyskuje się poprzez dostarczenie dsRNA do komórek.

U owadów istnieją trzy popularne sposoby dostarczania dsRNA, którymi są mikroiniekcja, karmienie i moczenie8. W chwili obecnej udane raporty RNAi u jedwabników poprzez dostarczanie nagiego dsRNA są przeprowadzane przez wstrzyknięcie dsRNA 9. Zaletą mikroiniekcji jest natychmiastowe dostarczenie dsRNA do hemolimfy oraz precyzyjna kontrola ilości dsRNA. Istnieją jednak również pewne wady mikroiniekcji. Na przykład jest to czasochłonne i wymaga delikatnych urządzeń. Ważne jest również, aby zoptymalizować igły do wstrzykiwań, objętość wstrzyknięć i ilość dsRNA. Dlatego konieczny staje się alternatywny sposób dostarczania dsRNA do jedwabników. Ponieważ egzoszkielet owada jest wodoszczelną barierą wykonaną z chityny, moczenie larw owadów w celu uzyskania RNAi jest rzadko zgłaszane, co nie jest dobrą opcją dla RNAi u owadów. Podawanie dsRNA jest pracochłonne, opłacalne i łatwe do wykonania10. Ta metoda ma również zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych genów11. Stwierdzono jednak, że niespecyficzna nukleaza DNA/RNA, a mianowicie BmdsRNaza, jest obecna w jelicie środkowym i soku z jelita środkowego larw jedwabników12. Wykazano, że ten nukleaza trawi dsRNA, najlepiej13. Dlatego podawanie jedwabnikowi nagiego dsRNA w celu wyciszenia ekspresji genów wydaje się być trudne.

Ostatnio udowodniono, że dRNA z powłoką nanocząstek jest dobrym sposobem na zwiększenie wydajności RNAi poprzez karmienie14. Chitozan jest niedrogim, nietoksycznym i biodegradowalnym polimerem, który można wytworzyć przez deacetylację chityny, naturalnie występującego i drugiego najobficiej występującego biopolimeru po celulozie15. Ponieważ grupa aminowa w chitozanie jest naładowana dodatnio, a grupa fosforanowa na szkielecie dsRNA jest naładowana ujemnie, nanocząstki chitozanu/dsRNA mogą powstać w wyniku samoorganizacji polikacji16. Nanocząstki chitozanu/dsRNA są skuteczne w osiąganiu RNAi poprzez żerowanie larw u komarów Aedes aegypti i Anopheles gambiae17, robaka plamistego Earias vittella18 i przędziorka karminowego Tetranychus cinnabarinus19.

W celu opracowania metodologii dostarczania dsRNA poprzez karmienie jedwabników w celu uzyskania skutecznej wydajności RNAi, ten raport skupia się na opisie krok po kroku procedur, jak przygotować nanocząstki chitozanu/dsRNA i podać nanocząstki larwom jedwabników. Metodologia ta jest stosunkowo niedroga, pracochłonna i łatwa do naśladowania, którą można dostosować do badań wyciszania genów u innych owadów. Naszym celem jest zapewnienie łatwiejszego protokołu dla metody dostarczania dsRNA z Lepidoptera o wyższej wydajności RNAi.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gatunki jedwabników i ich hodowla

  1. Wychowuj co najmniej 120 świeżo wyklutych larw jedwabników szczepu B. mori P50 w stadium rozwojowym ze świeżymi liśćmi morwy w temperaturze 25 ± 1 °C, fotoperiodzie 12 godzin Światło: 12 godzin Ciemno i wilgotności względnej 75% ± 5%.

2. Wybór larw jedwabników

  1. Wybierz 1 dzień z 5. stadium larwowego do eksperymentu RNAi; larwy jedwabników rosną szybko po 3. dniu 5. stadium rozwojowego, co jest idealne do porównania różnic w wyglądzie larw.
    UWAGA: Alternatywnie, młodsze stadia, takie jak 3. lub 4.stadium rozwojowe, mogą być wykorzystane w eksperymencie RNAi. Wymaga jednak stałej obróbki dsRNA do 5stadium rozwojowego, co jest stosunkowo drogie i kosztowne materiałowo.

3. Synteza dsRNA

  1. Identyfikacja docelowego fragmentu dsRNA: Wybierz sekwencję kodującą genu docelowego i dopasuj ją do innych genów homologicznych, aby określić konserwatywny region. Zaprojektuj startery specyficzne dla genu w niekonserwatywnym regionie do późniejszej amplifikacji docelowego fragmentu dsRNA. W przypadku eksperymentów RNAi na owadach typowy docelowy fragment dsRNA wynosi zwykle 400-600 pz. Minimalny rozmiar może wynosić 200 bp.
    UWAGA: Aby poprawić wydajność i wskaźnik powodzenia eksperymentów z RNAi, do zaprojektowania celu dsRNA można użyć narzędzia internetowego, takiego jak dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. Wytwarzanie szablonu produktu PCR: Dodać promotor polimerazy RNA T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') do końca 5' dowolnego startera zaprojektowanego powyżej. Wykonaj standardowy PCR, aby amplifikować docelowy fragment dsRNA. Uruchom 1% żel agarozowy w 1x TAE, aby zweryfikować pojedynczy produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze. Następnie należy oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania (tabela materiałów) i użyć go do późniejszej transkrypcji.
    UWAGA: Aby przechowywać docelowy produkt PCR przez długi czas i uzyskać wysoką wydajność, zaleca się podwiązanie produktu PCR do plazmidu. Plazmid powinien zostać zlinearyzowany przed reakcją PCR.
  3. Generowanie dsRNA: Użyj systemu T7 RNAi (tabela materiałów), aby wygenerować dsRNA. Ustaw reakcję, dodając składniki w temperaturze pokojowej zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać reakcję przez delikatne pipetowanie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    UWAGA: Aby zmaksymalizować plon, inkubację w temperaturze 37 °C można przedłużyć do 2-6 godzin. W przypadku matryc zawierających strukturę drugorzędową lub bogatych w GC, inkubację można przeprowadzić w temperaturze 42 °C, aby poprawić wydajność dsRNA.
  4. Wyżarzanie w celu wytworzenia dsRNA: Inkubować reakcję w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej (~20 min). Spowoduje to wyżarzanie dsRNA.
  5. Leczenie DNazą i RNazą: Odpipetować 1 μl dostarczonego roztworu RNazy do 199 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać świeżo rozcieńczony roztwór RNazy. Dodać 1 μl świeżo rozcieńczonego roztworu RNazy i 1 μl dostarczonej DNazy wolnej od RNaz RQ1 na 20 μl objętości reakcyjnej, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Jednoniciowy RNA (ssRNA) i matrycowy DNA w reakcji zostaną usunięte po tym zabiegu.
  6. Wytrącanie alkoholu: Do reakcji dodać 1 objętość izopropanolu lub 2,5 objętości 95% etanolu wraz z 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2). Wymieszaj reakcję przez wirowanie i inkubuj na lodzie przez 5 minut, aby uzyskać mętną masę. Wirować z maksymalną prędkością w wirówce przez 10 minut, aby zebrać biały granulek na dnie probówki. Wyrzuć supernatant i umyj osad 0,5 ml zimnego 70% etanolu, aby usunąć resztki soli. Usuń etanol po umyciu. Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz w ilości 2-5 razy większej niż początkowa objętość reakcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub -70 °C.
    UWAGA: Osadka dsRNA nie powinna być nadmiernie wysuszona, ponieważ może to utrudnić pełne ponowne zawieszenie. Aby zapewnić wystarczające ponowne zawieszenie, potrzebne są co najmniej 2 objętości.
  7. Kontrola ilości i jakości dsRNA: Rozcieńczyć dsRNA w wodzie wolnej od nukleaz w stosunku 1:100 do 1:300. Oznaczyć stężenie dsRNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Aby określić ilościowo dsRNA, pomnóż stężenie przez objętość. Aby ocenić jakość dsRNA, należy użyć elektroforezy w żelu agarozowym. Przygotuj 1% żel agarozowy w 1x TAE i rozcieńcz dsRNA w stosunku 1:50 wodą bez nukleaz. Użyj 5 μl rozcieńczonego dsRNA na linię i wybarwić żel w 0,5 mg/ml bromku etydyny przez co najmniej 15 minut w celu wizualizacji.
    UWAGA: dsRNA migruje wolniej niż dsDNA.

4. Przygotowanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

  1. Przygotować 100 mM octanu sodu (0,1 M NaC, 2H, 3O2 i 0,1 M kwasu octowego, pH 4,5 w wodzie dejonizowanej) i 100 mM siarczanu sodu (100 mM Na2SO4 w wodzie dejonizowanej) buforu w temperaturze pokojowej.
  2. Rozpuść skomercjalizowany chitozan (z muszli krewetek, ≥75% deacetylowany; Tabela materiałów) w 100 mM buforze octanu sodu w celu uzyskania 0,02% (m/v) roztworu chitozanu.
  3. Rozpuścić 20 μg dsRNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz i dodać do 50 μl 100 mM buforu siarczanu sodu, aby uzyskać 100 μl roztworu dsRNA.
  4. Dodać 100 μl roztworu chitozanu do 100 μl roztworu dsRNA. Jednocześnie przygotować kontrolę, dodając 100 μl roztworu chitozanu do 100 μl 50 mM siarczanu sodu. Wymieszać i podgrzewać mieszaniny w temperaturze 55 °C przez 1 minutę.
    5. Natychmiast wirować
  5. mieszaninę za pomocą wiru o dużej prędkości przez 30 sekund, aby umożliwić utworzenie nanocząstek.
  6. Odwirować mieszaninę przy 13 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby uzyskać biały osad. Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  7. Oznaczyć stężenie dsRNA w supernatancie za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego (tabela materiałów). Użyć supernatantu z kontrolki jako ślepej próby. Pomnóż stężenie przez objętość, aby obliczyć całkowitą ilość dsRNA pozostałego w supernatancie. Obliczyć procent dsRNA zamkniętego w nanocząstkach przez ilość pozostałą w supernatancie podzieloną przez początkową ilość dsRNA.
    UWAGA: Mimo że nanocząstki mogą być przechowywane w temperaturze 4-37 °C przez co najmniej 15 dni przed użyciem14, zaleca się jak najszybsze użycie nanocząstek.

5. Karmienie larw jedwabników nanocząstkami chitozanu/dsRNA

  1. Do eksperymentu żywieniowego należy wybrać świeżo wyliniene larwy jedwabników w 5. stadium rozwojowym (tj. Dzień 1 5. stadium) tej samej wielkości. Umieść larwy pojedynczo w każdym dołku 6-dołkowej płytki przed zamknięciem pokrywy i głodz przez 24 godziny.
  2. Opłucz świeże liście morwy wodą dejonizowaną i osusz je czystym papierem kuchennym. Liście morwy powinny być suche bez kropel wody. Pokroić w krążki z liści morwy o wymiarach 1 cm x 1 cm.
  3. Przed użyciem rozpuść nanocząstki chitozanu/dsRNA w wodzie wolnej od nukleaz w stężeniu 500 ng/μl. Rozcieńczyć kontrolne nanocząstki chitozanu (przygotowane w 4.4) tą samą objętością wody wolnej od nukleaz. Przygotuj nagie dsRNA do 500 ng/μl w wodzie wolnej od nukleaz.
  4. Użyj nanocząstek chitozanu / dsRNA do eksperymentu knockdown RNAi, kontrolnych nanocząstek chitozanu jako ślepej / negatywnej kontroli. Użyj nagiego dsRNA, aby porównać różnice z nanocząstkami chitozanu/dsRNA.
  5. Pokryj odpowiednio 10 μl nanocząstek chitozanu/dsRNA, chitozanu i nagiego dsRNA na powierzchni każdego krążka liścia. Wysuszyć na powietrzu roztwór nanocząstek i roztwór dsRNA na krążkach liści w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Karm każdą larwę jednym krążkiem liściowym pokrytym nanocząstkami lub pokrytym dsRNA dziennie. Dostarczaj larwom krążki liściowe pokryte nanocząstkami lub dsRNA w sposób ciągły przez 5 dni. Świeże liście morwy można dostarczać po całkowitym zjedzeniu przez larwy pokrytego krążka liściowego każdego dnia.
  7. W 6 dniu znieczulić larwy na lodzie, aż przestaną się poruszać, a następnie wypreparować larwy w celu pobrania próbek. Odetnij klatkę piersiową nożyczkami na czystej szalce Petriego. Wyciągnij jelito środkowe pęsetą. Usuń zawartość z jelita środkowego i umyj je na innej szalce Petriego wypełnionej wodą wolną od nukleaz. Przechowuj jelito środkowe w probówce o pojemności 1,5 ml i utrzymuj w temperaturze -70 °C.

6. Potwierdzenie wyciszenia genów

  1. Wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), aby obliczyć względną kwantyfikację transkryptu. Wymagane są co najmniej trzy kontrpróby biologiczne i trzy kontrpróby techniczne dla każdej kontrpróby biologicznej. Zalecane są co najmniej dwa geny referencyjne w celu normalizacji względnego transkryptu. Badany jest gen Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). Oceń skuteczność wyciszania genów, porównując średnią wartość względnego transkryptu z grupą kontrolną i przelicz ją na procent.
    UWAGA: Warunek amplifikacji qRT-PCR, informacje o starterze i względne obliczenia transkrypcji można znaleźć w naszej najnowszej publikacji20.
  2. Przeanalizuj fenotyp RNAi, aby ocenić efekt wyciszania genów. Obserwuj wielkość larw i kokonów. Rób zdjęcia codziennie, aby utrwalać wygląd.
    UWAGA: RNAi może wpływać na morfologię, metamorfozę, fizjologię i zachowanie. Obserwacja fenotypów związanych z RNAi zależy od genów, na które są kierowane.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić wydajność RNAi, do analizy wybrano gen immunologiczny ukierunkowany na BmToll9-2. Gen BmToll9-2 jest dobrze scharakteryzowany w laboratorium, a wyciszanie genów przez wstrzyknięcie dsRNA skutkuje lżejszymi i mniejszymi larwami w naszej ostatniej publikacji20. Aby potwierdzić skuteczność RNAi poprzez spożycie przez nanocząstki chitozanu/dsRNA, jako kontrolę zastosowano nanocząstki chitozanu i w tym samym czasie porównano nagie dsRNA.

W porównaniu z kontrolą, nanocząstki chitozanu bez dsRNA, nagie dsRNA skierowane do genu BmToll9-2 nie wykazują efektu wyciszenia. Podawanie nanocząstek chitozanu/dsRNA w jedwabniku znacznie hamuje transkrypt, z 79% knockdownem (Ryc. 1). Hamowanie względnego transkryptu wskazuje, że gen BmToll9-2 został skutecznie wyciszony poprzez spożycie chitozanu/dsRNA.

Wyłączenie genu BmToll9-2 znacząco wpływa na wzrost jedwabnika. Obserwując larwy, larwy wyciszone BmToll9-2 są mniejsze niż larwy kontrolne (Rysunek 2A). Porównując kokony, kokony wyciszone BmToll9-2 są również mniejsze (Rysunek 2B). Nanocząstki chitozanu/dsRNA wykazują skuteczne efekty RNAi zarówno w transkryptze, jak i fenotypie jedwabnika.

figure-results-1
Rysunek 1: Względny transkrypt BmToll9-2 po spożyciu nanocząstek chitozan/dsBmToll9-2 u larw B. mori 5stadium rozwojowego. Względne poziomy mRNA BmToll9-2 w larwach karmionych nanocząstkami chitozanu jako kontrolą, nagimi nanocząstkami dsRNA i chitozanem/dsRNA. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowego trzech replikacji biologicznych. Dla każdej replikacji biologicznej występowały trzy replikacje techniczne. Różne litery na słupkach wskazują na znaczące różnice w oparciu o jednoczynnikową analizę ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obserwacja fenotypu po karmieniu nanocząstkami chitozanu/dsBmToll9-2. Nanocząstki chitozanu są stosowane jako kontrola. (A) Pojawianie się larw jedwabników po spożyciu nanocząstek. (B) Pojawienie się kokonów jedwabników po spożyciu nanocząsteczek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla obserwacji fenotypu RNAi ważny jest odpowiedni etap, w zależności od docelowych genów. Nasze wstępne wyniki wykazały, że Toll9-2 bierze udział we wzroście jedwabnika. Wielkość i waga larw jedwabnika gwałtownie wzrastają w 5stadium 21. W związku z tym larwy 5.stadium rozwojowe są wybierane jako stadium do eksperymentu z odżywianiem nanocząstkami chitozanu / dsRNA. Możliwe jest również wybranie larw w 3. lub 4.stadium rozwojowym do eksperymentów żywieniowych i obserwowanie różnic rozwojowych w 5. stadium rozwojowym. Jednak eksperymenty z karmieniem nanocząstkami wymagają ciągłego codziennego karmienia14. Karmienie larw w młodszym stadium wymaga większego przygotowania dsRNA, co jest stosunkowo droższe. Z powyższych powodów sugerujemy wybór świeżo liniejących larw jedwabników z 5.stadium jako punktu wyjścia eksperymentu z karmieniem nanocząstkami.

Istotna jest również optymalizacja parametrów podawania nanocząstek. Stałe podawanie nanocząstek przez 5-7 dni w celu uzyskania wydajnego RNAi jest powszechne w obecnych badaniach 14,18,22,23. Ponieważ dsRNA jest najdroższym składnikiem w eksperymentach z RNAi, nanocząstki mogą być podawane larwom co drugi dzień, co może pomóc obniżyć o połowę koszty przygotowania dsRNA. Innym sposobem na obniżenie kosztów jest optymalizacja ilości dsRNA wykorzystywanego w karmieniu. W tym protokole na każdą larwę stosuje się 5 μg nanocząstek chitozanu/dsRNA, co jest uniwersalną dawką do wstrzyknięcia dsRNA w laboratorium. Biorąc pod uwagę, że 5 μg dsRNA to wysoka dawka, a hamowanie przez podawanie nanocząstek jest znaczące. Sugeruje się zmniejszenie ilości dsRNA w eksperymencie. Jednak wpływ powyższych dwóch parametrów na wydajność RNAi musi zostać oceniony w przyszłych eksperymentach.

Stosunek chitozanu i dsRNA można zoptymalizować. W tym protokole 20 μg chitozanu w 100 μl octanu sodu miesza się z 20 μg dsRNA w 100 μl siarczanu sodu. W pierwszym raporcie dotyczącym nanocząstek chitozanu/dsRNA 20 μg chitozanu w 100 μl octanu sodu miesza się z 32 μg dsRNA w 100 μl siarczanu sodu16. W niektórych innych doniesieniach 1 μg chitozanu w 100 μl octanu sodu miesza się z 1 μg dsRNA w 100 μl siarczanu sodu18,23. W związku z tym ilość chitozanu i dsRNA można zoptymalizować, aby osiągnąć najlepszą wydajność ładowania nanocząstek i optymalny efekt wyciszania RNAi.

Należy rozważyć przechowywanie nanocząstek chitozanu/dsRNA. Nanocząstki chitozanu/dsRNA są przygotowywane przed eksperymentem żywieniowym i sugeruje się ich natychmiastowe użycie. Niedawny raport wykazał, że nanocząstki chitozanu/dsRNA były przechowywane w temperaturze 4 °C, 24 °C i 37 °C przez 15 dni i nadal były stabilne19. W ten sposób nanocząstki chitozanu/dsRNA można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C w lodówce, ponieważ dsRNA jest bardziej stabilne w niskich temperaturach.

Oprócz dsRNA, niektóre małe RNA, takie jak małe interferujące RNA (siRNA) i krótkie RNA spinki do włosów (shRNA), mogą być wykorzystywane do przygotowania nanocząstek do eksperymentów RNAi. Na przykład nanocząstki siRNA poprawiają odporność roślin na Pseudomonas syringae24. Dostarczenie nanocząstek shRNA spowodowało pomyślny efekt RNAi u neotropikalnego brązowego pluskwiaka śmierdzącego Euschistus heros25. Dlatego nanocząstki można zastosować do dowolnych cząsteczek RNA użytych w eksperymencie RNAi.

Stwierdzono, że wydajność RNAi u Lepidoptera, w tym jedwabników, jest ogniotrwała26. Dostarczanie dsRNA odbywa się tylko poprzez wstrzyknięcie jedwabników, co jest czasochłonne i kosztowne. Dzięki tej metodzie dostarczania nanocząstek chitozan/dsRNA obserwuje się znaczący efekt wyciszania zarówno w transkryptze, jak i fenotypie larw jedwabników i kokonów, co jest możliwe dzięki mniejszej degradacji dsRNA przez ochronę chitozanu19. Ta metoda jest pracochłonna i łatwa do wykonania, którą można dostosować do innych owadów. Łatwość tego protokołu może być stosowana nie tylko w badaniach naukowych, ale także w nauczaniu w klasie, pokazach i praktyce. Metoda dostarczania nanocząstek wyznacza nowy kierunek przyszłej kontroli biologicznej i ochrony przed szkodnikami27 .

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31501898), Program Nauki i Technologii w Kantonie (202102010465), Projekt Jakości Nauczania i Reformy Nauczania w Kantonie w Kantonie (2022JXGG057) oraz Projekt Badawczy Komitetu Sterującego Otwartych Kursów Online Uniwersytetów Prowincji Guangdong (2022ZXKC381).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka wirówkowaSangonF601620do reakcji dsRNA lub nanocząstek
10 μ lpipeta EppendorfP13473Gdo zasysania lub ponownego wyparcia cieczy
100 μ lpipeta EppendorfQ12115Gdo zasysania lub ponownego zaparowania cieczy
2,5 i mu; lpipeta EppendorfP20777Gdo zasysania lub ponownego wymieszania płynu
20 μ lpipeta EppendorfH19229Edo zasysania lub ponownego zaparowania cieczy
200 μ l pipetaEppendorfH20588Edo zasysania lub ponownego zawieszania płynu
6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TCCostar3516do indywidualnej hodowli jedwabników
Kwas octowyAladdinA116165do wytwarzania TAE
Agaroza MBBI Nauki przyrodniczeA610013do elektroforezy w żelu agarozowym
Waga analitycznaSartoriusBSA224Sdo ważenia składników
Wirówka SartoriusCentrisart A-14Cdo wirowania w celu wytworzenia dsRNA lub nanocząstek
ChitozanSigma-AldrichC3646do łączenia z dsRNA do otrzymywania nanocząstek
EDTASangonA500895do wytwarzania TAE
EtanolAladynE130059do wytwarzania TAE, lub do wytrącania dsRNA
ZamrażarkaSiemensiQ300do przechowywania dsRNA lub nanocząstki
GoTaq Green Master MixPromegaM712do reakcji PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002do reakcji qRT-PCR
Isopropanol AladdinI112011do wytrącania dsRNA
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisherOnedo oznaczania stężenia phmetru dsRNA
Sartorius  PB-10do przygotowania
Zestaw do oczyszczania produktu SanPrep Column PCRSangonB518141do oczyszczania produktu PCR
Octan soduSigma-AldrichS2889do wytworzenia 100 mM buforu octanu sodu
Siarczan sodu Sigma-Aldrich239313do wytworzenia 100 mM buforu siarczanu sodu
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700do syntezy dsRNA
ThermoMixerEppendorfCdo wytwarzania dsRNA lub ogrzewania nanocząstek
TrisSangonA501492do wytwarzania TAE
Vortex IKAVortex 3do otrzymywania nanocząstek chitozanu/dsRNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanocz steczki chitosanudostarczanie dsRNAwyciszanie gen wkarmienie RNAidwuniciowy RNAformowanie nanocz steczekbadanie funkcji gen wmodel Lepidoptera

Powiązane artykuły