Artykuł metodologiczny

Porównawcza analiza kariotypu populacji ziół Lycoris aurea przy użyciu prążków fluorochromowych oraz 45S i 5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

⸱

29 listopada 2024

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół bada rozkład heterochromatyny w ośmiu populacjach zioła Lycoris aurea (L′Her), używając połączonego barwienia chromosomów PI i DAPI, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z regionami genu 18S-5.8-26S rRNA (regiony 45S rDNA) oraz sond rybosomalnego DNA 5S.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć zmienność kariotypów w ośmiu populacjach, szczegółowo ustalono kariotypy za pomocą pomiarów chromosomów, pasm fluorescencyjnych i sygnałów rDNA FISH. Liczba miejsc rDNA 45S waha się od jednej do pięciu par na populację, przy czym najczęstszą liczbą na kariotyp są cztery pary. Locus 45S rDNA znajduje się głównie w krótkich ramionach i końcowych regionach chromosomów, podczas gdy locus 5S rDNA znajduje się głównie w krótkim ramieniu i regionach końcowych lub proksymalnych. Populacje HBWF, HNXN, HBBD i HNZX wykazywały podobny rozkład miejsc rDNA 45S, podobnie jak GXTL, HBFC i SCLS, co wskazuje na bliski związek między populacjami o podobnych rozkładach miejsc rDNA 45S. Kariotypy wszystkich badanych populacji są symetryczne, składają się ze stabilnych i metastabilnych centromerów lub wyłącznie stabilnych centromerów. Wykresy punktowe MCA i CVCL skutecznie odróżniają ich struktury kariotypowe. Analiza obejmuje sześć parametrów ilościowych (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Ponadto wyniki wskazują, że PCoA oparty na tych sześciu parametrach jest solidną metodą określania biologicznych relacji kariotypów między ośmioma populacjami. Liczba chromosomów w populacjach Lycoris wynosi x = 6-8. Na podstawie aktualnych badań i piśmiennictwa omówiono zróżnicowanie genomowe tych populacji pod względem wielkości genomu, heterochromatyny, miejsc rDNA 45S i 5S oraz asymetrii kariotypu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris to rodzina, która obejmuje kilka ważnych roślin ogrodniczych1. Lycoris aurea (L'Hér.) Zioło. to tradycyjna chińska roślina lecznicza o długiej historii. Analiza fitochemiczna wykazała, że Lycoris aurea (L′Her.) Zioło zawiera galantaminę i inne alkaloidy, które mogą zwiększać wrażliwość na acetylocholinę i mieć potencjał w leczeniu choroby Alzheimera jako inhibitory cholinoesterazy2.

U roślin wyższych, analiza kariotypu jest kluczowa dla integracji map genetycznych i fizycznych, co ma znaczące praktyczne implikacje dla biologii roślin. Analiza ta pozwala na charakterystykę genomu na poziomie chromosomów, wyjaśnienie komórkowych relacji taksonomicznych między populacjami, identyfikację aberracji genetycznych i zrozumienie trendów ewolucji chromosomów3,4,5. Zazwyczaj opis kariotypu obejmuje liczbę chromosomów, bezwzględne i względne długości chromosomów, pierwotne i wtórne lokalizacje zwężeń, rozkład fragmentów heterochromatycznych, numery i lokalizacje miejsc rDNA oraz inne cechy sekwencji DNA, a także asymetrię kariotypu6,7,8. Wśród parametrów kariotypu asymetrię determinują zmiany długości chromosomów (asymetria międzychromosomowa) i położenia centromerów (asymetria wewnątrzchromosomowa). Asymetria kariotypu jest istotną cechą odzwierciedlającą morfologię chromosomów i jest szeroko stosowana w taksonomii komórek roślinnych9,10,11,12.

Często brak markerów chromosomowych ogranicza analizę kariotypu i utrudnia identyfikację poszczególnych chromosomów. W ostatnich latach barwienie Giemsa, pasmowanie fluorescencyjne i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) stały się popularne w analizie chromosomów roślin. Metody barwienia podwójnie fluorescencyjnego, takie jak barwienie CMA (chromomycyna A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenyloindol) i barwienie PI (jodek propylu) / DAPI (znane jako barwienie CPD), ujawniają bogate w GC i AT heterochromatyczne regiony na chromosomach4,13. Podczas metafazy lub pachytenu mitozy roślin, powtarzające się sekwencje DNA lub długie segmenty DNA mogą generować specyficzne sygnały w populacjach roślin poprzez hybrydyzację FISH14,15,16.

Fluorescencyjne pasma i sygnały FISH dostarczają użytecznych markerów do identyfikacji chromosomów. Mierząc długość chromosomów, analizując charakterystykę pasm fluorescencyjnych i porównując różnice w sygnale FISH, można skonstruować szczegółowe molekularne kariotypy cytogenetyczne różnych plazm zarodkowych lub populacji roślin. Te kariotypy skutecznie wyświetlają morfologię chromosomów w różnych plazmach zarodkowych lub populacjach, umożliwiając porównanie dystrybucji heterochromatyny i lokalizacji sekwencji DNA oraz zachęcając do dalszych badań4,8,17. Porównania molekularnych kariotypów cytogenetycznych mogą dostarczyć cennych informacji na temat powiązań filogenetycznych i ewolucji chromosomów w powiązanych populacjach8,14,18,19.

Rodzaj Lycoris, różnorodna i intrygująca grupa w rodzinie Amaryllis, znana jest ze swoich wieloletnich cebulek. Składa się z około 20 gatunków, z których 15 jest endemicznych dla Chin, i prezentuje bogatą różnorodność biologiczną. Ten rodzaj występuje wyłącznie w ciepłych umiarkowanych i subtropikalnych regionach Azji Wschodniej, w tym w południowo-zachodnich Chinach, południowej Korei i Japonii, z kilkoma populacjami rozciągającymi się na północne Indie i Nepal20. Wczesne badania cytogenetyczne obejmowały przede wszystkim liczenie chromosomów w celu ustalenia podstawowej liczby chromosomów rodzaju i opisania morfologii chromosomów w określonych populacjach, koncentrując się głównie na Lycoris radiata21. Całkowita liczba chromosomów obserwowana w tym rodzaju waha się od 12 do 33 lub 44, reprezentując odpowiednio poziomy diploidalne, nieprawidłowe diploidalne, triploidalne, tetraploidalne i aneuploidalne. Podstawowe liczby chromosomów, x, to 6, 7, 8 i 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Zioło, godny uwagi gatunek z rodzaju Lycoris, jest szeroko rozpowszechniony w Chinach22. Rozwija się w zrelaksowanym, wilgotnym środowisku i rozmnaża się przez małe cebulki. Żarówki te, zawierające likoninę i galantaminę - dwa kluczowe związki lecznicze - były stosowane w tradycyjnej medycynie chińskiej od wieków. Lycoris aurea urzeka również ogrodników efektownymi czerwonymi kwiatami jesienią i wiecznie zielonymi liśćmi zimą. Jednak podobieństwo morfologiczne u wszystkich badanych Lycoris aurea (L'Hér.) Populacje ziół stanowią poważne wyzwanie dla identyfikacji chromosomów przy użyciu konwencjonalnych metod cytologicznych.

Klonowanie FISH, fosmid lub BAC (bakteryjne sztuczne chromosomy) z powtarzającymi się sekwencjami DNA i sondami oligonukleotydowymi na chromosomach metafazowych lub pachydermatycznych zostało użyte do analizy kariotypu23,24,25, porównawcza analiza cytogenetyczna26,27, budowa mapy cytogenetycznej28,29, oraz testy specyficzne dla chromosomów30. Ostatnio technika FISH została zastosowana do analizy chromosomów populacji Lycoris31. Chociaż liczba chromosomów i kariotyp różnią się w populacjach Lycoris, całkowita liczba chromosomów pozostaje stała, przy czym obserwuje się trzy podstawowe typy: centralny chromosom centromerowy (M-), dystalny chromosom centromerowy (T-) i proksymalny chromosom centromeru (A-). Ponadto w naturalnych populacjach obserwuje się różne kształty i rozmiary chromosomów32.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest przydatna do wykrywania zmian chromosomalnych, takich jak fuzja centromerów, inwersja, amplifikacja genów i delecja fragmentów. Technologia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (RNA-FISH) umożliwia analizę wizualną chromosomów w wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia i identyfikacji wielu złożonych zmian, w tym fuzji centralnych regionów chromosomów, tworzenia nowych struktur chromosomowych, odwrócenia regionów chromosomowych, amplifikacji genów lub fragmentów genów oraz utraty sekwencji genów w określonych regionach chromosomowych33. Pięć z 500 klonów wykazywało silne sygnały FISH w regionie centromeru centralnego chromosomu centromeru (M-), ale nie na dystalnym chromosomie centromeru (T-)34. Unikalny wzorzec dystrybucji sygnału FISH na każdym chromosomie umożliwił identyfikację pojedynczych chromosomów, co wcześniej stanowiło wyzwanie w populacjach Lycoris przy użyciu tradycyjnych metod barwienia31. Obecnie istnieje niewiele badań nad cytogenetyką molekularną Lycoris aurea (L'Hér.) Zioło, podkreślając pilną potrzebę dalszych badań w tej dziedzinie.

W tym badaniu, osiem dobrze zróżnicowanych chromosomów metafazowych Lycoris aurea (L'Hér.) Populacje ziół przygotowano przy użyciu metod zanurzenia enzymatycznego i suszenia płomieniowego (EMF). Do identyfikacji FISH użyto barwienia CPD oraz sond rDNA 45S i 5S. Szczegółowe molekularne kariotypy cytogenetyczne tych populacji zostały skonstruowane przy użyciu połączonych danych z pomiarów chromosomów, prążków fluorescencyjnych oraz sygnałów 45S i 5S rDNA FISH. Dla każdej populacji obliczono sześć różnych wskaźników asymetrii kariotypowej, aby zidentyfikować relacje kariotypowe między nimi. Ocena danych dotyczących kariotypu cytogenetycznego dostarczyła istotnych informacji na temat różnicowania genomowego i powiązań ewolucyjnych ośmiu populacji, potencjalnie zmieniając wiedzę na temat chromosomów Lycoris.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odczynniki i sprzęt użyte w tym badaniu są szczegółowo opisane w Tabeli materiałów, podczas gdy użyte sondy są podane w Pliku uzupełniającym 1.

1. Przygotowanie chromosomów wierzchołkowych

  1. Zakorzenij się w hydroponice. Po wyjęciu nadziemnej części żarówki umieść ją w stożkowej butelce wypełnionej wodą, wymieniając wodę co 3 dni, zgodnie z metodą opisaną przez Song et al.35.
  2. Aktywnie rosnące wierzchołki korzeni, gdy osiągną około 1,0-2,0 cm długości, i traktować je nasyconym α-bromonaftalenem w temperaturze 28 °C przez 1,0 h.
  3. Przytnij końcówki korzeni do około 1 cm i umieść je w świeżo przygotowanej mieszaninie metanolu i lodowatego kwasu octowego w stosunku objętościowym 3:1 w temperaturze pokojowej (około 20-25 °C) na 2-3 godziny. Następnie przechowuj je w lodówce w temperaturze 4 °C, zgodnie z opisem She et al.36.
  4. Dokładnie umyj zamocowane końcówki korzeni (2-3 mm) w wodzie podwójnie destylowanej.
  5. Przygotować mieszaninę celulazy i hydrolazy pektynowej w 0,01 mM buforze kwasu cytrynowo-cytrynianu sodu o pH 4,5, z hydrolazą celulazy i pektyny po 1%. Umieść wstępnie przygotowane wierzchołki korzeni w mieszance i trawić w temperaturze 28 °C przez 1,0-1,5 godziny.
  6. Umyj strawione końcówki korzeni podwójnie destylowaną wodą, przenieś je na szklane szkiełko i dokładnie rozgnieć utrwalaczem za pomocą drobno spiczastych kleszczyków.
  7. Wysuszyć szkiełka nad płomieniem lampy alkoholowej, aż mgła wodna po prostu zniknie. Pod mikroskopem z kontrastem fazowym wybierz szkiełka z więcej niż pięcioma podzielonymi fazami i bez nakładających się chromosomów. Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Barwienie CPD

  1. Przygotować roztwór CPD, dodając PI i DAPI do 30% (v/v) tłumika antyfluorescencji, gdzie stężenie PI wynosi 0,6 μg·mL-1, a stężenie DAPI wynosi 3 μg·mL-1.
  2. Suszyć szkiełko chromosomowe w temperaturze 65 °C przez 30 minut.
  3. Dodać 100 μl rozcieńczalnika RNazy A (roztwór do przechowywania RNazy A rozcieńczony 100 razy 2x SSC (sól fizjologiczna cytrynian sodu), co daje końcowe stężenie 100 μg / ml) na szkiełko chromosomowe. Przykryj szkiełko i podgrzej je w wilgotnej komorze o temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
  4. Przemyć szkiełko chromosomowe 2x SSC w temperaturze pokojowej przez trzy odstępy po 5 minut każdy.
  5. Myj szkiełko chromosomowe w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty.
  6. Dodać 200 μl rozcieńczalnika pepsyny (roztwór do przechowywania pepsyny rozcieńczony 100 razy 0,01 N HCl, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 μg/ml) na szkiełko chromosomowe. Przykryć szkiełko i inkubować je w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 5-20 minut.
  7. Przemywać skrawki chromosomów ultraczystą wodą o temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie przemywać 2 xSSC w temperaturze pokojowej przez dwa odstępy czasu po 5 minut każdy.
  8. Utrwalić szkiełka metanolem: lodowatym roztworem kwasu octowego (3:1) przez 10 min.
  9. Umyć 2x SSC w temperaturze pokojowej przez trzy odstępy czasu po 5 min każde.
  10. Traktować 70%, 95% i 100% etanolem w temperaturze -20 °C przez 5 minut, a następnie wysuszyć w temperaturze pokojowej.
  11. Weź poddane działaniu i wysuszone szkiełka chromosomowe, dodaj 30 μl roztworu barwiącego CPD do każdego szkiełka, przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 50 mm i wybarwiaj w ciemności przez ponad 30 minut. Rozległy materiał chromosomowy należy wybarwić przez noc.
  12. Obserwuj szkiełka chromosomowe pod mikroskopem fluorescencyjnym, używając zielonego filtra wzbudzenia (WG) do barwienia PI i filtra ultrafioletowego (UV) do barwienia DAPI. Rób obrazy za pomocą kompatybilnego oprogramowania.
    1. Dostosuj czas ekspozycji za pomocą dwóch filtrów, aby uzyskać podobną intensywność czerwonej i niebieskiej fluorescencji podczas robienia zdjęcia. Obraz CPD uzyskuje się z obrazów w skali szarości wybarwionych za pomocą PI i DAPI. Pomiary chromosomów i obróbkę obrazu wykonano za pomocą programu Adobe Photoshop.

3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

  1. Przygotuj roztwór hybrydowy: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) i 50% siarczan glukanu (4 μL). Po przygotowaniu odwirować roztwór hybrydowy (2500 x g, 5-10 min, w temperaturze pokojowej) i umieścić go na lodzie.
  2. Zeskanowane szkiełka wkładamy do piekarnika nagrzanego do 65°C na 30-60 minut.
  3. Usuń upieczone szkiełka, dodaj 100 μl 70% roztworu denaturacyjnego FAD, przykryj szkłem nakrywkowym i poddaj denaturacji w piecu do hybrydyzacji molekularnej o temperaturze 85 °C przez 2,5 minuty.
  4. Zdejmij szkiełko nakrywkowe i natychmiast zanurz szkiełka w 70%, 90% i 100% zimnym etanolu, odwadniając kolejno przez 5 minut każde.
  5. Wyjmij szkiełka i pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez ponad 30 minut.
  6. Dodaj 20 μl roztworu hybrydowego do szkiełka podstawowego, delikatnie ułóż szkło nakrywkowe na wierzchu, aż płyn całkowicie się rozleje i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby zwilżyć pokryty obszar szkiełka.
  7. Umieścić szkiełka w naczyniu hybrydowym nasączonym 2× SSC (szalka hybrydowa powinna być dużą szalką Petriego z pokrywką owiniętą folią aluminiową w celu ułatwienia pracy z dala od światła) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (przez co najmniej 6 godzin).
  8. Przeciwbarwić chromosomy, montując je za pomocą 3 μg·mL-1 DAPI w 30% (v/v) roztworze Vectashield H-100. Przechwyć obraz za pomocą kompatybilnego oprogramowania, z niebieską fluorescencją DAPI wzbudzoną odpowiednio fioletowym światłem filtra i czerwoną fluorescencją PI wzbudzoną zielonym światłem.
    UWAGA: Hybrydyzację FISH przeprowadzono przy użyciu sond rDNA 45S i 5S na wcześniej wybarwionych preparatach CPD, zgodnie z metodą opisaną przez She et al.36.

4. Analiza kariotypu

  1. Wybierz pięć komórek mitotycznych metafazy dla każdej populacji, w której chromosomy są dobrze rozproszone (bez nakładania się) i umiarkowanie zagęszczone (chromosomy nie powinny być maksymalnie zagregowane, ale końce nie powinny być zlepione razem), zgodnie z metodologią opisaną przez She i wsp.4.
  2. Określ bezwzględną długość każdego chromosomu, wybierając pięć chromosomów o najwyższym stężeniu podczas podziału komórki.
  3. Skrupulatnie i precyzyjnie mierz długość długiego ramienia (L) i krótkiego ramienia (S) każdego chromosomu, a także rozmiar każdego fluorescencyjnego pasma pigmentowego na chromosomie.
  4. Oblicz następujące parametry: (1) względna długość chromosomu (RL, procent haploidalny); (2) stosunek ramienia (AR = L/S, długie ramię/krótkie ramię); (3) całkowita długość chromosomu haploidalnego (TCL; długość kariotypu); (4) średnia długość chromosomu (C); (5) wielkość pasma fluorescencji (procent pasma fluorescencji w stosunku do długości chromosomu); (6) odległość od centromeru do miejsca rDNA; (7) średni wskaźnik centromerów (CI, obliczany jako długość krótkiego ramienia każdego chromosomu podzielona przez całkowitą długość tego chromosomu, a następnie uśrednienie tych wartości); (8) cztery różne wskaźniki asymetrii kariotypu, w tym wskaźnik centromerów (CVCI), współczynnik zmienności (CV), współczynnik zmienności długości chromosomów (CVCL), średni współczynnik asymetrii centromerów (MCA) oraz kategoria asymetrii Stebbinsa.
    UWAGA: Zapoznaj się z metodami Paszko10 i Peruzzi et al.11, aby obliczyć wskaźnik asymetrii. Klasyfikuj chromosomy o różnych proporcjach ramion zgodnie z pięcioma metodami klasyfikacji Levana. Ułóż chromosomy Lycoris aurea (L'Hér.) Zioło w malejącej kolejności długości, zgodnie z opisem w protokole Han et al. 37.
  5. Zapewnienie precyzji i dokładności metodologii poprzez rysowanie wzorców kariotypów chromosomów na podstawie danych pomiarowych chromosomów w połączeniu z informacjami o prążku fluorescencji oraz położeniem i rozmiarem rDNA-FISH.
  6. Wizualizacja asymetrycznych relacji kariotypu w ośmiu populacjach jest kluczowym krokiem, który zapewnia jasny wgląd. Osiąga się to za pomocą dwuwymiarowych wykresów punktowych, które są używane do uzyskania ich MCA i CVCL.
  7. Przeprowadź analizę współrzędnych głównych (PCoA) przy użyciu współczynnika podobieństwa Gowera, kluczowego składnika, zgodnie z metodami She et al.38.
  8. Oblicz sześć parametrów ilościowych (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) w celu określenia kariotypów cytogenetycznych ośmiu populacji.
  9. Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu programu do analizy i wizualizacji danych w celu wygenerowania dendrogramu i wykresu punktowego PCoA opartego na UPGMA.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując skrupulatną metodę zanurzenia enzymatycznego i suszenia płomieniowego (EMF), rozproszone i dobrze zróżnicowane chromosomy metafazowe Lycoris aurea (L'Hér.) Uzyskano zioła i skonstruowano kariotyp chromosomu cytogenetycznego Lycoris aurea (Ryc. 1). Chromosomy metafazowe o najwyższym stopniu kondensacji nie nadają się do analizy kariotypu ze względu na zmniejszone różnice morfologiczne. Ponieważ jednak całkowita długość chromosomów haploidalnych (TCL) jest porównywalna między populacjami, rozróżnienie kariotypów różnych populacji Lycoris aurea jest możliwe poprzez porównanie różnic w wartościach TCL. Charakterystykę kariotypu i zawartość jądrowego DNA w ośmiu populacjach Lycoris aurea przedstawiono w tabeli 1. Rozkład prążków fluorescencji oraz lokalizacje miejsc 45S i 5S rDNA przedstawiono w tabeli 2. Rysunek 2 przedstawia pomiary chromosomów wraz z charakterystyką pasm fluorescencyjnych oraz lokalizacją i rozmiarem sygnałów 45S i 5S rDNA FISH.

Diploidalne liczby chromosomów są następujące: 2n = 16 = 8m + 8t dla GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t dla HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t dla GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t dla HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t dla HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t dla HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t dla HBWF, oraz 2n + 1 = 15 = 7m + 8t dla SCLS (Tabela 1). Jak opisano w protokole She i wsp.4, chromosomy metafazy ośmiu populacji L. aurea są małe, ze średnią długością chromosomów w zakresie od 1,01 μm (HNZX) do 2,08 μm (GZDS) i TCL w zakresie od 16,14 μm (HNZX) do 29,13 μm (GZDS). TCL w ośmiu populacjach korelują z raportowaną zawartością jądrowego DNA (Tabela 1). Najmniejszy zakres długości względnej (RRL) obserwuje się w HNXN (1,52-3,81), natomiast największy w GZDS (2,73-5,86). Populacje HNXN i GZDS wykazywały odpowiednio najmniejszą i największą zmienność długości chromosomów. Średni wskaźnik centromerowy (CI) genomu wahał się od 61,02 ± 5,63 (populacja HBFC) do 70,70 ± 4,63 (populacja HBWF). Populacja HBFC wykazała najmniejsze zmiany wskaźnika centromerów, podczas gdy populacja HBWF wykazała najbardziej rozległe zmiany.

Kariotypy składają się z chromosomów metacentrycznych (m) i telocentrycznych (t) (Tabela 1; Rysunek 2), reprezentujący najpowszechniejsze formy chromosomów w ośmiu badanych populacjach. Osiem różnych wskaźników asymetrii kariotypu przedstawiono w tabeli 1. Wśród tych wskaźników asymetrię wewnątrzchromosomową charakteryzuje współczynnik zmienności wskaźnika centromerów (CVCI) i średnia asymetria centromerów (MCA), natomiast współczynnik zmienności długości chromosomów (CVCL) mierzy asymetrię międzychromosomową. Zakresy dla CVCI i MCA są następujące: CVCI = 10,97 (HBBD) do 18,25 (HBWF) i MCA = 28,85 (HNZX) do 39,30 (HBWF). Wartości te konsekwentnie wskazują, że HBBD ma najniższą, a HBWF ma najwyższą asymetrię wewnątrzchromosomalną. Zakres dla CVCL wynosi od 14,98 (GZDS) do 23,32 (HBWF), co sugeruje, że GZDS wykazuje najmniej asymetryczny kariotyp, podczas gdy HBWF wykazuje najbardziej asymetryczny kariotyp spośród ośmiu populacji. Zgodnie z zasadami klasyfikacji Stebbins9, kariotypy te należą do klasy 1B, co wskazuje, że wszystkie badane populacje mają względnie symetryczne kariotypy.

Relacje asymetrii kariotypów między ośmioma Lycoris aurea (L'Hérit.) Populacje ziół zilustrowano za pomocą dwuwymiarowych wykresów punktowych CVCI w porównaniu z CVCL i MCA w porównaniu z CVCL (Rysunek 3). Struktura kariotypu tych populacji, ujawniona przez trzy pary parametrów - CVCI, CVCL i MCA - ma istotne implikacje. Parametry te wykazują podobne asymetrie kariotypów. Wyniki z wykresów punktowych podkreślają potencjalny wpływ badań, pokazując, że populacja HNXN ma najbardziej symetryczny kariotyp, podczas gdy populacje HBFC i HBWF wykazują odpowiednio najwięcej asymetrii wewnątrzchromosomalnych i międzychromosomowych (Rysunek 3).

To badanie skrupulatnie skategoryzowało osiem populacji Lycoris aurea na trzy główne grupy na podstawie diagramu drzewa UPGMA z pięcioma parametrami kariotypu (Rysunek 4). Pierwszy klaster, reprezentowany przez populację SCLS, tworzy niezależny klad. Druga grupa składa się z HNXN i HBWF. Trzeci klaster jest podzielony na dwie podgrupy: jedna zawiera tylko populację HBFC, podczas gdy druga obejmuje populacje HBWF, GZDS i GXTL, przy czym populacja HBBD i GZDS grupują się w mniejszej gałęzi. Zależności kariologiczne między badanymi populacjami, ujawnione za pomocą analizy głównych współrzędnych (PCoA), zilustrowano w Rysunek 5. Wykres punktowy PCoA wskazuje, że osiem populacji można podzielić na dwie grupy z poziomem ufności 68,36%. Pierwsza grupa obejmuje HBWF, HBBD i GXTL, przy czym pierwsze trzy populacje są ściśle zgrupowane razem. Druga grupa składa się z HBFC, HNXN, HNZX i SCLS, gdzie HBFC zajmuje środkową pozycję między dwiema grupami, a SCLS jest pozycjonowany najbardziej izolowany (Rysunek 5).

CPD (połączenie jodku propidyny i DAPI) oraz odwrotne barwienie DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) są standardowymi technikami stosowanymi do obserwacji struktury jądrowej i rozkładu chromatyny. Wyniki tego badania ujawniły widoczne zjawiska heterochromatyny w ośmiu populacjach Lycoris aurea (L'Hérit.) Herb (Rysunek 1 i Rysunek 2; Tabela 2). Wyniki hybrydyzacji FISH dla każdej populacji wykazały, że wszystkie regiony chromosomalne odpowiadają loci rDNA 45S i 5S. Charakterystyka pasm CPD jest zilustrowana w Rysunek 1A,C,E,G,I,K,M,O.

W populacjach HBFC i HBBD, pasma CPD zaobserwowano w regionach centromerowych i pericentromerowych (Rysunek 1G,K; Rysunek 2D,F). Jednak niektóre chromosomy nie wykazywały prążków CPD: 3. i 8. chromosom w SCLS, 1. chromosom w HNXN, 1. chromosom w HNZX, 1. chromosom w HBWF, 2. chromosom w GZDS i 2. chromosom w GXTL (Rysunek 1A,C,E,I,J,M,O; Rysunek 2A-C,E,G,H). Warto zauważyć, że prążki CPD znaleziono również na końcach krótkich ramion par chromosomów 5, 6 i 7 w SCLS i HNXN, na parach 4, 5, 6, 7 i 8 w HNZX oraz na parach 5, 6 i 7 w HBFC. Dodatkowo, prążki CPD były obecne na krótkich końcach ramion chromosomów 4, 5, 6, 7 i 8 w HBWF, na krótkich końcach ramion chromosomów 5, 6 i 7 w HBBD oraz na krótkich końcach ramion chromosomów 5, 6, 7 i 8 w GXTL (Figura 1A i Figura 2A).

Po hybrydyzacji FISH, odwrotne barwienie DAPI utworzyło jasne fluorescencyjne pasma wokół centralnych cząstek chromosomów 5, 6 i 7 w GZDS. Pasma te, zwane pasmami post-FISH DAPI+, wskazują, że te regiony heterochromatyny zawierają dużą liczbę par zasad A-T (Rysunek 2G). Zakres (około)centromerowych prążków CPD obserwowanych w ośmiu populacjach wynosił od 25,00% do 57,14% (Tabela 2), podczas gdy całkowita liczba końcowych prążków CPD wahała się od 40,00% do 71,43% (Tabela 2). W populacji GZDS prążki DAPI+ po FISH korelowały z długością kariotypu, stanowiąc 42,86% całości. Rozmiary prążków rDNA CPD, prążków CPD innych niż rDNA i prążków DAPI+ po FISH znacznie różniły się między różnymi parami chromosomów Lycoris aurea (L'Hérit). Zioło (Rysunek 2; Tabela 2).

Technika FISH została użyta do wstawienia sond 45S i 5S rDNA do chromosomów barwionych CPD, jak pokazano w Rysunek 1. Podsumowanie liczby i lokalizacji miejsc 45S i 5S rDNA w ośmiu populacjach Lycoris aurea (L'Hérit.) Zioło jest przedstawione w Tabeli 2 i przedstawione w Rysunek 2. Warto zauważyć, że znaczące różnice w liczbie, wielkości i lokalizacji loci rDNA między ośmioma populacjami podkreślają znaczenie tych ustaleń. W sumie w ośmiu populacjach znajdowało się 30 loci rDNA 45S. Spośród nich 4 loci (13,33%) znajdowały się w centralnym regionie centromerowym, 9 (30,00%) w pobliżu środkowego regionu centromerowego, a 17 (56,67%) w końcowych regionach odpowiednich ramion chromosomów (Rysunek 2; Tabela 2).

W populacji GXTL jeden sygnał locus 45S rDNA został znaleziony w regionie centromerowym krótkiego ramienia chromosomu 4, podczas gdy cztery dodatkowe sygnały znajdowały się w regionie centromerowym długich ramion chromosomów 5, 6, 7 i 8 (Rysunek 1P; Rysunek 2G). W populacji HBFC jeden locus rDNA 45S umieszczono w regionie centromerowym na krótkim ramieniu chromosomu 4, z trzema loci znalezionymi w pericentromerowych regionach heterochromatyny na krótkich ramionach chromosomów 5, 6 i 8 (Figura 1H; Rysunek 2D). W populacji GZDS locus 45S znajdował się w regionie centromerowym krótkiego ramienia metacentrycznego chromosomu 4 (Figura 1N; Rysunek 2G). W HNZX zaobserwowano pięć loci rDNA 45S w końcowych obszarach krótkich ramion par chromosomów 4, 5, 6, 7 i 8 (Figura 1H; Rysunek 2D). Rozkład stanowisk 45S w HBBD (Rysunek 1J; Rysunek 2E) oraz HNXN (Rysunek 1L; Rysunek 2F) była podobna, z jednym locus w regionie centromerowym krótkiego ramienia chromosomu 4 i trzema loci w regionie centromerowym krótkich ramion chromosomów 5, 6 i 7.

W HBWF pięć sygnałów loci 45S rDNA pojawiło się w regionach centromerów o krótkim ramieniu par chromosomów 4, 5, 6, 7 i 8 (Rysunek 1N; Rysunek 2G). W SCLS jeden sygnał locus 45S rDNA znaleziono w regionach centromerów krótkiego ramienia par chromosomów 1 i 2, a także w regionach pericentromerowych krótkich ramion par chromosomów 5 i 6 (Figura 1P; Rysunek 2H). W przypadku loci 5S rDNA zidentyfikowano łącznie dziewięć w ośmiu taksonach, z czego 3 (33,33%) zlokalizowane w regionach proksymalnych, 3 (33,33%) w regionach pericentromerowych i 3 (33,33%) w końcowych regionach odpowiednich ramion chromosomów (Ryc. 2; Tabela 2). W GXTL jeden sygnał locus 5S rDNA pojawił się w pobliżu końcowego końca długiego ramienia pary chromosomów 6 (Figura 1P; Rysunek 2G). Rozkład stanowisk 5S był podobny w HBFC (Rysunek 1H; Rysunek 2D) oraz GZDS (Rysunek 1N; Rysunek 2G), oba zawierają po jednym locus 5S rDNA w proksymalnym obszarze krótkiego ramienia chromosomu 7. W HNZX locus 5S rDNA znaleziono w pobliżu końcowego końca długiego ramienia chromosomu 8 (Figura 1H; Rysunek 2D), podczas gdy w HBBD locus 5S rDNA zidentyfikowano w chromosomie 7 (Rysunek 1J; Rysunek 2E). W HBWF dwa loci 5S rDNA pojawiły się w pobliżu końcowego końca długich ramion chromosomów 4 i 8, dwa kolejne w długim ramieniu chromosomu 7, jeden w regionie centromeru i jeden w pobliżu końca (Figura 1N; Rysunek 2G).

Kombinacja sygnałów 45S i 5S rDNA FISH, wraz z charakterystyką końcowego segmentu CPD, skutecznie odróżniała wszystkie chromosomy mitotyczne z różnych populacji Lycoris aurea (L'Hérit.) Zioło. W populacjach SCLS, HBFC, HBBD, GZDS i GXTL chromosom 1 wykazywał silne sygnały CPD w regionie centromerowym. Chromosom 2 wykazywał silne sygnały CPD w regionie centromerowym, z wyjątkiem GZDS i GXTL. Chromosom 3 wykazywał silny sygnał CPD w regionie centromerowym, z wyjątkiem SCLS. Chromosom 4 konsekwentnie wykazywał silne sygnały CPD w regionie centromerowym. W przypadku chromosomów 5, 6 i 7 zaobserwowano silne sygnały CPD na końcach krótkich ramion. Chromosom 4 wykazywał również silne sygnały rDNA 45S na końcu krótkiego ramienia, podczas gdy chromosomy 5 i 6 miały silne sygnały 45S w swoich obszarach końcowych, z wyjątkiem GZDS. Warto zauważyć, że silny sygnał DAPI był obecny w populacji GZDS. Dodatkowo słaby sygnał 5S rDNA pojawił się w proksymalnym regionie chromosomu 7 w populacjach HBFC, HBWF, HBBD i GZDS.

figure-results-1
Rysunek 1: Mitotyczne chromosomy ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół. Badanie mitotycznych chromosomów metafazy z ośmiu różnych Lycoris aurea (L' Herit.) Przedstawiono populacje ziół, w tym populację SCLS (A,B), populację HNXN (C,D), populację HNZX (E,F), populację HBFC (G,H), populację HBWF (I,J) i populację HBBD (K,L). Hybrydyzację GZDS (M,N) i GXTL (O,P) przeprowadzono przy użyciu FISH z sondami 45S znakowanymi biotyną i digoksyną 5S rDNA po barwieniu CPD. Uzyskane obrazy chromosomów po barwieniu CPD wyświetlają sygnały rDNA 45S (zielony) i 5S (czerwony). Całkowite DNA zostało zabarwione wstecznie barwnikiem DAPI, w wyniku czego uzyskano niebieski kolor. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Diagramy kariotypów chromosomów ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół. Diagram wzorca chromosomów dla ośmiu populacji Lycoris aurea (L' Herit.) Herb ujawnia charakterystykę pasma fluorescencji, a także lokalizację i wielkość sygnałów 45S i 5S rDNA FISH. Populacje SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS i GXTL są reprezentowane odpowiednio przez (A-H). Skala rzędnych wskazuje względną długość chromosomu (procent tego chromosomu w genomie haploidalnym), a liczba u góry wskazuje numer seryjny chromosomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wykresy punktowe dla ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół na podstawie trzech parametrów kariotypu. (A) Indeks CVCI zestawia się ze wskaźnikiem CVCL. (B) Indeks MCA zestawia się ze wskaźnikiem CVCL. Wskazane są populacje SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS i GXTL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Dendrogram UPGMA ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół. Dendrogram UPGMA opiera się na parametrach x, 2n, TCL, MCA, CVCL i CVCI dla ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS i GXTL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: PCoA ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Odmiany ziół oparte na sześciu parametrach kariotypu. PCoA opiera się na parametrach x, 2n, TCL, MCA, CVCL i CVCI, reprezentujących SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS i GXTL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Nazwy ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Rozkład prążków fluorochromowych i miejsc rDNA w ośmiu Lycoris aurea (L' Hér.) Populacje ziół. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Sondy użyte w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie Lycoris aurea (L'Hér.) Chromosomy korzeni ziół obejmują kilka krytycznych etapów: (1) uprawę korzeni za pomocą hydroponiki, (2) traktowanie wierzchołków korzeni nasyconym α-bromonaftalenem, (3) utrwalanie korzeni za pomocą roztworu kwasu alkoholowo-octowego, (4) przeprowadzanie hydrolizy enzymatycznej na wierzchołkach korzeni roztworem enzymu oraz (5) dokładne zgniatanie strawionych korzeni i suszenie szkiełek nad płomieniem lampy alkoholowej.

Dokładny pomiar chromosomu jest niezbędny do analizy kariotypu w badaniach cytogenetycznych. Chromosomy powinny wykazywać zauważalną kondensację i wyraźnie określone granice; W przeciwnym razie dokładne obliczenie parametrów chromosomów staje się wyzwaniem5. Wcześniejsze badania cytogenetyczne wykazały, że zróżnicowanie morfologiczne chromosomów mitotycznych zależy od stopnia zagęszczenia 4,36. Gdy kondensacja jest niewystarczająca, końce ramion chromosomów mogą nadal być zdesaglutynowe, co prowadzi do niejasnych granic chromosomów. Jednak gdy chromosomy osiągają maksymalną kondensację, różnice morfologiczne między chromosomami zmniejszają się. Dlatego wybór chromosomów o umiarkowanej kondensacji ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji i pomiaru chromosomów, zwłaszcza w populacjach z mniejszą liczbą chromosomów.

Znakowanie sondy ma kluczowe znaczenie dla udanej hybrydyzacji FISH in situ, szczególnie w przypadku roztworu sondy 5S rDNA. Ze względu na krótką sekwencję 5S rDNA, stężenie sekwencji docelowych znakowanych metodą PCR jest zwykle niskie, co prowadzi do słabych sygnałów hybrydyzacji. Bezpośrednia synteza sond znakowanych fluoresceiną wytwarza jednak silniejsze sygnały hybrydyzacji i upraszcza proces. W przypadku roztworu sondy 45S rDNA, częściowe sekwencje z regionów kodujących rRNA 5,8S, 18S i 25S Arabidopsis thaliana znakowano na końcach 5' i 3' za pomocą rodaminy 6-karboksylo-tetrametylowej (TAMRA), a następnie mieszano. Roztwór sondy fluoresceiny 5S rDNA uzyskano przy użyciu sekwencji nukleotydowych 1-59 i 60-118 z regionu kodującego gen rRNA Arabidopsis, przy czym każda sekwencja została znakowana na końcu 5' fluoresceiną 6-karboksylową (6-FAM), a następnie zmieszana.

W tym badaniu wykorzystaliśmy różnice między barwnikami DAPI i PI w wiązaniu DNA i połączyliśmy je, aby uzyskać przezroczyste pasma fluorescencyjne. Barwniki PI (jodek propydyny) mogą przenikać przez błony komórkowe i wiązać się z cząsteczkami DNA w komórkach. W przeciwieństwie do tego, DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) preferencyjnie wiąże się z regionami DNA bogatymi w AT, zapewniając wyraźne barwienie o wysokim kontraście. Ze względu na te komplementarne właściwości, DAPI i PI są często używane razem, znane jako barwienie CPD, w celu jednoczesnego zbierania informacji zarówno o jądrze, jak i cytoplazmie. Różnice w obecności, lokalizacji i wielkości prążków CPD i DAPI+ ujawniły znaczące zróżnicowanie heterochromatyny w ośmiu populacjach Lycoris aurea. Barwienie CPD wykazało regiony heterochromatyny bogate w zawartość GC zarówno w regionach centromerowych i pericentromerowych, jak i w obrębie chromosomów telocentrycznych.

Badanie asymetrii kariotypów jest popularnym, niedrogim i szeroko stosowanym cytogenetycznym podejściem taksonomicznym, które obejmuje szereg parametrów i wskaźników, w tym zarówno miary jakościowe, jak i ilościowe, parametry klasyfikacji Stebbinsa oraz różne wskaźniki ilościowe (np. Paszko10; Peruzzi i wsp.11). Wśród nich współczynnik R i CVCL są używane do pomiaru asymetrii chromosomów, podczas gdy CVCI i MCA reprezentują kluczowe wskaźniki asymetrii chromosomowej. Warto zauważyć, że CVCL jest uważany za solidny parametr statystyczny do szacowania asymetrii międzychromosomowej10, a wskaźnik asymetrii chromosomowej (MCA) jest uznawany za skuteczną miarę oceny asymetrii wewnątrzchromosomowej11. Aby jak najlepiej odzwierciedlić asymetrie kariotypów między populacjami, zaleca się dwuwymiarowy wykres punktowy z dwoma estymatorami asymetrii umieszczonymi odpowiednio na osiach x i y, gdzie każda próbka jest reprezentowana jako punkt11,12. Wyniki pokazały, że dwuwymiarowe wykresy punktowe CVCL vs. CVCI, a także MCA vs. CVCL, skutecznie ilustrują relacje asymetrii kariotypów między ośmioma odrębnymi populacjami Lycoris aurea (L′Herit.) Herb, potwierdzający wiarygodność tych wskaźników w ocenie asymetrii chromosomowej.

Aby porównać kariotypy i zrekonstruować relacje kariologiczne między ośmioma populacjami, w badaniu zastosowano metodologię zaproponowaną przez Peruzziego i wsp.11, wykorzystując parametry x, 2n, TCL, MCA, CVCL i CVCI. Wyniki ujawniły, że populacje HBWF, GZDS, HBBD i GXTL były blisko spokrewnione, a HBFC plasowało się pomiędzy tymi grupami. W związku z tym PCoA oparty na tych sześciu parametrach okazał się wysoce skuteczną metodą różnicowania relacji między ośmioma populacjami. Jednak pewne złożone wzorce wyłoniły się również ze skonstruowanego molekularnego drzewa ewolucyjnego. Na przykład, podczas gdy HNZX wydawał się blisko spokrewniony z HBWF w molekularnym drzewie filogenetycznym, był bardziej odległy na wykresie punktowym PCoA. Ta złożoność podkreśla znaczenie stosowania wielu podejść ilościowych do przewidywania trendów ewolucji kariotypu w obrębie Lycoris, uzupełniając charakterystykę klasyfikacji molekularnej.

Próbki roślin do tego badania pobrano z centralnych i zachodnich Chin, w tym z hrabstwa Tianlin w prowincji Guangxi (GXTL), hrabstwa Fang w prowincji Hubei (HBFC), hrabstwa Duszan, prowincji Guizhou (GZDS), hrabstwa Zixing, prowincji Hunan (HNZX), hrabstwa Badong, prowincji Hubei (HBBD), hrabstwa Xinning, prowincji Hunan (HNXN), hrabstwa Wufeng, prowincji Hubei (HBWF) i hrabstwa Lushan w prowincji Syczuan (SCLS). Egzemplarz kuponu zachował się w Zielniku Uniwersytetu Huaihua. Badanie to wykazało, że połączenie sygnałów 45S i 5S rDNA FISH oraz charakterystyki końcowego segmentu CPD skutecznie odróżniało wszystkie chromosomy mitotyczne z różnych populacji Lycoris aurea (L′Herit). Zioło. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zbadanie dystrybucji heterochromatyny w różnych populacjach Lycoris aurea (L′Herit.) Zioło. Odwrotne barwienie CPD (połączenie PI i DAPI) i DAPI (4′,6-diamidyn-2-fenyloindolowe) są uznanymi technikami obserwacji struktury jądrowej i dystrybucji chromatyny. Bezpośrednie znakowanie fluorescencyjne regionów genu 18S-5,8-26S rRNA (regiony 45S rDNA) i rybosomalnego DNA 5S do hybrydyzacji chromosomów FISH jest proste i zapewnia silne sygnały hybrydyzacji. To jakościowe rozróżnienie będzie miało coraz większą wartość w analizie różnych populacji.

Ta metoda najlepiej nadaje się dla gatunków roślin zdolnych do szybkiej uprawy wierzchołków korzeni, ponieważ podczas aktywnej mitozy potrzebna jest hodowla wierzchołków korzeni. Ze względu na krótką sekwencję 5S, w badaniu wykorzystano sekwencję nukleotydową 1-118bp regionu kodującego gen 5S rRNA Arabidopsis thaliana jako sondę 5S rDNA. Ze względu na krótką sekwencję i słaby sygnał, metoda ta jest skuteczna tylko w identyfikacji gatunków o stosunkowo konserwatywnych zasadach w regionie 1-118bp genu 5S rRNA. Selekcja chromosomów metafazowych o umiarkowanej kondensacji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia metody. Kondensacja chromosomów jest ściśle związana z czasem zbioru korzeni, czasem trwania obróbki wstępnej i pieczeniem płomieniowym. W związku z tym technika ta wymaga precyzyjnej kontroli nad każdym krokiem, aby zapewnić sukces eksperymentu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (32070367).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AlkoholSangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.A500737-0005(70%,  90%,  100%)
1 i razy; TNTSangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.B5481081&razy;, 10&razy;
2 razy; SSCSangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.B5481092&razy;, 20&razy;
45S  rDNASangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.TAMRA dodaje się na obu końcach (5 'i 3' końcach)
4'6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S  rDNASangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Oprogramowanie Adobe PhotoshopAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naftalenSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Środek
przeciwdziałający wypaleniu zawodowemuSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 ml
Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
Kwas cytrynowySangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Dejonizowanego formamidu (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000,7
Siarczan dekstranuSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 ml
Fluorescencyjny instrument do hybrydyzacji in situUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus  Chiny  Co.ltdBX60
Lodowaty kwas octowySangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 ml
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (Szanghaj)H399657500 ml
Maszyna do loduDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
LeicaNiemcy Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Alkohol metylowySangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 ml
Oprogramowanie MetMorphUrządzenia molekularneWersja 7.35
PiekarnikThermo Scientific™ Heratherm&handel;THM#51028152
PektynazaSangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
jodku propidyny (PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
DNA nasienia łososia (ssDNA)Odczynnik Aladdin Co. Ltd. (Szanghaj)D1198711 g
Cytrynian soduAladdin Odczynnik Co. Ltd. (Szanghaj)S18918310 g
Statistica dla Windows 10.0 do analizy statystycznej
Inkubator biochemiczny Mikroskop biologiczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

lokalizacje 45S rDNAlokalizacje 5S rDNAliczba chromosom wzmienno kariotypur nicowanie genomuasymetria kariotypu
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły