Artykuł metodologiczny

Pływające laboratorium: Standardowa procedura operacyjna pobierania i filtrowania próbek wody morskiej z działających promów do analizy środowiskowej DNA

DOI:

10.3791/67366

⸱

1 sierpnia 2025

 , 
1Department of Earth and Environmental Sciences, University of Milano-Bicocca, 2Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), 3National Biodiversity Future Centre (NBFC)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy nowatorski protokół odzyskiwania morskiego eDNA poprzez zbieranie i filtrację próbek wody morskiej z działających promów i innych statków handlowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetyczne narzędzia do pobierania informacji ze śladów DNA środowiska są dobrze znane zarówno do ukierunkowanej, jak i taksonomicznie szerokiej charakterystyki różnorodności biologicznej. Jednak w kontekście morskim pobieranie próbek eDNA z trudno dostępnych obszarów, takich jak wody głębinowe lub przybrzeżne, może nadal stanowić ograniczenie. Korzystanie z regularnych promów lub statków handlowych przemierzających duże obszary otwartego morza może stanowić cenne platformy oportunistyczne do pobierania próbek środowiskowych. Korzyści są niezliczone, począwszy od możliwości zbierania danych w każdych warunkach pogodowych i o każdej porze dnia, a skończywszy na powtarzalności w czasie, stałych trasach oraz całkowitej redukcji kosztów i emisji paliwa. Wcześniejsze prace wykazały, że podejście to jest możliwe i skuteczne. Jednak proces pobierania próbek z brzuchów tych dużych statków morskich może nie być natychmiastowy. Praca ta ilustruje w każdym szczególe, w jaki sposób można przygotować, zorganizować i przeprowadzić zbieranie i filtrowanie wody morskiej z dużych statków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach, analiza środowiskowego DNA (eDNA), czyli wykrywanie materiału genetycznego pozostawionego przez organizmy w środowisku, szybko się rozwinęła jako obiecujące narzędzie monitorowania społeczności zwierząt słodkowodnych i morskich. Ta technika molekularna daje możliwość jednoczesnej identyfikacji wielu taksonów w obrębie jednej próbki (podejście metabarcoding), umożliwiając wykrycie zbiorowisk biologicznych zamieszkujących lub przecinających obszar objęty próbką1,2,3,4,5.

Obecnie prawdziwym wyzwaniem jest dotarcie do miejsc pobierania próbek, ponieważ często jest to ekonomicznie i/lub logistycznie niewykonalne do pobrania próbek na dużych skalach geograficznych, co powoduje, że obszary pelagiczne są zwykle niedostatecznie próbkowane w porównaniu z bardziej dostępnymi obszarami przybrzeżnymi6. Korzystanie z promów lub innych statków komercyjnych pozwala na wysoce powtarzalne transekty pobierania próbek, ponieważ podążają one określonymi trasami żeglugowymi, które są zazwyczaj stałe w sezonie i obejmują duże obszary7,8. Co więcej, wykorzystanie tras promowych jako środka pobierania próbek umożliwia pobieranie próbek o każdej porze dnia i o każdej porze roku, niezależnie od pogody i warunków morskich, a ponadto ma wiele innych zalet (rysunek uzupełniający 1). Wstępne badania dowiodły zarówno jego wykonalności, jak i dokładności w ocenie wskaźników różnorodności biologicznej9,10. Próbki wody można pobrać z maszynowni promu za pomocą rury odprowadzającej przechwytującą morską wodę chłodzącą przed silnikami. LIFE-CONCEPTU MARIS (Conservation of CEtaceans and Pelagic sea TUrtles in Med: Managing Actions for their Recovery In Sustainability) jest pierwszym projektem, w którym ten dowód słuszności koncepcji został wprowadzony w życie na dużą skalę: ma na celu zebranie 500 próbek (w ciągu dwóch lat) i zakłada zaangażowanie nie jednego, ale kilku operatorów promowych i kilku przewoźników. Pozwala to na zwrócenie uwagi na wszelkie krytyczne problemy i udoskonalenie strategii pobierania próbek, aby lepiej dostosować się do najróżniejszych kontekstów, które można napotkać na pokładzie. Poniżej opisujemy charakterystykę projektu w odniesieniu do jego komponentu związanego z wielkoskalowym zbieraniem próbek DNA ze środowiska morskiego (opis projektu znajduje się na stronie https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

Decyzja o podjęciu kampanii próbkowania przy użyciu planowego promu implikuje pewne działania, które muszą być podjęte przed faktycznym pobraniem próbek, co jest aspektem bezpośrednio poruszonym w tej pracy. W tym miejscu pokrótce wspominamy o czynnościach, które muszą poprzedzać pobieranie próbek na pokładzie każdego statku komercyjnego.

To jest aspekt, którego nie należy pomijać i który decyduje o sukcesie kampanii kolekcjonerskiej. Przedsiębiorstwa żeglugowe są jednostkami komercyjnymi, a nie badawczymi, a zatem nie są i nie muszą być zaznajomione z celami i zadaniami badań naukowych, które mają być prowadzone na pokładzie. Pociąga to za sobą ważną i delikatną fazę początkową, w której cele proponowanego projektu naukowego, który może być multidyscyplinarny, muszą być przekazywane i motywowane przez ścisłe kierownictwo samego przedsiębiorstwa żeglugowego. W konkretnym przypadku projektu CONCEPTU MARIS było to możliwe dzięki trwającej dziesięciolecia współpracy, w ramach której przedsiębiorstwa żeglugowe były już zaangażowane w projekty monitoringu wizualnego (np. Fixed Line Transects [FLT]7), które określiły relację wzajemnego szacunku niezbędną do uzyskania zielonego światła na dostęp do maszynowni niezbędnej dla podejścia do pobierania próbek objętego tymi pracami.

Rodzaj reżimu pobierania próbek przyjęty w projekcie CONCEPTU MARIS jest dwojaki: próbki są pobierane zarówno w stałych stacjach pobierania próbek (FSS, patrz poniżej), jak i przy okazji obserwacji "rzadkich" waleni. Reprezentują one gatunki, które są najrzadziej widywane podczas transektów FTL11, a mianowicie: delfin zwyczajny (Delphinus delphis), wieloryb Cuviera (Ziphius cavirostris), grindwal (Globicephala melas), delfin Risso (Grampus griseus), kaszalot (Physeter macrocephalus) i finwal (Balaenoptera physalus). Dodatkowa próbka wody jest pobierana tylko wtedy, gdy obserwacja rzadkiego gatunku zgłoszona przez zespół ds. spisu wizualnego (zespół FLT) ma miejsce więcej niż pół godziny przed lub po jednym z FSS. Pobieranie próbek przeprowadzane w związku z obserwacjami będzie z konieczności

prowadzone w ciągu dnia.

Stałe stacje pobierania próbek (FSS), których pozycja geograficzna pozostaje niezmienna podczas rejsów, są wcześniej identyfikowane i uzgadniane z całym zespołem roboczym. Położenie geograficzne FSS wybiera się na podstawie: 1) obecności miejsca o znaczeniu biologicznym na podstawie wcześniejszych danych obserwacyjnych/literaturowych; 2) priorytet nadawany punktom wskazującym zmiany siedliskowe na mapach batymetrycznych (np. krawędź szelfu kontynentalnego); 3) jednorodne pokrycie wyznaczonych szlaków żeglugowych, a więc wybór mniej więcej jednakowo odległych od siebie miejsc pobierania próbek (oddalonych od siebie o około 35-45 mil morskich), w celu zarówno pokrycia całej trasy, jak i przewidzenia pobierania próbek również w nocy.

Aby upewnić się, że sąsiednie próbki są pobierane o różnych porach dnia i że jest wystarczająco dużo czasu między dwoma kolejnymi próbkami, aby zakończyć przetwarzanie próbki, zaleca się pobieranie próbek z sąsiednich FSS, jednego w drodze tam i jednego w drodze powrotnej. Oznacza to, że jeśli służby nadzoru bezpieczeństwa są ponumerowane zgodnie z kolejnością chronologiczną, w jakiej są próbkowane, nie pojawią się w kolejności kolejnej na mapie. Na przykład, jeżeli wybrano 6 służb bezpieczeństwa, próbki z 3 zostaną pobrane podczas podróży do miejsca przeznaczenia, a 3 podczas podróży powrotnej. "Ich kolejność wzdłuż trasy na mapie będzie następująca: PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, z trzema stacjami pobierania próbek pisanymi kursywą (FSS4, FSS5 i FSS6) badanymi w drodze powrotnej (patrz Rysunek 1).

Każdy pojedynczy FSS ma unikalny numer identyfikacyjny (tzn. żaden z FSS zidentyfikowanych na różnych trasach nie ma tego samego numeru identyfikacyjnego). Numeracja jest przypisywana przy pierwszym próbkowaniu FSS, a numeracja następująca po sobie jest następująca. W związku z tym, po zakończeniu projektu, niskonumerowe FSS będą to te, które były testowane przez kilka lat lub dla których dostępne są najstarsze dane.

Każda próbka składa się z ok. 13 l wody morskiej zebranej na każdej stacji pobierania próbek. Woda morska jest dekantowana bezpośrednio z rury odprowadzającej prom do pojemników "Bag-in-the-Box" (BiB), czyli sterylnych toreb foliowych laminowanych folią, do czasu przetworzenia próbki (patrz poniżej). Charakterystykę i zalety systemu pobierania próbek Bag-in-Box (BiBSS) szczegółowo zilustrowali Valsecchi et al. (2021)9 i są również przedstawione tutaj w Rysunek 2 dla wygody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie w laboratorium

  1. Lista kontrolna sprzętu
    1. Zapoznaj się z listą kontrolną dotyczącą elementów, które należy zabrać na pokład zarówno w celu pobrania próbki, jak i filtracji próbki. Jest on pokazany w pliku uzupełniającym 1. Każdy przedmiot i jego zastosowanie zostanie wyjaśnione w poniższych sekcjach.
    2. Wydrukować kopię pliku uzupełniającego nr 1 i wypełnić ją przed wyjazdem na kampanię pobierania próbek.
  2. Przygotowanie systemu pobierania próbek typu Bag-in-Box
    1. Przed wejściem na pokład należy przygotować torby Bags-in-Box w laboratorium, jeśli to możliwe, pod wyciągiem. Uszczelnij trzy otwory (ten na torbie, część nakrętki zamykającej worek i wylot z kranu) folią uszczelniającą (Rysunek 3, Tabela materiałów).
    2. Zwiń worki, z odczepioną i zamkniętą w środku nakrętką, szczelnie i zamknij je taśmą klejącą, aby zapobiec ponownemu otwarciu podczas transportu (Rysunek 3).
    3. Wykonaj tę operację, upewniając się, że nie wpuszczasz powietrza do worka podczas wspomnianego manewru zamykania, zarówno (i) aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia przenoszonego przez powietrze dostające się do worka, jak i (ii) aby zapobiec zwiększeniu się objętości złożonej torby (jeśli zawiera powietrze).

2. Przygotowanie do wejścia na pokład

  1. Koordynacja z członkami załogi
    1. Zaraz po wejściu na pokład należy podzielić się wybranymi punktami pobierania próbek z kapitanem i jego załogą, tak aby wskazane zostały godziny, w których prom będzie najbliżej każdego punktu wybranego jako "Stała stacja pobierania próbek" (FSS).
    2. Zanotuj czas pobierania próbek dla każdego FSS oraz aktualną (lub średnią, jeśli jest dostępna) prędkość przelotową promu na tej trasie: pozwala to na oszacowanie rozciągłości (km) odcinka morza, z którego pobrano próbki.
    3. Ponieważ prom nigdy nie przepływa dokładnie w tym samym punkcie, należy skorygować współrzędne każdej próbki wody morskiej po faktycznym pobraniu próbki.
      UWAGA: Dokładny odstęp między próbkami jest najważniejszą informacją pozwalającą na wierną identyfikację obszaru morskiego, z którego faktycznie pobrano próbki; w związku z tym przydatne jest wydrukowanie mapy zgrubnych punktów, w których podawane są rzeczywiste współrzędne próbkowania (np. w pliku uzupełniającym 2).
    4. Jeśli firma udzieli dostępu do maszynowni, poproś o odprowadzenie do pomieszczenia.
    5. Przed wejściem do maszynowni należy nosić środki ochrony osobistej (PPE). Tutaj środowisko jest niegościnne (ogłuszający hałas i wysokie temperatury) i pełne potencjalnie podstępnych punktów (strome schody, duże szczeliny w podłogach). Po uzyskaniu pozwolenia na wejście do maszynowni należy wyposażyć się we wszystkie niezbędne środki bezpieczeństwa, takie jak obuwie ochronne, kask i słuchawki chroniące słuch.
    6. Jeśli powierzchnia filtrująca jest dostarczana przez firmę spedycyjną (zwykle zaleca się posiadanie własnego składanego stołu), sprawdź, czy obszar ten można zdezynfekować między próbkami za pomocą 10% roztworu wybielacza.
  2. Osiedlanie się w maszynowni
    1. Ponieważ na statkach znajdują się różne wloty wody morskiej, należy skontaktować się z kierownikiem maszynowni, który umożliwia minimalną drogę dla pobieranej wody przez rury statku, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbki wody substancjami i organizmami, które mogą znajdować się w rurach.
    2. Po zidentyfikowaniu najodpowiedniejszego punktu/wlotu do zbierania dopływającej wody morskiej należy zapytać personel, czy kran do pobierania próbek może być lekko otwarty przez cały czas trwania rejsu, aby można było w sposób ciągły płukać rurę używaną do pobierania próbek "lokalną" wodą. Wodę morską, która nieustannie wypływa z kranu, należy usunąć w zęzie.

3. Pobieranie próbek wody (w maszynowni)

UWAGA: Rysunek 4 pokazuje fazy pobierania próbek wody morskiej.

  1. Przygotowanie do zbierania wody
    1. Przynieś cały niezbędny sprzęt (pierwsza część listy kontrolnej pliku uzupełniającego 1) do maszynowni. Udać się do maszynowni co najmniej 15 minut przed planowaną godziną pobierania próbek, aby wysterylizować obszar, w którym obsługiwane są BiB, przy użyciu 10% roztworu wybielacza.
    2. Jeśli dedykowany kran nie był otwarty przez cały rejs, otwórz go w celu pobrania próbek wody morskiej i pozwól wodzie płynąć przez co najmniej 5 minut (woda jest usuwana w zęzie) przed faktycznym pobraniem (Rysunek 4A).
    3. Przygotuj stację filtrującą.
      UWAGA: Istnieje kilka środków związanych z konfiguracją stacji filtrującej, które mogą znacznie poprawić skuteczność filtracji (patrz krok 4.3): 1) użyj kolb próżniowych o dużej pojemności (kolba 2 l, 4 l lub 5 l, w zależności od objętości, która ma zostać pobrana). To, oprócz oszczędności czasu potrzebnego na opróżnienie kolby od 1 litra do następnej, minimalizuje obsługę cylindra filtracyjnego, a tym samym wszelkie zanieczyszczenia; 2) Można użyć wielu kolb filtracyjnych ułożonych szeregowo, co pozwala na jednoczesną filtrację wielu próbek (worków). Środek ten jest zalecany w przypadku rygorystycznych reżimów pobierania próbek, w przypadku gdy w przeciwnym razie istnieje ryzyko, że nie będzie miał czasu niezbędnego do przetworzenia worków przed dotarciem do portu dokowania.
    4. Do przygotowania i oznakowania BiB należy użyć trwałego markera, pisząc na nim: 1) niepowtarzalny alfanumeryczny kod identyfikacyjny próbki po obu stronach BiB (ważne zwłaszcza wtedy, gdy BiB nie jest przetwarzany bezpośrednio na pokładzie i jest filtrowany na lądzie) 2) datę; 3) dokładny czas rozpoczęcia wypełniania BiB.
  2. Zbieranie wody
    1. Usuń folię uszczelniającą z otworu BiB i zacznij ją napełniać, aż do całkowitego napełnienia (około 13 l) (Rysunek 4B).
    2. Gdy worek jest prawie pełny, usuń folię uszczelniającą z pokrywy, ale nie z otworu kranu: utrzymuj folię uszczelniającą wokół kranu bezpiecznie (czerwona plastikowa wypustka) aż do filtracji (Rysunek 4C). Uszczelnij śliniak pokrywką, dociskając go mocno, aż do całkowitego zamknięcia.
    3. Zwróć uwagę na dokładny czas zakończenia pobierania próbki: pozwala to obliczyć całkowity czas trwania (w minutach) pobierania próbki.
  3. Po zebraniu wody
    1. Za pomocą markera permanentnego na biB należy zapisać dokładny czas zakończenia pobierania próbki i podać wszystkie dane w formularzu pobrania/filtracji próbki (plik uzupełniający 2).
    2. Przenieść napełniony BiB do pomieszczenia magazynowego lub do obszaru filtracji (wydzielone miejsce w samej maszynowni lub w kabinie).
    3. Przenieś wszystkie dane z formularza pobierania/filtracji próbki (plik uzupełniający 2).
      UWAGA: Plik uzupełniający 2 przedstawia arkusz pobierania próbek/filtracji, który należy wypełnić na pokładzie we wszystkich jego częściach.
      1. W części dotyczącej pobierania próbki (kolor zielony) należy podać czas rozpoczęcia i zakończenia pobierania próbek wody morskiej z maszynowni.
      2. Po drugie, po konsultacji z członkami załogi lub zapisach GPS, wprowadź współrzędne geograficzne względem początku i końca pobierania próbek oraz prędkości przelotowej. Pozwala to na późniejsze obliczenie długości próbkowanego odcinka morskiego.
        UWAGA: Jeśli chodzi o część dotyczącą filtrowania (niebieska), zostanie wskazane, czy filtracja odbywa się na pokładzie, czy później na lądzie: czasy filtrowania zostaną wskazane dla każdego z 3 filtrów.

4. Filtracja próbek wody morskiej

  1. Przygotuj się do filtracji
    UWAGA: Od tego momentu proces filtracji może być zarządzany zgodnie z różnymi protokołami w oparciu o konkretne cele projektu badawczego. Opisany tutaj protokół pozwala na wydajną filtrację dużej ilości wody morskiej (ponad 10 litrów) bezpośrednio na pokładzie, unikając ograniczeń objętości nieodłącznie związanych z innymi powszechnie stosowanymi komercyjnymi zestawami lub protokołami. Jeśli to możliwe, należy filtrować próbki wody na pokładzie: filtracja może odbywać się albo w samej maszynowni, albo w kabinie, najlepiej znajdującej się w pobliżu maszynowni. Zawsze pożądane jest filtrowanie próbek wody morskiej natychmiast po pobraniu, zarówno w celu ograniczenia degradacji eDNA, jak i dla wygody, unikając w ten sposób zejścia na ląd z dużymi ilościami wody morskiej do przetworzenia. Jeśli nie jest to możliwe, próbki mogą być przechowywane w pojemnikach typu Bag-in-Box i transportowane w celu późniejszej filtracji.
    1. W przewidzianym do tego miejscu przeznaczonym do filtracji na pokładzie (w maszynowni lub dedykowanej kabinie) przygotuj się ze wszystkim, co jest wymienione w drugiej części listy kontrolnej w pliku uzupełniającym 1 i zmontuj system filtrowania, jak pokazano na Rysunek 5.
    2. Przygotuj cylinder filtracyjny (tabela materiałów), jak pokazano na Rysunek 6 i Rysunek 7. Używaj nowej butli do każdej stacji, nowej pary pęset jednorazowych lub pary wysterylizowanych.
      UWAGA: Pojedynczy cylinder może być używany wielokrotnie do filtrowania próbek z tego samego miejsca. Należy go jednak wysterylizować 10% wybielaczem, a następnie spłukać słodką wodą, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w laboratorium, a następnie zapakować pojedynczo w celu przechowywania do następnej kampanii.
    3. Przed rozpoczęciem filtracji należy wypełnić dziennik danych pobierania próbek/filtracji (plik uzupełniający 2). Jest to konieczne zarówno do śledzenia liczby przetworzonych litrów, jak i do pomiaru czasu filtrowania (wskazującego ilość cząstek stałych w próbce). Jak tylko pompa próżniowa zostanie aktywowana, uruchom timer, aby zmierzyć czas filtrowania.
  2. Filtracja na pokładzie
    1. W celu zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia (zwłaszcza gdy przetwarzanych jest kilka worków jednocześnie, patrz poniżej), należy odizolować przepływ wody przeznaczonej do filtracji od otaczającego środowiska, umieszczając tuleję izolacyjną - plastikową torbę - między kranem a cylindrem filtrującym (patrz Rysunek 7).
      UWAGA: Jest to ważny środek ostrożności, ponieważ czułość technologii stosowanych do analizy środowiskowego DNA sprawia, że podejście to jest szczególnie podatne na zanieczyszczenie środowiska (od operatora lub zanieczyszczenie krzyżowe między próbkami).
    2. Aktywuj pompę próżniową i przefiltruj do 4 l wody na każdy filtr. Podczas filtracji butla powinna być zawsze pełna, aby uniknąć przedostania się powietrza do systemu i spowolnić proces filtracji.
      UWAGA: Jeśli chodzi o wybór porowatości membrany, zależy to od celu badań, docelowych grup taksonomicznych oraz ilości wody, która ma być przetwarzana. Ten problem został rozwiązany w poprzednich pracach9,12. w których porównano filtry o różnej porowatości. Do badania kręgowców i wyboru przetwarzania 4 litrów wody na filtr najlepszym rozwiązaniem okazała się membrana o porowatości 0,45 μm, pozwalająca na przetwarzanie dużych ilości wody bez powodowania zaśmiecania filtra z powodu nasycenia porów.
    3. Gdy poziom przefiltrowanej wody wewnątrz kolby osiągnie znak poziomu 4 l, wyłącz pompę próżniową i zatrzymaj timer, podając wartość czasu filtrowania w dzienniku danych.
      UWAGA: Z każdego BiB o pojemności 12/13 l zostaną otrzymane 3 powtórzenia techniczne, po 4 L każdy (o nazwach A, B i C).
    4. W tym momencie, za pomocą pęsety (i, jeśli to konieczne, sterylnej wykałaczki, która pomoże podnieść krawędź filtra), wyjmij pierwszy filtr (filtr A) z cylindra, jak pokazano na Rysunek 8, unikając ewentualnego uszkodzenia filtra.
    5. Złóż filtr na pół (stroną, która utrzymywała materiał biologiczny, złożoną na sobie) i zawiń go w folię aluminiową, natychmiast zapisując numer próbki i identyfikator powtórzonej próbki filtra (na przykład 15A) na opakowaniu. Przechowuj go w zamrażarce pokładowej do momentu zejścia na ląd.
    6. Zamontuj nowy filtr (filtr B) wewnątrz cylindra filtracyjnego, aby przetworzyć kolejną próbkę o pojemności 4 litrów (Rysunek 9). Opróżnić kolbę i rozpocząć od nowa filtrowanie drugiej kontrpróby, aż do całkowitego przefiltrowania 4 l. Odzyskaj filtr B, jak wyjaśniono, i powtórz te same kroki dla filtra C.
  3. Dobre praktyki
    1. Aby skrócić czas filtrowania, należy użyć dużej kolby próżniowej, która jest w stanie pomieścić całą przefiltrowaną wodę przetworzoną przez jeden filtr (dlatego w tym przypadku o pojemności co najmniej 4 l).
    2. Skróć znacznie czas filtrowania, filtrując wiele worków jednocześnie, ustawiając aparaturę filtrującą równolegle (tj. wiele kolb próżniowych obsługiwanych przez jedną pompę).
      UWAGA: W kampanii CONCEPTU MARIS przyjęto obie strategie (Rysunek 10). Należy pamiętać, że maksymalizacja wydajności filtrowania jest bardzo ważna, ponieważ liczba próbek zebranych na trasie może być duża. W związku z tym konieczne jest przetworzenie worków w krótkim czasie, aby uniknąć gromadzenia się próbek, co wiązałoby się z ryzykiem konieczności opróżnienia worków, jeżeli nie ma wystarczająco dużo czasu na ich przetworzenie na pokładzie.
    3. W celu monitorowania występowania wyników fałszywie dodatnich (skażenia) należy włączyć do procedury filtrowania, co najmniej raz na rejs, "ślepą próbę", filtrującą równolegle z próbkami worek wypełniony wodą pitną pobraną z zapieczętowanych butelek. Ta próbka kontrolna nie wymaga powtórzeń i traktuje ją jak pozostałe próbki i włącza do serii NGS.
  4. Przechowywanie i transport filtrów
    1. Po filtracji wszystkie filtry należy przechowywać w temperaturze od -4 °C do -20 °C do czasu dalszej obróbki laboratoryjnej.
    2. Zbierz próbki z pokładowej zamrażarki tuż przed zejściem na ląd i przygotuj je do transportu w niskich temperaturach za pomocą przenośnych chłodziarek, jak pokazano na Rysunek 11.
      UWAGA: Jeśli próbki nie są filtrowane na pokładzie, worki z wodą morską są bezpieczniej transportowane, jeśli są przechowywane pionowo z nakrętką trzymaną na górze, podtrzymywaną parami w torbach na zakupy wewnątrz plastikowych skrzynek, aby ułatwić transport (Rysunek 12).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonując protokół zgodnie z opisem, operator zbierze liczbę filtrów równą liczbie FSS pomnożonej dla 3 replik. Każdy filtr zatrzymuje ślady biologiczne (środowiskowe DNA) po jednej z dwóch stron. Etapy analityczne następujące po ekstrakcji eDNA silnie zależą od pytania badawczego, celu i celu. Na przykład w badaniu pilotażowym przeprowadzonym przez Valsecchi et al.9, opisany protokół zbierania eDNA pozwolił na zaprojektowanie powtarzalnego i systematycznego badania megafauny morskiej. Stosując po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ kroki protokołu są proste i nieskomplikowane, istnieje kilka istotnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas pracy na promach komercyjnych. Rura odprowadzająca wodę chłodzącą znajduje się zwykle w obszarze maszynowni, do której dostęp może być ograniczony lub podlegać uprzedniemu zezwoleniu. Dlatego tak ważne jest upewnienie się, że posiada się takie uprawnienie, wraz z odpowiednimi środkami ochrony osobistej (rysunek 4). Ponadto zbieranie i filtracja wody powinny odbywać si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy osobom, które pozwoliły na przetestowanie i opracowanie przedstawionej tutaj metody, a mianowicie Antonelli Arcangeli (ISPRA), która od dziesięcioleci kieruje projektem FLT, w ramach którego śródziemnomorskie (i nieśródziemnomorskie) są stale monitorowane wizualnie, opierając się na gęstej sieci promów, i które wierzyły w ambitną propozycję poszukiwania DNA na trasach, przez które przepływają promy; Cristina Pizzutti z Corsica and Sardinia Ferries, która z entuzjazmem przyjęła wyzwanie, udzielając nam wsparcia logistycznego w celu przetestowania metodologii po raz pierwszy na przewoźniku z ich floty (witając również ekipę filmowców, którzy wykonali film); Fulvio Maffucci, za kontakty z różnymi przedsiębiorstwami morskimi w celu wydania zezwoleń na pobieranie próbek na pokładzie. Dziękujemy Roberto Lombardo, którego praca magisterska zapoczątkowała badania nad eDNA i promami. Na koniec dziękujemy firmom morskim, które umożliwiły nam wejście na pokład i pobranie próbek eDNA w związku z projektem LIFE-CONCEPTU MARIS, ponieważ dało nam to możliwość przetestowania naszej metody na kilku różnych statkach na Morzu Śródziemnym: Grimaldi Lines, Minoan Lines, Tirrenia, Balearia, Corsica i Sardinia Ferries, Grandi Navi Veloci (GNV). Trwający obecnie finansowany ze środków UE projekt LIFE-CONCEPTU MARIS dostarcza dowodów na słuszność koncepcji możliwości powielenia tego podejścia na dużą skalę, a także finansuje produkcję tej publikacji wideo, która pozwoli na rozpowszechnienie Standardowego Protokołu Operacyjnego (SOP) wśród szerszej społeczności naukowej i opinii publicznej. Dziękujemy Mattii Noccioli i Francesco Tommasinelliemu (Triton Research) za udostępnienie materiału filmowego z protokołu. Na koniec dziękujemy wszystkim załogom, które współpracowały z nami i pomagały w pobieraniu próbek w ciągu ostatnich 5 lat.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Membrany filtracyjne o średnicy 4,7 cmBiosigma S.p.A.https://www.biosigma.com/Membrany filtracyjne 0,45 μ m porowatość, pakowane pojedynczo 
Termosy 4/5 LSzklana kolba Duranhttps://www.duran-bottle-system.com/5 L z korkiem
Chłonne wkładki papieroweAdvantec MFS, Inc.https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1Wkłady chłonne z bibuły filtracyjnej, rozmiar 47 mm.
Bag-in-Box (BiB)G.M.V. Agricenter S.r.l.https://www.gmvagricenter.it/10 litrowe worki w pudełku z kranem
Cylindry filtrujące Cylindry monitorowe Sartorius AGhttps://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#Biostart 100, 0,45 μ M membrana w komplecie 
Folia uszczelniającaMerckhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium=
cpc& utm_campaign=wszystkie+product_
dsa_WW_%28Bing+eBizPFS%29&
utm_id=626946489& utm_content=
1166583023365595& msclkid=
d2b55b82440b1AEF56FC3CA803C
6486F& utm_term=%2Fproduct%2F		rolka laboratoryjnej folii uszczelniającej 4 cale x 125 stóp
Pompa próżniowaGrupa KNF https://knf.com/en/usPrzenośna pompa próżniowa Laboport N. 96 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
  2. Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community. Nat Commun. 11 (1), 254(2020).
  3. DiBattista, J. D., et al. Environmental DNA can act as a biodiversity barometer of anthropogenic pressures in coastal ecosystems. Sci Rep. 10 (1), 8365(2018).
  4. Beng, K. C., Corlett, R. T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: Opportunities, challenges, and prospects. Biodivers Conserv. 29 (7), 2089-2121 (2020).
  5. He, X., et al. eDNA metabarcoding enriches traditional trawl survey data for monitoring biodiversity in the marine environment. ICES J Mar Sci. 80 (5), 1529-1538 (2023).
  6. Pawlowski, J., et al. The future of biotic indices in the ecogenomic era: Integrating (e)DNA metabarcoding in biological assessment of aquatic ecosystems. Sci Total Environ. 637 - 638, 1295-1310 (2018).
  7. Arcangeli, A., Marini, L., Crosti, R. Changes in cetacean presence, relative abundance and distribution over 20 years along a trans-regional fixed line transect in the central Tyrrhenian sea. Mar Ecol. 34 (1), 112-121 (2013).
  8. Matear, L., Robbins, J. R., Hale, M., Potts, J. Cetacean Biodiversity in the Bay of Biscay: Suggestions for environmental protection derived from citizen science data. Mar Policy. 103672, 109(2019).
  9. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels provides new opportunities for systematic genetic surveys of marine biodiversity. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  10. Boyse, E., Beger, M., Valsecchi, E., Goodman, S. J. Sampling from commercial vessel routes can capture marine biodiversity distributions effectively. Ecol Evol. 13 (2), e9810(2023).
  11. Arcangeli, A., et al. Testing indicators for trend assessment of range and habitat of low-density cetacean species in the Mediterranean Sea. Front Mar Sci. 10, 1116829(2023).
  12. Valsecchi, E., et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  13. Hunter, M. E., et al. Improving eDNA yield and inhibitor reduction through increased water volumes and multi-filter isolation techniques. Sci Rep. 9 (1), 5259(2019).
  14. Capo, E., et al. Effects of filtration methods and water volume on the quantification of brown trout (Salmo trutta) and Arctic char (Salvelinus alpinus) eDNA concentrations via droplet digital PCR. Environ DNA. 2 (2), 152-160 (2020).
  15. Li, J., et al. The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  16. Collins, R. A., Wangensteen, O. S., O'Gorman, E. J., Mariani, S., Sims, D. W., Genner, M. J. Persistence of environmental DNA in marine systems. Commun Biol. 1, 185(2018).
  17. Kelly, R. P., Gallego, R., Jacobs-Palmer, E. The effect of tides on nearshore environmental DNA. PeerJ. 6, e4521(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pobieranie pr bek wody morskiejmonitoring z pok adu promussaki morskiewody przybrze nefiltracja pr bekfiltracja pr niowaocena r norodno ci biologicznejprzechowywanie filtr wbadanie waleni

Powiązane artykuły