Artykuł metodologiczny

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67367

⸱

27 września 2024

 ,  , 
1Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Streszczenie

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) są związane z upośledzeniem funkcji układu nerwowego, ale często pozostają słabo poznane na poziomie molekularnym. Odrębne zaburzenia wywołane przez pojedyncze geny dostarczają modeli do badania mechanizmów napędzających nietypowy rozwój neurologiczny. Warianty genów kodujących białka z rodziny enzymów deubikwitylujących (DUB) są związane z kilkoma NDD, ale istnieje potrzeba określenia patogennych mechanizmów zaburzeń napędzanych przez te warianty genów. Wpływ wariantów genów na aktywność DUB można określić eksperymentalnie za pomocą niezależnego od substratu testu rozszczepienia ubikwityny in vitro. Test ten nie wymaga znajomości dalszych substratów do bezpośredniego pomiaru aktywności katalitycznej. W tym przypadku protokół określania wpływu wariantów genów na aktywność enzymatyczną jest modelowany przy użyciu DUB Ubiquitin Specific Protease 27, sprzężonej z chromosomem X (USP27X), która jest zmutowana w niepełnosprawności intelektualnej sprzężonej z chromosomem X 105 (XLID105). Ten eksperymentalny proces może zostać wykorzystany do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń neurorozwojowych napędzanych przez warianty genów DUB.

Wprowadzenie

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) wynikają z różnych etiologii z uwarunkowaniami środowiskowymi lub genetycznymi, które napędzają nietypowy rozwój układu nerwowego1. Sekwencjonowanie genetyczne nowej generacji powiązało rosnącą liczbę wariantów genów związanych z układem ubikwityny z genetycznymi NDDs2. System ubikwityny katalizuje ligację małego modyfikatora białka ubikwityny do reszt lizyny w substratach białkowych, aby napędzać zmiany w zachowaniu komórek, w tym lokalizację, stabilność, interakcje białko-białko lub aktywność3. Ubikwitylacja jest pośredniczona przez enzymy aktywujące E1, sprzężone E2 i ligazy E34 i jest odwracalna przez aktywność enzymów deubikwitytylacyjnych (DUB), które katalizują rozszczepianie i usuwanie ubikwityny z substratów białkowych5. Ubikwityna może być ligowana do substratu jako monomer (monoubikwitylacja) lub łańcuchy polimerowe (poliubikwitylacja), które powstają na dowolnej z siedmiu reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) lub reszcie M1 ubikwityny. Te różne topologie łańcuchów ubikwityny i ich kombinacje tworzą kod komórkowy, który jest kluczowy dla transdukcji sygnału6.

DUBs, takie jak USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B i OTUD5 zostały powiązane z NDDs2,7,8,9,10,11. W przypadku większości NDD mechanizmy molekularne, które napędzają patogenezę, pozostają eksperymentalnie niezdefiniowane. Niektóre z DUB powodujących ostatnio opisane zaburzenia są słabo poznane i brakuje im znanych odczytów komórkowych, które można wykorzystać do oceny wpływu zmienności genetycznej na funkcję białek. In vitro, testy rozszczepienia łańcucha ubikwityny przezwyciężają to ograniczenie, ponieważ niezależne od substratu odczyty aktywności DUB, które mogą mierzyć wpływ wariantów genów na aktywność enzymatyczną12.

Testy in vitro na rozszczepienie ubikwityny są stosowane od lat 80. Testy te z użyciem substratów znakowanych radioaktywnie pozwoliły na odkrycie pierwszych DUB, w tym izopeptydazy, zidentyfikowanej ze względu na jej zdolność do deubikwitylacji histonu H2A13, oraz hydrolazy karboksylowej ubikwityny (UCH), identyfikowanej przez jej zdolność do hydrolizy ubikwityny z różnych koniugatów chemicznych14,15,16. Ponadto do identyfikacji izopeptydazy T i kilku UCH oraz proteaz specyficznych dla ubikwityny ubikwityny (UBP) z erytrocytów i mięśni szkieletowych wykorzystano znakowane radioizopomagnetycznie białka lub peptydy o pełnej długości17,18,19,20. Łańcuchy ubikwityny o określonej długości i typie wiązań (tetra-ubikwityna sprzężona z K48) zostały po raz pierwszy użyte do pomiaru aktywności DUB izopeptydazy T21. Od tego czasu test ten stał się złotym standardem pomiaru aktywności DUB w analizach mutacyjnych22,23. Udoskonalenie tego testu pozwala obecnie na wizualizację rozszczepienia ubikwityny za pomocą elektroforezy i konwencjonalnych barwników żelowych, takich jak niebieski Coomassie, pomarańczowy SYPRO, rubinowy i srebrny barwnik lub detekcja fluorescencyjna lub immunologiczna12,24. Molekularne aspekty aktywności DUB, takie jak minimalna długość łańcucha i swoistość wiązania25,26,27,28, można wyjaśnić za pomocą łańcuchów ubikwityny o różnych długościach (np. di-, tri-, tetra-ubikwityna) i wiązaniach (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, liniowe) w testach funkcjonalnych. Warianty związane z NDD mogą napędzać defekty aktywności DUB, które są specyficzne dla typu ogniwa łańcucha ubikwityny11.

Test rozszczepienia di-ubikwityny przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych białek DUB może bezpośrednio mierzyć wpływ wariantów NDD na aktywność DUB. USP27X, który jest zmutowany w zaburzeniu niepełnosprawności intelektualnej sprzężonym z NDD X 105 (XLID105)7,28 modeluje przedstawiony tutaj proces. Podejście to pozwala na określenie, w jaki sposób aktywność DUB jest zakłócana przez warianty genów w istniejących i nieznanych NDD związanych z DUB.

Protokół

Poniższy protokół można dostosować do białek rekombinowanych z zastosowaniem różnych znaczników powinowactwa ekspresowanych w różnych szczepach kompetentnych komórek. W zależności od ekspresowanego białka, warunki hodowli i nocnej ekspresji mogą wymagać optymalizacji wartości OD600 w momencie indukcji ekspresji, czasu ekspresji, temperatury ekspresji oraz stężenia IPTG. Przegląd protokołu przedstawiono na Ryc. 1. Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu wykorzystanego w tej badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Transformacja kompetentnych Rosetta 2 E. coli plazmidem ekspresyjnym rekombinowanego GST-USP27X

UWAGA: Aby zachować sterylność hodowli bakteryjnej, należy wykonywać czynności związane z otwartymi pojemnikami z pożywką w pobliżu płomienia palnika Bunsena. Aby zapewnić optymalny transfer tlenu, wstrząsanie hodowli bakteryjnej należy przeprowadzić w laboratoryjnym inkubatorze wytrząsowym z kontrolą temperatury, przy orbicie od 19 mm do 50 mm i prędkości 200 rpm29.

  1. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić 20 µL chemicznie kompetentnych komórek Rosetta 2 E. coli na lodzie. Dodać 1-10 ng plazmidu ekspresyjnego pGEX6P1-USP27X (kodującego USP27X z N-końcowym znacznikiem Glutathione-S-transferase (GST)30 i zawierającego gen oporności na ampicylinę) i inkubować przez 5 min na lodzie.
  2. Przeprowadzić szok termiczny przez 30 s w temperaturze 42 °C w bloku grzewczym. Inkubować na lodzie przez 2 min.
  3. Dodać 80 µL pożywki SOC o temperaturze pokojowej (RT). Inkubować przez 60 min w temperaturze 37 °C przy 200 rpm w laboratoryjnej inkubatorze z wytrząsaniem i kontrolą temperatury o orbicie 19 mm.
  4. Wykulturzyć 50 µL hodowli na płytce z agarem LB uzupełnionym o 25 µg/L chloramfenikolu i 50 µg/L ampicyliny. Inkubować przez 20 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z kontrolą temperatury, ustawiając płytki dnem do góry.

2. Nocna ekspresja bakteryjna białka rekombinowanego z plazmidu ekspresyjnego

UWAGI: Aby zachować sterylność hodowli bakteryjnej, kroki wymagające otwarcia pojemników z pożywką należy przeprowadzać w pobliżu płomienia palnika Bunsena. W celu zapewnienia optymalnego transferu tlenu, inkubację z wytrząsaniem hodowli bakteryjnej należy prowadzić w laboratoryjnym inkubatorze z wytrząsaniem z kontrolą temperatury, przy orbicie od 19 mm do 50 mm i prędkości 200 rpm29. Wartość OD600 hodowli należy zmierzyć przy użyciu spektrofotometru.

  1. Przygotować 1 L pożywki Terrific Broth (TB), dodając 47,6 g proszku TB do 1 L wody ultrapurej z 0,4% glicerolu w 2 L kolbie hodowlanej z przegrodami. Autoklawować pożywkę przez 30 min, a następnie schłodzić do RT.
  2. Wybrać pojedynczą kolonię transformowanych bakterii i dodać do 10 mL sterylnej pożywki LB uzupełnionej o 25 µg/L chloramphenicolu i 50 µg/L ampicyliny. Inkubować przez 20 h w temperaturze 37 °C przy 200 rpm w inkubatorze wytrząsowym z kontrolą temperatury o orbicie 19 mm.
  3. Dodać 10 mL kultury nocnej do 1 L pożywki TB uzupełnionej o 25 µg/L chloramphenicolu i 50 µg/L ampicyliny (stosunek kultury startowej do kultury ekspresyjnej 1:100). Inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 rpm w inkubatorze wytrząsowym z kontrolą temperatury o orbicie 19 mm, aż OD600 kultury osiągnie wartość od 0,5 do 0,6.
  4. Dodać do kultury 50 µM IPTG w celu indukcji ekspresji, schłodzić do 16 °C i inkubować przez 20 h w temperaturze 16 °C przy 200 rpm.
  5. Zbiór komórek z kultury ekspresyjnej poprzez wirowanie przez 20 min przy ≥3,000 x g i 4 °C. Przechowywać osad w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h.
    UWAGA: Na tym etapie eksperyment można przerwać i wznowić później (najlepiej w tym samym tygodniu). Osad można przechowywać długoterminowo w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie białka przy użyciu kolumny powinowactwa z przepływem grawitacyjnym

UWAGA: Żywica oraz bufory wiążące, piorące, elucyjne i do przechowywania, odpowiednie dla każdej oczyszczania, zależą od oczyszczanego białka rekombinowanego. Próbki z osadu komórkowego, supernatantu, frakcji przepływowej, frakcji piorących i frakcji elucyjnych należy zbierać w buforze do SDS-PAGE. W celu oceny skuteczności oczyszczania należy przeprowadzić SDS-PAGE oraz barwienie Coomassie dla pobranych próbek. Proces oczyszczania należy prowadzić w temperaturze 4 °C, a frakcje przechowywać na lodzie. Odcinanie znaczników białkowych można przeprowadzić na kolumnie lub poza nią, wykorzystując odpowiednią proteazę skierowaną na właściwe miejsce cięcia specyficzne dla danej proteazy.

  1. Zamocuj pustą kolumnę grawitacyjną w statywie i wypełnij ją żywicą agarozową z glutationem. Do oczyszczania osadu komórkowego zebranego z 1 L kultury ekspresyjnej należy użyć 2-3 mL żywicy.
  2. Przemyj kolumnę jedną objętością złoża żywicy 20% etanolem. Przemyj kolumnę 3 razy jedną objętością złoża buforem MS500 (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP). Zatrzymaj przepływ w kolumnie tak, aby żywica pozostała pokryta buforem, co zapobiegnie jej wyschnięciu podczas przygotowywania osadu komórkowego.
  3. Rozmroź osad komórkowy w temperaturze 4 °C. Do rozmrożonego osadu dodaj 30 mL buforu MS500 (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 60 mg lizozymu oraz jedną tabletkę inhibitora proteaz). Lizuj przez 30 min w temperaturze 4 °C, stosując delikatne obracanie end-over-end.
  4. Sonicuj lizowane komórki w probówce wirówkowej 50 mL lub metalowym zlewce w lodzie, aż lizat będzie swobodnie wypływać z końcówki pipety. Wirować przez 30 min w temperaturze 4 °C przy ≥20,000 x g w celu sklarowania nadsączu.
    UWAGA: Ustawienia sonikatora należy dobrać empirycznie. Skonfiguruj sonikator tak, aby całkowity czas 120 s był wystarczający do przekształcenia lepkiego lizatu w swobodnie płynną i przezroczystą ciecz.
  5. Zlej nadsącz do zlewki i nałóż sklarowany lizat na kolumnę. Pozostaw lizat do przepływu przez kolumnę grawitacyjnie, zbierając frakcję niezatrzymaną. Ponownie nałóż zebraną frakcję niezatrzymaną na kolumnę i przepuść ją przez złoże.
  6. Przemyj kolumnę co najmniej pięciokrotnie, używając za każdym razem dwóch objętości złoża żywicy buforu piorącego MS500 (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP). Zbieraj frakcje z płukania w objętościach 5 mL. Dodaj 1 µL każdej frakcji do 100 µL odczynnika Bradforda, aby wizualnie sprawdzić obecność białka. Płucz do momentu, aż w ostatniej frakcji nie będzie już obecne niezatrzymane białko, dodając w razie potrzeby kolejne etapy płukania.
  7. Odzyskaj białko, przepuszczając przez kolumnę bufor elucyjny MS500 (bufor MS500 uzupełniony o 10 mM glutationu i 10 mM NaOH), zbierając frakcje elucyjne po 5 mL. Sprawdź obecność białka, dodając 1 µL eluatu do 100 µL odczynnika Bradforda. Zaprzestań zbierania frakcji, gdy odczynnik Bradforda nie będzie już wskazywał obecności białek.
  8. Przeprowadź wymianę buforu poprzez wytrącanie i wirowanie. Wytrąć białko, dodając do eluatu dwie objętości 4 M siarczanu amonu, delikatnie odwracając naczynie do momentu zmętnienia, a następnie wirując przez 30 min w temperaturze 4 °C przy ≥20,000 x g, a następnie ponownie przez 5 min. Usuwaj nadsącz po każdym wirowaniu, uważając, aby nie naruszyć osadu białkowego.
  9. Ponownie rozpuść i przechowuj białko w buforze MS500 uzupełnionym o 25% glicerolu. Przechowuj osady białkowe lub białko w buforze do przechowywania w temperaturze -80 °C.

4. Analiza rozszczepiania łańcuchów ubikwityny in vitro

UWAGA: Długość łańcucha ubikwityny oraz typy wiązań należy dobrać na podstawie swoistości DUB opisanej w poprzednich raportach31 lub określić empirycznie. W razie potrzeby protokół ten można wykorzystać do przetestowania aktywności badanego DUB typu dzikiego na panelu komercyjnie dostępnych łańcuchów ubikwityny o określonej długości i typie wiązania. Jako wartości początkowe dla analizy można przyjąć ilość łańcucha di-ubikwityny wynoszącą 375-750 ng oraz stężenie DUB na poziomie 1-2 µM27.

  1. Przygotować 10x bufor aktywacyjny DUB (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl oraz 100 mM TCEP).
  2. Dla każdego punktu czasowego dla każdego DUB przygotować łącznie 10 µL roztworu 2 µM oczyszczonego białka GST-USP27X w 1x buforze aktywacyjnym DUB (mieszanina DUB). Przygotować mieszaniny główne (master mixes), a następnie rozdzielić je na poszczególne punkty czasowe.
  3. Inkubować mieszaninę DUB przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Do próbki dla czasu 0 dodać 7 µL buforu do ładowania SDS-PAGE przed dodaniem łańcuchów ubikwityny, aby zapobiec rozpoczęciu reakcji deubikwitylacji.
  5. Do każdego punktu czasowego dla każdego DUB dodać 375 ng łańcuchów di-ubikwityny K-63 rozpuszczonych w 10 µL 1x buforu aktywacyjnego DUB. Objętość całkowita wynosi 20 µL na reakcję.
  6. Inkubować probówki w temperaturze 30 °C, zatrzymując reakcję w każdym punkcie czasowym poprzez dodanie 7 µL buforu do ładowania SDS-PAGE.
  7. Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE z użyciem żelu gradientowego 4%-12%, a następnie wykonać immunoblotting7,32 w kierunku ubikwityny i USP27X, aby przeanalizować zmiany w obecności mono-ubikwityny w wybranych punktach czasowych.

Schemat procesu oczyszczania białka: transformacja, ekspresja, liza, powinowactwo, analiza SDS-PAGE.
Rycina 1: Schemat projektu badania. (A) Transformacja kompetentnych komórek E. coli plazmidem do ekspresji białka rekombinowanego. (B) Nocna ekspresja bakteryjna rekombinowanego białka deubikwitylazy. (C) Oczyszczanie białka rekombinowanej deubikwitylazy przy użyciu kolumny powinowactwa z przepływem grawitacyjnym. (D) Test cięcia łańcucha ubikwityny in vitro w celu oceny aktywności deubikwitylazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Aby określić wpływ wariantów związanych z XLID105 na aktywność katalityczną USP27X, z bakterii oczyszczono białka USP27X typu dzikiego oraz warianty związane z XLID105: F313V, Y381H i S404N, wszystkie znakowane GST. Warianty te znajdują się w domenie katalitycznej USP białka USP27X (Rysunek 2A). Ponieważ wcześniej zgłoszono, że USP27X rozszczepia łańcuchy ubikwityny K6331, białka USP27X typu dzikiego oraz warianty związane z XLID105: F313V, Y381H i S404N inkubowano z łańcuchami di-ubikwityny powiązanymi K63 przez 1 h. Próbki te rozdzielono metodą SDS-PAGE32, a białka ubikwityny i USP27X analizowano metodą immunoblottingu. USP27X typu dzikiego indukuje rozszczepienie di-ubikwityny, generując mono-ubikwitynę (Rysunek 2B oraz Rysunek uzupełniający 1). Białka wariantowe USP27X F313V, Y381H i S404N związane z XLID105 nie rozszczepiły tych łańcuchów. Ponieważ warianty F313V, Y381H i S404N zaburzają aktywność katalityczną USP27X, dysfunkcja USP27X wydaje się być głównym mechanizmem leżącym u podstaw XLID1057. Dodatkowe pomiary ilościowe i eksperymenty uzupełniające zostały opisane wcześniej7.

Schemat mutacji domeny proteazy ubikwityny (USP27X) i analiza immunoblot dla di-Ub.
Rycina 2: Wpływ wariantów XLID105 na aktywność deubikwitynującą USP27X. (A) Schemat struktury białka USP27X człowieka, przedstawiający numery reszt oraz lokalizację ocenianych wariantów XLID105 w domenie USP (kolor fioletowy). (B) Oznakowane GST białko USP27X typu dzikiego oraz warianty XLID105 (F313V, Y381H i S404N) inkubowano z łańcuchami di-ubikwityny K63 przez wskazany czas. Analizę immunoblot przeprowadzono z użyciem przeciwciał anty-GST (USP27X) oraz przeciwciał przeciwko ubikwitynie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Nieprzycięte obrazy blotów do Ryciny 2B. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokół ekspresji i oczyszczania rekombinowanych USP27X DUB oraz test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro w celu porównania aktywności deubikwitylojącej białek USP27X typu dzikiego i wariantów NDD. Test ten wykazał, że warianty związane z XLID105 zakłócają aktywność katalityczną USP27X7. Ten mechanistyczny wgląd pomógł nam zdefiniować XLID105 jako zaburzenie zaburzeń funkcjonalnych USP27X.

Protokół ten można dostosować do innych DUB, które są związane z chorobami genetycznymi o słabo poznanych mechanizmach molekularnych. Optymalizacja protokołu ekspresji i oczyszczania dla konkretnego DUB będącego przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie. Jeśli dla danego DUB będącego przedmiotem zainteresowania nie opisano żadnych konkretnych protokołów, opisana tutaj metoda może służyć jako punkt wyjścia. Podczas optymalizacji protokołu ekspresji i oczyszczania białek krytyczne kroki obejmują wybór odpowiednich parametrów dla (1) systemu ekspresji (np. szczepy bakterii, komórki owadów lub komórki ssaków), (2) wektorów ekspresji, (3) żywicy znacznikowej i powinowactwa, które mają być użyte, (4) warunków wzrostu, (5) ilości kultury oraz (6) potrzeby dalszego oczyszczania (np. poprzez wykluczenie wielkości lub chromatografię jonowymienną). Omówiono szczegółowe zalecenia dotyczące tych i innych aspektów metody33.

Test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro jest prostym sposobem pomiaru aktywności deubikwitytylacyjnej DUB typu dzikiego lub zmutowanego. Zależna od czasu analiza rozszczepienia ubikwityny może dostarczyć informacji na temat wpływu zmienności genetycznej na kinetykę enzymatyczną DUB, umożliwiając określenie parametrów takich jak K, m i V,max. Umożliwiłoby to rozróżnienie defektów w miejscu aktywnym DUB, które upośledzają katalizę (zmniejszone Vmax) i tych, które upośledzają rozpoznawanie substratu (zwiększone Km). Wszechstronność tego testu wynika z różnorodności łańcuchów ubikwityny, które można wykorzystać do dostarczenia odrębnych informacji mechanistycznych na interesującym DUB. Łańcuchy ubikwityny o różnych długościach i topologiach wiązań są dostępne na rynku, dzięki czemu test ten jest dostępny dla osób niebędących ekspertami. Specyficzne DUB mają unikalne właściwości kinetyki enzymatycznej, rozpoznawania sprzężeń i rozszczepienia. Kluczowe etapy tego testu obejmują (1) zdefiniowanie stężenia roboczego DUB, (2) określenie optymalnego czasu reakcji, (3) wybór typu i długości ogniwa łańcucha ubikwityny oraz (4) wybór metody wykrywania.

Testy rozszczepienia łańcucha ubikwityny mierzą wpływ wariantów NDD na aktywność DUB 7,11, pomagając zidentyfikować warianty, które zakłócają aktywność DUB i napędzają nietypowy rozwój. Test ten może być stosowany w wielu sytuacjach, w których zmienność genetyczna napędza patologię, w tym rak i neurodegeneracja. Jako test niezależny od substratu, nie jest wymagana wcześniejsza identyfikacja specyficznego ubikwitylowanego substratu białkowego. Jednak test ogranicza się do pomiaru zmian w aktywności rozszczepienia łańcucha ubikwityny i nie może ocenić wpływu wariantów na funkcje DUB, takie jak interakcje białko-białko, lokalizacja subkomórkowa i modyfikacje potranslacyjne. Identyfikacja szerokich ścieżek sygnałowych, w których działa DUB będący przedmiotem zainteresowania, jest niezbędna do opracowania specyficznych testów określających, w jaki sposób te warianty napędzają dyskretne NDD.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez fundusze startowe Sanford Research dla FB oraz grant NIH R01CA233700 dla MJS. Grafikę wykonał Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com). Dziękujemy dr Gregowi Findlayowi (University of Dundee) za plazmid GST-USP27X.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amersham Protran 0,45 NC 200 mm i razy 200 mm 25/PKCytiva10600041
Siarczan amonuFisher ScientificAC205872500
AmpicylinaFisher ScientificBP1760 25
Anty-ubikwityna (mysi monoklonalny)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Owca poliklonalna)Odczynniki i usługi MRC-PPUCat# S902A Trzecie krwawienie(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Kolby hodowlane z przegrodami 2 lFisher Scientific10-042-5N
Odczynnik BradfordMillipore SigmaB6916-500ML
ChloramfenikolGold BiotechnologyC-105-25
Complete, tabletki inhibitora proteazyMillipore Sigma
Kolumna Econo-Column 1,5 i razy 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1,5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Glycerol GeneseeScientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12-dołkowy żelThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Donkey anty-kozi IgG Przeciwciało wtórneLI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Osioł Przeciwciało wtórne przeciw myszym IgGLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Cyfrowa sucha kąpielIsotemp Fisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB AgarGenesee Scientific11-119
LysozymeGold BiotechnologyL-040-100
MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalnalaboratoryjna Thermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Bufor do bieganiaBoston Bioproducts IncBP-177
Mini rotator rurkowyFisher Scientific88-861-051
Bufor do próbek NuPage LDS 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Odyseja  Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 human USP27XMRC-PPU Reagents and ServicesDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404NAddgene225717Koch i w 2024 r. (PMID: 38182161)
pGEX6P1 ludzki USP27X Y381HAddgene225716Koch i w 2024 r. (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)Gold BiotechnologyP-470-10
Polisorbat 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Competent CellsMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
Chlorek soduGenesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Wirówka Sorvall RC 6 PlusThermo Fisher Scientific46910
TCEP (chlorowodorek tris-(karboksetylo)fosfiny)Złoto BiotechnologiaTCEP10
Wspaniały bulion w proszkuGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
Moduł XCell SureLock Mini-Cell i XCell II Blot Thermo Fisher ScientificEI0002
5056489001 LB Rosół Genesee Scientific 11-118

Bibliografia

  1. Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).
  3. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).
  4. Pickart, C. M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).
  7. Koch, I., et al. USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms. Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).
  8. Hao, Y. -H., et al. USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder. Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).
  9. Fountain, M. D., et al. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies. Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).
  10. Santiago-Sim, T., et al. Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features. Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).
  11. Beck, D. B., et al. Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation. Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).
  12. Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. Assay systems for profiling deubiquitinating activity. Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).
  13. Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).
  14. Rose, I. A., Warms, J. V. B. An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes. Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).
  15. Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).
  16. Pickart, C. M., Rose, I. A. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).
  17. Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation. J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).
  18. Woo, S. K., et al. Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle. J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).
  19. Woo, S. K., et al. Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle. J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).
  20. Baek, S. H., et al. Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle. J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).
  21. Wilkinson, K. D., et al. Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T. Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).
  22. Hu, M., et al. Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).
  23. Hu, M., et al. Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14. EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).
  24. Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases. Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).
  25. Faesen, A. C., et al. The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types. Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).
  26. Mevissen, T. E. T., et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis. Cell. 154 (1), 169-184 (2013).
  27. Kwasna, D., et al. Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability. Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).
  28. Hu, H., et al. X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes. Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).
  29. Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples (2020).
  30. Smith, D. B., Johnson, K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 67 (1), 31-40 (1988).
  31. Ritorto, M. S., et al. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 5, 4763(2014).
  32. Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).
  33. Wingfield, P. T. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zaburzenia neurorozwojowepomiar aktywno ci enzymatycznejmutacja USP27Xbadanie in vitrooczyszczanie bia ekSDS PAGEubikwityna z wi zaniem K63analiza wariant w genowych
Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.