Artykuł metodologiczny

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

DOI:

10.3791/67367

⸱

27 września 2024

 ,  , 
1Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) są związane z upośledzeniem funkcji układu nerwowego, ale często pozostają słabo poznane na poziomie molekularnym. Odrębne zaburzenia wywołane przez pojedyncze geny dostarczają modeli do badania mechanizmów napędzających nietypowy rozwój neurologiczny. Warianty genów kodujących białka z rodziny enzymów deubikwitylujących (DUB) są związane z kilkoma NDD, ale istnieje potrzeba określenia patogennych mechanizmów zaburzeń napędzanych przez te warianty genów. Wpływ wariantów genów na aktywność DUB można określić eksperymentalnie za pomocą niezależnego od substratu testu rozszczepienia ubikwityny in vitro. Test ten nie wymaga znajomości dalszych substratów do bezpośredniego pomiaru aktywności katalitycznej. W tym przypadku protokół określania wpływu wariantów genów na aktywność enzymatyczną jest modelowany przy użyciu DUB Ubiquitin Specific Protease 27, sprzężonej z chromosomem X (USP27X), która jest zmutowana w niepełnosprawności intelektualnej sprzężonej z chromosomem X 105 (XLID105). Ten eksperymentalny proces może zostać wykorzystany do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń neurorozwojowych napędzanych przez warianty genów DUB.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) wynikają z różnych etiologii z uwarunkowaniami środowiskowymi lub genetycznymi, które napędzają nietypowy rozwój układu nerwowego1. Sekwencjonowanie genetyczne nowej generacji powiązało rosnącą liczbę wariantów genów związanych z układem ubikwityny z genetycznymi NDDs2. System ubikwityny katalizuje ligację małego modyfikatora białka ubikwityny do reszt lizyny w substratach białkowych, aby napędzać zmiany w zachowaniu komórek, w tym lokalizację, stabilność, interakcje białko-białko lub aktywność3. Ubikwitylacja jest pośredniczona przez enzymy aktywujące E1, sprzężone E2 i ligazy E34 i jest odwracalna przez aktywność enzymów deubikwitytylacyjnych (DUB), które katalizują rozszczepianie i usuwanie ubikwityny z substratów białkowych5. Ubikwityna może być ligowana do substratu jako monomer (monoubikwitylacja) lub łańcuchy polimerowe (poliubikwitylacja), które powstają na dowolnej z siedmiu reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) lub reszcie M1 ubikwityny. Te różne topologie łańcuchów ubikwityny i ich kombinacje tworzą kod komórkowy, który jest kluczowy dla transdukcji sygnału6.

DUBs, takie jak USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B i OTUD5 zostały powiązane z NDDs2,7,8,9,10,11. W przypadku większości NDD mechanizmy molekularne, które napędzają patogenezę, pozostają eksperymentalnie niezdefiniowane. Niektóre z DUB powodujących ostatnio opisane zaburzenia są słabo poznane i brakuje im znanych odczytów komórkowych, które można wykorzystać do oceny wpływu zmienności genetycznej na funkcję białek. In vitro, testy rozszczepienia łańcucha ubikwityny przezwyciężają to ograniczenie, ponieważ niezależne od substratu odczyty aktywności DUB, które mogą mierzyć wpływ wariantów genów na aktywność enzymatyczną12.

Testy in vitro na rozszczepienie ubikwityny są stosowane od lat 80. Testy te z użyciem substratów znakowanych radioaktywnie pozwoliły na odkrycie pierwszych DUB, w tym izopeptydazy, zidentyfikowanej ze względu na jej zdolność do deubikwitylacji histonu H2A13, oraz hydrolazy karboksylowej ubikwityny (UCH), identyfikowanej przez jej zdolność do hydrolizy ubikwityny z różnych koniugatów chemicznych14,15,16. Ponadto do identyfikacji izopeptydazy T i kilku UCH oraz proteaz specyficznych dla ubikwityny ubikwityny (UBP) z erytrocytów i mięśni szkieletowych wykorzystano znakowane radioizopomagnetycznie białka lub peptydy o pełnej długości17,18,19,20. Łańcuchy ubikwityny o określonej długości i typie wiązań (tetra-ubikwityna sprzężona z K48) zostały po raz pierwszy użyte do pomiaru aktywności DUB izopeptydazy T21. Od tego czasu test ten stał się złotym standardem pomiaru aktywności DUB w analizach mutacyjnych22,23. Udoskonalenie tego testu pozwala obecnie na wizualizację rozszczepienia ubikwityny za pomocą elektroforezy i konwencjonalnych barwników żelowych, takich jak niebieski Coomassie, pomarańczowy SYPRO, rubinowy i srebrny barwnik lub detekcja fluorescencyjna lub immunologiczna12,24. Molekularne aspekty aktywności DUB, takie jak minimalna długość łańcucha i swoistość wiązania25,26,27,28, można wyjaśnić za pomocą łańcuchów ubikwityny o różnych długościach (np. di-, tri-, tetra-ubikwityna) i wiązaniach (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, liniowe) w testach funkcjonalnych. Warianty związane z NDD mogą napędzać defekty aktywności DUB, które są specyficzne dla typu ogniwa łańcucha ubikwityny11.

Test rozszczepienia di-ubikwityny przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych białek DUB może bezpośrednio mierzyć wpływ wariantów NDD na aktywność DUB. USP27X, który jest zmutowany w zaburzeniu niepełnosprawności intelektualnej sprzężonym z NDD X 105 (XLID105)7,28 modeluje przedstawiony tutaj proces. Podejście to pozwala na określenie, w jaki sposób aktywność DUB jest zakłócana przez warianty genów w istniejących i nieznanych NDD związanych z DUB.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół może być dostosowany do rekombinowanych białek przy użyciu różnych znaczników powinowactwa wyrażanych w różnych szczepach kompetentnych komórek. W zależności od wyrażanego białka, warunki hodowli i ekspresji przez noc mogą wymagać optymalizacji OD600 przy indukcji ekspresji, czasie ekspresji, temperaturze ekspresji i stężeniu IPTG. Przegląd protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Transformacja kompetentnych komórek Rosetta 2 E. coli z rekombinowanym plazmidem ekspresyjnym GST-USP27X

UWAGA: Aby utrzymać sterylność kultury bakteryjnej, wykonaj kroki, w których pojemniki na media są otwarte pod płomieniem palnika Bunsena. Aby umożliwić optymalny transfer tlenu, należy przeprowadzić wytrząsanie kultur bakteryjnych w wytrząsarce stołowej o kontrolowanej temperaturze o orbicie od 19 mm do 50 mm i prędkości 200 obr./min29.

  1. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić 20 μl chemicznie kompetentnych komórek Rosetta 2 E. coli na lodzie. Dodać 1-10 ng plazmidu ekspresyjnego pGEX6P1-USP27X (kodującego N-końcową S-transferazę glutationu (GST)30 -znakowany USP27X i zawierający oporność na ampicylinę) i inkubować 5 minut na lodzie.
  2. Szok termiczny przez 30 s w temperaturze 42 °C w suchej kąpieli. Inkubować na lodzie przez 2 minuty.
  3. Dodać 80 μl pożywki SOC o temperaturze pokojowej (RT). Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C z obrotem o prędkości 200 obr./min w wytrząsarce stołowej o średnicy 19 mm z kontrolowaną temperaturą.
  4. Umieścić 50 μl kultury na płytce agarowej LB uzupełnionej 25 μg/l chloramfenikolu i 50 μg/l ampicyliny. Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C pokrywą do dołu w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze.

2. Nocna bakteryjna ekspresja rekombinowanego białka z ekspresji plazmidu

UWAGI: Aby utrzymać sterylność kultury bakteryjnej, wykonaj kroki, w których pojemniki na media są otwarte pod płomieniem palnika Bunsena. Aby umożliwić optymalny transfer tlenu, należy przeprowadzić wytrząsanie kultur bakteryjnych w wytrząsarce stołowej o kontrolowanej temperaturze o orbicie od 19 mm do 50 mm i prędkości 200 obr./min29. Zmierz kulturę OD600 za pomocą spektrofotometru.

  1. Przygotuj 1 l pożywki Terrific Bulth (TB), dodając 47,6 g TB proszku do 1 l ultraczystej wody z 0,4% glicerolem w 2-litrowej kolbie hodowlanej. Podłoże w autoklawie przez 30 minut i schłodzić do temperatury RT.
  2. Wybierz pojedynczą kolonię przekształconych bakterii i dodaj do 10 ml sterylnej pożywki LB uzupełnionej 25 μg/l chloramfenikolu i 50 μg/l ampicyliny. Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C z obrotem 200 obr./min w wytrząsarce stołowej o średnicy 19 mm z kontrolowaną temperaturą.
  3. Dodać 10 ml hodowli na noc do 1 l pożywki gruźliczej uzupełnionej 25 μg/l chloramfenikolu i 50 μg/l ampicyliny (stosunek 1:100 kultury wyjściowej do kultury ekspresyjnej). Inkubować w temperaturze 37 °C z obrotem 200 obr./min w wytrząsarce stołowej o średnicy 19 mm z kontrolowaną temperaturą, aż poziom OD600 kultury znajdzie się w przedziale 0,5-0,6.
  4. Dodać 50 μM IPTG do kultury w celu wywołania ekspresji, schłodzić do 16 °C i inkubować przez 20 godzin w temperaturze 16 °C z obrotem 200 obr./min.
  5. Komórki osadu z hodowli ekspresyjnej przez odwirowanie przez 20 minut w temperaturze ≥3 000 x g i w temperaturze 4 °C. Przechowywać osad w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać i wznowić później (najlepiej w tym samym tygodniu). Pellet może być przechowywany przez długi czas w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie białek za pomocą kolumny powinowactwa grawitacyjnego

UWAGA: żywicy, wiązania, mycia, elucji i przechowywania odpowiednie dla każdego oczyszczania będą zależeć od oczyszczanego białka rekombinowanego. Pobrać próbki z osadu komórkowego, supernatantu, frakcji przepływowych, frakcji płuczących i frakcji elucyjnych w buforze SDS-PAGE. Wykonaj barwienie SDS-PAGE i Coomassie dla próbek, aby ocenić powodzenie oczyszczania. Przeprowadzić oczyszczanie w temperaturze 4 °C i obchodzić się z frakcjami na lodzie. Rozszczepienie znaczników białkowych można przeprowadzić na kolumnie lub poza nią przy użyciu odpowiedniej proteazy, aby celować w odpowiednie miejsce rozszczepienia specyficzne dla proteazy.

  1. Zabezpiecz pustą kolumnę przepływu grawitacyjnego w stojaku na retortę i napełnij ją żywicą agarozową glutationową. Użyj 2-3 ml żywicy do oczyszczenia osadu komórkowego zebranego z 1 litra hodowli ekspresyjnej.
  2. Przemyć kolumnę jedną objętością złoża żywicy zawierającą 20% etanolu. Przemyć kolumnę 3 razy jedną objętością buforu MS500 w złożu żywicy (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP). Zatrzymaj kolumnę, aby żywica pozostała pokryta buforem, aby zapobiec wysuszeniu podczas przygotowywania osadu komórkowego.
  3. Rozmrozić osad komórkowy w temperaturze 4 °C. Do rozmrożonego osadu dodać 30 ml buforu MS500 (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 60 mg lizozymu i jedną tabletkę inhibitora proteazy). Liza przez 30 minut w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami od końca do końca.
  4. Sonikować lizowane komórki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml lub w metalowej zlewce na lodzie, aż lizat będzie swobodnie przepływał po dozowaniu z końcówki pipety. Wirować przez 30 minut w temperaturze 4 °C i ≥20 000 x g, aby usunąć supernatant.
    UWAGA: Określ ustawienia sonikatora empirycznie. Ustaw sonikator tak, aby całkowity czas 120 s wystarczył, aby zredukować lepki lizat do sypkiej i przezroczystej cieczy.
  5. Zdekantować supernatant do zlewki i załadować oczyszczony lizat do kolumny. Przepuść lizat przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego, jednocześnie zbierając przepływ. Załaduj kolumnę z zebranym przepływem i uruchom ją przez kolumnę.
  6. Przemyć kolumnę co najmniej dwiema objętościami buforu do płukania MS500 w złożu żywicy (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP) 5 razy. Zebrać przepływ płukania we frakcjach o pojemności 5 ml. Dodaj 1 μl każdej frakcji do 100 μl odczynnika Bradford, aby wizualnie sprawdzić obecność białka. Pierz do momentu, aż niezwiązane białko nie będzie już obecne w ostatnim praniu, w razie potrzeby dodając dodatkowe etapy prania.
  7. Odzyskaj białko, przepuszczając bufor elucyjny MS500 (bufor MS500 uzupełniony 10 mM glutationu i 10 mM NaOH) przez kolumnę, zbierając 5 ml frakcji elucyjnych. Sprawdzić obecność białka, dodając 1 μl eluatu do 100 μl odczynnika Bradforda. Przestań zbierać frakcje, gdy odczynnik Bradforda nie wskazuje już na obecność białek.
  8. Przeprowadzić wymianę buforu przez wytrącanie i wirowanie. Wytrącić białko przez dodanie 2 objętości 4 M siarczanu amonu do eluatu, delikatnie odwracając aż do zmętnienia, a następnie wirując przez 30 minut w temperaturze 4 °C i ≥20 000 x g i ponownie przez kolejne 5 minut. Usunąć supernatant po każdym wirowaniu, nie naruszając osadu białkowego.
  9. Ponownie rozpuść i przechowuj białko w MS500 uzupełnionym 25% glicerolem. Przechowywać granulki białka lub białko w buforze do przechowywania w temperaturze -80 °C.

4. Test in vitro rozszczepienia łańcucha ubikwityny

UWAGA: Wybierz długość łańcucha ubikwityny i typy połączeń na podstawie specyficzności DUB opisanej w poprzednich raportach31 lub określonej empirycznie. W razie potrzeby protokół ten może być wykorzystany do przetestowania aktywności interesującego nas DUB typu dzikiego na panelu dostępnych na rynku łańcuchów ubikwityny o określonej długości i typie wiązania. Ilość łańcucha di-ubikwityny wynosząca 375-750 ng i stężenie DUB 1-2 μM mogą być wykorzystane jako punkty wyjścia dla testu27.

  1. Przygotuj 10x bufor aktywacyjny DUB (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl i 100 mM TCEP).
  2. Dla każdego punktu czasowego dla każdego DUB przygotuj łącznie 10 μl 2 μM oczyszczonego GST-USP27X w 1x buforze aktywacyjnym DUB (DUB mix). Przygotuj miksy wzorcowe i podziel je na punkty czasowe.
  3. Inkubuj mieszankę DUB przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodaj 7 μl bufora ładującego SDS-PAGE do czasu 0 przed dodaniem łańcuchów ubikwityny, aby zapobiec rozpoczęciu reakcji deubikwitylacji.
  5. Do każdego punktu czasowego dla każdego DUB dodaj 375 ng łańcuchów di-ubikwityny K-63 rozcieńczonych w 10 μl 1x bufor aktywacyjny DUB. Całkowita objętość wynosi 20 μL na reakcję.
  6. Inkubować probówki w temperaturze 30 °C, zatrzymując każdy punkt czasowy za pomocą 7 μl buforu ładującego SDS-PAGE.
  7. Wykonaj SDS-PAGE z żelem o gradinie 4%-12% i immunoblot7,32 dla ubikwityny i USP27X, aby przeanalizować zmianę obecności mono-ubikwityny w wybranych punktach czasowych.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat projektu badania. (A) Transformacja kompetentnych komórek E. coli z plazmidem o ekspresji białka rekombinowanego. (B) Nocna bakteryjna ekspresja rekombinowanego białka deubikwitylazy. (C) Oczyszczanie białek z rekombinowanej deubikwitylazy przy użyciu kolumny powinowactwa grawitacyjno-przepływowego. (D) Test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro w celu oceny aktywności deubikwitylojącej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić wpływ wariantów związanych z XLID105 na aktywność katalityczną USP27X, oczyszczono z bakterii białka USP27X typu dzikiego oznaczone GST, a związane z XLID105 warianty F313V, Y381H i S404N USP27X. Warianty te znajdują się w domenie katalitycznej USP USP27X (Rysunek 2A). Ponieważ wcześniej donoszono, że USP27X rozszczepia łańcuchy ubikwityny K6331, USP27X typu dzikiego i związany z XLID105 wariant F313V, Y381H i S404N USP27X inkubowano z łańcuchami di-ubikwityny połączonymi z K63 przez 1 godzinę. Próbki te oddzielono za pomocą SDS-PAGE32, a ubikwitynę i białka USP27X analizowano za pomocą immunoblottingu. Dziki typ USP27X indukuje rozszczepienie di-ubikwityny, generując mono-ubikwitynę (Rysunek 2B i Rysunek uzupełniający 1). Związane z XLID105 białka wariantu F313V, Y381H i S404N USP27X nie rozszczepiały tych łańcuchów. Ponieważ warianty F313V, Y381H i S404N zakłócają aktywność katalityczną USP27X, zakłócenie funkcjonalne USP27X wydaje się być głównym mechanizmem leżącym u podstaw XLID1057. Wcześniej zgłoszono dodatkowe eksperymenty ilościowe i uzupełniające7.

figure-results-1
Rysunek 2: Wpływ wariantów XLID105 na aktywność deubikwitylacyjną USP27X. (A) Diagram struktury ludzkiego białka USP27X, pokazujący liczbę reszt i lokalizację ocenianych wariantów XLID105 w domenie USP (fioletowy). (B) Znakowane GST warianty USP27X i XLID105 typu dzikiego (F313V, Y381H i S404N) inkubowano z łańcuchami di-ubikwityny K63 przez wskazane czasy. Analizę immunoblot przeprowadzono przy użyciu przeciwciał anty-GST (USP27X) i ubikwityny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Nieprzycięte plamy Rysunek 2B. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono protokół ekspresji i oczyszczania rekombinowanych USP27X DUB oraz test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro w celu porównania aktywności deubikwitylojącej białek USP27X typu dzikiego i wariantów NDD. Test ten wykazał, że warianty związane z XLID105 zakłócają aktywność katalityczną USP27X7. Ten mechanistyczny wgląd pomógł nam zdefiniować XLID105 jako zaburzenie zaburzeń funkcjonalnych USP27X.

Protokół ten można dostosować do innych DUB, które są związane z chorobami genetycznymi o słabo poznanych mechanizmach molekularnych. Optymalizacja protokołu ekspresji i oczyszczania dla konkretnego DUB będącego przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie. Jeśli dla danego DUB będącego przedmiotem zainteresowania nie opisano żadnych konkretnych protokołów, opisana tutaj metoda może służyć jako punkt wyjścia. Podczas optymalizacji protokołu ekspresji i oczyszczania białek krytyczne kroki obejmują wybór odpowiednich parametrów dla (1) systemu ekspresji (np. szczepy bakterii, komórki owadów lub komórki ssaków), (2) wektorów ekspresji, (3) żywicy znacznikowej i powinowactwa, które mają być użyte, (4) warunków wzrostu, (5) ilości kultury oraz (6) potrzeby dalszego oczyszczania (np. poprzez wykluczenie wielkości lub chromatografię jonowymienną). Omówiono szczegółowe zalecenia dotyczące tych i innych aspektów metody33.

Test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro jest prostym sposobem pomiaru aktywności deubikwitytylacyjnej DUB typu dzikiego lub zmutowanego. Zależna od czasu analiza rozszczepienia ubikwityny może dostarczyć informacji na temat wpływu zmienności genetycznej na kinetykę enzymatyczną DUB, umożliwiając określenie parametrów takich jak K, m i V,max. Umożliwiłoby to rozróżnienie defektów w miejscu aktywnym DUB, które upośledzają katalizę (zmniejszone Vmax) i tych, które upośledzają rozpoznawanie substratu (zwiększone Km). Wszechstronność tego testu wynika z różnorodności łańcuchów ubikwityny, które można wykorzystać do dostarczenia odrębnych informacji mechanistycznych na interesującym DUB. Łańcuchy ubikwityny o różnych długościach i topologiach wiązań są dostępne na rynku, dzięki czemu test ten jest dostępny dla osób niebędących ekspertami. Specyficzne DUB mają unikalne właściwości kinetyki enzymatycznej, rozpoznawania sprzężeń i rozszczepienia. Kluczowe etapy tego testu obejmują (1) zdefiniowanie stężenia roboczego DUB, (2) określenie optymalnego czasu reakcji, (3) wybór typu i długości ogniwa łańcucha ubikwityny oraz (4) wybór metody wykrywania.

Testy rozszczepienia łańcucha ubikwityny mierzą wpływ wariantów NDD na aktywność DUB 7,11, pomagając zidentyfikować warianty, które zakłócają aktywność DUB i napędzają nietypowy rozwój. Test ten może być stosowany w wielu sytuacjach, w których zmienność genetyczna napędza patologię, w tym rak i neurodegeneracja. Jako test niezależny od substratu, nie jest wymagana wcześniejsza identyfikacja specyficznego ubikwitylowanego substratu białkowego. Jednak test ogranicza się do pomiaru zmian w aktywności rozszczepienia łańcucha ubikwityny i nie może ocenić wpływu wariantów na funkcje DUB, takie jak interakcje białko-białko, lokalizacja subkomórkowa i modyfikacje potranslacyjne. Identyfikacja szerokich ścieżek sygnałowych, w których działa DUB będący przedmiotem zainteresowania, jest niezbędna do opracowania specyficznych testów określających, w jaki sposób te warianty napędzają dyskretne NDD.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez fundusze startowe Sanford Research dla FB oraz grant NIH R01CA233700 dla MJS. Grafikę wykonał Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com). Dziękujemy dr Gregowi Findlayowi (University of Dundee) za plazmid GST-USP27X.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amersham Protran 0,45 NC 200 mm i razy 200 mm 25/PKCytiva10600041
Siarczan amonuFisher ScientificAC205872500
AmpicylinaFisher ScientificBP1760 25
Anty-ubikwityna (mysi monoklonalny)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Owca poliklonalna)Odczynniki i usługi MRC-PPUCat# S902A Trzecie krwawienie(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Kolby hodowlane z przegrodami 2 lFisher Scientific10-042-5N
Odczynnik BradfordMillipore SigmaB6916-500ML
ChloramfenikolGold BiotechnologyC-105-25
Complete, tabletki inhibitora proteazyMillipore Sigma
Kolumna Econo-Column 1,5 i razy 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1,5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Glycerol GeneseeScientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12-dołkowy żelThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Donkey anty-kozi IgG Przeciwciało wtórneLI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Osioł Przeciwciało wtórne przeciw myszym IgGLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Cyfrowa sucha kąpielIsotemp Fisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB AgarGenesee Scientific11-119
LysozymeGold BiotechnologyL-040-100
MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalnalaboratoryjna Thermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Bufor do bieganiaBoston Bioproducts IncBP-177
Mini rotator rurkowyFisher Scientific88-861-051
Bufor do próbek NuPage LDS 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Odyseja  Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 human USP27XMRC-PPU Reagents and ServicesDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404NAddgene225717Koch i w 2024 r. (PMID: 38182161)
pGEX6P1 ludzki USP27X Y381HAddgene225716Koch i w 2024 r. (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)Gold BiotechnologyP-470-10
Polisorbat 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Competent CellsMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
Chlorek soduGenesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Wirówka Sorvall RC 6 PlusThermo Fisher Scientific46910
TCEP (chlorowodorek tris-(karboksetylo)fosfiny)Złoto BiotechnologiaTCEP10
Wspaniały bulion w proszkuGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
Moduł XCell SureLock Mini-Cell i XCell II Blot Thermo Fisher ScientificEI0002
5056489001 LB Rosół Genesee Scientific 11-118

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).">Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).">Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).
  3. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).">Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).
  4. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).">Pickart, C. M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).
  5. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).">Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).">Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).
  7. USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms. Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).">Koch, I., et al. USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms. Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).
  8. USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder. Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).">Hao, Y. -H., et al. USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder. Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).
  9. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies. Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).">Fountain, M. D., et al. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies. Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).
  10. Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features. Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).">Santiago-Sim, T., et al. Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features. Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).
  11. Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation. Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).">Beck, D. B., et al. Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation. Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).
  12. Assay systems for profiling deubiquitinating activity. Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).">Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. Assay systems for profiling deubiquitinating activity. Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).
  13. Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).">Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).
  14. An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes. Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).">Rose, I. A., Warms, J. V. B. An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes. Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).
  15. Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).">Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).
  16. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).">Pickart, C. M., Rose, I. A. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).
  17. A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation. J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).">Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation. J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).
  18. Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle. J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).">Woo, S. K., et al. Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle. J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).
  19. Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle. J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).">Woo, S. K., et al. Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle. J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).
  20. Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle. J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).">Baek, S. H., et al. Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle. J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).
  21. Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T. Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).">Wilkinson, K. D., et al. Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T. Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).
  22. Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).">Hu, M., et al. Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).
  23. Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14. EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).">Hu, M., et al. Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14. EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).
  24. Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases. Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).">Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases. Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).
  25. The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types. Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).">Faesen, A. C., et al. The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types. Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).
  26. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis. Cell. 154 (1), 169-184 (2013).">Mevissen, T. E. T., et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis. Cell. 154 (1), 169-184 (2013).
  27. Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability. Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).">Kwasna, D., et al. Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability. Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).
  28. X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes. Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).">Hu, H., et al. X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes. Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).
  29. https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples (2020).">Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples (2020).
  30. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 67 (1), 31-40 (1988).">Smith, D. B., Johnson, K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 67 (1), 31-40 (1988).
  31. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 5, 4763(2014).">Ritorto, M. S., et al. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 5, 4763(2014).
  32. Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).
  33. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).">Wingfield, P. T. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zaburzenia neurorozwojowepomiar aktywno ci enzymatycznejmutacja USP27Xbadanie in vitrooczyszczanie bia ekSDS PAGEubikwityna z wi zaniem K63analiza wariant w genowych

Powiązane artykuły