Artykuł metodologiczny

Przedkliniczna pozytonowa tomografia emisyjna z pleśniami zwierzęcymi zgodnymi z ciałem do automatycznej analizy obrazu u myszy w chmurze

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67370

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Safety R&D, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc., 2Comparative Medicine, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę wykonywania obrazowania PET in vivo na myszach za pomocą Body Conforming Animal Molds (BCAMs) w skanerze G8 PET/CT. Podano szczegóły techniczne dotyczące przygotowania myszy, w tym prawidłowej implantacji guza, optymalnego pozycjonowania, akwizycji obrazu PET/CT wspomaganej BCAM i analizy danych.

Streszczenie

Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) to metoda obrazowania molekularnego, która może być wykorzystana do zbadania wielu zagadnień farmakologicznych, takich jak modulacja biomarkerów, zajętość receptorów i biodystrybucja interesujących związków. W badaniach biodystrybucji uczestnicy eksperymentu są często obrazowani podłużnie po otrzymaniu badanego przedmiotu. Obrazy są następnie analizowane w celu określenia profilu rozmieszczenia związku w różnych narządach w różnych punktach czasowych. Stanowi to kluczowy krok w rozwoju leku, aby zrozumieć dystrybucję i potencjalnie wiążący profil badanego związku. Standardowe/ręczne metody analiz biodystrybucji opartych na obrazowaniu PET są jednak pracochłonne i czasochłonne oraz często wiążą się z dużą zmiennością między operatorami. Co więcej, trudno jest utrzymać spójne pozycje zwierząt w różnych punktach czasowych. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, zastosowano serię mysich form zwierzęcych konformujących ciało (BCAM), aby umożliwić sztywne i spójne ułożenie zwierząt podczas akwizycji obrazowania PET/CT. Ponadto wykorzystano platformę SaaS (Software-as-a-Service), składającą się z opartej na chmurze mapy prawdopodobieństwa narządów (OPM) oraz narzędzia do segmentacji opartego na sztucznej inteligencji, aby umożliwić wiarygodną i zautomatyzowaną ocenę ilościową danych obrazowania PET in vivo. Przedstawiony tutaj przepływ pracy obejmuje (1) przygotowanie myszy do obrazowania za pomocą BCAM, w tym prawidłowe wszczepienie guzów podskórnych, aby były kompatybilne z formami, (2) pozyskiwanie obrazów PET/CT za pomocą BCAM za pomocą skanera G8 oraz 3) wykonywanie automatycznej segmentacji narządów i analizy biodystrybucji przy użyciu SaaS opartego na chmurze. [18plików]FDG został tutaj wykorzystany jako przykładowy znacznik, ale inne biomarkery i/lub związki znakowane radioaktywnie można łatwo dostosować do przepływu pracy. Procedura ta może być wykonana dokładnie i skutecznie przy minimalnym przeszkoleniu, a zautomatyzowana analiza danych PET przyniosła zadowalające wyniki zgodne z metodą ręczną.

Wprowadzenie

Technologie obrazowania molekularnego in vivo są ważnymi narzędziami w rozwoju leków, ułatwiającymi ocenę wszystkich trzech filarów farmakologii - biodystrybucji, zaangażowania celów i modulacji farmakodynamiki1,2,3. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET), ze względu na swoją kliniczną translację i wysoką czułość, jest jedną z najczęściej stosowanych metod obrazowania molekularnego zarówno w klinice, jak i w przedklinicznej przestrzeni badawczo-rozwojowej. Rozwijająca się dziedzina przedklinicznego obrazowania PET i radioterapii jest cenna dla rozwoju zarówno terapii wewnątrznowotworowych, terapii celowanych, jak i nowatorskich terapii immunoonkologicznych (IO). Ciągłe pojawianie się i opracowywanie nowych radioznaczników Immuno-PET może potencjalnie wpływać na specyficzne, dostosowane do potrzeb schematy leczenia IO i identyfikować osoby reagujące na leczenie w porównaniu z tymi, którzy nie reagują4,5,6. Tymczasem specyficzne dla metabolizmu radioznaczniki, takie jak [18F]FDG i [18F]FLT, mogą monitorować odpowiedź guza na terapię i mogą odpowiednio rzucić światło na to, czy guz aktywnie się proliferuje lub zużywa glukozę7, czy też komórki nowotworowe przechodzą zatrzymanie cyklu komórkowego poprzez hamowanie8,9.

Nieinwazyjne obrazowanie in vivo ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi, nieobrazowymi eksperymentami farmakologicznymi. Na przykład obrazowanie umożliwia systemową, holistyczną ocenę dystrybucji leku i/lub efektu farmakologicznego u całego pacjenta, co umożliwia nie tylko monitorowanie skuteczności w miejscu docelowym, ale także wykrywanie nieoczekiwanych działań poza ośrodkiem. Ze względu na swój nieinwazyjny charakter, ten sam zestaw zwierząt może być oceniany podłużnie w różnych punktach czasowych i/lub za pomocą różnych biomarkerów, aby odpowiedzieć na różne pytania biologiczne10. Nie tylko znacznie zmniejsza to liczbę zwierząt potrzebnych do badania, ale także zapewnia ortogonalną kontrolę we wszystkich punktach czasowych, a tym samym pomaga poprawić korelacje i zmniejszyć indywidualne zmienność. Pomimo tak obiecującego rozwoju biomarkerów obrazowych, potrzeba oceny badanych związków in vivo za pomocą badań biodystrybucji opartych na obrazowaniu PET spotyka się jednak z brakiem wydajnych zautomatyzowanych procesów analizy. Badania biodystrybucji PET dostarczają cennych informacji na temat kinetyki związku, akumulacji tkankowej, wiązania i metabolizmu. Uzyskanie wysoce powtarzalnych danych ilościowych ma kluczowe znaczenie dla rozwoju terapii farmaceutycznych.

Aby zaspokoić te niezaspokojone potrzeby w automatycznej analizie obrazów PET, InVivo Analytics zaprojektowało zestaw mysich form zwierzęcych konformujących ciało (BCAMs)11. Są to wydrukowane w 3D plastikowe formy, które utrzymują głowę, tułów (i narządy wewnętrzne), ogon i kończyny myszy w sztywnych, wstępnie zdefiniowanych pozycjach. Formy o różnych rozmiarach można wybrać w zależności od masy ciała zwierzęcia, a wycięcia można utworzyć w określonych obszarach, takich jak ramię lub dolna strona, aby umożliwić wysunięcie guzów podskórnych. Obrazy PET/CT uzyskane za pomocą tych BCAM są wysoce jednorodne i mogą być analizowane partiami przez opartą na chmurze platformę automatycznej segmentacji firmy11. W tym artykule przedstawiono zautomatyzowany przepływ pracy analizy biodystrybucji in vivo, który opiera się na fizycznym pozyskiwaniu obrazów za pomocą BCAM oraz przeprowadzaniu segmentacji i analizy obrazów za pomocą SaaS.

Protokół

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach były zgodne z przepisami i ustalonymi wytycznymi, zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt firmy Pfizer lub w procesie oceny etycznej. Badanie obrazowania PET przeprowadzono zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa radiacyjnego. W badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni o masie ciała w zakresie 18-26 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie i ustawianie zwierząt

UWAGA: Ten krok polega na ocenie stopnia zaawansowania zwierząt do obrazowania PET za pomocą implantacji guza pod kontrolą BCAM.

  1. Przed implantacją komórek należy ogolić sierść myszy w pożądanym obszarze wzrostu guza.
  2. Ustaw stację anestezjologiczną i przymocuj formę BCAM o odpowiednim rozmiarze do klipsa wstępnego z górną częścią odchyloną o 90 stopni. Będzie to służyć jako podstawa implantacji guza (Rysunek 1A).
  3. Znieczulanie zwierząt w odpowiednim pudełku indukcyjnym z 2,0% izofluranem i 98% tlenem przy natężeniu przepływu 0,5-1,5 l/min.
    UWAGA: Wszystkie systemy anestezjologiczne są zmienne.
    1. Użyj skalibrowanego systemu i przetestuj przed użyciem. Umieść znieczuloną mysz na podstawie i wyciągnij jej kończyny (Rysunek 1B).
  4. Delikatnie umieść formę szablonu do wstrzykiwania guza BCAM ( Rysunek 1C) na grzbietowej stronie myszy ( Rysunek 1D).
  5. Ostrożnie utwórz tymczasowy okrągły znak odniesienia w żądanym miejscu wycięcia (np. pobocze lub bok, po lewej lub prawej stronie) za pomocą markera ( Rysunek 1D). Usuń formę szablonu.
  6. Przygotować komórki do wstrzyknięcia, pobierając żądaną objętość do strzykawki. Podłączyć igłę 27 G do strzykawki i wypełnić martwą przestrzeń. Zalecana jest objętość 0,1-0,2 ml na szczepienie.
  7. Podnieś skórę palcami lub kleszczami, używając tymczasowych śladów z kroku 1.5 jako odniesienia, aby stworzyć namiot, powoli włóż igłę i wstrzyknij komórki podskórnie w żądane miejsce. Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre przedmioty stanowiącego zagrożenie biologiczne.
  8. Monitoruj wzrost guza. Średnia objętość guza w momencie rejestracji w tym przykładzie wynosiła 200-300 mm3,
    UWAGA: Unikaj używania metalowych elementów, takich jak kolczyki lub mikroczipy, aby zapobiec artefaktom obrazowania CT.

2. Pobieranie dawek radioaktywnych

  1. Postępując zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa radiologicznego, ostrożnie sporządzić docelową dawkę [18F]FDG w zakresie około 70-80 μCi do sterylnej strzykawki nadającej się do wstrzyknięcia dożylnego.
    UWAGA: Zakres 70-80 μCi jest optymalny, aby dopasować się do zakresu dynamicznego skanera PET Sofie G8. Inne imagery mogą mieć różne zakresy dynamiki, które wymagają innej dawki docelowej.
  2. Ostrożnie odmierzyć dawkę promieniotwórczą w kalibratorze dawki, umieszczając strzykawkę w komorze studzienki i opuszczając czerpak. Zwróć uwagę na wybór odpowiedniego izotopu lub numeru kalibracyjnego przed pomiarem.
  3. Dokonaj stabilnego odczytu. Zapisz datę i godzinę. W razie potrzeby należy dostosować dawkę.
  4. (Opcjonalnie) Użyj sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby doprowadzić ostateczną objętość dawki do 0,1-0,2 ml.
    UWAGA: Żądana objętość wstrzyknięcia może się różnić.
  5. Dawka jest gotowa do podania.

3. Podanie dożylne

  1. Postępując zgodnie z instytucjonalnymi protokołami IACUC i bezpieczeństwa radiacyjnego, przygotuj ogon myszy do wstrzyknięcia dożylnego, rozszerzając żyłę ogonową. W tym badaniu żyłę ogonową rozszerzono poprzez umieszczenie klatki dla zwierząt lub komory indukcyjnej na podgrzewaczu do zjeżdżalni ustawionym na 42 °C.
    UWAGA: Pełne rozszerzenie żyły ogonowej może zająć do 10 minut rozgrzania.
  2. Przed wstrzyknięciem należy zanotować masę ciała myszy. Pozwoli to określić, który BCAM dla określonej masy ciała należy użyć do obrazowania PET/CT.
  3. Gdy będzie gotowa, przenieś mysz do odpowiedniego ogranicznika (np. w niniejszym badaniu użyto platformy do wstrzykiwania żyły ogonowej) i zlokalizuj żyłę ogonową.
  4. Ostrożnie obchodzić się z radioaktywną strzykawką i wstrzykiwać dawkę dożylnie przytomnej myszy. Zapisać czas wstrzyknięcia.
  5. Ostrożnie odłożyć strzykawkę na bok i usunąć nadmiar krwi z ogona gazą. Wyjmij mysz z ogranicznika i umieść ją z powrotem w odpowiedniej obudowie.
  6. Ostrożnie umieścić strzykawkę z powrotem w komorze kalibratora dawki i zanotować wszelkie pozostałe odczyty w celu prawidłowego obliczenia dawki. Zapisz datę i godzinę odczytu aktywności resztkowej.
  7. Po zakończeniu wstrzykiwań należy zachować ostrożność i umieścić kohorty myszy za ołowianymi obudowami i/lub z dala od personelu, postępując zgodnie z bezpiecznymi dla instytucji praktykami promieniowania. Należy pamiętać, że wszystkie użyte materiały są narażone na niewielkie skażenie radioaktywne. Monitoruj wszystkie obszary za pomocą skalibrowanego licznika Geigera i czyść zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego.

4. Znieczulanie i ustawianie zwierząt do obrazowania PET

  1. W odpowiednim czasie (np. 10-15 minut przed końcem okresu pobierania znacznika) włącz wszystkie urządzenia anestezjologiczne i przyrządy do ogrzewania zwierząt wymagane zarówno do indukcji znieczulenia, jak i obrazowania PET. Znieczulenie można ustawić na 2,0%-2,5% izofluranu w 98% tlenu (ustawienia mogą się różnić w zależności od szczepu myszy i modelu choroby).
  2. Upewnij się, że wszystkie adaptery i zawory są włączone, a natężenie przepływu gazu wynosi 0,5-1,0 l/min. Konkretne natężenia przepływu mogą się różnić w zależności od systemu anestezjologicznego i systemu obrazowania.
  3. Umieść odpowiednie zwierzę (zwierzęta) w pudełku indukcyjnym i poczekaj, aż badany osiągnie odpowiednią głębokość znieczulenia.
  4. Nałóż maść nawilżającą do oczu na każde oko.
  5. Przenieś mysz do BCAM o odpowiednim rozmiarze w zależności od masy ciała.
  6. Delikatnie podnieś mysz za kark, włóż ogon do szczeliny ogonowej i zawiń go pod BCAM. Umieść ogon na platformie ogonowej i taśmie, aby zabezpieczyć pozycję. Sprawdź, czy kręgosłup jest prosty. Delikatnie zamknij BCAM (Rysunek 2A,B).
  7. Ostrożnie ustaw wszystkie cztery kończyny tak, aby spoczęły na każdej z platform łap BCAM. W razie potrzeby użyj taśmy, aby przymocować łapy do każdej platformy (Rysunek 2B).
  8. Delikatnie zatrzaśnij BCAM w czółenku stołu obrazowania, wkładając najpierw przedni koniec (Rysunek 2C). Wahadłowiec powinien być już podłączony do doku załadunkowego G8 z przepływającym środkiem znieczulającym (Rysunek 2D). Naciśnij tylną część BCAM, a kliknięcie wskaże, że jest on przymocowany do wahadłowca G8.
    UWAGA: Utrzymuj dopływ środka znieczulającego tak, aby zwierzę pozostało w pożądanej płaszczyźnie znieczulenia podczas obrazowania.

5. Akwizycja obrazu

  1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji G8 PET. Foldery badań, parametry skanowania i identyfikatory obiektów można utworzyć z wyprzedzeniem.
    1. Wprowadź szczegóły badania do oprogramowania: wagę myszy, datę/godzinę i ilość pobranej dawki początkowej, datę/godzinę wstrzyknięcia oraz datę/godzinę i ilość odczytu aktywności resztkowej.
  2. Włóż czółenko z myszą do otworu skanera. Niebieska lampka wskaźnika będzie wskazywać prawidłowe dokowanie do systemu.
  3. Wybierz odpowiednie parametry PET/CT. Pobieranie danych obrazowania.
    UWAGA: W tym badaniu przeprowadzono 7-minutowy statyczny skan PET 18F, a następnie domyślny skan CT 70 sekund, a algorytm rekonstrukcji 3D maksymalizacji oczekiwań i maksymalizacji maksymalnego prawdopodobieństwa (domyślna i jedyna opcja w skanerze G8) został zastosowany w celu zrekonstruowania danych12.
  4. Po zakończeniu nabycia, wahadłowiec powróci do swojej początkowej pozycji. Wyjmij czółenko za pomocą myszy i włóż je do stacji dokującej. Naciśnij tylną część pionowej klapki BCAM, aby wyjąć ją z czółenka G8, a następnie delikatnie pociągnij i wyjmij BCAM za pomocą myszy.
  5. Naciśnij dwa zaczepy mocujące, aby podnieść i otworzyć górną część BCAM.
  6. Delikatnie wyjmij mysz. Upewnij się, że mysz w pełni wyzdrowiała po znieczuleniu i jest jasna, czujna i reaguje (BAR) przed powrotem do klatki domowej.
  7. Kontynuuj procedurę w ustalonych odstępach czasu, aby przeskanować całą kohortę/grupę myszy.

6. Przesyłanie obrazów do SaaS

  1. Zaloguj się do app.invivo.ax i utwórz projekt.
  2. Kliknij czerwoną kartę przesyłania w prawym górnym rogu okna. Wybierz system obrazowania i reporter używany w badaniu obrazowym (tj. [18F]FDG). Wybierz folder z danymi obrazowania.
  3. Przejdź do karty adnotacji w folderze projektu. Kliknij Adnotację, aby dodać odpowiednie informacje o skanowaniu (imię i nazwisko pacjenta, płeć, rozmiar BCAM, waga pacjenta, nazwa kohorty, punkt czasowy i wartość wstrzykniętej dawki). Większość metadanych zostanie wypełniona automatycznie.

7. Automatyczna analiza danych

  1. W folderze projektu powinny zostać wypełnione wszystkie skanowania. Kliknij skany, aby przejść z poziomu projektu, grupy i poszczególnych tematów. Wybierz pozycję Analizuj w prawym górnym rogu.
  2. W prawym górnym rogu okna wstążki analizy w obszarze Projekt wybierz symbol plusa i wybierz pozycję Zwrot z inwestycji mapy prawdopodobieństwa narządu. Mapa prawdopodobieństwa narządów (OPM) to statystyczny atlas narządów myszy obejmujący wiele wstępnie zdefiniowanych narządów i tkanek. Wybierz poszczególne narządy zainteresowania w oparciu o potrzeby badawcze.
    UWAGA: W tym przykładzie ręczna segmentacja i analiza zostały wykonane za pomocą VivoQuant, przy użyciu narzędzia splajn, a następnie interpolacja w operatorze ROI 3D. Wyniki automatycznej analizy porównano z wynikami ręcznej segmentacji jako punkt odniesienia.

Wyniki

Po przesłaniu dane PET można przeglądać na stronie SaaS w formie panelu obrazów w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej i poprzecznej z nałożonymi wybranymi obszarami zainteresowania (ROI) organów określonymi przez OPM (Rysunek 3A). Oprogramowanie pozwala nie tylko na ładowanie pojedynczych obrazów, ale umożliwia również jednoczesny podgląd wielu myszy z jednej grupy lub z całego badania w formie jednego, zbiorczego obrazu. W oknie analizy dostępne są opcje dostosowywania kolorów ROI, intensywności paska skali oraz innych powszechnych parametrów. Po wybraniu optymalnych parametrów analitycznych SaaS generuje do pobrania wykres słupkowy biodystrybucji dla wybranych organów (Rysunek 3B).

Aby ocenić wydajność platformy SaaS opartej na OPM, wyniki analizy automatycznej porównano z wynikami uzyskanymi przez doświadczonego analityka obrazowego, które przyjęto jako złoty standard. Przeprowadzono liniową regresję dopasowania dla wartości wychwytu [18F]FDG w mózgu, sercu, prawej nerce i śledzionie. Należy zauważyć, że platforma oferuje użytkownikom kompleksową listę organów do wyboru, w tym szkielet, mózg, pęcherz moczowy, serce, nerki (prawą i lewą), wątrobę, śledzionę, płuca oraz mięśnie czworogłowe (prawe i lewe). Cztery wyżej wymienione organy wybrano w niniejszym badaniu wyłącznie w celach ilustracyjnych. Ponadto, ze względu na zmijną wielkość, kształt oraz głębokość/lokalizację zaimplantowanych guzów, guz nie jest uwzględniony jako organ w OPM, a tym samym został wykluczony z tej analizy porównawczej. Jak pokazano na Rysunku 4, analiza automatyczna i analiza ręczna dały ogólnie spójne wyniki, przy czym mózg wykazał najwyższą korelację (r2 = 0,8466). Jest to oczekiwane ze względu na dużą wielkość organu i wysoce stałą pozycję mózgu wewnątrz czaszki. Prawa nerka i serce wykazały również zadowalające wartości r2, wynoszące odpowiednio 0,6874 i 0,4849. W przeciwieństwie do nich, analiza korelacji dla śledziony dała wartość r2 równą 0,3922, co jest najniższym wynikiem wśród badanych organów. Nie jest to zaskakujące, ponieważ śledziona jest otoczona przez trzustkę i tkankę tłuszczową, które nie posiadają zdefiniowanej morfologii i wykazują taką samą gęstość tkanek miękkich w TK. Śledziona jest zatem trudna do ręcznej segmentacji, a OPM może stanowić bardziej precyzyjny sposób wyznaczenia granic tego organu (tzn. przewyższając złoty standard). Nachylenie i punkt przecięcia z osią Y dla tych analiz korelacji przedstawiono również na Rysunku 4. Zgodnie z wartościami r2, mózg miał nachylenie najbliższe 1 (tzn. idealną korelację między wynikami OPM a wynikami ręcznymi) i najmniejszy punkt przecięcia z osią Y (tzn. minimalne obciążenie systematyczne), podczas gdy w przypadku pozostałych organów odnotowano większe i zmienne odchylenia od idealnej korelacji.

Eksperyment z bieżnią dla myszy; aparat z regulowaną blokadą do badań behawioralnych.
Rysunek 1: BCAM i implantacja guza z wykorzystaniem szablonu. (A) Klips wstępny (1) jest przymocowany do dolnej części formy BCAM (2) z podłączoną linią do znieczulenia (3). Służy ona jako podstawa do implantacji guza. (B) Myszy z ogoloną docelową stroną implantacji (w tym przypadku prawym barkiem) umieszcza się na podstawie pod znieczuleniem przed wstrzyknięciem komórek. (C) Szablon do implantacji guza (4) z predefiniowanymi wycięciami w celu naprowadzenia miejsca inokulacji komórek nowotworowych. (D) Wykonanie tymczasowego znaku referencyjnego przed wstrzyknięciem komórek, przy umieszczonej na grzbiecie myszy formie szablonu. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Układ unieruchomienia zwierząt do analizy obrazowej; obejmuje urządzenia ograniczające ruchy i metody pozycjonowania.
Rycina 2: Pozycjonowanie myszy w BCAM. (A) Widok z góry – Umieść mysz ciasno w odpowiednio dobranym rozmiarze BCAM (5). (B) Widok z boku – Taśma jest używana do przymocowania tylnych łap do platform (6). Ogon jest przymocowany taśmą do platformy dla ogona (7) znajdującej się bezpośrednio pod myszą. (C) Mysz w BCAM jest wkładana do uchwytu obrazującego (8). (D) Mysz, BCAM i uchwyt są podłączone do stacji dokującej z działającą anestezyją (9). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza obrazów PET/CT z wykresem słupkowym danych o aktywności organów; wykresy pokazujące wskaźniki dla mózgu, serca i płuc.
Rycina 3: Odpowiednio reprezentatywne obrazy oraz wynik analizy danych, wyświetlane i analizowane za pomocą narzędzia SaaS. (A) Reprezentatywne obrazy wyświetlane na stronie internetowej SaaS. Przekroje czołowy, strzałkowy i poprzeczny obrazu PET/CT z nałożonymi obszarami zainteresowania (ROI) organów wybranych z mapy prawdopodobieństwa organów (OPM). Kolor różowy: mózg; czerwony: serce; ciemnoniebieski: płuca; łososiowy: wątroba; pomarańczowy: nerka (prawa). Guz nie jest definiowany przez OPM. (B) Reprezentatywny, dostępny do pobrania wykres wygenerowany z automatycznej analizy. Listę wybranych organów można zobaczyć w panelu w lewym górnym rogu. Dane są tutaj raportowane w %ID/mL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres korelacji procentowego wychwytu przez organy; regresja liniowa; organy: mózg, serce, nerki, śledziona.
Rysunek 4: Analiza regresji liniowej porównująca wartości wychwytu [18F]FDG w organach uzyskane za pomocą analizy ręcznej oraz zautomatyzowanego procesu opartego na OPM. Wykorzystano skany PET/CT dziesięciu samic myszy C57BL/6. Wartości r2, linie ufności 95%, nachylenie i punkty przecięcia z osią Y są przedstawione na wykresie dla każdego wskazanego organu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejszy raport opisuje procedurę wykonywania obrazowania PET in vivo na myszach za pomocą form BCAM i analizy danych za pomocą zautomatyzowanego narzędzia SaaS. Znajdują się tam instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania myszy, pozyskiwania obrazowania i przetwarzania danych. Ten przepływ pracy automatyzacji przyniósł również dane, które były zgodne z ręczną analizą. Poniżej przedstawiono kilka kluczowych kwestii technicznych.

Chociaż guz nie jest jednym z narządów zdefiniowanych przez OPM, krytycznym krokiem w tym protokole jest właściwa implantacja guzów podskórnych, aby ostatecznie zapewnić optymalne wyrównanie wszystkich narządów myszy w jamie ciała i BCAM. OPM może generować dokładne dane tylko wtedy, gdy kręgosłup myszy jest stosunkowo prosty, a narządy wewnętrzne są ustawione neutralnie. Zbyt duże lub źle umieszczone guzy mogą wpływać na postawę myszy i wciskać się w jej jamę ciała, przesuwając w ten sposób narządy wewnętrzne. Ta zmiana z kolei zniekształci analizę ilościową wynikającą z algorytmu OPM. Inni donosili o wpływie nieprostego kręgosłupa na wyrównanie narządów wewnętrznych przy użyciu różnych modalności obrazowania i algorytmów segmentacji13,14. Dlatego tak ważne jest, aby używać szablonu do kierowania implantacją guza i ścisłego monitorowania wzrostu guza, aby upewnić się, że guzy są zarówno prawidłowo ustawione, jak i w idealnym zakresie wielkości.

Kolejnym obszarem możliwych odchyleń jest wybór BCAM o odpowiedniej wielkości. BCAM są tworzone w całkach 2 g, w zakresie 18-26 g. Ponieważ jednak myszy o różnym składzie ciała (np. więcej mięśni w porównaniu z większą ilością tłuszczu) mogą mieć tę samą masę ciała, ale różne rozmiary fizyczne, ważne jest, aby wybrać najbardziej pasujący BCAM, używając ich masy ciała jako ogólnego odniesienia. Wyrównaj w górę lub w dół metodą prób i błędów i pamiętaj, że prawidłowe wyrównanie ma kluczowe znaczenie. Wybór zbyt dużego BCAM spowoduje, że narządy wewnętrzne myszy "zapadną się" bliżej dna łóżka, co szczególnie wpłynie na dokładność analizy narządów grzbietowych, takich jak nerki i kręgosłup. W przeciwieństwie do tego, umieszczenie myszy w BCAM, która jest zbyt mała, może naciskać na ich jamy ciała, zniekształcić położenie narządów i potencjalnie powodować trudności w oddychaniu. Użycie taśmy, aby upewnić się, że kończyny są zabezpieczone na platformach łap, pomoże w ustawieniu i ustawieniu.

Chociaż ten raportowany przepływ pracy umożliwia ustandaryzowaną i zautomatyzowaną analizę obrazu PET, warto podkreślić, że obecny OPM jest skonstruowany w oparciu o immunokompetentny szczep myszy C57BL/6 i zdrowe myszy. Inne szczepy i warunki zdrowotne myszy mogą wykazywać różne cechy anatomiczne, które wymagają dodatkowego dostosowania, optymalizacji i walidacji algorytmu. Na przykład szczepy z niedoborem odporności, takie jak NSG lub NCG, mają mniejsze śledziony. Podobnie myszy z ortotopowymi implantami nowotworowymi mogą mieć różne rozmiary, kształty i lokalizacje narządów wewnętrznych w zależności od ich statusu chorobowego. Innym ograniczeniem tego przepływu pracy jest ogólna przepustowość w fazie pozyskiwania eksperymentu. Wynika to głównie z dodatkowego czasu potrzebnego do prawidłowego skonfigurowania myszy w BCAM. Szkolenie i praktyka mogą zwiększyć wydajność operatora w prawidłowym ustawieniu. Dodanie drugiej stacji dokującej może również zwiększyć ogólną przepustowość, przy czym jedna stacja dokująca może służyć do konfiguracji BCAM, a druga może służyć do wyjmowania myszy do klatki odzyskiwania. Niemniej jednak, nawet przy wydłużonym czasie wymaganym do konfiguracji BCAM przed skanowaniem, inwestycja w czas zwraca się, oszczędzając czas po stronie analizy danych. Na przykład w niniejszym badaniu OPM potrzebował mniej niż 10 minut, aby przeanalizować dziesięć obrazów (z 4 zwrotami akcji), podczas gdy bardzo doświadczony analityk potrzebował 3-4 godzin, aby ręcznie segmentować i analizować ten sam zestaw obrazów i ROI. Niedoświadczony analityk potrzebowałby jeszcze więcej czasu na ręczną analizę. Platforma SaaS pozwala na analizę skanów PET w dużych seriach, gdzie pełna analiza biodystrybucji in vivo może zostać zakończona w ciągu kilku minut po przesłaniu danych. Jest to niezwykle przydatna funkcja w przypadku obsługi dużych ilości danych z wielu grup i/lub w kilku punktach czasowych, jak omówiono poniżej.

Ręczna segmentacja narządów dla pojedynczego podmiotu może być czasochłonna i zwykle wymaga znacznego wcześniejszego przeszkolenia operatora. Nawet przy odpowiednim przeszkoleniu analizy ręczne nieuchronnie napotykają na zmienność między operatorami, która może zniekształcić wyniki ilościowe15,16. Z kolei zautomatyzowana segmentacja i analiza danych mogą dokładnie i skutecznie określić ogólną biodystrybucję radioznacznika i wyeliminować zmienność zakorzenioną w operacjach człowieka. Takie korzyści płynące z automatyzacji zaobserwowano zarówno w analizie obrazu klinicznego, jak i w przestrzeni przedklinicznej. Na przykład Sluis i in. wykazali, że pojedynczy skan wymagał 4 godzin na segmentację narządów będących przedmiotem zainteresowania, w porównaniu z 30 minutami przy użyciu metod opartych na chmurze opartych na sztucznej inteligencji17. Inne badanie przeprowadzone przez Nazari i wsp. wykazało również, że oparta na algorytmach analiza wątroby i nerek wykazała dokładne wyniki w granicach 7,0% w porównaniu z dwoma ludzkimi fizykami medycznymi. Dane przedstawione na rysunku 4 wyraźnie pokazały również niezawodność procesu analizy obrazowania PET opartego na modelu SaaS oraz to, że zautomatyzowana analiza przyniosła spójne wyniki w porównaniu z analizą ręczną.

Podsumowując, artykuł ten ilustruje przebieg pracy związany z wykorzystaniem form BCAM w celu ułatwienia standaryzacji przedklinicznego pozyskiwania obrazów PET/CT, a także automatycznej analizy danych PET z obsługą SaaS. Wykazano, że ta technologia platformy jest stosunkowo prosta do zastosowania, a jakość danych generowanych przez automatyzację jest zgodna z ręczną analizą, ale oferuje znaczne korzyści w zakresie oszczędności czasu. W związku z tym ten przepływ pracy może zaoszczędzić badaczom setki godzin czasu poświęconego na analizę danych oraz pomóc w standaryzacji i zmniejszeniu zmienności między operatorami. Procedura ta może pomóc w opracowaniu wielu związków leczniczych w różnych modalnościach i wskazaniach. W szczególności modalności wielkocząsteczkowe, takie jak przeciwciała terapeutyczne, bispecyficzne przeciwciała zagęszczające komórki odpornościowe, koniugaty przeciwciało-lek, a nawet nanocząstki, można łatwo znakować radiometalami (np. Zr-89, Cu-64), aby umożliwić ocenę biodystrybucji za pośrednictwem obrazowania PET19,20. Podobnie, ta technologia platformy może pomóc w określeniu dozymetrii nowych radioterapii u myszy21. Zastosowanie tej procedury będzie miało wielką wartość dodaną dla rozwoju leków.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są obecnymi lub byłymi pracownikami firmy Pfizer, Inc.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla personelu badawczego i technicznego Pfizer La Jolla Comparative Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[18F]FDGPETNet Solutions, Culver City, CANARadioznacznik używany do obrazowania PET
igła 27G Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA305136Używany do wstrzykiwania komórek 
app.invivo.ax/loginInvivo Analytics, Seattle, WANAinternetowa Software as a Service
Body Conforming Animal MoldsInvivo Analytics, Seattle, WANABCAM o zakresie wagowym 18 - 26 g
Kalibrator dawki; CRC-55twCapintec, Florham Park, NJCRC-55twPomiar dawek promieniotwórczych
Skaner G8 PET/CTSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANASkaner laboratoryjny z dokiem załadowczym
G8-Stacja dokującaSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANAStacja dokująca do etapowania
Szablon formy implantacyjnejInvivo Analytics, Seattle, WANASzablon do optymalnej implantacji guza
Lubrykantowa maść do oczuBAUSCH & LOMB, Ontario, KanadaŁagodzenienocnego lubrykantu do oczu dla myszy
Zmodyfikowany wahadłowiec G8Invivo Analytics, Seattle, WANAWahadłowiec do zakwaterowania BCAM
Znieczulenie myszy Skrzynka indukcyjnaPatterson Scientific, Waukesha, WI78933388Służy do znieczulania myszy
PRE-ClipInvivo Analytics, Seattle, WAAdapter BCAM do podłączenia
znieczuleniaPodgrzewacz do slajdówPremiere LabScientific, Danvers, MAXH-2001Podgrzewacz o regulowanej temperaturze używany do rozszerzania żył ogonowych i indukcji znieczulenia
Strzykawka (1 ml)Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA309659Służy do wstrzykiwania komórek 
Platforma iniekcyjna żyły ogonowej Braintree Scientific, Pembroke, MAIL-300Ogranicznik używany do podawania wstrzyknięć dożylnych. 
Oprogramowanie Vivoqaunt Invicro, Needham, MANAOprogramowanie używane do ręcznej segmentacji
Strona

Bibliografia

  1. Huang, R., Wang, M., Zhu, Y., S Conti, P., Chen, K. Development of pet probes for cancer imaging. Curr Top Med Chem. 15 (8), 795-819 (2015).
  2. Schwenck, J., et al. Advances in pet imaging of cancer. Nat Rev Cancer. 23 (7), 474-490 (2023).
  3. Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. Br J Clin Pharmacol. 73 (2), 175-186 (2012).
  4. Tavaré, R., et al. An effective immuno-pet imaging method to monitor CD8-dependent responses to immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  5. Maresca, K. P., et al. Preclinical evaluation of 89ZR-DF-IAB22M2C PET as an imaging biomarker for the development of the gucy2c-cd3 bispecific pf-07062119 as a t-cell engaging therapy. Mol Imaging Biol. 23 (6), 941-951 (2021).
  6. Nisnboym, M., et al. Immuno-pet imaging of cd69 visualizes t-cell activation and predicts survival following immunotherapy in murine glioblastoma. Cancer Res Commun. 3 (7), 1173-1188 (2023).
  7. Lee, C., et al. Efficacy and imaging-enabled pharmacodynamic profiling of Kras g12c inhibitors in xenograft and genetically engineered mouse models of cancer. Mol Cancer Ther. 22 (7), 891-900 (2023).
  8. Bollineni, V., Kramer, G., Jansma, E. P., Liu, Y., Oyen, W. J. A systematic review on [18f] flt-pet uptake as a measure of treatment response in cancer patients. Eur J Cancer. 55, 81-97 (2016).
  9. Everitt, S., et al. Imaging cellular proliferation during chemo-radiotherapy: A pilot study of serial 18f-flt positron emission tomography/computed tomography imaging for non-non-small-cell lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1098-1104 (2009).
  10. Rashidian, M., et al. Predicting the response to CTLA-4 blockade by longitudinal non-invasive monitoring of cd8 t cells. J Exp Med. 214 (8), 2243-2255 (2017).
  11. Klose, A. D., Paragas, N. Automated quantification of bioluminescence images. Nat Commun. 9 (1), 4262(2018).
  12. Gu, Z., et al. Performance Evaluation of G8, a high-sensitivity benchtop preclinical PET/CT Tomograph. J Nucl Med. 60 (1), 142-149 (2019).
  13. Bongratz, F., Rickmann, A. -M., Wachinger, C. Abdominal organ segmentation via deep diffeomorphic mesh deformations. Sci Rep. 13 (1), 18270(2023).
  14. Wang, H., Stout, D. B., Chatziioannou, A. F. Mouse atlas registration with non-tomographic imaging modalities-a pilot study based on simulation. Mol Imaging Biol. 14, 408-419 (2012).
  15. Montgomery, M. K., et al. Mouse lung automated segmentation tool for quantifying lung tumors after micro-computed tomography. PLoS One. 16 (6), e0252950(2021).
  16. Montgomery, M. K., et al. Applying deep learning to segmentation of murine lung tumors in preclinical micro-computed tomography. Transl. Oncol. 40, 101833(2024).
  17. Van Sluis, J., et al. Manual versus artificial intelligence-based segmentation as a pre-processing step in whole-body pet dosimetry calculations. Mol Imaging Biol. 25 (2), 435-441 (2023).
  18. Nazari, M., et al. Automated and robust organ segmentation for 3D-based internal dose calculation. EJNMMI Res. 11, 1-13 (2021).
  19. Goel, S., England, C. G., Chen, F., Cai, W. Positron emission tomography and nanotechnology: A dynamic duo for cancer theranostics. Adv Drug Deliv Rev. 113, 157-176 (2017).
  20. Campbell, D. O., et al. Preclinical evaluation of an anti-nectin-4 immunopet reagent in tumor-bearing mice and biodistribution studies in cynomolgus monkeys. Mol Imaging Biol. 18, 768-775 (2016).
  21. Bednarz, B., et al. Murine-specific internal dosimetry for preclinical investigations of imaging and therapeutic agents. Health Phys. 114 (4), 450-459 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przedkliniczne obrazowanie PETformy dopasowane do ciałasegmentacja w chmurzemapa prawdopodobieństwa organówanaliza biodystrybucjipodskórna implantacja guzafluor 18 FDGobrazowanie PET CT
Przedkliniczna pozytonowa tomografia emisyjna z pleśniami zwierzęcymi zgodnymi z ciałem do automatycznej analizy obrazu u myszy w chmurze
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.