Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67371

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

To badanie przedstawia protokół tworzenia wysoce powtarzalnego zwierzęcego modelu transformacji krwotocznej (HT) przy użyciu okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią.

Streszczenie

Transformacja krwotoczna (HT) jest poważnym powikłaniem, które może wystąpić w wyniku terapii trombolitycznej po udarze niedokrwiennym (IS) i stanowi znaczące ograniczenia w klinicznym zastosowaniu rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (rt-PA). Niestety, obecnie w praktyce klinicznej nie ma skutecznych interwencji w HT. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia stabilnych i wiarygodnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych, które wyjaśnią patogenezę HT i opracują skuteczne strategie interwencyjne. W badaniu tym przedstawiono protokół tworzenia mysiego modelu HT indukowanego przez ostrą hiperglikemię połączoną z przemijającym ogniskowym niedokrwieniem (tMCAO). Samcom myszy C57BL / 6J wstrzyknięto 30% glukozy w celu wywołania hiperglikemii, a następnie poddano 60-minutowemu tMCAO z reperfuzją. Objętość zawału, integralność bariery krew-mózg (BBB) i stopień krwotoku śródczaszkowego oceniano po 24 godzinach od MCAO. Wyniki wykazały, że wstrzyknięcie glukozy prowadziło do przejściowej hiperglikemii (14,3-20,3 mmol/L), która znacznie zwiększyła zarówno objętość zawału, jak i częstość występowania HT. Zabarwienie hematoksyliną-eozyną (H&E) wykazało znaczne zmiany krwotoczne w strefie zawału u myszy z hiperglikemią. Ponadto myszy z hiperglikemią wykazywały nasilone zakłócenie BBB, o czym świadczy poważniejszy wyciek błękitu Evansa (EB) i dekstranu FITC. Podsumowując, ostra hiperglikemia niezawodnie i konsekwentnie skutkowała makroskopowym HT w mysim modelu tMCAO. Ten powtarzalny model stanowi cenne narzędzie do badania patologicznych mechanizmów HT i opracowywania odpowiednich interwencji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Zawał mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i drugą najczęstszą przyczyną zgonów u dorosłych na całym świecie1. Ostra faza odgrywa kluczową rolę w postępie zawału mózgu, służąc jako kluczowy punkt czasowy w leczeniu choroby. Wczesne i terminowe przywrócenie przepływu krwi w obszarze półcienia jest niezbędne, aby zapobiec dalszej śmierci komórek mózgowych, przy czym tromboliza i terapia interwencyjna stanowią podstawę leczenia ostrego zawału mózgu (ACI). Jednak transformacja krwotoczna (HT) stanowi poważne powikłanie po trombolizie i terapii interwencyjnej, występujące u 15%-30% pacjentów z udarem niedokrwiennym, co w pewnym stopniu ogranicza ich stosowanie2,3. Występowanie HT istotnie zwiększa ryzyko śmiertelności i niepełnosprawności, wpływając na rokowanie w ACI. W związku z tym ogromne znaczenie kliniczne ma badanie patologicznych mechanizmów HT i identyfikacja skutecznych celów terapeutycznych.

Obecnie, niedrożność tętnicy środkowej mózgu wywołana zatorowością nitkową (MCAO) jest często wykorzystywana jako model HT u gryzoni4. Długotrwała niedrożność może spowodować masywny zawał mózgu obejmujący korę mózgową i prążkowie, potencjalnie prowadzący do wtórnego HT. Nici MCAO nie wymagają kraniotomii, są wysoce powtarzalne i powodują ogniskowe uszkodzenie mózgu i HT podobne do ludzkiego udaru. Jednak ten model mechaniczny ma pewne wyraźne wady, w tym wysokie wskaźniki wczesnej śmiertelności i niskie wskaźniki długoterminowego przeżycia5. Innym często stosowanym modelem HT jest model trombolizy, w którym tworzenie się skrzepów krwi jest indukowane najpierw w naczyniu docelowym, a następnie stosuje się leki trombolityczne (np. rt-PA, warfarynę) w celu rozpuszczenia skrzepu, naśladując proces kliniczny HT w udarze niedokrwiennym6,7. Pomimo odtworzenia w dużym stopniu patologicznego procesu klinicznej terapii trombolitycznej, modele zwierzęce HT indukowane przez rt-PA lub warfarynę są skomplikowane do wdrożenia i wiążą się z wysoką śmiertelnością zwierząt, a także zmienną częstością występowania i lokalizacją krwawienia. Aby posunąć naprzód podstawowe i kliniczne badania translacyjne nad HT po zawale mózgu, konieczne jest stworzenie powtarzalnego modelu zwierzęcego HT, który jest łatwy w obsłudze i oferuje wysoką stabilność.

Hiperglikemia jest znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do HT po niedokrwieniu mózgu/reperfuzji (I/R)8. W kilku badaniach retrospektywnych przeanalizowano dane kliniczne pacjentów poddawanych trombektomii mechanicznej, ujawniając, że podwyższony poziom glukozy we krwi po przyjęciu wiąże się z większą częstością występowania spontanicznego HT3. U pacjentów z udarem cukrzycowym hiperglikemia znacznie zwiększa ryzyko HT i prowadzi do poważniejszych deficytów neurologicznych9,10. Naukowcy opracowali modele HT poprzez indukcję mózgowego I/R w modelach zwierzęcych z cukrzycą za pomocą MCAO. Jednak model cukrzyca-MCAO ma długi czas trwania eksperymentu, złożoną procedurę i wysokie koszty11,12. Wiarygodny model HT można ustalić poprzez wywołanie ostrej hiperglikemii poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie glukozy i zintegrowanie jej z mózgowym modelem I/R wygenerowanym techniką szwów. Metoda ta jest łatwa do wykonania przy stałym ułożeniu krwawienia i skutecznie imituje kliniczne cechy hiperglikemii poudarowej. Istnieją jednak znaczne różnice w kluczowych stanach, takich jak czas niedokrwienia i stężenie glukozy; ponadto stabilność modelu i częstość występowania HT są niespójne w różnych literaturach.

Nasza grupa badawcza szeroko wykorzystała metodę ostrej hiperglikemii-MCAO do stworzenia modelu HT. Ponadto przeprowadziliśmy obszerną serię eksperymentów, aby zbadać związek między czasem niedokrwiennym, stężeniem glukozy we krwi, częstością występowania HT i śmiertelnością zwierząt. Eksperymenty te ostatecznie doprowadziły do zidentyfikowania optymalnych warunków do stworzenia modelu HT po zawale mózgu. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół ustalania ostrego modelu HT wywołanego hiperglikemią za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 30% glukozy w połączeniu z zatorowym MCAO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jianghan (JHDXLL2024-080) i przeprowadzony zgodnie z Wytycznymi Etycznymi dla Zwierząt Doświadczalnych wydanymi przez Centrum Kontroli Chorób w Chinach. W badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6J o masie ciała 21–26 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Grupowanie zwierząt i wywoływanie ostrej hiperglikemii

  1. Trzymaj myszy w centrum zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Jianghan w 12-godzinnym środowisku kontrolowanym cyklem światła/ciemności (20–22 °C, 50%–55% wilgotności) z jedzeniem i wodą ad libitum.
  2. Losowo podziel myszy na cztery grupy: Sham + sól fizjologiczna (n = 12), Sham + glukoza (n = 12), MCAO + sól fizjologiczna (n = 12) i MCAO + glukoza (n = 20).

2. Przygotowanie przedoperacyjne

UWAGA: Wszystkie eksperymentalne myszy pościły przez 12 godzin przed operacją.

  1. Analgezję ogólnoustrojową (meloksykam, 5 mg/kg mc. podskórnie) i znieczulenie miejscowe w miejsce nacięcia należy podawać w okresie okołooperacyjnym (bupiwakaina, 2 mg/kg mc. podskórnie).
  2. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, waciki i szwy chirurgiczne przez autoklawowanie w warunkach 121 °C i 15 psi przez 30 minut.
  3. Przetrzyj platformę chirurgiczną i otaczający ją obszar roboczy 75% etanolem i włącz przełącznik ogrzewania przy temperaturze ustawionej na 37 °C.
  4. Znieczulij mysz mieszaniną 3% izofluranu i 20% tlenu gazowego w komorze indukcyjnej znieczulenia. Następnie oceń odruch szczypania palca u nogi, aby przetestować głębokość znieczulenia.
  5. Przesuń mysz po platformie operacyjnej w pozycji leżącej i szybko włóż nos myszy do stożka nosowego. Otwórz przepływ gazu do stożka nosowego, zamykając przepływ do komory indukcyjnej znieczulenia. Dostosuj proporcję izofluranu do 2% i ustaw przepływ mieszaniny gazów na 0,4 ml/min w celu utrzymania znieczulenia.
  6. Nałóż żel pod oczy myszy, aby utrzymać wilgoć podczas zabiegu.
  7. Ogol włosy w okolicy szyi za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyść i zdezynfekuj skórę, naprzemiennie nakładając jod i 70% etanol za pomocą dezynfekującego bawełnianego patyczka.
  8. Przykryj jałową gazę na szyi i wytnij otwór, aby odsłonić obszar operacyjny.

3. Podstawowy pomiar przepływu krwi w mózgu

  1. Ogol włosy w okolicy skóry głowy za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyść i zdezynfekuj skórę głowy, naprzemiennie nakładając jod i 70% etanol za pomocą dezynfekującego bawełnianego patyczka.
  2. Wykonaj nacięcie linii środkowej o długości 1,0 cm w skórze nad obszarem czołowym, aby odsłonić ciemiączko czaszki. Utrzymuj czaszkę wilgotną zwykłą solą fizjologiczną.
  3. Przygotować przyrząd do laserowego przepływomierza dopplerowskiego (LDF) i trzymać końcówkę sondy LDF prostopadle do powierzchni lewej czaszki ciemieniowej (1 mm z tyłu i 5 mm z boku do bregmy); gdy FLUX jest stabilny i zapisać wartość wyjściową.
    UWAGA: Jednostką miary dla FLUX są jednostki perfuzji (PU), z zakresem pomiarowym 0-1000 PU. Idealne wyjściowe CBF w laserowym przepływomierzu dopplerowskim to >600 PU. Ciągły okres 5 sekund z zakresem wahań mniejszym niż 10% jest uważany za prawidłowy odczyt FLUX.
  4. Zszyj mięsień i skórę oddzielnie za pomocą szwu wchłanialnego 5.0 PGA. Na ranę nałożyć diklofenak, żel sodowy i maść mupirocyny.

4. Zabieg chirurgiczny MCAO

UWAGA: MCAO jest wykonywane przy użyciu zmodyfikowanej metody gwintowania, jak wcześniej opisali Chiang et al.13.

  1. Delikatnie obróć mysz do pozycji leżącej na plecach i podawaj myszom dootrzewnowo 30% glukozy (7,2 ml/kg) lub sól fizjologiczną na 15 minut przed zabiegiem chirurgicznym.
    UWAGA: Myszy z grup Sham + glukoza i MCAO + glukoza otrzymały dootrzewnowe zastrzyki glukozy. Myszy z grup Sham + sól fizjologiczna i MCAO + sól fizjologiczna otrzymały dootrzewnowe zastrzyki normalnej soli fizjologicznej.
  2. Ogol włosy w okolicy szyi za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyść i zdezynfekuj skórę, naprzemiennie nakładając jod i 70% etanol za pomocą dezynfekującego bawełnianego patyczka. Przykryj szyję sterylną gazą i wytnij otwór, aby odsłonić obszar operacyjny.
    UWAGA: Upewnij się, że nacięcie jest proste, aby uzyskać optymalną wizualizację tętnicy szyjnej.
  3. Wykonaj 1,5 cm nacięcie w linii środkowej na brzusznej stronie szyi za pomocą skalpela. Rozsuń tkankę podskórną i powięź powierzchowną za pomocą pęsety chirurgicznej.
    UWAGA: Upewnij się, że nacięcie jest proste, aby uzyskać optymalną wizualizację tętnicy szyjnej.
  4. Pod powięzią powierzchowną zlokalizuj gruczoł podżuchwowy i odwrócony trójkąt utworzony przez trzy mięśnie: mostek gnykowo-gnykowy, umieszczony na linii środkowej nad tchawicą; tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego, rozpoznawalny po błyszczącej białej części ścięgnistej; i wreszcie mięsień mostkowo-sutkowy.
  5. Wykonaj rozwarstwienie w odwróconym trójkącie, aby zidentyfikować i oddzielić lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA).
  6. Wypreparuj nerw błędny przylegający do CCA i tkankę śluzówkową otaczającą naczynia krwionośne za pomocą kleszczy okulistycznych. Wykonaj dzwonek na CCA za pomocą wchłanialnego szwu z kwasu poliglikolowego 5.0 (PGA), ale nie utrzymuj szwu napiętego.
  7. Oddzielony w górę wzdłuż CCA można zaobserwować rozwidlenie "Y", które dzieli CCA na tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA).
  8. Oddziel rozwidlenie, aby w pełni odsłonić ECA i ICA. Zapętlić i mocno zawiązać wchłanialny szew 5.0 PGA wokół ECA dystalnie od rozwidlenia.
    UWAGA: Zapewnić wystarczającą odległość między miejscem stałego podwiązania a rozwidleniem naczyń krwionośnych, aby zapobiec przemieszczaniu się nici podczas obracania ECA.
  9. Tymczasowo zaciśnij zarówno CCA, jak i ICA za pomocą dwóch lekkich zacisków mikro serrafine tętnic tętniczych o wymiarach 8 mm x 2 mm, aby zablokować przepływ krwi z CCA do ICA.
  10. Rozciągnij opaskę szwów na dystalnej części ECA i CCA, aby wyprostować segment ECA.
  11. Użyj mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie między dwoma mocowaniami szwów na ECA.
  12. Włożyć do ECA nici monofilamentowy pokryty silikonem (o długości 30 mm, silikon powlekany 3–4 mm). Zapętlić i lekko zawiązać drugi wchłanialny szew 5.0 PGA na ECA w pobliżu rozwidlenia, aby zapobiec cofaniu się szwu monofilamentowego.
  13. Całkowicie przeciąć ECA dystalnie do stałego podwiązania i usunąć zacisk kleszczy tętniczych z ICA.
  14. Wycofaj szew do rozwidlenia CCA, a następnie ostrożnie schuj i obróć kikut ECA. Dostosuj kierunek wprowadzania szwu i powoli wprowadzaj go, około 9,0–10,0 mm od rozwidlenia CCA do ICA, aby zamknąć MCA.
  15. Zaciśnij drugi wchłanialny szew PGA wokół ECA i usuń zacisk tętnicy z CCA.
  16. Zszyj mięsień i skórę oddzielnie za pomocą szwu wchłanialnego 5.0 PGA. Na ranę nałożyć diklofenak, żel sodowy i maść mupirocyny.
  17. Delikatnie obróć mysz do pozycji leżącej i powtórz krok 3.4., aby zarejestrować przepływ krwi po okluzji MCA.
    UWAGA: Myszy wykazujące zmniejszenie przepływu krwi o mniej niż 40% wartości wyjściowej po MCAO zostały wykluczone z badania14.
  18. Włącz wyłącznik ogrzewania klatki rekonwalescencji z temperaturą ustawioną na 37°C. Umieść mysz w klatce odzyskiwania w okresie po okluzji (60 min).

5. Usuwanie i reperfuzja monofilamentu

  1. Ponownie znieczulij mysz zgodnie z wcześniejszym opisem tuż przed zakończeniem okresu okluzji.
  2. Zacisnąć CCA za pomocą zacisku tętniczego z mikroklipsem.
  3. Częściowo wycofaj żyłkę z ICA, aż końcówka pokryta silikonem stanie się widoczna przez ICA.
  4. Umieść kolejny zacisk tętnicy mikroklipsowej na ICA nad końcówką pokrytą silikonem.
  5. Całkowicie wyciągnij żyłkę i mocno podwiąż kikut ECA.
  6. Usuń zacisk tętnicy mikroklipsowej odpowiednio z ICA i CCA.
  7. Zszyj mięsień i skórę warstwa po warstwie za pomocą wchłanialnego szwu 5.0 PGA.
  8. Umieść mysz w komorze odzyskiwania i monitoruj wszystkie myszy, aż w pełni się obudzą. Meloksykam (5 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać w celu złagodzenia bólu co 12 godzin przez okres do 24 godzin.

6. Pomiar stężenia glukozy we krwi

UWAGA: Poziom glukozy we krwi mierzono w następujących punktach czasowych: (1) tuż przed operacją MCAO (wartość wyjściowa), (2) bezpośrednio po wprowadzeniu monofilamentu (15 minut po wstrzyknięciu glukozy), (3) bezpośrednio po odstawieniu monofilamentu bezpośrednio po włożeniu monofilamentu (75 minut po wstrzyknięciu glukozy).

  1. Przetrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem, aby żyła ogonowa była całkowicie przekrwiona.
  2. Odetnij końcówkę ogona o 1–2 mm za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  3. Delikatnie ściśnij wzdłuż nasady ogona do czubka ogona, ułatwiając przepływ krwi z nacięcia.
  4. Umieść zbiornik absorpcyjny próbki bibułki testowej na krawędzi kropli krwi.
    UWAGA: Krew zostanie wciągnięta do papieru testowego ze względu na efekt syfonowania.
  5. Odczytaj odczyt glukometru i zapisz wynik.
    UWAGA: Wyklucz myszy, u których poziom glukozy we krwi nie wzrósł powyżej 10 mmol/L po 15 minutach wstrzyknięcia glukozy.
  6. Usuń nadmiar krwi za pomocą wacika i uciskaj, aby zatrzymać krwawienie.

7. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)

  1. Poddać mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu (300 mg/kg).
  2. Gdy mysz przestanie oddychać, natychmiast unieruchom ją w pozycji leżącej.
  3. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i wytnij przeponę, aby odsłonić serce.
  4. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań 23 G do lewej komory myszy i naciąć wyrostek uszny nożyczkami.
  5. Roztworuj 15 ml soli fizjologicznej, aż płyn spływający z wyrostka robaczkowego usznego stanie się czysty i przezroczysty.
  6. Odetnij głowę myszy i rozetnij skórę głowy, aby całkowicie odsłonić czaszkę za pomocą nożyczek. Włóż końcówkę nożyczek 2 mm lekko przed szew koronowy czaszki, aby ją podważyć.
  7. Użyj pęsety, aby usunąć nienaruszoną tkankę mózgową myszy.
  8. Umieść tkankę mózgową w matrycy mózgu gryzonia i pokrój ją na 2 mm plastry koronalne.
  9. Przenieść plastry na płytkę 24-dołkową i inkubować je w 2% roztworze TTC w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  10. Uruchom oprogramowanie skanujące i ustaw ustawienia parametrów na rozdzielczość 1200 dpi i format JPG do analizy obrazu.
  11. Wytnij skrawki tkanki z płytki 24-dołkowej za pomocą zakrzywionych kleszczyków i ułóż skrawki na szklanej płytce skanującej.
  12. Zeskanuj skrawki tkanki, a następnie wyeksportuj obrazy do analizy pomiarów.
  13. Zmierz obszar zawału, korygując obrzęk tkanek. Odejmij obszar bez zawału po stronie ipsilateralnej od obszaru po stronie przeciwległej za pomocą oprogramowania ImageJ15. Oceń rozmiar zawału jako procent przeciwległej półkuli. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat analizy obszaru zawału, zapoznaj się z Friedländer et al.16.

8. Obserwacja Grossa

  1. Powtórz kroki 7.1–7.8.
  2. Wytnij skrawki tkanki z matrycy mózgu za pomocą zakrzywionych kleszczy i ułóż skrawki na szklanej płytce skanującej.
  3. Zeskanuj sekcje koronalne mózgu zgodnie z opisem w krokach 7.10 i 7.12.

9. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Powtórz kroki 7.1–7.4. Powoli przetopić 15 ml soli fizjologicznej, a następnie perfuzję około 15 ml paraformaldehydu (PFA).
  2. Powtórz kroki 7.6–7.7. Utrwal tkankę mózgową za pomocą 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść utrwaloną tkankę mózgową w automatycznym odwadniaczu tkanek w celu odwodnienia, witryfikacji i zanurzenia w wosku.
  4. Osadź tkankę w wosku parafinowym i pokrój tkankę mózgową na plastry koronalne o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.
  5. Odwoskuj plaster, zanurzając go trzykrotnie w ksylenie, przy czym każde zanurzenie trwa 8 minut. Następnie stopniowo zanurzaj plaster w roztworach etanolu o malejących stężeniach (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), a następnie w wodzie destylowanej, przy czym każdy krok trwa 5 minut.
  6. Plamić plasterek roztworem hematoksyliny przez 3 minuty. Następnie rozróżnicuj go, zanurzając go w 5% alkoholu kwasu solnego na 5 s.
  7. Inkubuj plasterek z roztworem eozyny przez 1 minutę, a następnie odwodnij i hialinizuj go gradientowym roztworem etanolu (90%, 95%, 100%) i ksylenem.
  8. Zamontuj sekcję za pomocą żywic neutralnych.
  9. Uchwyć obrazy barwionych H&E wycinków mózgu w jasnym polu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

10. Oznaczanie leku Evans Blue (EB)

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z Wang et al.17.

  1. Wstrzyknąć 2% (w/v) roztwór Evans Blue (EB) (2 ml/kg) przez żyłę ogonową 23 godziny po MCAO.
  2. Powtórz kroki 7.1–7.7 godzinę po wstrzyknięciu EB i zrób zdjęcie całego mózgu.
  3. Umieść mózg w matrycy mózgu gryzonia i pokrój go koronalnie na plastry o średnicy 2 mm. Zeskanuj odcinki korony mózgu zgodnie z opisem w krokach 7.10–7.12, aby zaobserwować przeciek EB.
  4. Podziel plastry na prawą i lewą część i włóż każdą z nich do probówki wirówkowej.
  5. Homogenizuj każdy wycinek tkanki mózgowej w 50% kwasie trichlorooctowym, w proporcji 100 mg tkanki mózgowej do 0,4 ml kwasu trójchlorooctowego.
  6. Po inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc odwirowywać homogenat przez 30 minut w temperaturze 10 000 x g (w temperaturze 4 °C).
  7. Przenieść ciecz sklarowaną nad osadem do innej probówki wirówkowej i rozcieńczyć ją czterokrotnie etanolem.
  8. Zmierzyć absorbancję cieczy sklarowanej nad osadem przy długości fali 620 nm za pomocą spektrofotometru.
  9. Przelicz wartości absorbancji na stężenie EB przy użyciu wzorcowej krzywej EB w etanolu (np. przy 31,25, 62,5, 125 i 250 ug/ml).
    UWAGA: Wynik jest przedstawiony jako mikrogram EB na gram tkanki mózgowej.

11. Oznaczanie wycieku FITC-Dekstranu

  1. Wstrzyknąć FITC-Dekstran (10 KDa, 6 mg / ml, rozcieńczony w 0,01 M PBS; 4 ml / kg) do żyły ogonowej 24 godziny po MCAO, pozwalając mu krążyć we krwi przez 10 minut.
  2. Powtórz kroki 7.1–7.7, aby przeprowadzić perfuzję i usunąć nienaruszoną tkankę mózgową.
  3. Utrwal tkankę mózgową w 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Przenieś utrwaloną tkankę mózgową do roztworu sacharozy o gradientowych stężeniach 10%, 20% i 30% (rozcieńczonych w 0,01 M PBS) w celu odwodnienia.
  5. Osadź tkankę mózgową za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i pokrój na odcinki tkanki mózgowej o grubości 30 μm. Przenieś skrawki na szkiełko mikroskopowe za pomocą pętli zaszczepiającej i upewnij się, że przylegają do powierzchni szkiełka.
  6. Zamontuj skrawki tkanki mózgowej za pomocą pożywki montażowej zawierającej 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI).
  7. Uruchom laserową mikroskopię konfokalną i jej oprogramowanie sterujące.
  8. Zamocuj szkiełko mikroskopu na stoliku obiektowym i zlokalizuj obszar zawału pod okularem 200x.
  9. Ustaw rozdzielczość na 1024 x 1024 i dostosuj wartość wzmocnienia oraz czas ekspozycji, aby uzyskać jak najwyraźniejszy obraz.
  10. Uzyskaj obrazy barwionego FITC-Dekstranem obszaru zawału mózgu pod długością fali wzbudzenia 488 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Procedura eksperymentalna niniejszego badania została przedstawiona na Rysunku 1. W skrócie, myszy poddano MCAO indukowanej okluzją nicią przez 60 min, a następnie reperfuzji. Glukozę (30% w soli fizjologicznej, 7,2 mL/kg masy ciała) podano dożylnie 15 min przed MCAO. Poziomy glukozy we krwi mierzono w punkcie wyjściowym (przed wstrzyknięciem glukozy), bezpośrednio po MCAO oraz w momencie reperfuzji. Po 24 h reperfuzji myszy uśpiono, a tkanki mózgowe pobrano w celu analizy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół ma na celu stworzenie wiarygodnego zwierzęcego modelu transformacji krwotocznej po udarze niedokrwiennym, który może replikować szkodliwe skutki rewaskularyzacji naczyń w warunkach hiperglikemii. Wśród różnych czynników ryzyka udaru niedokrwiennego poziom glukozy we krwi w ciągu 24 godzin od wystąpienia udaru jest dodatnio skorelowany z zaostrzeniem uszkodzenia mózgu i zwiększoną śmiertelnością 3,18. Liczne badania kliniczne wykazały również, że h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Rysunek 1 został stworzony za pomocą oprogramowania BioRender (https://www.biorender.com/). Badanie to zostało wsparte grantami z projektu przewodniego Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hubei (nr 2022CFC057).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)Sigma-Aldrich108380Barwnik do barwienia
TTC 24-dołkowa płytka hodowlanaCorning IncorporatedCLS3527Naczynie do barwienia TTC
30% wstrzyknięcie glukozyKelun PharmaceuticalH42021188Ostra indukcja hiperglikemii
4% paraformaldehyduWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Utrwalanie tkanek
5.0 Wchłanialny szew kwasu poliglikolowegoJinhuan Medical Co., LtdKCR531Sprzęt do chirurgii
96-dołkowa płytka hodowlanaCorning IncorporatedCLS3596Maszyna do pomiaru zawartości EB
ZnieczulenieMidmark CorporationVMRZnieczulenie dla zwierząt
Środek montażowy zapobiegający blaknięciu z DAPIBeyotime BiotechP0131Uchwyt do sekcji tkanek
Automatyzacja-odwadnianie tkanek  Maszyna
Leica BiosystemsTP1020Odwadnianie tkanek
Mikroskopia konfokalnaLeica BiosystemsSTELLARIS 5Akwizycja obrazu
Żel sodowy diklofenakuMaYinglong FarmaceutycznyH10950214Analgezja dla zwierząt
Roztwór do barwienia eozynyServicebio TechnologyG1001Barwnik do H& Barwienie E
Evans BlueAladdinE104208barwienie EB
Żel do oczuGuangzhou PharmaceuticalH44023098Materiał do operacji
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8Ocena przepuszczalności BBB
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusBX51Akwizycja obrazu
Zamrożony mikrotomLeica BiosystemsCM1900Zastosowanie do zamrożonych skrawków
GlukometrYuWell580Pomiar stężenia glukozy we krwi
Barwienie hematoksyliną RoztwórServicebioG1004Barwnik do H& E barwienie
Jod Lircon20020059Materiał do operacji
IzofluranRwd Life ScienceR510-22-10Znieczulenie dla zwierząt
Laserowy dopplerowski miernik przepływu krwiMoor InstrumentsmoorVMSMonitorowanie przepływu krwi
MCAO SzwyRwd Life Science907-00023-01Materiał do operacji
MeloksykamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgezja dla zwierząt
Zestaw narzędzi mikrochirurgicznychRwd Life ScienceSP0003-MSprzęt do chirurgii
MicrotomeThermo Fisher ScientificHM325Produkcja przekrojów tkanek
Ostrze mikrotomuLeica Biosystems819Produkcja przekrojów tkanek
Maść mupirocynaGlaxoSmithKlineH10930064Środek przeciw infekcjom dla zwierząt
Neutralny balsamAbsin Bioscienceabs9177Pieczęć dla H& Barwienie E
Centrum zatapiania parafinyThermo Fisher ScientificEC 350Wyprodukuj bloki parafinowe
Pentobarbital soduSigma-AldrichP3761Eutanazja dla zwierząt
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBeyotime BiotechC0221APłukanie sekcji tkanek
SkanerEPSONV330Golarka
do skanowania tkanekShenzhen Codos Urządzenia elektryczne Co., Ltd.CP-9200Sprzęt do chirurgii
SpektrofotometrThermo Fisher Scientific1510-02362EB pomiar zawartości
roztworu sacharozyShanghai Macklin Biochemiczny57-50-1Odwodnienie tkanek
Tissue-Tek OCT CompoundSakura4583Podłoże do zatapiania tkanek
Kwas trichlorooctowySigma-AldrichT6399EB Pomiar zawartości

Bibliografia

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761(2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003(2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

Przeglądaj więcej artykułów

Model myszy z hiperglikemiązamknięcie środkowej tętnicy mózgowejbariera krew-mózgobjętość zawału mózguprzepuszczalność błękitu Ewansawyciek FITC-dekstranubarwienie hematoksyliną i eozynąlaserowa dopplerowska pomiar prędkości przepływu krwi
Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.