Artykuł metodologiczny

Szachownica gojącego rany po oparzeniach model myszy oparty na cyfrowym urządzeniu grzewczym

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67375

⸱

27 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono uproszczony protokół do tworzenia modelu gojenia ran oparzeniowych u myszy za pomocą cyfrowego urządzenia grzewczego. Przypominające szachownicę miejsca eksperymentalne utworzone na skórze ułatwiają dalszą analizę funkcjonalną w teście gojenia się ran.

Streszczenie

Poważne oparzenia należą do najbardziej traumatycznych i fizycznie wyniszczających stanów, wpływając na prawie każdy układ narządów i powodując znaczną zachorowalność i śmiertelność. Biorąc pod uwagę ich złożoność i zaangażowanie wielu narządów, stworzono różne modele zwierzęce, aby odtworzyć różne aspekty oparzeń. Metody stosowane do wytwarzania spalonych powierzchni różnią się w zależności od eksperymentalnych modeli zwierzęcych. W tym badaniu opisano prosty, opłacalny i przyjazny dla użytkownika model spalania myszy do tworzenia spójnych oparzeń o pełnej grubości za pomocą cyfrowego urządzenia grzewczego. Końcówkę tego urządzenia przykładano do grzbietu myszy przez 10 s w temperaturze 97 °C, aby ustalić oparzenie przypominające szachownicę i zbadać gojenie się ran pod wpływem eksperymentalnego opatrunku. Pobrano próbki skóry do analizy histologicznej, w tym barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienia Massona. Gojenie się ran oceniano poprzez analizę obszaru rany i badanie mikroskopowe nacieku zapalnego, reepitelializacji i tworzenia się ziarniny. Model oparzeń myszy może służyć jako podstawowe narzędzie w badaniu patofizjologii urazów termicznych i ocenie interwencji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Oparzenia są uważane za jeden z krytycznych urazów skóry, spowodowanych ekspozycją na ciepło, elektryczność, materiały chemiczne i narażenie na promieniowanie1,2. Można go podzielić na cztery stopnie w zależności od głębokości urazu, począwszy od naskórka, a skończywszy na pełnej grubości skóry, a nawet mięśniach i kościach. Małe oparzenia mogą prowadzić do powstawania blizn i zwiększać ryzyko infekcji. Duży obszar oparzenia nie tylko powoduje miejscowe uszkodzenia, ale także stymuluje zaburzenia serca, nerek i innych narządów lub układów organizmu poprzez ciężkie i długotrwałe stany zapalne i odpowiedzi immunologiczne, co prowadzi do poważnych konsekwencji ogólnoustrojowych i wysokiej zachorowalności3. Większości osób, które przeżyły oparzenia, towarzyszy długotrwałe niepełnosprawność fizyczna, stres emocjonalny i obniżona jakość życia4,5. Dlatego ważne jest zbadanie patologicznego procesu oparzeń i mechanizmów regeneracji spalonej tkanki.

Zaangażowany w reakcje immunologiczne, regenerację tkanek i systematyczną homeostazę, badania in vitro nie mogły kompleksowo zbadać patologicznego procesu gojenia się ran oparzeniowych. W związku z tym w ciągu ostatnich dwóch dekad, w celu zbadania potencjalnych interwencji terapeutycznych, opracowano różne modele zwierzęce gojenia ran oparzeniowych, aby odtworzyć różne cechy urazów oparzeń6,7. Rany oparzeniowe powstają zwykle na powierzchni grzbietu świń, szczurów, myszy, królików i innych zwierząt po usunięciu włosów. Czas palenia może trwać od 3 s do 30 s, tworząc uszkodzenia termiczne o częściowej lub pełnej grubości w zakresie od 5% do 30% całkowitej powierzchni ciała (TBSA)8. Obecnie nie ma znormalizowanych modeli tych metod w badaniach nad oparzeniami na zwierzętach ze względu na dużą zmienność stosowanych technik. Metody stosowane do produkcji spalonych powierzchni różnią się w zależności od eksperymentalnych modeli zwierzęcych, w tym płomienia gazowego9, kąpiel z palącym etanolem10, wstępnie podgrzana pojedyncza metalowa płyta/bar11,12, wrząca lub gorąca woda13,14. Jednak technika zadawania oparzeń i wytwarzana głębokość oparzenia są często niespójne i słabo opisane we wcześniejszych badaniach, co ma kluczowe znaczenie dla określenia ciężkości oparzenia i sposobu leczenia oparzeń.

To badanie ma na celu opracowanie prostego, opłacalnego i przyjaznego dla użytkownika modelu zwierzęcego oparzeń myszy do tworzenia spójnych oparzeń pełnej grubości w symulowanych scenariuszach klinicznych. W tym protokole zastosowaliśmy wygodne cyfrowe urządzenie grzewcze do kontrolowania głębokości oparzenia poprzez regulację temperatury wywieranej na skórę. Końcówka tego urządzenia może być przełączana na różne rozmiary, aby wywołać oparzenia termiczne przy różnych zakresach TBSA. Pozwala to na stworzenie przypominającej szachownicę rany po oparzeniu na grzbiecie myszy, umożliwiając porównanie kilku eksperymentalnych i kontrolnych zabiegów na tym samym zwierzęciu. Obserwowaliśmy i rejestrowaliśmy proces zamykania się ran. Próbki skóry pobrano w celu oceny histologicznej (barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienie trichromem Massona) na różnych etapach gojenia się rany. Takie podejście zmniejsza liczbę zwierząt wykorzystywanych w doświadczeniu, a tym samym obniża koszty ekonomiczne, a jednocześnie jest bardziej zgodne z etyką zwierząt. Badanie to dostarczy naukowcom niezbędnych narzędzi, które ułatwią opracowanie nowych metod leczenia oparzeń i ujawnią patofizjologiczne mechanizmy gojenia się ran oparzeniowych.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii, Uniwersytetu Syczuańskiego (WCHSIRB-D-2024-499). Do niniejszego badania wykorzystano dwadzieścia cztery ośmiotygodniowe myszy C57BL/6 (samice, masa ciała 25-30 g). Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie sprzętu i myszy przed oparzeniami

  1. Zdobądź zwierzęta i trzymaj je w klatkach przez 7 dni po przyjeździe, aby umożliwić im aklimatyzację w środowisku.
  2. Wysterylizuj obszar roboczy, spryskując i przecierając 70% etanolem (v/v). Przykryj stół operacyjny sterylnymi chłonnymi wkładkami chirurgicznymi.
  3. Ustaw temperaturę cyfrowego urządzenia grzewczego na 97 °C. Urządzenie grzewcze składa się z trzech części (Rysunek 1).
    UWAGA: Temperaturę w zakresie 50-450 °C można regulować za pomocą regulatora temperatury (Rysunek 1A). Podstawa statywu służy do umieszczenia końcówki (Rysunek 1B), którą można zdemontować (Rysunek 1C) w celu wymiany różnych rozmiarów instrumentów. Zdezynfekuj końcówkę jodoforem lub alkoholem.
  4. Znieczulaj mysz 5% izofluranem w 100% tlenu w komorze indukcyjnej przez 3 minuty (natężenie przepływu: 4 l/min), aż oddech ulegnie spowolnieniu. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania palców u stóp.
    UWAGA: Wdychanie izofluranu może prowadzić do senności i uszkodzić układ sercowo-naczyniowy. Konieczne jest noszenie sprzętu ochronnego i obchodzenie się z nim pod wyciągiem w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
  5. Gdy mysz jest głęboko znieczulona, przenieś ją na podgrzewaną podkładkę w pozycji leżącej, aby utrzymać ciepło i zapobiec hipotermii podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1. 5% tlenu do konserwacji przez stożek nosowy.
  6. Nałóż żel nawilżający na oba oczy myszy za pomocą bawełnianego wacika, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.

2. Wywoływanie oparzeń pełnej grubości

UWAGA: Ogólny proces indukcji i analizy oparzeń jest pokazany w Rysunek 2.

  1. Ogol skórę myszy golarką elektryczną na obszarze o długości około 5 cm i szerokości 4 cm od szyi do ogona. Pracuj delikatnie, aby uniknąć zranienia skóry podczas golenia (Rysunek 3C).
  2. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nałożyć krem do depilacji na ogoloną skórę przez 3 minuty (Rysunek 3D).
    UWAGA: Unikaj nakładania kremu do depilacji na inne części myszy, aby zapobiec oparzeniom, które mogą być trudne do wykrycia. Krem powodował wysypki skórne, jeśli był stosowany dłużej niż 5 minut. Dokładny czas trwania optymalnej skuteczności różni się w zależności od produktu i powinien być określony przez operatora.
  3. Wytrzyj krem wilgotną gazą, aż krem i włosy nie zostaną wykryte. Zdezynfekuj obszar operacyjny peelingiem z chlorheksydyną, a następnie trzykrotnie dodaj 70% etanol (v/v). Oczyść i osusz obszar sterylną gazą.
  4. Użyj wysterylizowanej końcówki do pipety o pojemności 1 ml i średnicy 9 mm (Rysunek 3A) zanurzonej w wysterylizowanym tuszu, aby dokładnie określić pożądane miejsca zranienia. Mysia skóra grzbietowa charakteryzuje się nierówną topografią. Zdefiniowanie obszaru rany poza rdzeniem kręgowym myszy jest niezbędne do zapewnienia powtarzalności.
  5. Przykryj skórę wcześniej przyciętym sterylnym obłożeniem, pozostawiając wolne pole operacyjne (Ryc. 3). Załóż rękawice żaroodporne i sprawdź temperaturę cyfrowego urządzenia grzewczego. Przed i po indukcji oparzenia zdezynfekuj końcówkę urządzenia 70% etanolem (v/v).
  6. Przyłóż końcówkę urządzenia grzewczego do środka zlokalizowanych miejsc ran (97 °C przez 10 s), aby utworzyć sześć okrągłych ran o średnicy 4 mm (Rysunek 3B). Odstęp między sąsiednimi oparzeniami wynosi 0,5-1 cm. Określ liczbę oparzeń zgodnie z projektem eksperymentalnym.
    UWAGA: Oparzenie jest spowodowane głównie przewodzeniem ciepła; Dlatego nie ma potrzeby wywierania nacisku na pręt, tj. utrzymywania go w kontakcie ze skórą pod wpływem grawitacji podczas indukcji oparzenia. W przypadku projektu eksperymentalnego było sześć oparzeń. Jest to maksymalna liczba ran oparzeniowych, jaką można zbudować w zależności od użytego przez nas urządzenia i obszaru grzbietu myszy. Na tej podstawie można uzyskać wielokrotne powtórzenia tej samej grupy doświadczalnej.

3. Pielęgnacja i pomiar po oparzeniu

  1. Nałóż lód na ranę po oparzeniu na 5 minut, aby zmniejszyć potencjalny ból w celu leczenia bólu (Rysunek 3G).
  2. Wyłącz izofluran i usuń stożek nosowy po oparzeniu. Przenieś mysz na poduszkę grzewczą, aż mysz będzie się normalnie poruszać (np. nie będzie kucać ani nie drżeć).
  3. Umieść każdą mysz w klatce odzyskiwania, aby zapobiec ich drapaniu. Zmiękcz niektóre granulki żywności, dodając 5-10 kropli wody pitnej do każdej granulki i umieść je na podłodze klatki, aby ułatwić karmienie.
    UWAGA: Sterylizacja klatek poprzez spryskiwanie i wycieranie 70% etanolem (obj./obj.). Ściółkę należy regularnie wymieniać, aby myszy były ciepłe i wchłaniały mocz.
  4. Buprenorfinę (0,1 mg/kg mc.) podaje się podskórnie w miejscu doogonowym dwa razy na dobę przez łącznie 3 dni, zapewniając co najmniej 8 godzin między wstrzyknięciami.
  5. Oczyść wszystkie rany sterylną gazą zwilżoną solą fizjologiczną po 24 godzinach od indukcji oparzenia. Osusz skórę gazą i nałóż niewielką ilość żelu przeciwbakteryjnego (hydrożelu TKH) za pomocą strzykawki, aby zakryć ranę po oparzeniu12,14. Powtórz tę procedurę w kolejnych dniach 3, 7 i 10.
  6. Użyj oddychającego, przezroczystego opatrunku, aby zakryć rany. Rozmiar opatrunku powinien pokrywać około 1 cm wokół rany i nie powinien zakrywać obszaru bez depilacji.
    UWAGA: Opatrunek należy zmieniać co najmniej raz na 2 dni. Długotrwałe stosowanie opatrunku bez wymiany może prowadzić do zakażenia rany z tworzeniem się ropy, co skutkuje opóźnionym gojeniem się rany.
  7. Przez cały okres obserwacji mierz wagę co 2-3 dni. Ogólnie rzecz biorąc, myszy, które tracą 15%-20% swojej początkowej masy ciała, powinny zostać poświęcone i usunięte z eksperymentu.

4. Zbieranie ran

  1. Po 0, 3, 7, 10 i 14 dniach należy oznaczyć ranę końcówką sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1 ml i zarejestrować ją za pomocą aparatu cyfrowego.
  2. Poddaj myszy eutanazji przez przedawkowanie znieczulenia i zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas zwichnięcia szyjki macicy, aby uniknąć nadmiernego ciągnięcia, które może uszkodzić rany grzbietowe.
  3. Nożyczkami odizoluj miejsce rany i otaczającą je skórę, w tym mięśnie leżące pod nią (1 cm x 1 cm). Przygotować co najmniej trzy próbki dla każdej grupy.
  4. Utrwalić próbki skóry w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 24 godziny i przechowywać w temperaturze 4 °C. Objętość utrwalacza musi być 30 razy większa od objętości tkanki15,16.
    UWAGA: PFA jest niebezpieczny. Upewnij się, że pracujesz w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego.

5. Ocena gojenia się ran

  1. Tkankę rany należy dwukrotnie przemyć PBS i rozprowadzić ją bibułą filtracyjną, którą należy przyciąć do odpowiedniego rozmiaru (Rysunek 2H). Ze względu na obecność pewnej zawartości śluzu w warstwie tkanki podskórnej, przylega on do powierzchni bibuły filtracyjnej bez ruchu i zwijania się tkanki.
    1. Umieść bibułę filtracyjną i próbkę w kasecie na tkanki w celu odwodnienia parafiny, aby uzyskać stosunkowo gładkie próbki tkanek, a następnie osadź tissue15,16. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Rozciągnij tkankę tak bardzo, jak to możliwe i unikaj fałdowania, ponieważ te fałdy staną się trwałe po utrwaleniu.
  2. Pokrój próbki zatopione w parafinie na odcinki o grubości 5 μm i zabarwij szkiełka za pomocą H&E i trichromu Massona, aby ocenić zakres ziarniny, tworzenie angiogenezy i odkładanie kolagenu, dostarczając dowodów do oceny różnych etapów i postępu gojenia się ran17,18.
  3. Uchwyć obrazy wszystkich próbek za pomocą mikroskopu z obiektywem 40x.
  4. Użyj kompatybilnego oprogramowania, aby przeanalizować poplamiony wycinek skóry, w tym naskórek, skórę właściwą, tkankę podskórną i stan mięśni.

Wyniki

W niniejszym protokole, za pomocą cyfrowego urządzenia grzewczego, stworzono rany oparzeniowe w układzie szachownicy, stosując czas wypalania wynoszący 10 s w temperaturze 97 °C (Rysunek 1). Głowica urządzenia wykonana jest z czystej miedzi, która charakteryzuje się doskonałym przewodnictwem cieplnym i zdolnością do szybkiego nagrzewania. Uchwyt trzymany przez eksperymentatora wykonano z poliwęglanu, który zapewnia odporność termiczną i niepalność. W porównaniu do metod wykorzystujących wstępnie podgrzaną pojedynczą płytkę/pręt metalowy lub wrzątek i gorącą wodę, urządzenie to wykazuje wyższy poziom bezpieczeństwa oraz skraca czas anestezji u myszy, co w konsekwencji zmniejsza całkowity czas trwania eksperymentu.

Ogólny przebieg procesu indukowania oparzeń i ich analizy przedstawiono na Rysunku 2. Każde zwierzę posiadało sześć ran oparzeniowych na grzbiecie, rozmieszczonych zgodnie z przedstawieniem na Rysunku 2E. U tych zwierząt oceniano wielkość ran oraz pobierano próbki skóry do analizy histologicznej, obejmującej barwienie H&E oraz barwienie trichromem Massona, odpowiednio w 1., 3., 7., 10. i 14. dobie po oparzeniu.

Każda rana oparzeniowa miała kształt okrągły, taką samą powierzchnię oraz jednorodną głębokość po wywołaniu oparzenia. Kolor krawędzi rany oparzeniowej zmienił się z woskowo-białego na czerwony, co towarzyszyło powstaniu strefy hiperemicznej w wyniku natychmiastowej odpowiedzi zapalnej na uraz. Dodatkowo wielkość rany oparzeniowej nieznacznie zwiększyła się w ciągu 72 h po oparzeniu (Rysunek 4A).

Analiza mikroskopowa przekrojów ran barwionych H&E oraz trichromem Massona (Rysunek 4B) wykazała całkowite zniszczenie warstwy naskórka oraz uszkodzenie pełnej grubości skóry właściwej, obejmujące zarówno tkankę tłuszczową podskórną, jak i mięśnie. Badanie histologiczne wykazało, że w 3. dniu proces gojenia rany znajdował się w fazie zapalnej, charakteryzującej się rozszerzeniem naczyń krwionośnych i znaczną infiltracją komórek zapalnych. W obrazach mikroskopowych próbek zaobserwowano wyraźną redukcję powierzchni rany w 7. dniu po oparzeniu w porównaniu z 3. dniem. W 14. dniu utworzyła się tkanka ziarnina oraz naczynia krwionośne, a włókna kolagenowe osadziły się gęsto, co oznacza przejście procesu gojenia rany w fazę przebudowy. W trakcie całego procesu gojenia rany regenerowały się bez widocznych oznak infekcji.

Dodatkowo oceniono zdolność do gojenia ran poprzez ilościowe określenie danych dotyczących gojenia oraz analizę obrysów ran (Rycina 5). Zaobserwowano przyspieszenie regeneracji ran leczonych hydrożelem peptydowym TKH12,14, co potwierdziły znacznie mniejsze powierzchnie ran w 7., 10. i 14. dniu.

Odstęp między sąsiednimi ranami (Rysunek 6), zarówno poprzecznymi, jak i podłużnymi, potwierdził brak różnic w porównaniu ze skórą niepoparzoną. Naskórek, skóra właściwa i tkanki podskórne pozostały nienaruszone; nie stwierdzono nacieku limfocytów ani rozszerzenia naczyń krwionośnych. Proces gojenia obu ran nie wpływa na siebie nawzajem. W związku z tym, w ramach tego modelu do leczenia ran można stosować różne leki lub opatrunki w celu oceny ich działania in vivo.

Konfiguracja stacji lutowniczej do montażu elektronicznego, obejmująca kontrolę temperatury i elementy lutownicy.
Rysunek 1: Cyfrowe urządzenie grzewcze do indukowania oparzeń. Cyfrowe urządzenie grzewcze wykorzystywane do indukowania obrażeń oparzeniowych. (a) Sterownik temperatury umożliwia ustawienie wartości w zakresie 50-450 °C. (b) Podstawa statywu służy do utrzymania końcówki grzewczej. (c) Końcówkę urządzenia można wymieniać na różne rozmiary. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat eksperymentu gojenia oparzeń skóry myszy; kroki obejmują użycie pipety, indukcję oparzenia i barwienie tkanek.
Rysunek 2: Schemat modelu rany w układzie szachownicy. Opis krok po kroku procesu odtwarzania modelu rany w układzie szachownicy opisanego w artykule. (A) Jako model do eksperymentów nad gojeniem ran wykorzystano 8-tygodniową mysz. (B) Usunięto sierść z wyznaczonego obszaru tworzenia ran. (C) Wyznaczono sześć miejsc tworzenia ran, używając końcówki pipety 1 mL. (D) Użyto cyfrowego urządzenia grzewczego do stworzenia sześciu oparzeń w centrum każdego wyznaczonego miejsca (E). (F) Powiększony obraz grzbietu po indukcji oparzeń. (G) Próbki skóry (około 1 cm × 1 cm) pobrano w dniach 3, 7, 10 i 14. (H) Próbki skóry spłaszczono za pomocą papieru filtracyjnego i przeniesiono do kaset do zatapiania. (I) Wykonano odwodnienie w parafinie, a następnie (J) próbki pocięto na skrawki o grubości 5 µm. (K) Skrawki zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz metodą trichromu Massona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces inżynierii tkankowej z pomiarem suwmiarką, przygotowaniem materiału oraz wycinaniem i analizą próbek.
Rysunek 3: Proces indukowania pełnowarstwowego oparzenia. (A) Średnica końcówki pipety 1 mL oraz (B) końcówka cyfrowego urządzenia grzewczego wynoszą odpowiednio 9 mm i 4 mm. (C) Grzbiet myszy jest golony golarką elektryczną. (D) Krem do depilacji jest nakładany przez 3 min. (E) Ogolony obszar zostaje oczyszczony i osuszony, a punkty zranienia są zaznaczane za pomocą wysterylizowanej końcówki pipety 1 mL. (F) Cyfrowe urządzenie grzewcze jest przykładane w temperaturze 97 °C przez 10 s w celu utworzenia sześciu oparzeń. (G) Lód jest przykładany do oparzeń w celu uśmierzenia bólu. (H) Cały grzbiet myszy z widocznymi sześcioma pełnowarstwowymi oparzeniami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Postępy w gojeniu ran u myszy, dni 3-14, przekroje histologiczne z regeneracją tkanki.
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy oparzeń oraz analiza histologiczna. (A) Obrazy oparzeń w dniach 3, 7, 10 i 14, ukazujące postępy w gojeniu. (B) Obrazy histologiczne barwione H&E oraz trichromem Massona wykazujące gojenie ran i regenerację skóry. Paski skali = 200 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza gojenia ran z wykresem i mapami odległości dla grup CTRL i TKH w ciągu 14 dni.
Rysunek 5: Zmienność wielkości rany w czasie. (A) Zmienność wielkości rany u zwierząt kontrolnych oraz leczonych hydrożelem TKH w czasie, analizowana przy użyciu oprogramowania ImageJ. (B) Przedstawiono odpowiadające im dane z obrysów ran. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Postępy gojenia skóry myszy, analiza histologiczna, porównanie dnia 1-3, obrazy mikroskopowe.
Rycina 6: Sąsiednie rany oparzeniowe i analiza histologiczna. (A) Reprezentatywne obrazy sąsiednich ran oparzeniowych w 1. dniu. (B) Próbki z sąsiednich ran pobrane do analizy histologicznej w 3. dniu (zaznaczone czerwonym okręgiem). (C) Papier filtracyjny jest używany do spłaszczenia próbek tkankowych przed odwadnianiem w parafinie. (D) Analiza H&E oraz trichromem Massona w sąsiednich ranach. Paski skali: 1 mm i 200 µm (powiększenie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W przypadku badań oparzeń modele in vitro zazwyczaj koncentrują się na hamującym wpływie miejscowych środków przeciwdrobnoustrojowych lub antybiotyków na bakterie związane z oparzeniami, takie jak Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa19, a także na wpływie różnych biomateriałów (takich jak elastyna, jedwab i opatrunki hydrożelowe14,20) na komórkach zapalnych po oparzeniu (takich jak neutrofile, makrofagi) lub komórkach macierzystych (takich jak mezenchymalne komórki macierzyste). Eksperymenty te są zwykle przeprowadzane w sztucznie kontrolowanych środowiskach, a komórki hodowane in vitro mogą wykazywać cechy wzrostu i zachowania, które różnią się od tych in vivo, które mogą nie być w stanie w pełni odtworzyć fizjologicznych procesów gojenia się ran oparzeniowych, takich jak interakcje międzykomórkowe i wpływ macierzy zewnątrzkomórkowej. Z tych powodów zwierzęce modele oparzeń są niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów patologicznych po oparzeniu i oceny nowych podejść terapeutycznych. Proces gojenia się ran u myszy i ludzi przechodzi przez cztery nakładające się na siebie, ale odrębne etapy: zapalenie, proliferację, reepitelializację i przebudowę21,22. Istnieje kilka biologicznych zalet wykorzystania myszy jako obiektów eksperymentalnych, w tym dostępność licznych odczynników specyficznych dla myszy oraz możliwość tworzenia modeli transgenicznych w celu zbadania molekularnych szlaków sygnałowych zaangażowanych w proces rekonwalescencji. To sprawia, że myszy są jednym z najczęściej wykorzystywanych modeli zwierzęcych do badań nad oparzeniami i gojeniem się ran.

W niniejszym badaniu ustalono przypominający szachownicę model rany oparzenia o pełnej grubości i oceniono skuteczność opatrunku hydrożelowego przy użyciu tego modelu. Wyniki wskazują, że model ten może skutecznie monitorować skuteczność kliniczną eksperymentalnych opatrunków. U każdego zwierzęcia sześć ran oparzeniowych było symetrycznie rozmieszczonych wzdłuż kręgosłupa. Rany oparzeniowe mogą powstawać w podobnych miejscach, ale na różnych myszach. Ze względu na ograniczoną powierzchnię skóry grzbietu i liczbę ran, analiza histologiczna wykazała, że rany nie oddziaływały ze sobą, zapewniając niezależną ocenę każdego eksperymentalnego opatrunku w różnych miejscach na tym samym grzbiecie myszy, minimalizując błąd systematyczny związany z procesem gojenia się ran. Ponadto model ten korzysta również z zapewnienia, że każda mysz służy jako osobna kontrola, co umożliwia porównanie zabiegów eksperymentalnych i kontrolnych na grzbiecie tej samej myszy, co prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby zwierząt i kosztów doświadczalnych. Ze względu na różny wpływ różnych leków na ogólny stan zdrowia myszy, jeśli wiele leków ma być nałożonych na skórę tej samej myszy w celu leczenia różnych ran i późniejszego porównania, może być konieczna obserwacja i sprawdzenie, czy zastosowanie jednego leku lub połączone stosowanie różnych leków wpłynie na ogólny stan zdrowia myszy. Dodatkowo należy zwrócić uwagę na stabilność lub przyczepność różnych leków do powierzchni skóry, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu leków lub zakażeniu rany z powodu drapania myszy podczas procesu gojenia.

Pobranie próbki skóry ma kluczowe znaczenie dla późniejszej analizy histologicznej. Krawędź tkanki kurczy się i fałduje w utrwalaczu bez żadnego leczenia16. Po odwodnieniu i przecięciu parafiny zostanie ona również zakrzywiona lub nawet częściowo nałożona na szkiełko, co spowoduje nieestetyczne obrazy pod mikroskopem i potencjalnie wpłynie na dalszą analizę histologiczną, taką jak analiza statystyczna długości lub grubości rany. Dlatego użycie bibuły filtracyjnej do spłaszczenia tkanki pozwala uzyskać gładszy przekrój na szkiełku, co sprawia, że obraz histologiczny jest schludny i ułatwia dalszą analizę statystyczną. Próbowaliśmy również użyć spinaczy do papieru, aby utrwalić próbkę przed odwodnieniem, co pomogło zapewnić gładkość tkanek. Jednak zastosowanie spinaczy do papieru może wywierać nacisk na zaciśniętą tkankę, prowadząc do ściskania i deformacji tkanki. Dlatego przy stosowaniu tej metody nie można zacisnąć części rany po oparzeniu, aby nie wpływać na obserwację.

Na proces gojenia może wpływać wiele czynników, w tym ból, swędzenie i infekcja bakteryjna23. Skuteczne leczenie bólu oparzeniowego ma kluczowe znaczenie dla powrotu do zdrowia i reintegracji pacjentów z oparzeniami. Nieodpowiednia kontrola bólu może utrudnić proces gojenia, prowadząc do długotrwałych wyzwań fizycznych i psychicznych, a także przedłużonych pobytów w szpitalu24. Ogólnie rzecz biorąc, ból wpływa na zachowania żywieniowe u myszy. W związku z tym każdą ranę po oparzeniu natychmiast opatrzono lodem i wstrzyknięto buprenorfinę (0,1 mg/kg) podskórnie dwa razy dziennie przez 3 dni w celu złagodzenia bólu. Dodatkowo granulki pokarmowe zostały zmiękczone i umieszczone na podłodze klatki, aby ułatwić karmienie. W pomieszczeniach komunalnych myszy mogą drapać i lizać nawzajem swoje rany, potencjalnie opóźniając gojenie się ran lub powodując infekcje. Dlatego indywidualne trzymanie myszy staje się konieczne jako środek zapobiegawczy. Stosowanie oddychającego opatrunku do zakrycia grzbietu po indukcji oparzenia może zapobiec drapaniu rany przez myszy i zmniejszyć ryzyko infekcji25. Jednak ważne jest, aby rozsądnie dobierać opatrunki i przycinać je do odpowiedniego rozmiaru, aby umożliwić myszom normalne poruszanie się. Opatrunki należy niezwłocznie wymienić, jeśli odpadną, z zaleceniem ich wymiany co najmniej raz na dwa dni. Długotrwałe stosowanie opatrunków może prowadzić do niewystarczającego wchłaniania wysięku z rany.

Chociaż model mysi ma swoje specyficzne zalety, nadal nie może w pełni symulować procesu gojenia się ran u ludzi. Ludzie goją się przede wszystkim poprzez reepitelializację i ziarninowanie. W przeciwieństwie do tego, skóra myszy ma unikalny panniculus carnosus, cienką warstwę mięśni szkieletowych, która jest obecna tylko w platysmie szyi u ludzi7, więc gojenie się ran następuje głównie poprzez skurcz rany. Dodatkowo skóra myszy może posiadać wzbogaconą pulę komórek progenitorowych, co ułatwia szybkie gojenie się skóry i keratynizację26,27. Czynniki te łącznie przyczyniają się do znacznego skrócenia czasu gojenia. W modelach zwierzęcych pierścienie zapobiegające skurczowi ran zostały wykorzystane do złagodzenia wpływu skurczu rany na proces gojenia i naśladowania fizjologicznego gojenia się ran podobnego do ludzkiego, które goi się za pomocą ziarniny i ponownego nabłonkowania 12,17,28.

Pomyślne opracowanie modelu oparzeń myszy stanowi cenne narzędzie do badania patofizjologii urazów termicznych i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Zaobserwowane zmiany histologiczne w spalonej tkance skórnej są zgodne z charakterystycznymi cechami urazu termicznego, podkreślając wiarygodność i trafność modelu w rekapitulacji objawów klinicznych oparzeń.

Ogólnie rzecz biorąc, model oparzeń myszy stanowi solidną platformę do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uszkodzeń tkanek wywołanych oparzeniami, stanami zapalnymi i procesami gojenia się ran. Przyszłe badania wykorzystujące ten model mogą przyczynić się do opracowania nowatorskich podejść terapeutycznych mających na celu poprawę wyników leczenia pacjentów z oparzeniami oraz zmniejszenie obciążenia związanego z zachorowalnością i śmiertelnością związaną z oparzeniami.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Sichuan Science and Technology Program (23ZYZYTS0120), granty Zachodniochińskiego Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Sichuan (RD-03-202011) oraz Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC0614). Figury zostały stworzone za pomocą BioRender. Com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Końcówka do pipety 1 mlKIRGEN, USAKG1333Służy do lokalizacji miejsc ran oparzeniowych
3 M Folia Tegaderm3M, USA1624WCN 6 cm x 7 cmDo pokrywania ran po indukcji oparzeń
4% paraformaldehyd (PFA)Biosharp, ChinyBL539ASłuży do mocowania próbek skóry
BuprenorfinaSigma-Aldrich, USAPHR8955-50MGDo leczenia bólu myszy
Myszy C57BL / 6Chengdu Dashuo eksperymentalna firma zwierzęca, ChinybrakDo ustanowienia modelu oparzeń
Krem do depilacjiVeet, Chiny—Do usuwania owłosienia z grzbietu myszy
Cyfrowe urządzenie grzewczeShenzhen Kapper Technology Company, ChinyNo.936DDo indukcji oparzeń myszy
Golarka elektrycznaAUX, ChinyAUX-A5Do usuwania włosów na grzbiecie myszy
Bibuła filtracyjna——Służy do rozkładania próbek skóry
Oprogramowanie GraphPad—Pryzmat GraphPad 9.5.0Do analizy obszaru rany oparzeniowej
Rękawice żaroodporne——Służy do przytrzymywania końcówki cyfrowego urządzenia grzewczego
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozynySolarbio, ChinyG1120Do analizy histologicznej preparatów
Oprogramowanie ImageJ—ImageJ 1.54fDo analizy obszaru rany oparzeniowej
IzofluranRWD, ChinyR510-22-10Do znieczulenia myszy
Masson's Trichrome Stain KitSolarbio, ChinyG1340Do analizy histologicznej preparatów
MikroskopOlympus, Japonia VS200 ASWSłuży do skanowania H& Szkiełka barwione E i Masson
Kaseta na tkankiCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD, Chiny31050102WDo odwadniania parafiny tkankowej i zatapiania parafiny

Bibliografia

  1. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
  2. Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
  3. Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
  4. Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
  5. Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
  6. Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
  7. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
  10. Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
  11. Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
  12. Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
  13. Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
  14. Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
  15. Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. (186), e64345(2022).
  16. Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
  17. Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
  18. Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
  19. Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
  20. Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
  21. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  22. Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
  23. Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
  24. Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
  25. Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
  26. Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
  27. Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
  28. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model oparze u myszyoparzenia pe nej grubo ci sk ryanaliza powierzchni ranyanaliza histologicznanaciek zapalnytkanka ziarninowareepitelializacjahydro el peptydowy

Powiązane artykuły