Artykuł metodologiczny

Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

1 listopada 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.

Streszczenie

Wątroba jest głównym organem, który pełni podstawowe funkcje metaboliczne. Opracowanie skutecznej i bezpiecznej metody obniżania ekspresji genów w wątrobie stanowi ważne narzędzie do określania funkcji genów w patofizjologii wątroby. W tym badaniu opisujemy metodę wstrzykiwania do śledziony serotypu 8 wirusa związanego z adenowirusem (AAV8) zaprojektowanego w celu ekspresji małego RNA spinki do włosów (shRNA) przeciwko docelowemu genowi, nukleosteminie (NS). Wstrzyknięcie do śledziony AAV8 wyrażającego shRNA ukierunkowane na NS (AAV8-shNS1) osiągnęło taką samą skuteczność knockdown NS w wątrobie, jak wstrzyknięcie do żyły wrotnej, w porównaniu z wstrzyknięciem AAV8 wyrażającego zakodowaną sekwencję shRNA (AAV8-shScr). Ponadto wstrzyknięcie wirusa AAV8-shRNA wywołało minimalne reakcje zapalne w miąższu wątroby. Co najważniejsze, ten protokół iniekcji dośledzionowej nie był wymagający technicznie i powodował minimalne krwawienie w miejscu wstrzyknięcia, co jest główną przyczyną śmiertelności okołooperacyjnej i pooperacyjnej podczas wykonywania iniekcji do żyły wrotnej. Badanie to donosi o ulepszonej i stosunkowo bezpiecznej metodzie osiągania skutecznego knockdownu genów w wątrobie.

Wprowadzenie

Wątroba jest ważnym organem, który metabolizuje składniki odżywcze i substancje chemiczne, ale jest również narażona na ciągłe działanie substancji cytotoksycznych i rakotwórczych. Podczas gdy dorosła wątroba jest zdolna do odbudowy po urazie, jej zdolność regeneracyjna jest poważnie ograniczona przez wiek1. Do tej pory jedyną opcją terapeutyczną dla pacjentów ze schyłkową przewlekłą chorobą wątroby lub masywnym ostrym uszkodzeniem wątroby jest przeszczep wątroby, który sam w sobie stwarza wiele wyzwań2. Aby lepiej zrozumieć molekularną patofizjologię wątroby poprzez badanie funkcji genów będących przedmiotem zainteresowania, opracowano manipulacje genetyczne do zastosowań in vivo, w tym knockdown za pośrednictwem RNAi i celowaną delecję przez rekombinazę Cre w obecności miejsc loxP3. Kaseta ekspresji Cre i konstrukt shRNA mogą być dostarczane przez nośniki wirusowe.

Wirus związany z adenowirusem serotyp 8 (AAV8) jest silnym wektorem do dostarczania genów do wybranych typów tkanek (np. wątroby, mięśni szkieletowych, serca, mózgu i trzustki) o wysokiej skuteczności i niskiej odpowiedzi zapalnej4,5. Aby celować w narządy wewnętrzne ciała, AAV8 jest zwykle wprowadzany przez wstrzyknięcie żyły ogonowej, w której cząsteczki wirusa najpierw przemieszczają się przez płuca, zanim dotrą do krążenia ogólnoustrojowego. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie żyły wrotnej pozwala im dotrzeć najpierw do wątroby, zanim zaczną krążyć w płucach, co jest potencjalnym źródłem sekwestracji i rozcieńczenia. Jednak wstrzyknięcie żyły wrotnej jest technicznie trudne i często skomplikowane ze względu na krwawienie wywołane operacją i wysoką śmiertelność. Aby osiągnąć skuteczny knockdown genu (KD) w wątrobie, unikając jednocześnie problemu wysokiej śmiertelności około/pooperacyjnej, przetestowaliśmy metodę wstrzykiwania do śledziony AAV8 przenoszącego zmodyfikowaną nukleosteminę shRNA ukierunkowaną na nukleosteminę (NS) (AAV8-shNS1) i porównaliśmy jej skuteczność KD z wydajnością AAV8-shNS1 wstrzykniętego do żyły wrotnej.

NS to białko wzbogacone w komórki macierzyste/progenitorowe, odkryte najpierw w nerwowych komórkach macierzystych, a później w kilku innych typach komórek macierzystych i nowotworów6,7. O biologicznym znaczeniu NS świadczy wczesny embrionalny fenotyp letalny myszy z nokautem NS (NSKO) in vivo3,8 oraz wywołane przez NSKD zaburzenie samoodnawiania się in vitro9,10. U dorosłych zwierząt wysoki poziom ekspresji NS stwierdza się w jądrach i kilku tkankach poddawanych regeneracji, w tym w odróżnicowujących się komórkach nabłonka barwionych traszką po lentektomii i komórkach mięśniowych po amputacji kończyny11, a także w regenerujących się tkankach ssaków, takich jak kardiomiocyty myszy po urazie serca12 i hepatocytach po uszkodzeniu wątroby (np. CCl4) lub resekcji chirurgicznej (np. częściowa hepatektomia)13,14. Ponadto wykazano, że NS odgrywa ważną rolę w rozwoju nowotworów sutka, wątroby i jamy ustnej15,16,17. Mechanicznie wykazano, że NS sprzyja samoodnowie poprzez ochronę replikującego się genomu przed uszkodzeniem DNA18,19. Jednak ze względu na wczesny embrionalny fenotyp letalny linii zarodkowej NSKO, potrzebna jest eksperymentalna metoda czasowego wprowadzania NSKD po zakończeniu rozwoju tkanki w celu dalszego określenia jej aktywności biologicznej w dorosłych narządach.

W tym artykule używamy NS jako przykładu do zilustrowania ustanowienia i testowania metody in vivo genu wątrobowego KD, która jest skuteczna i ma niską śmiertelność wywołaną zabiegiem.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Texas A&M University Health Science Center w Houston (numer zatwierdzenia: 2021-0264-IBT) i przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi. Wykorzystano samice myszy C57BL/6J (4-5 miesięcy, masa ciała 23-30 g). Szczegóły dotyczące użytych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Projektowanie i produkcja AAV8- shRNA

UWAGA: Proszę zapoznać się z Sands et al.4 w celu uzyskania szczegółów proceduralnych.

  1. Zaprojektuj oligonukleotydy shRNA z wyczuciem i antysensem, które są ukierunkowane na długą sekwencję 21-nukleotydową w regionie kodującym interesującego genu. W tym przypadku użyto mysiego NS (shNS1) i zaszyfrowanej sekwencji 21 nukleotydów jako kontroli negatywnej (shScr) (Rysunek 1A, dolny panel).
  2. Uwzględnij w strukturze spinki do włosów sekwencję pętli łodygi TTCAAGAGA, koniec 5', spójny koniec zgodny z XhoI 3' oraz specyficzną dla genu sekwencję ukierunkowaną na wyczuwanie 5'-GAA, CTA, AAA, CAG, CAG, CAG, AA-3' (shNS1) lub zakodowaną sekwencję 5'-TCT CGC, TTG, GGC, GAG, AGT AAG-3' (shScr).
  3. Fosforylować i wyżarzać każdą parę oligonukleotydów.
  4. Trawić wektor transferu genu AAV, AV5-siRNA-GFP (Rysunek 1A, górny panel), z HpaI i XhoI, defosforylacją i żelem oczyszcza fragment wektora.
  5. Zligować wyżarzone oligonukleotydy do wektora oczyszczonego żelem.
  6. Przekształć ligowane produkty DNA w kompetentne bakterie DH5α z wydajnością subklonowania.
  7. Wybierz pojedyncze klony według oporności na ampicylinę i wyhoduj 100 ml kultury bakteryjnej do miniprepu plazmidu. Potwierdź poprawność klonowania poprzez sekwencjonowanie i przygotuj plazmidy za pomocą dostępnego w handlu zestawu bez endotoksyn (zgodnie z instrukcjami producenta).
  8. Zapakuj wirusy AAV8 poprzez transfekcję wektora transferowego AV5, serotypu 8 Rep / Cap i plazmidów pomocniczych AdF6 do komórek 293T za pomocą odczynnika do transfekcji iMFectin. W sumie 40 × 15-centymetrowych szalek zostało przetransfekowanych i zebranych/strawionych w ciągu 3 dni po transfekcji.
  9. Odzyskaj związany z komórkami AAV8 przez lizę komórek i wytrącić wydzielany przez pożywkę AAV8 za pomocą 40% PEG. Po roztrawieniu połączyć wirusy AAV8 w lizacie komórkowym i pożywce, oczyścić na nieciągłym gradiacji jodiksanolu i skoncentrować w jednostkach wirowania o odcięciu masy cząsteczkowej (1 000 000 MW).
  10. Określ ilościowo miana AAV8 za pomocą bezwzględnego punktu końcowego qPCR ze starterami: WPRE-172 (5'- TTTATGAGTTGTGGCCC-3') i WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Wstrzyknięcie AAV8 do śledziony (Rysunek 1B, 1C)

  1. Umieść myszy C57BL6/J w komorze anestezjologicznej wypełnionej 2% izofluranem i tlenem (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Po utracie przytomności przenieś myszy na aseptyczne pole operacyjne w prawej bocznej pozycji leżącej. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 2% izofluranu z tlenem dostarczanym przez stożek nosowy. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu po znieczuleniu izofluranem. Usuń włosy z pola operacyjnego.
    UWAGA: Codzienne tabletki karprofenu do żucia stosowano jako przedoperacyjny środek przeciwbólowy (1/4 tabletki na BW < 30 g, 1/2 tabletki na BW 30-60 g i 1 tabletka na BW > 60 g) na dzień przed zabiegiem.
  2. Wysterylizuj miejsce nacięcia 2% chlorheksydyną, a następnie 80% etanolem. Potwierdź poziom znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp. Za pomocą ostrza chirurgicznego wykonaj 15 mm nacięcie na lewej górnej ścianie brzucha, a następnie 10 mm nacięcie na otrzewnej.
  3. Delikatnie odsłoń śledzionę za pomocą kleszczy i przytrzymaj ją na miejscu za pomocą mokrej gazy umieszczonej pod narządem.
  4. Delikatnie wymieszaj i wstrzyknij wirusy AAV8 (50 μl) w ciągu 30 sekund do śledziony za pomocą igły 30 G z końcówką umieszczoną na głębokości 3 mm pod powierzchnią (Rysunek 1B). Przykryj miejsce wstrzyknięcia kawałkiem bawełnianego wacika i kompresuj przez 1 min.
  5. Zamknij ścianę brzucha szwem wchłanialnym 4-0.
  6. Zamknij skórę niewchłanialnym szwem 4-0.
  7. Umieść myszy w czystej klatce na elektrycznej poduszce grzewczej i monitoruj je aż do wyzdrowienia.
    UWAGA: Tabletki karprofenu do rozgryzania i żucia stosowano jako pooperacyjny środek przeciwbólowy (1/4 tabletki na BW < 30 g, 1/2 tabletki na BW 30-60 g i 1 tabletka na BW > 60 g) przez trzy dni po zabiegu.

3. Wstrzyknięcie do żyły wrotnej AAV8

  1. Znieczulić myszy C57BL6/J przez inhalację izofluranu (2%) zmieszaną z tlenem (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu po znieczuleniu izofluranem. Usuń włosy z pola operacyjnego.
    UWAGA: Codzienne tabletki karprofenu do żucia stosowano jako przedoperacyjny środek przeciwbólowy (1/4 tabletki na BW < 30 g, 1/2 tabletki na BW 30-60 g i 1 tabletka na BW > 60 g) na dzień przed zabiegiem.
  2. Wykonaj laparotomię4,13 przez nacięcie w linii środkowej (~1 cal) na skórze, a następnie do otrzewnej.
  3. Umieść sterylną gazę nasączoną sterylną solą fizjologiczną po lewej stronie myszy i za pomocą sterylnego bawełnianego wacika delikatnie wyciągnij jelito grube i cienkie. Umieść jelito na zwilżonej gazie i przykryj je podkładką, aby uniknąć kontaktu ze skórą lub wysuszenia.
  4. Wstrzyknąć wirusa AAV do żyły wrotnej za pomocą sterylnej igły o stężeniu 32 G w objętości 50 μl. Wprowadzić igłę na odległość 3-5 mm do żyły wrotnej pod kątem mniejszym niż 5 stopni. Pozwól, aby krew przepływała przez igłę przez 5 sekund, aby uniknąć przepływu wstecznego.
  5. Aby uniknąć krwawienia, należy umieścić sterylną końcówkę wacika na wierzchu miejsca wstrzyknięcia, delikatnie uciskając, aż do całkowitego zamknięcia żyły i braku krwawienia (około 5 minut).
  6. Delikatnie włóż narządy wewnętrzne z powrotem do jamy brzusznej.
  7. Zamknij ścianę brzucha szwem wchłanialnym 4-0. Następnie zamknij skórę niewchłanialnym szwem 4-0.
    UWAGA: Tabletki karprofenu do rozgryzania i żucia stosowano jako pooperacyjny środek przeciwbólowy (1/4 tabletki na BW < 30 g, 1/2 tabletki na BW 30-60 g i 1 tabletka na BW > 60 g) przez trzy dni po zabiegu.

4. analiza qRT-PCR

  1. Ekstrahuj RNA z 50-100 mg tkanki wątroby4,13 za pomocą dostępnego na rynku odczynnika do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  2. Zsyntetyzuj 1pierwszą nić cDNA z całkowitej liczby RNA z losowymi heksamerami i odwrotną transkryptazą M-MLV20,21.
  3. Określ wartości ΔC(t) między genem docelowym a genami referencyjnymi za pomocą jednokolorowego systemu wykrywania PCR w czasie rzeczywistym i zielonego odczynnika supermix SYBR zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami22,23.
  4. Zmierzyć wartości ΔΔC(t) z czterech kontrprób biologicznych i trzech powtórzeń technicznych (n = 12). Ustawić Tm na 60 °C dla wszystkich reakcji. Potwierdź wyniki za pomocą dwóch genów referencyjnych, Rps3 i Rplp0.
  5. Zaprojektuj sekwencje podkładowe w następujący sposób: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' i 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' oraz 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' i 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Wyniki

Wydajność wyciszania genów w wątrobie metodą wewnątrzśledzionową kontrawtryskiwanie AAV8-shRNA do żyły wrotnej
Zapasy wirusowe AAV8 rozcieńczono do stężenia roboczego 2E+12 kopii genomu (gc) na mililitr (gc/mL). Poszczególnym myszom wstrzyknięto 1E+11 gc AAV8-shNS1 lub AAV8-shScr (50 μL) poprzez iniekcję wewnątrzśledzionową lub dożylną do żyły wrotnej. Dwa tygodnie po iniekcji pobrano tkanki wątroby w celu izolacji RNA, 1stsynteza cDNA nici minus oraz analiza qPCR. Wyniki wykazały, że metoda wstrzykiwania doszpienowego pozwoliła na osiągnięcie statystycznie takiej samej wydajności NSKD (20,8% ± 4,4%), jak metoda wstrzykiwania do żyły wrotnej (16,3% ± 3,6%) przy użyciu Rsp3 i Rplp0 jako referencję wewnętrzną (Rycina 2Co więcej, procedurę wstrzykiwania dosplenicznego można było przeprowadzić w ciągu 15 min, niemal bez zgonów spowodowanych samym zabiegiem, podczas gdy metoda wstrzykiwania do żyły wrotnej zazwyczaj wymagała 25–30 min i częstych ćwiczeń, a także wiązała się z wyższym wskaźnikiem śmiertelności (śmiertelność na poziomie ok. 25%–30%).

Odpowiedź zapalna tkanek
Tkanki wątroby pobrano od myszy, którym podano wtryskiwanie do żyły wrotnej lub wtryskiwanie dospleniczne AAV8-shScr (Rysunek 3A) lub AAV8-shNS1 (Rysunek 3B), a następnie porównano je z tkankami myszy kontrolnych (Rysunek 3C). Reakcje zapalne badano za pomocą barwienia H&E4. Wyniki wykazały, że ani AAV8-shScr, ani AAV8-shNS1 nie wywołały istotnych reakcji zapalnych w miąższu wątroby w porównaniu z PBS podanym metodą wtryskiwania dosplenicznego (Spl) lub wtryskiwania do żyły wrotnej (PV) (Rysunek 3A-C).

Projekt plazmidu AV5-siRNA-GFP i protokół iniekcji wirusa AAV8 u myszy; obejmuje analizę qRT-PCR.
Rycina 1: Ilustracje projektu AAV8-shRNA oraz procedury iniekcji wewnątrzśledzionowej. (A) (Góra) Schemat plazmidu AV5-siRNA-GFP zaprojektowanego do produkcji wirusa towarzyszącego adenowirusom serotypu 8 (AAV8) do eksperymentów z wyciszaniem genów in vivo. AV5-siRNA-GFP zawiera sekwencję shRNA sterowaną promotorem CMV oraz EGFP. (Dół) Konstrukcje małych hapinowych RNAi zaprojektowane do celowania w 21-nukleotydowe sekwencje mysiego NS (shNS1) lub w zmodyfikowaną (scrambled) 21-nukleotydową sekwencję (Scr). (B) Schematyczny wykres przebiegu procedury iniekcji AAV8 wewnątrzśledzionowej. (C) Widoki poszczególnych etapów procedury chirurgicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający poziomy mRNA NS po wstrzyknięciach do śledziony (Spl) i żyły odrodzonej (PV); porównanie zabiegów shScr i shNS1.
Rycina 2Wydajność wyciszania ekspresji nukleosteminy (NS) w wątrobie za pomocą AAV8-shRNA poprzez śledzionowy kontrainiekcja do żyły wrotnej. Analizy qRT-PCR ekspresji NS w próbkach wątroby pobranych od myszy 2 tygodnie po wstrzyknięciu doszpaniowym (Spl) lub do żyły wrotnej (PV) AAV8-shScr lub AAV8-shNS1 (1E+11 gc). Wykresy przedstawiają wyniki w odniesieniu do dwóch kontroli wewnętrznych, Rps3 (A) oraz Rplp0 (B). Słupki przedstawiają średnią ± SEM z czterech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy techniczne powtórzenia PCR; *p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza histologiczna wątroby, obrazy mikroskopowe porównujące regiony śledzionowe (Spl) i okołonaczyniowe (PV).
Rysunek 3: Histologia tkanek wątroby po wstrzyknięciu dosplenicznym lub dożylnie do żyły wrotnej PBS, AAV8-shScr lub AAV8-shNS1. Barwienie H&E tkanek wątroby w 2. tygodniu po wstrzyknięciu dosplenicznym (Spl) lub dożylnie do żyły wrotnej (PV) AAV8-shScr (A) lub AAV8-shNS1 (B), w porównaniu do próbek kontrolnych niewstrzykniętych AAV8 (C). Paski skali: 100 µm. Prawe panele przedstawiają powiększone widoki wstawek z lewych paneli. Paski skali: 50 µm. W każdej grupie zbadano od sześciu do dziewięciu przekrojów od dwóch różnych zwierząt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Gen KD poprzez dostarczenie wirusa konstruktu eksprymującego shRNA na tle typu dzikiego24,25 lub konstruktu eksprymującego rekombinazę Cre na tle floksowanym26 jest potężnym sposobem badania funkcji genu in vivo w indukowalny, kontrolowany w czasie sposób. Idealna metoda dostarczania do badań in vivo genów KO/KD powinna zapewnić wysoką skuteczność KO/KD w badanym narządzie, a ponadto sama procedura powinna być technicznie łatwa przy minimalnej śmiertelności około/pooperacyjnej.

W przypadku narządów wewnętrznych, takich jak wątroba, cząsteczki wirusa mogą być wprowadzane przez wstrzyknięcie przez żyłę ogonową27 lub żyłę wrotną28,29 lub przez bezpośrednie wstrzyknięcie do śledziony (wstrzyknięcie dośledzionowe)30,31. Iniekcje do żyły wrotnej i dośledziony wprowadzają do krążenia wrotnego cząsteczki wirusa, które spływają do wątroby przed wejściem do żyły głównej dolnej, a następnie do krążenia płucnego. Natomiast cząsteczki wirusa wprowadzone przez iniekcję do żyły ogonowej omijają krążenie wrotne i trafiają do krążenia płucnego, zanim dotrą do krążenia ogólnoustrojowego. W przypadku narządów, do których dochodzi krążenie wrotne, takich jak wątroba, wstrzyknięcia do żyły wrotnej i dośledziony mają tę zaletę, że dostarczają cząsteczki wirusa bezpośrednio do tych narządów bez ryzyka ich sekwestracji przez płuca lub rozcieńczenia w krążeniu ogólnoustrojowym. W przypadku narządów, które nie otrzymują krążenia wrotnego, takich jak mózg, wstrzyknięcie żyły ogonowej może być bardziej korzystne, aby nie poddawać cząstek wirusa wątrobie przed dotarciem do krążenia płucnego, a następnie krążenia ogólnoustrojowego.

W tym badaniu wstrzyknęliśmy AAV8-shNS1 w dawce 1E+11 gc na zwierzę, co dało lepszą skuteczność KD w porównaniu do 1E+10 gc, ale osiągnęło taki sam efekt KD, jak 5E+11 gc poprzez wstrzyknięcie wewnątrzwrotne (dane nie pokazane). Przy dawce 1E+11 gc, porównując metodę iniekcji do żyły wrotnej i metodę iniekcji dośledzionowej, nie stwierdzono statystycznej różnicy między tymi metodami w ich skuteczności NSKD w wątrobie, osiągając 70%-80% sprawność KD. Efekt genu KD wstrzykiwanego do żyły wrotnej AAV8 w wątrobie może trwać do sześciu tygodniw sposób zależny od konstruktu. Warto zauważyć, że powikłania związane z zabiegiem, takie jak krwawienie wywołane operacją i zrost sieci / otrzewnej, a także trudności techniczne, są znacznie rzadsze i niższe w przypadku metody iniekcji dośledzionowej w porównaniu z metodą iniekcji żyły wrotnej. W rezultacie iniekcja do żyły wrotnej jest wykonywana jednorazowo, podczas gdy iniekcja dośledzionowa może być wykonywana wielokrotnie32. Wreszcie, reakcje zapalne były niewielkie lub żadne w miąższu wątroby otrzymującej wstrzyknięcie do żyły wrotnej lub wstrzyknięcie dośledzionowe AAV8-shScr lub AAV8-NS1. Ostatnie odkrycie nie wyklucza jednak możliwości, że ekstremalnie wysokie miana AAV mogą nadal wywoływać reakcje zapalne, które zakłócają wyniki eksperymentalne. W związku z tym optymalna dawka AAV musi być empirycznie określona i zrównoważona między wydajnością KD a reakcją indukowaną przez AAV8 i może się różnić w zależności od różnych docelowych genów i/lub sekwencji. Podsumowując, wyniki te pokazują, że dośledzionowe wstrzyknięcie AAV8-shRNA jest wysoce wydajną, stosunkowo bezpieczną i prostą metodą uzyskania genu KD in vivo w wątrobie.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Individual Investigator Research Award (RP200081) dla RYT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry wirówkowe AmiconMilliporeSigmaUFC9100Szybka ultrafiltracja
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plazmid
Właściwy DH5&alfa; bakterie Invitrogen#18265-017Chemicznie kompetentny szczep do klonowania 
HpaI New England BiolabsR0105Enzym restrykcyjny
odczynnik do transfekcji iMFectin GenDepotI7100-101
Odwrotna transkryptaza M-MLV Polimeraza DNA zależna od RNAPromegaM1708
Jednokolorowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym MyiQ Zestaw Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega bez endotoksyn BioteckD6915-03Przygotowanie midi plazmidowego DNA 
Losowe heksamery Invitrogen48190-011
Supermix SYBR zielony odczynnik Bio-Rad1708882Aplikacje PCR w czasie rzeczywistym
Ligaza DNA T4OdczynnikM1801
 Life Technologies15596-018Izolacja wysokiej jakości całkowitego RNA
XhoINew England BiolabsR0146Enzym restrykcyjny
  TRIzol Promega

Bibliografia

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie AAV8ekspresja gen w w w trobiewtryskiwanie do y y wrotnejwyciszenie nukleosteminyw troba myszyinterferencja RNAregeneracja w troby

Powiązane artykuły