Artykuł metodologiczny

Badanie różnicowania mysich limfocytów T CD4 za pomocą ablacji genów za pośrednictwem kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR-Cas9

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67380

⸱

20 czerwca 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy wysoce elastyczne podejście do wykorzystania ablacji genów za pośrednictwem kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR-Cas9 w mysich naiwnych limfocytach T CD4 do zbadania funkcji genu w różnicowaniu limfocytów T CD4.

Streszczenie

Powszechna dostępność technologii CRISPR)-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 sprawiła, że celowanie w geny w komórkach pierwotnych stało się rutynową metodą oceny funkcji genów w limfocytach T. Biorąc pod uwagę koszt i ograniczoną dostępność szczepów myszy z nokautem (KO), testowanie wstępnych hipotez dotyczących funkcji genów w limfocytach T może być zaporowe przy użyciu modeli zwierzęcych ukierunkowanych na geny. Jednak korzystając z dostępnych na rynku zasobów, w tym wstępnie zaprojektowanych przewodników RNA (gRNA), naukowcy mogą wygodnie generować ukierunkowane na geny naiwne limfocyty T, które można wykorzystać do badań nad aktywacją i różnicowaniem limfocytów T.

Tutaj przedstawiamy protokół użycia dostarczanych przez nukleofekcję kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP) CRISPR-Cas9 do efektywnego generowania mysich naiwnych limfocytów T CD4 o genach KO, które mogą być użyte do oceny funkcji genu w różnicowaniu limfocytów T CD4, in vitro. Izolacja naiwnych limfocytów T CD4 z mysich wtórnych narządów limfatycznych, a następnie nukleofekcja kompleksami Cas9-gRNA zapewnia, że gen KO jest inicjowany przed dalszą aktywacją limfocytów T, oferując strategiczną przewagę nad dostarczaniem gRNA za pośrednictwem retrowirusa, które zwykle wymaga wstępnej aktywacji limfocytów T, zapobiegając ocenie efektów w naiwnych limfocytach T. Co więcej, ta metoda oparta na nukleofekcji omija potencjalne problemy rozwojowe związane ze zwierzętami z genem KO.

Po dostarczeniu Cas9-gRNA, opisujemy protokoły badania różnicowania limfocytów T CD4 na linie Th1, Th2, Th17 i Treg za pomocą polaryzacji in vitro. Ponadto protokół ten można dostosować do wykorzystania ukierunkowanych na geny limfocytów T CD4 lub CD8 do wielu dalszych zastosowań, w tym innych badań aktywacji limfocytów T in vitro i adoptywnych badań transferowych in vivo. Zastosowanie metod CRISPR-Cas9 usprawniło naszą zdolność do oceny funkcji genów w limfocytach T i pozwala na rutynowe KO wielu genów będących przedmiotem zainteresowania, uwalniając badaczy od ograniczeń związanych z badaniem genów KO u zwierząt.

Wprowadzenie

Użycie technologii opartych na CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) zmieniło naszą zdolność do manipulowania sekwencjami genomowego DNA, znacznie zwiększając naszą zdolność do badania funkcji genów w niezliczonych systemach biologicznych. W odniesieniu do limfocytów T CD4 pojawiły się metody wykorzystujące kompleksy rybonukleoproteiny (RNP) CRISPR-Cas9, ułatwiające skuteczny nokaut genów (KO) w pierwotnych naiwnych limfocytach T, które można wykorzystać do badań in vitro i in vivo1,2,3,4. Identyfikacja nowych przypuszczalnych genów regulujących różnicowanie limfocytów T CD4 jest często napędzana analizami transkryptomicznymi i epigenomicznymi, generując nowe cele, dla których może być niewiele lub trudno jest uzyskać zasoby do zbadania, szczególnie jeśli gen wpływa na wiele tkanek i może wymagać oceny przy użyciu myszy ukierunkowanych na gen warunkowy. Celowanie w geny poprzez transdukcję retrowirusową gRNAs5,6 zostało wykorzystane do oceny funkcji genów w limfocytach T, ale wymaga aktywacji limfocytów T w przypadku infekcji retrowirusowej i nie może być używane do celowania w geny w naiwnych limfocytach T. CRISPR-Cas9 dostarczany przez nukleofekcję w naiwnych limfocytach T stanowi stosunkowo niedrogie i szybkie alternatywne narzędzie do walidacji i badania nowych genów będących przedmiotem zainteresowania przed zainwestowaniem w czasochłonne i kosztowne modele mysie.

W naszym protokole opisanym tutaj, edycja genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 odbywa się za pomocą rekombinowanego białka Cas9 skompleksowanego z cząsteczkami przewodnika RNA (gRNA), które są dostarczane do naiwnych limfocytów T CD4 poprzez nukleofekcję. gRNA składa się z dwóch odrębnych składników, transaktywującego CRISPR RNA (tracrRNA) i CRISPR RNA (crRNA). Funkcjonalnie sekwencje pochodzące z tracrRNA ułatwiają asocjację gRNA z Cas9, podczas gdy sekwencje crRNA zawierają swoistość dla docelowych regionów DNA będących przedmiotem zainteresowania. Kompleksy Cas9-gRNA pośredniczą w ukierunkowanych pęknięciach dwuniciowego DNA (dsDNA), przy czym gRNA pośredniczą w specyficzności sekwencji aktywności endonukleazy Cas97,8. Rozszczepienie dsDNA za pośrednictwem Cas9 prowadzi do inaktywacji genów poprzez generowanie mutacji indel po niehomologicznym połączeniu końców w komórkach docelowych9. W tym protokole zalecamy stosowanie wielu gRNA ukierunkowanych na geny będące przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić silne KO w naiwnych limfocytach T CD4.

Helper Limfocyty T CD4 są kluczowymi graczami w układzie odpornościowym, kierując odpowiedziami immunologicznymi poprzez produkcję różnych cytokin, które modulują funkcję wielu typów komórek odpornościowych. Po stymulacji przez receptor limfocytów T (TCR) w obecności specyficznych cytokin, naiwne limfocyty T CD4 mogą różnicować się w odrębne linie limfocytów T pomocniczych (Th) CD4, w tym Th1, Th2, Th17 i regulatorowych limfocytów T (Treg)10,11,12. Definiowanie tych odrębnych linii limfocytów T CD4 polega na wyrażaniu specyficznych czynników transkrypcyjnych (TF) i cytokin definiujących linię (TF) i cytokin (Figura 1). Różnicowanie limfocytów T CD4 można modelować za pomocą polaryzacji in vitro13,14,15, przy użyciu naiwnych limfocytów T CD4 aktywowanych przez TCR w obecności cytokin promujących linię i przeciwciał blokujących, które zapobiegają niewłaściwej adopcji linii.

Połączenie celowania genu CRISPR-Cas9 w naiwnych limfocytach T CD4 z polaryzacją limfocytów T CD4 in vitro oferuje solidny system do oceny funkcji genów w tych komórkach (Rysunek 2). Biorąc pod uwagę powszechną dostępność odczynników do oceny różnicowania CD4 za pomocą cytometrii przepływowej, kluczowe aspekty różnicowania limfocytów T CD4, w tym ekspresję TF i produkcję cytokin, można łatwo zbadać przy użyciu opisanych tutaj protokołów. Identyfikacja nowych genów regulujących funkcję limfocytów T CD4 zwiększa naszą wiedzę na temat tych komórek, a metody CRISPR-Cas9 w połączeniu z polaryzacją in vitro oferują solidną modalność oceny funkcji genów przed zaangażowaniem się w mysie modele genu KO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Do wszystkich opisanych tutaj procedur użyliśmy myszy C57/BL6J typu dzikiego (WT). Myszy były utrzymywane i leczone w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) zgodnie z wytycznymi NIAID (protokół LISB-22E) oraz komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania w NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. Uwagi przed rozpoczęciem

  1. Wybór odczynników gRNA
    UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać wstępnie zaprojektowane odczynniki gRNA ukierunkowane na genom myszy używany w tym protokole.
    1. Wyszukaj interesujący Cię gen (Tabela materiałów, Pożądane crRNA) i wybierz trzy najwyżej uszeregowane wstępnie zaprojektowane crRNA (format 2 nmol). Ponadto należy uzyskać crRNA kontroli ujemnej do stosowania równolegle (tabela materiałów).
      UWAGA: Tworzenie funkcjonalnych gRNA wymaga dupleksowania crRNA za pomocą tracrRNA; uzyskać odczynnik tracrRNA i postępować zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3.
    2. Projektowanie niestandardowych ukierunkowanych sekwencji gRNA.
      UWAGA: Projektowanie niestandardowych ukierunkowanych sekwencji gRNA wykracza poza zakres tego protokołu, ale można je wykonać za pomocą publicznie dostępnych narzędzi, takich jak CRISPick (Table of Materials).
  2. , media i urządzenia
    UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, należy używać zimnych (4 °C) i odczynników.
    1. Przed rozpoczęciem procedury przygotować bufor MACS, bufor FACS, 0,5% bufor Triton X-100, 1x bufor przepuszczalny, kompletne podłoże RPMI i kompletne podłoże IMDM (tabela materiałów) przed rozpoczęciem procedury i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przed rozpoczęciem tej procedury należy zaopatrzyć się w naiwne zestawy do izolacji limfocytów T CD4 i mikrokulek anty-FITC (tabela materiałów).
    3. Przed rozpoczęciem nukleofekcji (sekcja 4) należy podgrzać (37 °C) 5 ml kompletnej pożywki IMDM i przygotować co najmniej 10 ml kompletnej pożywki IMDM uzupełnionej IL-7 w stężeniu 5 ng/μl ogrzanej do 37 °C (tabela materiałów). Dostosuj objętość wstępnie podgrzanej pożywki zgodnie z potrzebami, aby uwzględnić dodanie 125 μl na próbkę po nukleofekcji. W razie potrzeby dostosować objętość pełnego IMDM zawierającego IL-7, w oparciu o liczbę komórek jądrkowanych (sekcja 4).
    4. Przed rozpoczęciem izolacji komórek prezentujących antygen (APC) należy przygotować odczynnik mitomycyny C, dodając 4 ml sterylnegoH2Odo fiolki 2 mg mitomycyny C (stężenie podstawowe 0,5 mg/ml).
      UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w kapturze do hodowli tkanek i stosuj sterylne techniki aseptyki.

2. Naiwna izolacja limfocytów T CD4

UWAGA: Naiwne limfocyty T CD4 mogą być izolowane za pomocą izolacji magnetycznej lub poprzez sortowanie komórek. Czystość uzyskana z izolacji magnetycznej wynosi zwykle 97%, a żywotność komórek jest bardzo wysoka, podczas gdy sortowanie elektroniczne może poprawić czystość komórek kosztem żywotności komórek. Opisany tutaj protokół będzie wykorzystywał izolację magnetyczną, ale można go dostosować do dowolnego scenariusza. Upewnij się, że kolumny LS są odpowiednio przygotowane (Tabela materiałów).

  1. Odizoluj śledzionę i węzły chłonne (pachwinowe, ramienne, osiowe i szyjne) od myszy (tutaj używane myszy WT C57BL / 6J).
  2. Umieść sito o średnicy 70 μm w naczyniu o średnicy 60 mm z 5 ml kompletnego RPMI (Tabela Materiałów) dla każdej przetwarzanej tkanki. Przetwarzaj węzły chłonne i śledzionę w różnych naczyniach, aby zwiększyć wydajność. Delikatnie przetrzyj chusteczki przez filtr za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 3 ml. Przepłukać filtr 1-3 ml pożywki i przenieść zawiesiny jednokomórkowe do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
  3. W razie potrzeby powtórz krok 2.2 dla dodatkowych węzłów chłonnych i tkanek śledziony.
  4. Odwirować zawiesiny jednokomórkowe o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj się do policzenia komórek w następujący sposób.
    1. W przypadku próbek śledziony odessać supernatant, delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy ACK, inkubować przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej, następnie dodać 2 ml całkowitego RPMI, odwirować, ponownie zawiesić w 5 ml pełnego RPMI i policzyć komórki.
    2. W przypadku komórek węzłów chłonnych odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżego kompletnego RPMI i policzyć komórki.
  6. Aby wprowadzić dane do naiwnego zestawu do izolacji CD4, wymieszaj splenocyty z komórkami węzłów chłonnych, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek do izolacji.
    UWAGA: Zazwyczaj 1 × 108 komórek węzłów chłonnych i śledziony myszy WT-B6 daje 2-8 × 106 naiwnych limfocytów T CD4.
  7. Odwirować połączone komórki śledziony i węzłów chłonnych w ilości 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości buforu MACS (tabela materiałów), jak wskazano w protokole producenta (nieprawidłowo wyposażony zestaw do izolacji limfocytów T CD4).
  8. Dokładnie postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wyizolować naiwne limfocyty T CD4 przez selekcję negatywną (tabela materiałów) przy użyciu koktajlu przeciwciał biotynowych naiwnych limfocytów T CD4 +, mikrogranulek antybiotyny i mikrokulek CD44; użyj kolumn LS do tej izolacji i zbierz komórki w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
  9. Po wyizolowaniu odwirować komórki pod ciśnieniem 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml kompletnej pożywki RPMI i policzyć komórki.
  10. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do rozpoczęcia nukleofekcji.

3. Tworzenie kompleksu Cas9-gRNA

UWAGA: Przygotuj zapasy crRNA dla kontroli negatywnej i specyficzne dla genów. Przedstawiamy użycie jednego unikalnego crRNA dla warunków kontroli negatywnej i trzech unikalnych crRNA dla warunków ukierunkowanych na geny. Jednoczesne użycie trzech odrębnych crRNA zapewnia KO interesujących nas genów.

  1. Zawiesić crRNA i tracrRNA do stężeń podstawowych 100 μM za pomocą buforu dupleksowego (tabela materiałów). Odpowiada to 10 μl buforu na 1 nmol RNA.
  2. Połącz poszczególne crRNA z tracrRNA w stosunku 1:1 w sterylnych probówkach do PCR i wymieszaj przez pipetowanie. Podgrzewać do 95 °C przez 5 minut w termocyklerze. Następnie pozwól kompleksom ostygnąć do temperatury RT na stole przez co najmniej 10 minut.
    UWAGA: dupleksy crRNA/tracrRNA są od tego momentu określane jako gRNA. Kompleksy są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy, jeśli są przechowywane w temperaturze -20 °C. Zwykle wytwarzamy 6 μl gRNA (3 μl crRNA + 3 μl tracrRNA) na serię, zapewniając wystarczającą ilość materiału na około pięć próbek (1 μl / próbkę).
  3. W przypadku gRNA ukierunkowanych na geny: W sterylnych probówkach do PCR dodaj 3 μl gRNA (po 1 μl z trzech unikalnych gRNA na cel), 1 μl białka Cas9 i 1 μl buforu Duplex (łącznie 5 μl na próbkę). Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i upewnić się, że cały materiał znajduje się na dnie probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zsynchronizuj czas tego kroku z nukleofekcją (kroki 4.1-4.2).
  4. W przypadku gRNA kontroli ujemnej: W sterylnych probówkach do PCR dodać 1 μl gRNA, 1 μl białka Cas9 i 3 μl buforu Duplex (łącznie 5 μl na próbkę). Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i upewnić się, że cały materiał znajduje się na dnie probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ponownie zsynchronizuj czas tego kroku z nukleofekcją (kroki 4.1-4.2).
    UWAGA: Użycie 50 pmol gRNA do kontroli negatywnej (w porównaniu z 3 x 50 pmol do testu) jest bardziej opłacalne i nie ma wpływu na wyniki.

4. Nucleofekcja - ablacja genów za pośrednictwem Cas9-gRNA

  1. Odwirować 1-8 × 106 oczyszczonych limfocytów T w ilości 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C na próbkę nukleofekcji. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu.
  2. Zawiesić komórki w 20 μl buforu P3 (16,4 μl P3 + 3,6 μl suplementu na próbkę; Nucleofector Kit, tabela materiałów) i przenieść zawiesinę do probówek PCR zawierających kompleksy Cas9-gRNA. Wymieszaj i przenieś do niezależnych dołków 16-dołkowego nukleokuwety (zestaw Nucleofector , tabela materiałów). Upewnij się, że podczas przenoszenia komórek do kuwety nie utworzyły się pęcherzyki, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na wydajność nukleofekcji. Uderz kuwetą o powierzchnię roboczą, aby upewnić się, że cały materiał znajduje się na dnie każdej studzienki i jest wolny od pęcherzyków.
  3. Wykonaj nukleofekcję za pomocą programu DN100 przywoływanego nukleofektora (tabela materiałów). Natychmiast dodać 125 μl wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki IMDM do dołków nukleokowitowych i przenieść komórki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przepłukać każdą studzienkę jeszcze raz 125 μl wstępnie podgrzanego podłoża, aby zapewnić zebranie wszystkich komórek.
  4. Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut, 4 °C, usunąć wszystkie podłoża i ponownie zawiesić w 200 μl ogrzanej kompletnej pożywki IMDM + 5 ng/ml IL-7 (tabela materiałów).
  5. Przenieść 200 μl komórek na płytkę hodowlaną i dodać podgrzane kompletne podłoże IMDM + 5 ng/ml IL-7, aby uzyskać ostateczną pożądaną objętość zgodnie z rozmiarem płytki w następujący sposób: 1-2 × 106 komórek na basenie na 48-dołkowej płytce (1 ml pożywki na studzienkę), 2-4 × 106 komórek na basenik na 24-dołkowej płytce (1,5 ml pożywki na studzienkę) objętość, 4-6 × 106 komórek na basenie na płytce 12-dołkowej (2 ml pożywki na studzienkę) i 6-10 × 106 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej (4 ml pożywki na studzienkę). Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.
    UWAGA: W zależności od obrotu białka i dalszego testu, zoptymalizuj ten okres hodowli. Znaleźliśmy optymalny okres odpoczynku wynoszący 3 dni, ale można go dostosować w oparciu o gen docelowy do od 1 do 7 dni w tych warunkach.
  6. Po hodowli w kompletnych pożywkach IMDM + 5 ng/ml IL-7, ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie i zebrać je do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml kompletnej pożywki RPMI.
  7. Policz komórki, aby określić liczbę żywych, naiwnych limfocytów T CD4 odpowiadających interesującym komórkom z jądrem gRNA.
    UWAGA: W procesie nukleofekcji spodziewaj się utraty ~ 50% komórek wejściowych w trakcie tego protokołu i odpowiednio dostosuj liczbę używanych naiwnych limfocytów T CD4. Ponadto w tym momencie możesz przetestować skuteczność celowania genu w naiwnych limfocytach T CD4 przy użyciu różnych technik (cytometria przepływowa, western blot, qPCR lub test T7EI).

5. Izolacja komórek prezentujących antygen (APC)

UWAGA: Upewnij się, że przygotowano odczynnik mitomycyny, który będzie używany do leczenia APC po izolacji (Tabela materiałów). Przed rozpoczęciem należy zapoznać się z protokołem producenta dotyczącym mikrokulek anty-FITC i upewnić się, że kolumny LS są odpowiednio przygotowane (Tabela materiałów).

  1. Wyizoluj śledziony od myszy WT przeznaczonych do izolacji APC.
  2. Wykonać zawiesiny jednokomórkowe, jak opisano powyżej (2.2, 2.5.1)-lizy erytrocytów z buforem do lizy ACK, ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pełnego RPMI (4 °C) i policzyć komórki.
    UWAGA: Po izolacji APC spodziewaj się uzyskać około połowy liczby komórek wejściowych, na przykład 1 × 108 wejściowych splenocytów da ~ 40-50 × 106 APC. Przygotuj żądaną liczbę splenocytów do izolacji.
  3. Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 800 μl buforu MACS (tabela materiałów).
  4. Dodać po 4 μl przeciwciał anty-CD4 i anty-CD8 sprzężonych z FITC do splenocytów. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  5. Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, ponownie zawiesić ogniwa w zalecanej objętości bufora MACS i dodać odpowiednią ilość mikrogranulek anty-FITC (Tabela Materiałów).
  6. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu MACS i przepuścić komórki przez przygotowaną kolumnę LS zgodnie z opisem w protokole producenta, zbierając komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  7. Odwirować komórki w temperaturze 600 × g przez 5 minut, 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2,7 ml sterylnego 1x PBS.
    UWAGA: Transportery opancerzone mogą słabo pluskać; Użyj zwiększonej prędkości do wirowania.
  8. Dodać 300 μl roztworu mitomycyny C do komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut lub przez 45 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze.
  9. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 600 × g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C, i przemyć je 10 ml sterylnego 1x PBS. Użyj próżni, aby usunąć jak najwięcej supernatantu. Powtórz pranie 2x.
  10. Ponownie odwirować komórki w temperaturze 600 × g przez 5 minut, 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml kompletnej pożywki RPMI (4 °C). Policz komórki. Przechowywać APC w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia różnicowania limfocytów T CD4.

6. Różnicowanie limfocytów T CD4

UWAGA: Ten protokół jest ustawiony na hodowlę komórek w formacie płytki 48-dołkowej-2 × 105 naiwne CD4 + 1 × 106 APC na studzienkę w stosunku 1:5. Komórki są hodowane w kompletnych pożywkach IMDM. Tutaj zapewnimy warunki do różnicowania limfocytów T Th1, Th2, Th17 i Treg CD4; Jednak indywidualne warunki pochodzenia mogą być wybrane w zależności od tego, na czym skupia się użytkownik.

  1. Określ liczbę komórek w 48-dołkowej płytce, która ma być użyta, i oblicz liczbę komórek potrzebnych dla każdego typu komórek.
    UWAGA: Na przykład 10 studzienek wymagałoby 2 × 106 naiwnych CD4 i 10 × 106 APC, aby utrzymać stosunek 1:5. Jeśli pozwala na to liczba komórek, należy obliczyć wystarczającą liczbę komórek dla jednego dodatkowego dołka, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania podczas powlekania.
  2. Wymieszać ze sobą żądaną liczbę naiwnych CD4 i APC w stosunku 1:5, odwirować komórki w stężeniu 600 × g przez 5 minut, 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl kompletnej pożywki IMDM na studzienkę (np. komórki odpowiadające 10 studzienkom w 5 ml pożywki).
  3. Umieszczać komórki w odstępach 500 μl do studzienek na płytce 48-dołkowej, upewniając się, że każda studzienka zawiera 2 ×10 5 naiwnych CD4 + 1 × 106 APC.
  4. Dla pożądanych warunków różnicowania limfocytów T CD4 należy przygotować mieszaniny 2x cytokina + przeciwciała w pełnym IMDM, jak opisano w tabeli 1. Dodać 500 μL mieszanki 2x do wcześniej posianych przyrostów 500 μl komórek, aby uzyskać końcowe stężenia odczynników 1x,
    UWAGA: Te przykłady opierają się na sporządzeniu 2,5 ml preparatów 2x, co wystarcza na pięć dołków na każdy stan. Ponownie, jeśli pozwalają na to ilości odczynników, należy dodać jeden dodatkowy przyrost 2x mieszanki, aby uwzględnić błąd pipetowania.
  5. Dodaj 500 μL 2x cytokiny + pożywki przeciwciała do 500 μl studzienek zawierających komórki CD4 / APC, aby uzyskać końcowe stężenie odczynników przy 1x.
  6. Umieścić 48-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Hoduj komórki przez 72 godziny, aby umożliwić zakończenie polaryzacji CD4.
    UWAGA: Zbadaj płytkę po okresie hodowli, aby zapewnić solidny wzrost. Pożywka po inkubacji powinna mieć pomarańczowy kolor, z żółtym podłożem wskazującym na potencjalny przerost komórek.

7. Ocena wpływu ablacji genów na różnicowanie limfocytów T CD4

UWAGA: Dla wszystkich etapów barwienia, przygotuj główną mieszankę przeciwciał dodanych w odpowiednim rozcieńczeniu do wymaganego buforu do barwienia. Na próbkę stosuje się objętość 50 μl koktajlu przeciwciało/bufor. Dostosuj specyficzne przeciwciała użyte na podstawie eksperymentu. Użytkownicy powinni wybrać panele przeciwciał odpowiednie dla ich konkretnych eksperymentów; Poniżej przedstawiamy szablon, za pomocą którego można podejść do tego w kontekście genów, do których jest tutaj skierowany.

  1. Po różnicowaniu CD4 ostrożnie usunąć 600 μl supernatantu, a następnie ponownie zawiesić komórki w każdym dołku przez pipetowanie.
  2. Usuń 200 μl komórek z każdej studzienki i dodaj je do oznakowanej 96-dołkowej płytki w celu barwienia czynnikiem transkrypcyjnym. Próbki należy otopić przez wirowanie z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, strzepnąć skonstytut i przystąpić do barwienia powierzchniowego (krok 7.5).
  3. W celu analizy cytokin należy ponownie stymulować pozostałe 200 μl komórek za pomocą PMA (50 ng / ml), jonomycyny (500 ng / ml) i Golgi Stop (rozcieńczenie 1/2,000) w pełnym IMDM. Dodać 200 μl mieszanki 2x restymulacji do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 godziny
    UWAGA: W płytce 48-dołkowej powinno pozostać 200 μl; w związku z tym dodanie 200 μL 2x mieszanki PMA (2x, 100 ng/mL), jonomycyny (2x, 1 μg/ml) i Golgi Stop (2x, 1/1,000) stworzy końcowe stężenie 1x (Tabela materiałów).
  4. W międzyczasie rozpocznij barwienie czynnikiem transkrypcyjnym. Przeprowadzić barwienie antygenu powierzchniowego poprzez ponowne zawieszenie komórek w 50 μl buforu FACS zawierającego pożądane przeciwciała sprzężone z fluorochromem na próbkę (Tabela 2). Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 min.
  5. Dodaj 150 μl buforu FACS do każdej studzienki, aby zmyć bufor barwiący. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Strząsnąć supernatant. Powtórz w sumie dwa prania.
  6. Utrwalić komórki za pomocą 100 μl roztworu utrwalającego Foxp3 (tabela materiałów) w ciemności w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
  7. Po 25 minutach dodaj 100 μl buforu FACS do każdej studzienki, aby zmyć utrwalacz. Odwirować płytkę o sile 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i strzepnąć sklamr stężenie nad osadem. Powtórz w sumie dwa prania.
  8. Przeprowadzić barwienie wewnątrzkomórkowe poprzez ponowne zawieszenie komórek w 50 μl 1x buforu permeabilizacji Foxp3 zawierającego bezpośrednio sprzężone przeciwciała specyficzne dla czynnika transkrypcyjnego na próbkę (Tabela 2) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
  9. Po zakończeniu barwienia wewnątrzkomórkowego dodaj 100 μl buforu FACS do każdej studzienki. Odwirować płytkę o sile 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i strzepnąć sklamr stężenie nad osadem. Powtórz w sumie dwa prania. Zawiesić komórki w końcowej objętości 200 ml do cytometrii przepływowej.
  10. Po ponownej stymulacji PMA/jonomycyny/Golgi Stop, ponownie zawieś komórki przez pipetowanie i przenieś 400 μl każdej próbki cytokin do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Próbki należy osadzać w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Ponownie zawiesić próbki komórek w 100 μl buforu FACS i przenieść je na 96-dołkową płytkę w celu zabarwienia powierzchni. Ponownie zagnieździć próbki, wirując z prędkością 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, strzepnąć supernatant.
  11. Przygotować koktajl barwienia powierzchni z buforem FACS zawierającym przeciwciała fluorescencyjne skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym (Tabela 2). Zawiesić komórki w 50 μl buforu barwiącego na próbkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  12. Dodaj 150 μl buforu FACS do każdej studzienki, aby zmyć bufor barwiący. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Strząsnąć supernatant. Powtórz w sumie dwa prania.
  13. Utrwalić komórki w 100 μl 4% PFA (tabela materiałów) w ciemności w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
  14. Dodaj 100 μl buforu FACS do każdej studzienki, aby zmyć utrwalacz. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Strząsnąć supernatant. Powtórz w sumie dwa prania.
  15. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych należy przeprowadzić poprzez ponowne zawieszenie komórek w 50 μl przeciwciała antycytokinowego zawierającego 0,5% buforu barwiącego Triton X-100 na próbkę (Tabela 2) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
  16. Po zakończeniu barwienia wewnątrzkomórkowego dodaj 100 μl buforu FACS do każdej studzienki. Odwirować płytkę o sile 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i strzepnąć sklamr stężenie nad osadem. Powtórz w sumie dwa prania. Zawiesić komórki w końcowej objętości 200 ml do cytometrii przepływowej.
  17. Analizować czynnik transkrypcyjny i próbki barwione cytokinami za pomocą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Oczekiwane profile cytometrii przepływowej z przedstawionych paneli barwiących zostaną pokazane w sekcji reprezentatywnych wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby potwierdzić, że uzyskano czystą populację naiwnych limfocytów T CD4 przy użyciu naszego protokołu (sekcja 2), użyliśmy cytometrii przepływowej do identyfikacji tych komórek przed i po izolacji magnetycznej. Korzystając z naszego podejścia, uzyskaliśmy wysoce czystą populację żywych naiwnych limfocytów T CD4 + TCRb + CD25-CD44-CD62L + po izolacji (Figura 3A). Ponadto, aby potwierdzić, że kompleksy Cas9-gRNA zostały pomyślnie za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Integracja protokołów dostarczania kompleksów CRISPR-Cas9 do naiwnych limfocytów T CD4 z metodami badania różnicowania limfocytów T CD4 zapewnia solidne narzędzie do badania nowych genów regulujących biologię limfocytów T CD4. Tutaj przedstawiamy obszerny przewodnik dotyczący korzystania z dostępnych na rynku odczynników Cas9 i gRNA, które są proste w obsłudze. Dostarczanie kompleksów Cas9-gRNA za pośrednictwem nukleofekcji do naiwnych limfocytów T CD4 zapewnia wysoce wydajną edycję genów, ułatwiając prawie całkowity nok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program NIAID, NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
16% paraformaldehyd,Mikroskopia elektronowa PFA Sciences15710Rozcieńczyć PBS, aby uzyskać 4% roztwór utrwalający PFA
1x bufor eBioscience (1x bufor permeabilizacyjny)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Użyj buforu permeabilizacyjnego z zestawu, aby przygotować 1x roztwór
1x PBS, pH = 7,4Jakość Biologiczny114-058-101
2-merkaptoetanol (1000x)Gibco21985-023
Jednostka rdzeniowa 4D NucleofectorLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X JednostkaLonzaAAF-1003X
Szalka 60 mmFalcon353002
70 µ m Sitko z siatki nylonowejFisherbrand22363548
ACK Bufor lizującyGibcoA10492-01
Amaxa P3 Zestaw komórek pierwotnych 4D-Nucleofector X LonzaV4XP-3032Ten zestaw zawiera: Roztwór komórek pierwotnych P3, suplement 1 i 16-dołkowe paski nukleokulowe
anty-FITCMiltenyi Biotec130-048-701Postępuj zgodnie z protokołem mikrokulek Miltenyi Anti-FITC
anty-mysie CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1patrz Tabela 1 dla stężenia zapasowego
anty-mysie CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1patrz Tabela 1 dla stężenia
zapasowego anty-mysiego IFNγ (XMG1.2)bioXcellBE0055patrz Tabela 1 dla stężenia zapasowego
anty-mysiego IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051patrz Tabela 1 dla stężenia zapasowego
anty-mysiego IL-4 (11B11)bioXcellBE0045patrz Tabela 1 dla stężenia zapasowego
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
Albumina surowicy bydlęcej, BSASigma Life ScienceA3059
Cas9 enzymIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10mg/mL) - zawiera sekwencję lokalizacji jądrowej
Kompletny IMDM + IL-7 MediaKompletny IMDM z 5 ng / ml IL-7
Complete IMDMMedia IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-glutamina, 1% Pen/Strep, 0,1% BME
Complete RPMI MediaRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-glutamina, 1% Pen/Strep, 0,1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
Pożądane crRNA IDTUżywany wstępnie zaprojektowany ze strony internetowej IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Zestaw do barwienia czynnikiem transkrypcyjnymThermo Fisher Scientific00-5523-00Zestaw zawiera trzy odczynniki: Koncentrat utrwalający/przepuszczalny (4x), Rozcieńczalnik utrwalający/przepuszczalny i Bufor permeabilizacyjny (10x)
Bufor1x PBS, 1% FBS, 1 mM
EDTA Płodowa surowica bydlęca (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Podgrzewać dezaktywować przed użyciem (podgrzać do 56° C przez 45 minut)
FITC anty-mysie CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 rozcieńczenie (stężenie podstawowe 0,5 mg/mL)
FITC anty-mysie CD8 i alfa; (53-6,7)Biolegend100706Rozcieńczenie 1/200 (stężenie podstawowe 0,5 mg/ml)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 rozcieńczenie
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Sól wapniowa jonomycyny ze Streptomyces conglobatus (1 mg/ml)Sigma Aldrich10634Zalecane stężenie końcowe 500 ng/ml
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
Bufor1x PBS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, filtr sterylizowany
Mitomycyna C (0,5 mg / ml)Millipore SigmaM4287-2MG 
Mysz Naï ve Zestaw do izolacji komórek T CD4Miltenyi Biotec130-104-453Postępuj zgodnie z instrukcjami Miltenyi Naï ve Protokół izolacji limfocytów T CD4. Ten zestaw zawiera Naï ve CD4 + T Cell Biotyna Przeciwciało Koktajl, Mikrokulki anty-Biotyny i Mikrogranulki CD44
Kontrola negatywna crRNAIDT1072544alternatywa dla projektowania własnej kontroli negatywnej
nukleaz Duplex BufferIDT1072570
Paski probówki PCRUSA Scientific1402-2700
Penicylina StreptomycynaGibco15140-023
12-mirystynian 13-octan forbolu, PMA (100 &mikro; g / mL)Sigma AldrichP8139Zalecane stężenie końcowe 50 ng / ml
ProSeries Wysokowydajne probówki wirówkowe 15 mlAlkali ScientificPS560015 ml stożkowe probówki
rekombinowane ludzkie (h) IL-2Peprotech200-02patrz tabela 1 dla stężenia zapasów
rekombinowany ludzki TGF-b1 (pochodny HEK293)Peprotech100-21patrz tabela 1 dla zapasów stężenie
rekombinowana mysia IL-12p70Peprotech210-12patrz Tabela 1 dla stężenia wyjściowego
rekombinowana mysia IL-4Peprotech214-14patrz Tabela 1 dla stężenia zapasów
rekombinowana mysia IL-6Peprotech216-16patrz Tabela 1 dla stężenia zapasów
rekombinowana mysia IL-7Peprotech217-17Przygotować w stężeniu 100 ng/ml
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
Thermal CyclerApplied Biosystems4375786Używamy tego modelu termocyklera, jednak każdy podobny sprzęt będzie dobrze działał w tym protokole
tracrRNA Atto550 oznaczone IDT1075928Umożliwia detekcję kompleksów Cas9-gRNA po nucelefekcji przy użyciu fluorescencji Atto550 jako odczytu. Zalecamy ten odczynnik, jeśli to możliwe. 
Triton-X1x PBS, 0,5% TritonX-100, 0,1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
nieznakowany tracrRNA IDT1072534Bardziej opłacalna opcja tracrRNA, ale nie pozwala na ocenę skuteczności nucelofekcji kompleksów Cas9-gRNA
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305Używamy tego modelu termocyklera, jednak każdy podobny sprzęt sprawdzi się w tym protokole
FACS MACS Bez Bufor

Bibliografia

  1. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  2. Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncultured naive mouse T cells for in vivo studies. J Immunol. 204 (8), 2308-2315 (2020).
  3. Albanese, M., et al. efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses. Nat Methods. 19 (1), 81-89 (2022).
  4. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein transfection for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e69(2019).
  5. Huang, B., Johansen, K. H., Schwartzberg, P. L. Efficient CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in primary murine T lymphocytes. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e62(2019).
  6. Huang, B., et al. In vivo CRISPR screens reveal a HIF-1α-mTOR network regulates T follicular helper versus Th1 cells. Nat Commun. 13 (1), 805(2022).
  7. Asmamaw, M., Zawdie, B. Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics. 15, 353-361 (2021).
  8. Li, T., et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 36(2023).
  9. Yang, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9-induced double-strand breaks. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  10. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol. 28, 445-489 (2010).
  11. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., Xia, B. CD4+ T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol. 2012, 925135(2012).
  12. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  13. Rumble, J., Segal, B. M. In vitro polarization of T-helper cells. Methods Mol Biol. 1193, 105-113 (2014).
  14. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-cell differentiation in vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  15. Wang, W., Ai, X. Primary culture of immature, naive mouse CD4+ T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100756(2021).
  16. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  17. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  18. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  19. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  20. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  21. Wan, Y. Y., Flavell, R. A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression. Nature. 445 (7129), 766-770 (2007).
  22. Williams, L. M., Rudensky, A. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3. Nat Immunol. 8 (3), 277-284 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ablacja gen w CRISPR Cas9aktywacja limfocyt w Tizolacja naiwnych limfocyt w Tdostarczanie metod nukleofekcjimyszy z nokautem genupolaryzacja in vitroTh1 Th2 Th17 Tregbadania nad transferem adoptywnym
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły