Ten protokół wykorzystuje mikrotomografię komputerową, aby umożliwić ekonomiczną kwantyfikację beztłuszczowej masy, w tym mięśni szkieletowych i tkanki trzewnej, tkanki tłuszczowej i tkanki szkieletowej u małych zwierząt. Rozróżnia tkankę beztłuszczową i tłuszczową, co daje znaczące korzyści w badaniach biomedycznych, szczególnie w badaniach translacyjnych na małych zwierzętach.
Artykuł metodologiczny
Nieinwazyjna kwantyfikacja mięśni szkieletowych u małych zwierząt za pomocą mikrotomografii komputerowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wielkość, masa i skład mięśni szkieletowych są kluczowymi właściwościami do badania chorób metabolicznych i związanych z mięśniami, ponieważ bezpośrednio wpływają na zrozumienie postępu choroby i wyników leczenia. Kwantyfikacja masy beztłuszczowej, tłuszczowej i szkieletowej żywego zwierzęcia jest ważna w badaniach metabolicznych, fizjologicznych, farmakologicznych i gerologicznych. Jednak uzyskanie dokładnych pomiarów składu ciała, zwłaszcza beztłuszczowej masy, pozostaje wyzwaniem ze względu na nieodłączne ograniczenia konwencjonalnych technik oceny. Mikrotomografia komputerowa (micro-CT) jest nieinwazyjną techniką radiologiczną, która umożliwia wizualizację struktur wewnętrznych w wysokiej rozdzielczości w małych modelach zwierzęcych. Standaryzowana metoda mikrotomografii komputerowej może znacznie usprawnić badania translacyjne dzięki bardziej wiarygodnym i wpływowym wynikom, szczególnie podczas badań starzenia się lub w różnych punktach czasowych u tego samego zwierzęcia. Pomimo swojego potencjału, brak standaryzacji metod pozyskiwania i analizy obrazów znacznie utrudnia porównywalność wyników między różnymi badaniami. W niniejszym artykule przedstawiamy kompleksowy i szczegółowy, niskokosztowy protokół analizy masy beztłuszczowej przy użyciu mikro-CT, aby sprostać tym wyzwaniom i promować spójność w badaniach z udziałem małych modeli zwierzęcych.
Wprowadzenie
Rozmiar, masa i skład są kluczowymi właściwościami mięśni szkieletowych do badania mechanizmów chorób związanych z mięśniami i metabolicznymi1. Sarkopenia, kacheksja, atrofia i miopatie mają wspólne fenotypy: zmniejszenie masy, zmiana składu i upośledzenie funkcji mięśni2,3,4,5. Jednak ilościowe określenie składu ciała żywego zwierzęcia pozostaje bardzo złożone i stanowi wyzwanie techniczne6.
Podstawowe metodologie obrazowania in vivo i analizy składu ciała to absorpcjometria promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii (DXA), tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MRI). Metody te są stosowane przede wszystkim do badań przesiewowych i monitorowania chorób, które prowadzą do redukcji beztłuszczowej masy ciała7,8,9,10,11. DXA jest złotym standardem w analizie składu ciała ze względu na niższy koszt. DXA ma jednak istotną wadę w porównaniu z MRI i CT: niezdolność do przestrzennego rozdzielenia tkanki mięśniowej i tłuszczowej1.
MRI wykorzystuje silne pola magnetyczne i fale radiowe do generowania szczegółowych obrazów wewnętrznych struktur ciała12. Jedną z jego głównych zalet w porównaniu z tomografią komputerową jest doskonała rozdzielczość kontrastu, umożliwiająca doskonałe rozróżnienie różnych typów tkanek miękkich1,13,14. W przeciwieństwie do tomografii komputerowej, rezonans magnetyczny nie wykorzystuje promieniowania jonizującego, dzięki czemu jest bezpieczniejszy przy wielokrotnym użyciu15,16. Jednak rezonans magnetyczny jest droższy i mniej dostępny, z dłuższym czasem skanowania i wyższymi kosztami konserwacji13,17. W związku z tym instrumenty MRI przystosowane do analizy małych zwierząt zwykle nie są dostępne.
Micro-CT jest podobny do konwencjonalnego tomografu komputerowego, ale dostosowany do małych struktur i badań biomedycznych18. Mikrotomografia komputerowa to zaawansowana, nieinwazyjna technika oceny radiologicznej, która umożliwia szczegółową wizualizację struktur wewnętrznych w modelach małych zwierząt. Mikrotomografia komputerowa wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie do tworzenia szczegółowych obrazów wewnętrznych struktur organizmu, opierając się na zróżnicowanym tłumieniu promieni rentgenowskich przez różne typy tkanek. Podczas badania mikrotomografią komputerową mysz leży na stole, który powoli przesuwa się po okrągłej suwnicy. Wewnątrz suwnicy lampa rentgenowska obraca się wokół myszy, emitując promieniowanie rentgenowskie pod różnymi kątami. Detektory po przeciwnej stronie wychwytują te promienie rentgenowskie po ich przejściu przez body18.
Oprogramowanie mikrotomografu komputerowego przetwarza dane z tych wielu kątów, aby zrekonstruować dwuwymiarowe obrazy przekroju poprzecznego (plasterki) ciała. Dzięki rekonstrukcji te wycinki mogą być łączone, aby kompleksowo reprezentować anatomię wewnętrzną19. Obrazy wytwarzane przez mikrotomografię komputerową opierają się na różnym stopniu tłumienia promieniowania rentgenowskiego przez różne tkanki w ciele. Tłumienie to jest określane ilościowo za pomocą jednostek Hounsfielda (HU), skali, która standaryzuje radiogęstość20,21. Skala HU ma fundamentalne znaczenie dla segmentacji, ponieważ każda struktura ma nieco inną wartość.
W tym artykule użyliśmy wartości HU, aby dokładnie rozróżnić kość, tkankę beztłuszczową i tkankę tłuszczową1. Odwołując się do ustalonych zakresów HU, zapewniliśmy precyzyjną analizę i porównanie składu ciała. W tym artykule pokazujemy, jak pozyskiwać obrazy za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej zastosowania w wizualizacji i ilościowym określaniu masy beztłuszczowej, tłuszczowej i kostnej.
Protokół
Wszystkie metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Skanowanie przeprowadzono u samców myszy C57BL/6 w wieku 6 i 22 miesięcy.
1. Przygotowanie zwierząt
- Zanurz myszy w narkozie, stosując 2% isofluranu w mieszaninie z tlenem podawanym poprzez waporyzację. Do indukcji i podtrzymania znieczulenia w mieszaninie 100% tlenu należy użyć precyzyjnego waporyzatora.
- Umieść znieczulone zwierzę w pozycji grzbietowej na podkładce dla myszy w skanerze mikro-CT. Przymocuj mysz taśmą, aby zminimalizować ruchy podczas skanowania, a następnie wprowadź ją do gantry.
- Przez cały czas trwania eksperymentu, który trwa około 10 min, upewnij się, że zwierzę ma założoną maskę, aby utrzymać je w stanie znieczulenia, podając w razie potrzeby dawkę podtrzymującą.
2. Akwizycja i rekonstrukcja obrazu
- Wykonaj skany mikro-CT całego ciała za pomocą wysokorozdzielczego systemu obrazowania preklinicznego. Pozyskaj łącznie 1 024 projekcje z an czas ekspozycji z 470 ms każdy, używając rotacja w trybie lotu w a napięcie z 60 kV oraz a bieżący z 480 µAUstaw system w trybie a powiększenie 1,25x, co skutkuje powstaniem pole widzenia 94,72 mm (FOV) przy całkowitym czasie akwizycji wynoszącym 8,02 min. Należy zarejestrować obrazy z binowanie z 1 x 1co skutkuje rozdzielczością wynoszącą 2 368 x 2 240 pikseli.
UWAGA: Sprzęt wykorzystany w niniejszym opracowaniu do obrazowania mikro-CT wykazuje ograniczenia w uzyskiwaniu obrazów głowy ze względu na nakładanie się na nią maski anestezjologicznej. Ponadto nie zarejestrowano pełnej długości ogona. W związku z tym wykluczono analizę głowy i ogona (patrz sekcja 3). - Przeprowadź skanowanie z tymi samymi parametrami na akrylowym fantomie cylindrycznym (średnica: 2,5 cm, długość: 11,5 cm) wypełnionym w połowie wodą destylowaną, aby wyznaczyć wartości HU dla powietrza i wody. Po zakończeniu akwizycji zrekonstruuj obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji, stosując ustawienia zoptymalizowane pod kątem redukcji szumów oraz algorytm filtrowanej projekcji wstecznej (FBP). Przeprowadź rekonstrukcję seryjną obrazów zwierząt oraz fantoma, używając 147 µm izotropowy rozmiar woksela oraz a macierz 640.
- Wyodrębnij jednostki Housfielda (HU) dla powietrza i wody z fantoma (dane surowe) przy użyciu wskazanego oprogramowania. Konwertuj obrazy do plików DICOM i skoryguj wartości HU.
3. Analiza obrazu
- Przesyłanie pliku
UWAGA: Mikro-CT jest techniką, która przechwytuje obrazy w czasie i przestrzeni, generując sekwencję obrazów. Dlatego konieczne jest otwarcie całego folderu, a nie pojedynczego obrazu.- W górnej lewej części interfejsu znajdź menu 3D Slicer, wyróżnione w kolorze szaro-niebieskim. Kliknij Add Data (
). - Gdy pojawi się okno z dwiema opcjami, wybierz pierwszą: Choose Directory to Add.
- Przejdź do folderu zawierającego serie obrazów DICOM docelowego zwierzęcia i kliknij go. Działanie to otworzy folder w oprogramowaniu, umożliwiając jednoczesny podgląd wszystkich obrazów.
- Zaobserwuj obrazy wyświetlone na trzech ekranach. Każdy ekran reprezentuje inną płaszczyznę anatomiczną: czołową, strzałkową i poprzeczną, zidentyfikowane odpowiednio kolorami zielonym, żółtym i czerwonym.
- W górnej lewej części interfejsu znajdź menu 3D Slicer, wyróżnione w kolorze szaro-niebieskim. Kliknij Add Data (
- Segmentacja
- Zlokalizuj Segment Editor (
) w górnej karcie (Modules) i kliknij go. - Kliknij zielony przycisk + Add, aby utworzyć segmenty, definiując zakres HU.
- Utwórz segmenty dla kości, tkanki beztłuszczowej i tkanki tłuszczowej, klikając po 3 razy dla każdego z nich.
- Kliknij dwukrotnie każdy segment, aby nazwać go i nadać mu kolor zgodnie z pożądanymi ustawieniami.
- Ustaw zakres HU dla każdego segmentu za pomocą funkcji Threshold, znajdującej się po lewej stronie okna. Aby to zrobić, znajdź funkcję Threshold Range
i wprowadź wartości HU dla każdego rodzaju tkanki: tkanka beztłuszczowa (-29 do 225 HU); tkanka tłuszczowa (-190 do -30 HU); kość (500 do 5,000 HU). Kliknij przycisk Apply.
UWAGA: Porównanie wartości HU znajduje się na Supplemental Figure S1. - Powtórz proces segmentacji dla każdego rodzaju tkanki.
- Kliknij Show 3D, aby wygenerować rendering 3D.
UWAGA: Rendering pojawi się w niebieskim kwadrancie wyświetlacza.
- Zlokalizuj Segment Editor (
- Czyszczenie obrazu
UWAGA: Po segmentacji i renderingu 3D należy wykluczyć zbędne elementy, aby upewnić się, że nie zostaną one uwzględnione w pomiarach objętości tkanki beztłuszczowej, tkanki tłuszczowej i kości. Usunięcie tych artefaktów jest niezbędne dla zapewnienia dokładnej analizy.- Zlokalizuj narzędzie „Scissors” (
) w menu Segmentation. - Wybierz płaszczyznę anatomiczną lub rendering 3D, aby uzyskać wyraźniejszy widok obiektu do usunięcia.
- W przypadku korzystania z płaszczyzny anatomicznej kliknij przycisk maximize view (
) na kolorowym pasku płaszczyzny. W oknie płaszczyzny anatomicznej użyj pokrętła myszy, aby przesuwać się do przodu lub do tyłu w skanie CT.
UWAGA: Każde okno może być przewijane niezależnie. - W przypadku renderingu 3D użyj lewego przycisku myszy do obrotu wzdłuż dowolnej osi oraz prawego przycisku myszy do powiększenia.
UWAGA: Obraz można również obracać za pomocą klawiszy strzałek na klawiaturze.
- W przypadku korzystania z płaszczyzny anatomicznej kliknij przycisk maximize view (
- Po wybraniu narzędzia Scissors zaznacz segmentację wokół niepożądanego obiektu i zakreśl go, aby usunąć go z obrazu. Oprogramowanie usuwa obiekt automatycznie.
UWAGA: Upewnij się, że wybrana jest operacja Erase Inside. Jeśli użyty sprzęt generuje obrazy zawierające elementy niebiologiczne, takie jak koraliki, środek znieczulający lub sprzęt chirurgiczny, należy je usunąć. Dodatkowo, jeśli któryś obszar anatomiczny nie został uzyskany w całości, fundamentalne jest ustanowienie punktu odniesienia anatomicznego, aby usunąć te niepełne obszary i zapewnić powtarzalność między eksperymentami. Niepożądane obiekty muszą zostać usunięte w każdej płaszczyźnie. - Kliknij ikonę restore view layout icon (
), aby powrócić do ekranu z czterema oknami, niezależnie od wybranego okna. - Powtórz proces dla wszystkich okien, w których obiekt wymaga usunięcia.
- Zlokalizuj narzędzie „Scissors” (
- Objętość segmentacji
- Po segmentacji określ ilościowo objętości segmentów, korzystając z funkcji quantification znajdującej się w menu rozwijanym.
UWAGA: Aby wykonać tę czynność, wszystkie segmentacje muszą być widoczne. - Przejdź do Quantification | Segment Statistics. Kliknij Apply i poczekaj, aż oprogramowanie wygeneruje tabelę wyświetlającą wartości dla każdej segmentacji. Oprogramowanie podaje dwie wartości objętości dla każdej segmentacji: Labelmap (LM) i Closed Surface (CS).
UWAGA: Wartość LM jest zazwyczaj odpowiednia do obliczania objętości segmentów, wykorzystując liczbę wokseli pomnożoną przez objętość pojedynczego woksela. Wartość CS wykorzystuje wygładzony model powierzchni i integruje objętość w oparciu o trójkątne elementy powierzchni. CS dokładniej odpowiada konturom anatomicznym i jest zalecany do precyzyjnych pomiarów. - Aby wgrać dane nowego zwierzęcia, zapisz i zamknij scenę w menu file.
- Po segmentacji określ ilościowo objętości segmentów, korzystając z funkcji quantification znajdującej się w menu rozwijanym.
- Analiza składu ciała
- Użyj pomiarów objętości podanych przez oprogramowanie w cm3, aby przeliczyć te objętości na masę tkanki, stosując odpowiednią gęstość dla każdego rodzaju tkanki. Użyj następujących gęstości tkanek określonych przez International Commission on Radiation Units and Measurements22: 0.95 g/cm³ (tkanka tłuszczowa), 1.05 g/cm³ (tkanka beztłuszczowa) i 1.92 g/cm³ (tkanka szkieletowa)2.
- Aby obliczyć masę tkanki, pomnóż objętość (cm³) uzyskaną z oprogramowania przez odpowiednią gęstość tkanki (g/cm³):
Masa tkanki tłuszczowej: Volumesegmentation X 0.95 = Massadipose
Masa tkanki beztłuszczowej: Volumesegmentation X 1.05 = Masslean
Masa tkanki szkieletowej: Volumesegmentation X 1.92 = Massskeletal
Masa całkowita: Massadipose + Masslean + Massskeletal= MassTotal
- Aby obliczyć masę tkanki, pomnóż objętość (cm³) uzyskaną z oprogramowania przez odpowiednią gęstość tkanki (g/cm³):
- Użyj pomiarów objętości podanych przez oprogramowanie w cm3, aby przeliczyć te objętości na masę tkanki, stosując odpowiednią gęstość dla każdego rodzaju tkanki. Użyj następujących gęstości tkanek określonych przez International Commission on Radiation Units and Measurements22: 0.95 g/cm³ (tkanka tłuszczowa), 1.05 g/cm³ (tkanka beztłuszczowa) i 1.92 g/cm³ (tkanka szkieletowa)2.
- Pomiar długości kości
UWAGA: Aby skorygować masę tkanki względem długości kości w określonych analizach, konieczne jest uzyskanie konkretnych długości kości.- Powróć do menu Segment Editor. Ukryj segmentacje tkanki tłuszczowej i beztłuszczowej, klikając ikonę oka (
) obok każdego segmentu.
UWAGA: Widoczna powinna pozostać tylko segmentacja odpowiadająca tkance szkieletowej. - Wybierz opcję Toggle Markups/Toolbar (
) w górnym rogu menu głównego. Otworzy to menu pomocnicze tuż poniżej menu głównego. Zlokalizuj przycisk create new line (
). - Po kliknięciu przycisku create new line przejdź do rekonstrukcji 3D i zidentyfikuj kość do pomiaru.
UWAGA: Zalecanymi kośćmi są kość piszczelowa lub kość udowa22. - Po zidentyfikowaniu kości kliknij lewym przyciskiem myszy na jednym końcu kości, a następnie ponownie na drugim końcu tkanki. Działanie to pozwala oprogramowaniu obliczyć rozmiar kości.
UWAGA: Aby uzyskać spójne pomiary, wybierz ten sam region anatomiczny kości dla każdego zwierzęcia. Na przykład w przypadku kości udowej jako jeden koniec stosuje się głowę kości udowej, a jako drugi kłykieć boczny.
- Powróć do menu Segment Editor. Ukryj segmentacje tkanki tłuszczowej i beztłuszczowej, klikając ikonę oka (
- Analiza i normalizacja danych
UWAGA: Dane dotyczące masy można uzyskać zgodnie z opisem w sekcji 3.5 i używać ich w formie pierwotnej. Alternatywnie masę beztłuszczową, tłuszczową i kostną można znormalizować na dwa sposoby.- Oblicz stosunek masy tkanki do masy ciała zwierzęcia w dniu wykonania obrazowania.
Normalizacja do masy ciała: Masslean ÷ Body weight - Oblicz stosunek masy do rozmiaru kości (na przykład kości udowej lub piszczelowej).
Normalizacja do kości udowej: Masslean ÷ Sizefemur
Normalizacja do kości piszczelowej: Masslean ÷ Sizetibia
UWAGA: Parametry normalizacji są dobierane w zależności od pytania badawczego. Jeśli spodziewane są zmiany w rozmiarze kości (na przykład przy porównywaniu przebudowy kości), sugerowana jest normalizacja do masy ciała (punkt 3.7.1). Ponadto, jeśli w pytaniu badawczym spodziewane są zmiany masy ciała, sugerowanym parametrem normalizacji jest rozmiar kości długiej (punkt 3.7.2).
- Oblicz stosunek masy tkanki do masy ciała zwierzęcia w dniu wykonania obrazowania.
Wyniki
Właściwe ułożenie anatomiczne zsedowanego zwierzęcia na stole do obrazowania zapewnia spójne i powtarzalne wyniki skanowania, co podkreśla efektywność akwizycji danych w uzyskiwaniu wiarygodnych rezultatów. Prawidłowa sedacja zwierzęcia podczas całego procesu obrazowania, z wykorzystaniem specjalistycznych systemów podawania gazów i parowników, jest kluczowa dla precyzyjnych ocen anatomicznych (Rysunek 1).
Rycina 2 ilustruje segmentację i renderowanie w różnych płaszczyznach anatomicznych, przedstawiając sekwencyjne obrazy w płaszczyznach czołowej, strzałkowej i poprzecznej. Obrazy te demonstrują stopniową segmentację tkanki szkieletowej, tłuszczowej i chudej, kończącą się na w pełni zsegmentowanej reprezentacji integrującej wszystkie typy tkanek, co podkreśla wyraźne rozróżnienie między tkankami i pokazuje specyficzne dla regionów oznaczenia w oparciu o zidentyfikowane typy tkanek. Pomimo ograniczeń sprzętowych uniemożliwiających obrazowanie całego ciała, metoda ta dostarcza szczegółowych informacji o rozkładzie i składzie tkanek w różnych płaszczyznach anatomicznych.
Rysunek 3 przedstawia renderingi 3D z wyróżnieniem typów tkanek – kości (niebieski), tkanki tłuszczowej (żółty) i tkanki beztłuszczowej (czerwony) – zapewniając kompleksową wizualizację struktur anatomicznych. Wizualizacja ta podkreśla skuteczność protokołu w generowaniu szczegółowych modeli 3D, niezbędnych do badań anatomicznych.
Tabela 1 przedstawia znormalizowane masy tkanek (masę beztłuszczową, tkankę tłuszczową organizmu oraz masę szkieletową) w stosunku do masy ciała zwierzęcia w dniu obrazowania. Przedstawione wartości wynikają z pomnożenia objętości tkanki (w cm³) przez odpowiednią gęstość tkanki, zgodnie z opisem w kroku 3.5.1.1 metodologii.
Tabela 2 przedstawia bezwzględne wartości składu ciała, ukazując rozkład masy każdego zwierzęcia oraz procentową zawartość tkanki beztłuszczowej, tłuszczu ustrojowego i tkanki szkieletowej. Pozwala to ocenić całkowitą ilość każdego rodzaju tkanki oraz jej udział w ogólnym składzie ciała każdego osobnika.
Tabela uzupełniająca S1 przedstawia czas potrzebny każdemu analitykowi na przeprowadzenie analizy składu ciała każdego zwierzęcia oraz zmienność wyników pomiędzy analitykami. Pozwala ona ocenić, czy istnieje istotna zmienność pomiędzy doświadczonymi operatorami (Analitycy 1, 2 i 5) a niedoświadczonymi operatorami (Analitycy 3 i 4) w pomiarach wskaźników składu ciała, takich jak masa beztłuszczowa, masa tkanki tłuszczowej i masa szkieletowa.
Rysunek 4 przedstawia porównawczą analizę składu ciała u osób dorosłych i starszych. Wykazuje ona spadek procentowej beztłuszczowej masy ciała oraz wzrost zawartości tkanki tłuszczowej, co jest zgodne z typowymi wzorcami starzenia się organizmu. Wyniki te łącznie podkreślają niezawodność i precyzję protokołu obrazowania w dostarczaniu kluczowych danych anatomicznych, co jest niezbędne dla rozwoju metodologii badań przedklinicznych.
Rycina 1: Przygotowanie zwierzęcia. (A) Aparatura wykorzystywana do sedacji zwierzęcia podczas procesu obrazowania, taka jak systemy podawania gazu i parowskazy; (B) system skanowania mikro-CT. (C) Zznieczulone zwierzę leży na plecach w legowisku dla myszy. Właściwe ułożenie jest kluczowe dla uzyskania spójnych i powtarzalnych wyników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Segmentacja i wizualizacja przekrojów w różnych płaszczyznach anatomicznych. (A) płaszczyzna czołowa, (B) płaszczyzna strzałkowa oraz (C) płaszczyzna poprzeczna. Od lewej do prawej obrazy przedstawiają skan niesegmentowany (szary), segmentację kości (niebieski), segmentację tkanki tłuszczowej (żółty), segmentację tkanki beztłuszczowej (czerwony) oraz pełną segmentację, obejmującą wszystkie powyższe elementy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Renderowanie 3D. Od lewej do prawej obrazy przedstawiają renderowanie 3D badanego obiektu, z wyróżnieniem różnych typów tkanek: kości na niebiesko, tkanki tłuszczowej na żółto, tkanki beztłuszczowej na czerwono, a ostatni obraz pokazuje widok kompleksowy łączący kości, tkankę tłuszczową i tkankę beztłuszczową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 4: Porównanie składu ciała myszy dorosłych i starych. Wykres słupkowy przedstawia procentowy skład ciała: tkanki szkieletowej (dorosłe: 10.5 ± 0.5%; stare: 9.9 ± 1.0%, p = 0.19), tkanki tłuszczowej (dorosłe: 17.2 ± 5.7%; stare: 27.9 ± 4.4%, p = 0.03) oraz beztłuszczowej masy ciała (dorosłe: 72.3 ± 5.7%; stare: 62.3 ± 3.6%, p = 0.03). Dane przedstawiono jako ŚREDNIA ± SD dla zwierząt (dorosłe: n = 3; stare: n = 3). Statystyki obliczono za pomocą nieparzystego testu t z jednostronną wartością p (* p < 0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| LEAN | |||
| Identyfikator zwierzęcia | Masa beztłuszczowa (g) | Masa (g) | Normalizacja (masa) |
| Osoby starsze 1 | 15.1 | 37.4 | 0.4 |
| Osoby starsze 2 | 14.4 | 44.4 | 0.3 |
| Osoby starsze 3 | 14.3 | 37.7 | 0.4 |
| Dorosły 1 | 12.3 | 29.1 | 0.4 |
| Dorosły 2 | 16.5 | 30.4 | 0.5 |
| Dorosły 3 | 16.1 | 31.7 | 0.5 |
| TKANKA TŁUSZCZOWA | |||
| Identyfikator zwierzęcia | Masa tkanki tłuszczowej organizmu (g) | Masa (g) | Normalizacja (masa) |
| Osoby starsze 1 | 6.4 | 37.4 | 0.2 |
| Osoby starsze 2 | 8.2 | 44.4 | 0.2 |
| Osoby starsze 3 | 5.3 | 37.7 | 0.1 |
| Osoba dorosła 1 | 4.4 | 29.1 | 0.2 |
| Dorosły 2 | 2.7 | 30.4 | 0.1 |
| Dorosły 3 | 3.4 | 31.7 | 0.1 |
| SZKIELETOWY | |||
| Identyfikator zwierzęcia | Masa szkieletowa (g) | Masa (g) | Normalizacja (masa) |
| Osoby starsze 1 | 2.3 | 37.4 | 0.06 |
| Osoby starsze 2 | 2.3 | 44.4 | 0.05 |
| Osoby starsze 3 | 2.4 | 37.7 | 0.06 |
| Dorosły 1 | 2.0 | 29.1 | 0.07 |
| Dorosły 2 | 2.3 | 30.4 | 0.08 |
| Osoba dorosła 3 | 2.2 | 31.7 | 0.07 |
Tabela 1: Normalizacja masy do masy ciała zwierzęcia w dniu obrazowania.Zgodnie z wyjaśnieniami w sekcji 3.7, masę tkanki można znormalizować do masy ciała zwierzęcia w dniu badania. Normalizację tę zastosowano do tkanki chudej, tłuszczowej i kostnej w oparciu o masę ciała zwierzęcia.
| Skład ciała (g) | ||||
| Objętość segmentacji X 1,05 | Objętość segmentacji X 0,95 | Objętość segmentacji X 1,92 | Masa beztłuszczowa + tłuszczowa + szkieletowa | |
| ID zwierzęcia | Masa beztłuszczowa (g) | Masa tłuszczowa (g) | Masa szkieletowa (g) | Masa całkowita (g) |
| Elderly 1 | 15,1 | 6,4 | 2,3 | 23,8 |
| Elderly 2 | 14,3 | 8,2 | 2,3 | 24,9 |
| Elderly 3 | 14,3 | 5,3 | 2,4 | 22,0 |
| Adult 1 | 12,3 | 4,4 | 2,0 | 18,6 |
| Adult 2 | 16,5 | 2,7 | 2,3 | 21,5 |
| Adult 3 | 16,1 | 3,4 | 2,2 | 21,7 |
| Skład ciała (%) | ||||
| ID zwierzęcia | Masa beztłuszczowa (%) | Masa tłuszczowa (%) | Masa szkieletowa (%) | Masa całkowita (%) |
| Elderly 1 | 63,6 | 26,8 | 9,6 | 100 |
| Elderly 2 | 58,1 | 32,8 | 9,0 | 100 |
| Elderly 3 | 64,9 | 24,1 | 11,0 | 100 |
| Adult 1 | 65,9 | 23,5 | 10,6 | 100 |
| Adult 2 | 76,8 | 12,4 | 10,9 | 100 |
| Adult 3 | 74,3 | 15,7 | 9,9 | 100 |
Tabela 2: Skład ciała. (A) Skład ciała zwierząt w gramach; (B) procentowy skład ciała.
Tabela uzupełniająca S1: Skład ciała oceniany przez różnych operatorów. Dla każdej oceny zarejestrowano masę beztłuszczową, masę tkanki tłuszczowej, masę mięśni szkieletowych oraz czas trwania analizy (w minutach). Analitycy 1, 2 i 5 byli doświadczonymi operatorami, natomiast analitycy 3 i 4 byli niedoświadczeni i postępowali wyłącznie zgodnie z protokołem opisanym w badaniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca S1: Zakres gęstości różnych materiałów biologicznych i niebiologicznych. Rycina przedstawia zakresy gęstości różnych tkanek biologicznych i substancji niebiologicznych. Wartości zostały pozyskane z literatury i dostosowane w celu uzyskania optymalnego różnicowania tkanek. Kości wykazują najwyższą gęstość, następnie tkanka beztłuszczowa, natomiast tkanka tłuszczowa wykazuje znacznie niższą gęstość. Urządzenie zostało skalibrowane z wodą jako referencją przy gęstości 0. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Ocena za pomocą tomografii jest skuteczną i nieinwazyjną metodą uzyskiwania szczegółowych informacji o składzie ciała. W szczególności mikrotomografia komputerowa oferuje cenne mierniki wyników w badaniach przedklinicznych. W dziedzinie kości mikrotomografia komputerowa ma różne zastosowania, ponieważ analiza mikroarchitektury23 i przebudowa kości24 są szczególnie interesujące. Ocena morfologii wewnętrznej struktury biologicznej jest również istotna w badaniach biomedycznych, ponieważ analiza gęstości naczyń krwionośnych w określonej tkance może ocenić jej funkcję i wywnioskować o metabolizmie25. W badaniach endokrynologicznych i metabolicznych masy tłuszczowej zastosowanie mikrotomografii komputerowej dostarcza podstawowych informacji u żywych małych zwierząt26,27. Ponadto mikrotomografia komputerowa może być stosowana w innych dziedzinach, takich jak zoologia i botanika, gdzie służy do oceny struktur małych owadów i roślin28,29.
Istotnym ograniczeniem mikrotomografii komputerowej jest wysoki koszt i ograniczony dostęp do oprogramowania do analizy obrazu. Ponadto wcześniejsza wiedza anatomiczna, zwłaszcza z zakresu anatomii zwierząt, jest niezbędna do prawidłowych pomiarów. Ten manuskrypt przedstawia oprogramowanie 3D slicer, które jest w stanie uzyskać wyniki porównywalne z komercyjnymi alternatywami. System ten zmniejsza również zapotrzebowanie na rozległą wiedzę anatomiczną, ponieważ jest półautomatyczny30.
Obrazy uzyskane za pomocą mikro-CT i przeanalizowane przez oprogramowanie wykazały, że skład ciała myszy podąża podobną trajektorią do człowieka podczas starzenia się, charakteryzując się wzrostem całkowitej tkanki tłuszczowej i jednoczesnym spadkiem beztłuszczowej masy ciała31. Wyniki te były widoczne podczas porównywania dorosłych myszy (6 miesięcy) z myszami w podeszłym wieku (22 miesiące).
Ze względu na ograniczenia sprzętu, maska anestezjologiczna blokuje nabycie głowy. W związku z tym nie udało nam się uchwycić i dokładnie podzielić całej głowy. W rezultacie ustaliliśmy konwencję używania kości atlasu (C1) jako anatomicznego punktu odniesienia, koncentrując naszą analizę na obszarze poniżej tego punktu w użytym tu sprzęcie. W związku z tym wszystkie obrazy powyżej C1 zostały wybrane do usunięcia. Sprzęt nie uzyskał pełnej długości ogona. W ten sposób ogon został usunięty z obszaru podstawy we wszystkich analizach. Sugerujemy, aby użytkownik ustalił punkty anatomiczne dla wybranych wykluczonych obszarów, aby zachować powtarzalność między eksperymentami.
W artykule przedstawiono metodę analizy obrazów tomograficznych przy użyciu dostępnego i opłacalnego protokołu. Oprogramowaniu udało się rozróżnić trzy typy tkanek: masę beztłuszczową, tkankę tłuszczową i tkankę szkieletową. Nie był jednak w stanie odróżnić mięśni szkieletowych od narządów trzewnych, co jest częstym wyzwaniem w analizie składu ciała myszy.
Mikrotomografia komputerowa nie ma zdolności do różnicowania tkanki trzewnej i masy mięśni szkieletowych. Pomimo tego ograniczenia, nasze wyniki pokazują wartość oprogramowania w badaniu chorób wpływających na skład ciała, szczególnie tych wpływających na mięśnie szkieletowe, takich jak przerost lub atrofia. Można go powtórzyć jako badanie nieinwazyjne, umożliwiające podłużne monitorowanie składu ciała. Ta zdolność pomaga w ocenie leczenia ochronnego i opracowywaniu protokołów modelowania wielu chorób metabolicznych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Fundację Carlosa Chagasa Filho na rzecz Wspierania Badań Stanu Rio de Janeiro (FAPERJ; E-26/010.002643/2019 i E-26/201.335/2022), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -Brazil (CAPES)-001 Kodeks finansowy. Programa Institucional de bolsas de iniciação científica da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Krajowa Rada Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq; FFB: 001. 306236/2022-2 TMO-C: 309339/2023-5). Autorzy dziękują Narodowemu Centrum Biologii Strukturalnej i Bioobrazowania (CENABIO)/ Universidade Federal do Rio de Janeiro za korzystanie z jego urządzeń, w szczególności platformy microPET/SPECT/CT w Zakładzie Obrazowania Małych Zwierząt (UIPA). Rysunek uzupełniający S1 został utworzony z BioRender.com.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3DSlicer, wersja 5.6.2 | 3D Slicer | Darmowe oprogramowanie typu open source do analizy obrazów i wizualizacji naukowej. | |
| Amide, wersja 1.0.1 | Platforma | Darmowe oprogramowanie typu open source służące do korygowania wartości jednostek Hounsfielda w przetwarzanych obrazach DICOM. | |
| Amira, wersja 4.1 | Thermo Fisher Scientific | Służy do ekstrakcji powietrza i wody wartości jednostki Hounsfielda z surowych danych fantomu oraz do konwersji obrazów na pliki DICOM. | |
| Izoforyna | Crist&aaostry; lia | Isoflurane jest niepalnym płynnym środkiem znieczulającym do stosowania w ogólnym znieczuleniu wziewnym przez waporyzację. | |
| Podsystem Triumph XO | Gamma Medica-Ideas Flex | Zaawansowany podsystem obrazowania przeznaczony do przedklinicznego obrazowania małych zwierząt, oferujący możliwości CT i PET o wysokiej rozdzielczości do analizy ilościowej i jakościowej. |
Bibliografia
- Engelke, K., Museyko, O., Wang, L., Laredo, J. D. Quantitative analysis of skeletal muscle by computed tomography imaging-State of the art. J Orthop Translat. 15, 91(2018).
- Peixoto da Silva, S., Santos, J. M. O., Costa e Silva, M. P., Gil da Costa, R. M., Medeiros, R. Cancer cachexia and its pathophysiology: links with sarcopenia, anorexia and asthenia. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 11 (3), 619(2020).
- Lan, X. Q., et al. The role of TGF-β signaling in muscle atrophy, sarcopenia and cancer cachexia. Gen Comp Endocrinol. 353, 1-10 (2024).
- Bloise, F. F., Oliveira, T. S., Cordeiro, A., Ortiga-Carvalho, T. M. Thyroid hormones play role in sarcopenia and myopathies. Front Physiol. 9, 560(2018).
- Yin, L., et al. Skeletal muscle atrophy: From mechanisms to treatments. Pharmacol Res. 172, 1-12 (2021).
- Heymsfield, S. B., Adamek, M., Gonzalez, M. C., Jia, G., Thomas, D. M. Assessing skeletal muscle mass: historical overview and state of the art. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 5 (1), 9-18 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
- Faron, A., et al. Quantification of fat and skeletal muscle tissue at abdominal computed tomography: associations between single-slice measurements and total compartment volumes. Abdom Radiol (NY). 44 (5), 1907-1916 (2019).
- Marra, M., et al. Assessment of body composition in health and disease using bioelectrical impedance analysis (BIA) and dual energy X-ray absorptiometry (DXA): A critical overview. Contrast Media Mol Imaging. 2019, 3548284(2019).
- Martin, L., et al. Cancer cachexia in the age of obesity: skeletal muscle depletion is a powerful prognostic factor, independent of body mass index. J Clin Oncol. 31 (12), 1539-1547 (2013).
- Schlaeger, S., et al. Association of paraspinal muscle water-fat MRI-based measurements with isometric strength measurements. Eur Radiol. 29 (2), 599-608 (2019).
- Kose, K. Physical and technical aspects of human magnetic resonance imaging: present status and 50 years historical review. Adv Phys: X. 6 (1), (2021).
- Arnold, T. C., Freeman, C. W., Litt, B., Stein, J. M. Low-field MRI: Clinical promise and challenges. J Magn Reson Imaging. 57 (1), 25-44 (2023).
- Wang, H., et al. Preoperative MRI-based radiomic machine-learning nomogram may accurately distinguish between benign and malignant soft-tissue lesions: A two-center study. J Magn Reson Imaging. 52 (3), 873-882 (2020).
- Brower, C., Rehani, M. M. Radiation risk issues in recurrent imaging. Br J Radiol. 94 (1126), (2021).
- Mainprize, J. G., Yaffe, M. J., Chawla, T., Glanc, P. Effects of ionizing radiation exposure during pregnancy. Abdom Radiol (NY). 48 (5), 1564(2023).
- Geethanath, S., Vaughan, J. T. Accessible magnetic resonance imaging: A review. J Magn Reson Imaging. 49 (7), e65-e77 (2019).
- Ritman, E. L. Current status of developments and applications of micro-CT. Annu Rev Biomed Eng. 13, 531-552 (2011).
- Khoury, B. M., et al. The use of nano-computed tomography to enhance musculoskeletal research. Connect Tissue Res. 56 (2), 106(2015).
- DenOtter, T. D., Schubert, J. Hounsfield Unit. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
- Pinto, E. M., et al. Efficacy of Hounsfield units measured by lumbar computer tomography on bone density assessment: A systematic review. Spine (Phila Pa 1976). 47 (9), 702-710 (2022).
- Beaucage, K. L., Pollmann, S. I., Sims, S. M., Dixon, S. J., Holdsworth, D. W. Quantitative in vivo micro-computed tomography for assessment of age-dependent changes in murine whole-body composition. Bone Rep. 5, 70-80 (2016).
- Faot, F., Chatterjee, M., de Camargos, G. V., Duyck, J., Vandamme, K. Micro-CT analysis of the rodent jaw bone micro-architecture: A systematic review. Bone Rep. 2, 14-24 (2015).
- Cooper, D., Turinsky, A., Sensen, C., Hallgrimsson, B. Effect of voxel size on 3D micro-CT analysis of cortical bone porosity. Calcif Tissue Int. 80 (3), 211-219 (2007).
- Mrzilkova, J., et al. Morphology of the vasculature and blood supply of the brown adipose tissue examined in an animal model by micro-CT. Biomed Res Int. 2020 (1), 7502578(2020).
- Li, F. W., et al. Optimal use ratio of the stromal vascular fraction (SVF): An animal experiment based on micro-CT dynamic detection after large-volume fat grafting. Aesthet Surg J. 39 (6), NP213-NP224 (2019).
- Berndt, S., et al. Microcomputed tomography technique for in vivo three-dimensional fat tissue volume evaluation after polymer injection. Tissue Eng Part C Methods. 23 (12), 964-970 (2017).
- Rother, L., et al. A micro-CT-based standard brain atlas of the bumblebee. Cell Tissue Res. 386 (1), 29-45 (2021).
- Ijiri, T., Todo, H., Hirabayashi, A., Kohiyama, K., Dobashi, Y. Digitization of natural objects with micro CT and photographs. PLoS One. 13 (4), e0195852(2018).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the Quantitative Imaging Network. Magn Reson Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Ponti, F., et al. Aging and imaging assessment of body composition: From fat to facts. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 861(2020).
Przedruki i uprawnienia
