Nieinwazyjna kwantyfikacja mięśni szkieletowych u małych zwierząt za pomocą mikrotomografii komputerowej

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje mikrotomografię komputerową, aby umożliwić ekonomiczną kwantyfikację beztłuszczowej masy, w tym mięśni szkieletowych i tkanki trzewnej, tkanki tłuszczowej i tkanki szkieletowej u małych zwierząt. Rozróżnia tkankę beztłuszczową i tłuszczową, co daje znaczące korzyści w badaniach biomedycznych, szczególnie w badaniach translacyjnych na małych zwierzętach.

Streszczenie

Wielkość, masa i skład mięśni szkieletowych są kluczowymi właściwościami do badania chorób metabolicznych i związanych z mięśniami, ponieważ bezpośrednio wpływają na zrozumienie postępu choroby i wyników leczenia. Kwantyfikacja masy beztłuszczowej, tłuszczowej i szkieletowej żywego zwierzęcia jest ważna w badaniach metabolicznych, fizjologicznych, farmakologicznych i gerologicznych. Jednak uzyskanie dokładnych pomiarów składu ciała, zwłaszcza beztłuszczowej masy, pozostaje wyzwaniem ze względu na nieodłączne ograniczenia konwencjonalnych technik oceny. Mikrotomografia komputerowa (micro-CT) jest nieinwazyjną techniką radiologiczną, która umożliwia wizualizację struktur wewnętrznych w wysokiej rozdzielczości w małych modelach zwierzęcych. Standaryzowana metoda mikrotomografii komputerowej może znacznie usprawnić badania translacyjne dzięki bardziej wiarygodnym i wpływowym wynikom, szczególnie podczas badań starzenia się lub w różnych punktach czasowych u tego samego zwierzęcia. Pomimo swojego potencjału, brak standaryzacji metod pozyskiwania i analizy obrazów znacznie utrudnia porównywalność wyników między różnymi badaniami. W niniejszym artykule przedstawiamy kompleksowy i szczegółowy, niskokosztowy protokół analizy masy beztłuszczowej przy użyciu mikro-CT, aby sprostać tym wyzwaniom i promować spójność w badaniach z udziałem małych modeli zwierzęcych.

Wprowadzenie

Rozmiar, masa i skład są kluczowymi właściwościami mięśni szkieletowych do badania mechanizmów chorób związanych z mięśniami i metabolicznymi¹. Sarkopenia, kacheksja, atrofia i miopatie mają wspólne fenotypy: zmniejszenie masy, zmiana składu i upośledzenie funkcji mięśni^2,3,4,5. Jednak ilościowe określenie składu ciała żywego zwierzęcia pozostaje bardzo złożone i stanowi wyzwanie techniczne⁶.

Podstawowe metodologie obrazowania in vivo i analizy składu ciała to absorpcjometria promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii (DXA), tomografia komputerowa (CT) i rezonans magnetyczny (MRI). Metody te są stosowane przede wszystkim do badań przesiewowych i monitorowania chorób, które prowadzą do redukcji beztłuszczowej masy ciała^7,8,9,10,11. DXA jest złotym standardem w analizie składu ciała ze względu na niższy koszt. DXA ma jednak istotną wadę w porównaniu z MRI i CT: niezdolność do przestrzennego rozdzielenia tkanki mięśniowej i tłuszczowej¹.

MRI wykorzystuje silne pola magnetyczne i fale radiowe do generowania szczegółowych obrazów wewnętrznych struktur ciała¹². Jedną z jego głównych zalet w porównaniu z tomografią komputerową jest doskonała rozdzielczość kontrastu, umożliwiająca doskonałe rozróżnienie różnych typów tkanek miękkich^1,13,14. W przeciwieństwie do tomografii komputerowej, rezonans magnetyczny nie wykorzystuje promieniowania jonizującego, dzięki czemu jest bezpieczniejszy przy wielokrotnym użyciu^15,16. Jednak rezonans magnetyczny jest droższy i mniej dostępny, z dłuższym czasem skanowania i wyższymi kosztami konserwacji^13,17. W związku z tym instrumenty MRI przystosowane do analizy małych zwierząt zwykle nie są dostępne.

Micro-CT jest podobny do konwencjonalnego tomografu komputerowego, ale dostosowany do małych struktur i badań biomedycznych¹⁸. Mikrotomografia komputerowa to zaawansowana, nieinwazyjna technika oceny radiologicznej, która umożliwia szczegółową wizualizację struktur wewnętrznych w modelach małych zwierząt. Mikrotomografia komputerowa wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie do tworzenia szczegółowych obrazów wewnętrznych struktur organizmu, opierając się na zróżnicowanym tłumieniu promieni rentgenowskich przez różne typy tkanek. Podczas badania mikrotomografią komputerową mysz leży na stole, który powoli przesuwa się po okrągłej suwnicy. Wewnątrz suwnicy lampa rentgenowska obraca się wokół myszy, emitując promieniowanie rentgenowskie pod różnymi kątami. Detektory po przeciwnej stronie wychwytują te promienie rentgenowskie po ich przejściu przez body¹⁸.

Oprogramowanie mikrotomografu komputerowego przetwarza dane z tych wielu kątów, aby zrekonstruować dwuwymiarowe obrazy przekroju poprzecznego (plasterki) ciała. Dzięki rekonstrukcji te wycinki mogą być łączone, aby kompleksowo reprezentować anatomię wewnętrzną¹⁹. Obrazy wytwarzane przez mikrotomografię komputerową opierają się na różnym stopniu tłumienia promieniowania rentgenowskiego przez różne tkanki w ciele. Tłumienie to jest określane ilościowo za pomocą jednostek Hounsfielda (HU), skali, która standaryzuje radiogęstość^20,21. Skala HU ma fundamentalne znaczenie dla segmentacji, ponieważ każda struktura ma nieco inną wartość.

W tym artykule użyliśmy wartości HU, aby dokładnie rozróżnić kość, tkankę beztłuszczową i tkankę tłuszczową¹. Odwołując się do ustalonych zakresów HU, zapewniliśmy precyzyjną analizę i porównanie składu ciała. W tym artykule pokazujemy, jak pozyskiwać obrazy za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej zastosowania w wizualizacji i ilościowym określaniu masy beztłuszczowej, tłuszczowej i kostnej.

Protokół

Wszystkie metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Skany przeprowadzono na samcach myszy C57BL/6 w wieku 6 i 22 miesięcy.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Znieczulenie myszy za pomocą 2% izofluranu w mieszaninie tlenu dostarczanego przez parowanie. Używaj waporyzatora precyzyjnego zarówno do indukcji, jak i konserwacji mieszaniną 100% tlenu za pomocą waporyzatora precyzyjnego.
2. Umieść znieczulone zwierzę na wznak na skanowaniu mikro-CT za pomocą łóżka myszy. Zabezpiecz mysz taśmą, aby zminimalizować ruch podczas skanowania, a następnie włóż ją do suwnicy.
3. Przez cały czas trwania eksperymentu, który trwa około 10 minut, należy upewnić się, że zwierzę nosi maskę, aby utrzymać je pod płaszczyzną znieczulenia, podczas gdy w razie potrzeby otrzymuje dawkę podtrzymującą.

2. Akwizycja i rekonstrukcja obrazu

1. Pobieraj skany mikrotomografii komputerowej ciała za pomocą systemu obrazowania przedklinicznego o wysokiej rozdzielczości. Uchwyć łącznie 1 024 projekcje o czasie naświetlania 470 ms każde, wykorzystując rotację w trybie lotu przy napięciu 60 kV i prądzie 480 μA. Ustaw system na powiększenie 1,25, co daje pole widzenia (FOV) 94,72 mm, co daje całkowity czas akwizycji wynoszący 8,02 min. Przechwytuj obrazy z binningiem 1 x 1, co daje rozdzielczość 2 368 x 2 240 pikseli.
   UWAGA: Sprzęt używany w tym manuskrypcie do obrazów mikro-CT ma ograniczenia w uzyskiwaniu obrazów głowy ze względu na nakładanie się na maskę znieczulającą. Dodatkowo cała długość ogona nie jest przechwytywana. W związku z tym Trybunał wykluczył analizę głowy i ogona (zob. sekcja 3).
2. Wykonaj skan z tymi samymi parametrami na akrylowym cylindrycznym fantomie (średnica: 2,5 cm, długość: 11,5 cm) wypełnionym do połowy wodą destylowaną, aby określić HU dla powietrza i wody. Po zakończeniu akwizycji zrekonstruuj obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji z ustawieniami zoptymalizowanymi pod kątem redukcji szumów i algorytmu Filtered Back Projection (FBP). Rekonstrukcja wsadowa zarówno obrazów zwierzęcych, jak i fantomowych przy użyciu izotropowego rozmiaru woksela 147 μm i matrycy 640.
3. Odprowadź powietrze i wodę HU z fantomu (surowe dane) za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Przekonwertuj obrazy na pliki DICOM i popraw wartości HU.

3. Analiza obrazu

1. Przesyłanie pliku
   UWAGA: Micro-CT to technika, która rejestruje obrazy w czasie i przestrzeni, generując sekwencję obrazów. Dlatego konieczne jest otwarcie całego folderu, a nie pojedynczego obrazu.
   1. W lewym górnym rogu interfejsu znajdź menu 3D Slicer, podświetlone szaro-niebieskim kolorem. Kliknij na Dodaj dane ().
   2. Gdy pojawi się okno z dwiema opcjami, wybierz pierwszą opcję: Wybierz katalog do dodania.
   3. Przejdź do folderu zawierającego serię zdjęć DICOM zwierzęcia docelowego i kliknij go. Ta czynność otworzy folder w oprogramowaniu, umożliwiając jednoczesne przeglądanie wszystkich obrazów.
   4. Obserwuj obrazy wyświetlane na trzech ekranach. Każdy ekran reprezentuje inną płaszczyznę anatomiczną: koronalną, strzałkową i poprzeczną, oznaczoną odpowiednio kolorami zielonym, żółtym i czerwonym.
2. segmentacja
   1. Znajdź Edytor segmentów () w górnej zakładce (Moduły) i kliknij na niego.
   2. Kliknij zielony przycisk + Dodaj, aby utworzyć segmenty, definiujące zakres HU.
   3. Utwórz segmenty dla kości, tkanki beztłuszczowej i tkanki tłuszczowej, klikając po 3 razy każdy.
   4. Kliknij dwukrotnie każdy segment, aby go nazwać i pokolorować zgodnie z żądanymi ustawieniami.
   5. Ustaw zakres HU dla każdego segmentu za pomocą funkcji Próg, znajdującej się po lewej stronie okna. Aby to zrobić, znajdź funkcję Threshold Range i wprowadź wartości HU dla każdego typu tkanki: Beztłuszczowa tkanka (od -29 do 225 HU); tkanka tłuszczowa (od -190 do -30 HU); kość (od 500 do 5 000 HU). Kliknij przycisk Zastosuj.
      UWAGA: Patrz rysunek uzupełniający S1 w celu porównania wartości HU.
   6. Powtórz proces segmentacji dla każdego typu tkanki.
   7. Kliknij Pokaż 3D, aby wygenerować rendering 3D.
      UWAGA: Renderowanie pojawi się w niebieskim kwadrancie wyświetlacza.
3. Czyszczenie obrazu
   UWAGA: Po segmentacji i renderowaniu 3D należy wykluczyć obce elementy, aby upewnić się, że nie są one uwzględniane w pomiarach wolumetrycznych tkanki beztłuszczowej, tkanki tłuszczowej i kości. Usunięcie tych artefaktów jest niezbędne do zapewnienia dokładnej analizy.
   1. Znajdź narzędzie "Nożyczki" () w menu Segmentacja.
   2. Wybierz płaszczyznę anatomiczną lub renderowanie 3D, aby uzyskać wyraźniejszy widok obiektu, który ma zostać usunięty.
      1. Jeśli używasz płaszczyzny anatomicznej, kliknij przycisk maksymalizacji widoku () na kolorowym pasku płaszczyzny. Wewnątrz okna płaszczyzny anatomicznej użyj przycisku przewijania myszy, aby poruszać się do przodu lub do tyłu po skanowaniu CT.
         UWAGA: Każde okno można przewijać niezależnie.
      2. W przypadku renderowania 3D użyj lewego przycisku myszy, aby obrócić wzdłuż dowolnej osi, a prawego przycisku myszy, aby powiększyć.
         UWAGA: strzałek na klawiaturze mogą również obracać obraz.
   3. Po wybraniu narzędzia Nożyczki podświetl segmentację wokół niechcianego obiektu i okrąż ją, aby usunąć go z obrazu. Oprogramowanie automatycznie usunie obiekt.
      UWAGA: Upewnij się, że wybrana jest operacja Wymaż wnętrze. Jeśli używany sprzęt generuje obrazy dla jakiegokolwiek obrazu niebiologicznego, takiego jak koralik, znieczulenie lub sprzęt chirurgiczny, ważne jest, aby go usunąć. Dodatkowo, jeśli jakikolwiek obszar anatomiczny nie jest w pełni uzyskany, zasadnicze znaczenie ma ustanowienie odniesienia anatomicznego w celu usunięcia tych obszarów, które nie są w pełni uzyskane, aby zapewnić powtarzalność między eksperymentami. Niechciane obiekty muszą zostać usunięte w każdej płaszczyźnie.
   4. Kliknij ikonę przywracania układu widoku (), aby powrócić do ekranu z czterema oknami, niezależnie od wybranego okna.
   5. Powtórz ten proces dla wszystkich okien, w których obiekt wymaga usunięcia.
4. Objętość segmentacji
   1. Po segmentacji określ ilościowo objętości segmentów za pomocą funkcji kwantyfikacji znajdującej się w menu rozwijanym.
      UWAGA: Wszystkie segmentacje muszą być widoczne dla tej akcji.
   2. Przejdź do sekcji Kwantyfikacja | Statystyki segmentu. Kliknij Zastosuj i poczekaj, aż oprogramowanie wygeneruje tabelę wyświetlającą wartości dla każdej segmentacji. Oprogramowanie zapewnia dwie wartości objętości dla każdej segmentacji: Labelmap (LM) i Closed Surface (CS).
      UWAGA: Wartość LM jest ogólnie odpowiednia do obliczania objętości segmentów przy użyciu liczby wokseli pomnożonej przez objętość pojedynczego woksela. CS Value wykorzystuje wygładzony model powierzchni i integruje objętość w oparciu o trójkątne elementy powierzchni. CS jest bardziej dopasowany do konturów anatomicznych i jest zalecany do dokładnych pomiarów.
   3. Aby przesłać dane z nowego zwierzęcia, zapisz i zamknij scenę w menu pliku.
5. Analiza składu cielesnego
   1. Użyj pomiarów objętości dostarczonych przez oprogramowanie w^cm3, aby przeliczyć te objętości na masę tkankową i zastosować odpowiednią gęstość dla każdego typu tkanki. Należy stosować następujące gęstości tkanek określone przez Międzynarodową Komisję ds. Jednostek i Pomiarów Promieniowania²²: 0,95 g/cm³ (tkanka tłuszczowa), 1,05 g/cm³ (tkanka beztłuszczowa) i 1,92 g/cm³ (tkanka szkieletowa)².
      1. Aby obliczyć masę tkanki, pomnóż objętość (cm³) uzyskaną z oprogramowania przez odpowiednią gęstość tkanki (g/cm³):
         Masa tkanki tłuszczowej:_Segmentacja objętości x 0,95 =_{Masa tkanki tłuszczowej}
         Beztłuszczowa masa tkanki:_Segmentacja objętości X 1,05 = Masa_uboga
         Masa tkanki szkieletowej:_Segmentacja objętości X 1,92 = Masa_szkieletowa
         Masa całkowita: Masa_{tkanki tłuszczowej} + Masa_{beztłuszczowa} + Masa_szkieletowa = Masa_całkowita
6. Pomiar długości kości
   UWAGA: Aby skorygować masę tkanki o długość kości w przypadku niektórych analiz, konieczne jest uzyskanie określonych długości kości.
   1. Wróć do menu Edytor segmentów. Ukryj segmentację tkanki tłuszczowej i tkanki beztłuszczowej, klikając ikonę oka () obok każdego segmentu.
      UWAGA: Widoczna powinna pozostać tylko segmentacja odpowiadająca tkance szkieletowej.
   2. Wybierz opcję Toggle Markups/Toolbar () w górnym rogu menu głównego. Spowoduje to otwarcie menu pomocniczego tuż pod menu głównym. Znajdź przycisk tworzenia nowej linii ().
   3. Po kliknięciu na przycisk utwórz nową linię przejdź do rekonstrukcji 3D i zidentyfikuj kość, która ma być zmierzona.
      UWAGA: Zalecane kości to kość piszczelowa lub udowa²².
   4. Po zidentyfikowaniu kości kliknij lewym przyciskiem myszy na jednym końcu kości i ponownie na drugim końcu tkanki. Ta czynność pozwala oprogramowaniu obliczyć rozmiar kości.
      UWAGA: Aby uzyskać spójne pomiary, wybierz ten sam obszar anatomiczny kości dla każdego zwierzęcia. Na przykład głowa kości udowej jest używana jako jeden koniec, a kłykieć boczny jako drugi koniec kości udowej.
7. Analiza i normalizacja danych
   UWAGA: Dane dotyczące masy można uzyskać w sposób opisany w sekcji 3.5 i stosować w takiej postaci, w jakiej się znajdują. Alternatywnie, masa beztłuszczowa, tłuszczowa i kostna mogą być znormalizowane na dwa sposoby.
   1. Obliczyć stosunek masy tkanki do masy ciała zwierzęcia w dniu uzyskania obrazów.
      Normalizacja do masy ciała: Masa_{beztłuszczowa} ÷ Masa ciała
   2. Oblicz stosunek masy do wielkości kości (na przykład kości udowej lub piszczelowej).
      Normalizacja do kości udowej: Masa_chuda ÷ Rozmiar_{kości udowej}
      Normalizacja do kości piszczelowej: Masa_chuda ÷ Rozmiar_tibia
      UWAGA: Parametry normalizacji są wybierane na podstawie pytania eksperymentalnego. Jeśli spodziewane są zmiany w wielkości kości (na przykład: podczas porównywania przebudowy kości), sugeruje się normalizację ze względu na masę ciała (pozycja 3.7.1). Dodatkowo, jeśli w pytaniu eksperymentalnym spodziewane są zmiany masy ciała, sugerowanym parametrem normalizacji jest rozmiar kości długiej (pozycja 3.7.2).

Wyniki

Prawidłowe anatomiczne ułożenie zwierzęcia poddanego sedacji na stole do obrazowania zapewnia spójne i powtarzalne wyniki skanowania, podkreślając skuteczność pozyskiwania danych w osiąganiu wiarygodnych wyników. Właściwa sedacja zwierząt podczas obrazowania, w tym specjalistyczne systemy dostarczania gazów i waporyzatory, ma fundamentalne znaczenie dla precyzyjnych ocen anatomicznych (Rysunek 1).

Rysunek 2 ilustruje segmentację i renderowanie w różnych płaszczyznach anatomicznych, prezentując sekwencyjne obrazy w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej i poprzecznej. Obrazy te pokazują stopniową segmentację tkanki szkieletowej, tłuszczowej i beztłuszczowej, której kulminacją jest dokładnie segmentowana reprezentacja, która integruje wszystkie typy tkanek, podkreślając wyraźne rozróżnienie między tkankami i demonstrując oznaczenia specyficzne dla regionu na podstawie zidentyfikowanych typów tkanek. Pomimo ograniczeń sprzętowych uniemożliwiających przechwytywanie całego ciała, metoda dostarcza szczegółowych informacji na temat rozmieszczenia i składu tkanek na różnych płaszczyznach anatomicznych.

Rysunek 3 przedstawia rendery 3D podkreślające typy tkanek - kości (niebieskie), tkankę tłuszczową (żółte) i tkankę beztłuszczową (czerwone) - oferując kompleksową wizualizację struktur anatomicznych. Ta wizualizacja podkreśla skuteczność protokołu w generowaniu szczegółowych modeli 3D niezbędnych do badań anatomicznych.

Tabela 1 zawiera szczegóły znormalizowanej masy tkanek (beztłuszczowa masa, tkanka tłuszczowa i masa szkieletowa) w stosunku do wagi zwierzęcia w dniu obrazowania. Przedstawione wartości wynikają z pomnożenia objętości tkanki (w cm³) przez odpowiadającą jej gęstość tkanki, jak opisano w kroku 3.5.1.1 metodyki.

Tabela 2 zawiera bezwzględne wartości składu ciała, pokazujące rozkład masy każdego zwierzęcia oraz procentową zawartość tkanki tłuszczowej, tkanki tłuszczowej i tkanki szkieletowej. Pozwala nam to ocenić całkowitą ilość każdego rodzaju tkanki i sposób, w jaki przyczynia się ona do ogólnego składu ciała każdej próbki.

Tabela uzupełniająca S1 pokazuje czas potrzebny każdemu analitykowi na ukończenie analizy składu ciała dla każdego zwierzęcia oraz zmienność wyników między analitykami. Ocenia, czy istnieje znacząca zmienność między doświadczonymi (Analitycy 1, 2 i 5) i niedoświadczonymi operatorami (Analitycy 3 i 4) w pomiarze wskaźników składu ciała, takich jak masa beztłuszczowa, masa tkanki tłuszczowej i masa szkieletowa.

Rysunek 4 przedstawia porównawczą analizę składu ciała między osobami dorosłymi i starszymi. Ujawnia zmniejszenie procentu beztłuszczowej masy mięśniowej i zwiększenie tkanki tłuszczowej, co jest zgodne z typowymi wzorcami starzenia. Odkrycia te podkreślają solidność i precyzję protokołu obrazowania w dostarczaniu krytycznych danych anatomicznych, co jest niezbędne do rozwoju metodologii badań przedklinicznych.

Rysunek 1: Przygotowanie zwierząt. (A) Aparatura używana do sedacji zwierząt podczas całego procesu obrazowania, taka jak systemy dostarczania gazu i parowniki; B) system mikrotomografii komputerowej. (C) Znieczulone zwierzę leży na wznak na mysim łóżku. Prawidłowe pozycjonowanie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych i powtarzalnych wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Segmentacja i wizualizacja przekrojów w różnych płaszczyznach anatomicznych. (A) płaszczyzna czołowa, (B) płaszczyzna strzałkowa i (C) płaszczyzna poprzeczna. Od lewej do prawej obrazy pokazują skan niepodzielony na segmenty (szary), segmentację kości (niebieski), segmentację tkanki tłuszczowej (żółty), segmentację tkanki beztłuszczowej (czerwony) i wreszcie pełną segmentację, w tym wszystkie segmentacje. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Renderingi 3D. Od lewej do prawej obrazy przedstawiają renderowanie 3D obiektu, podkreślając różne typy tkanek: kość na niebiesko, tkanka tłuszczowa na żółto, tkanka beztłuszczowa na czerwono, a końcowy obraz przedstawia kompleksowy widok łączący kości, tkankę tłuszczową i tkankę beztłuszczową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Porównanie składu ciała myszy dorosłych i starszych. Wykres słupkowy ilustruje procentowy skład tkanki szkieletowej (dorośli: 10,5 ± 0,5%; osoby starsze: 9,9 ± 1,0%, p = 0,19%), tkanki tłuszczowej (dorośli: 17,2 ± 5,7%; osoby starsze: 27,9 ± 4,4%, p = 0,03) oraz beztłuszczowej masy ciała (dorośli: 72,3 ± 5,7%; osoby starsze: 62,3 ± 3,6%, p = 0,03). Dane przedstawiono jako ŚREDNIĄ ± SD od zwierząt (dorosłe: n = 3; osoby w podeszłym wieku: n = 3). Statystyki obliczono przy użyciu niesparowanego testu t z jednostronną wartością p (* p < 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

LEAN
Identyfikator zwierzęcia	Beztłuszczowa masa (g)	Waga (g)	Normalizacja (waga)
Osoby w podeszłym wieku 1	Rozdział 15.1	37,4	0,4
Osoby w podeszłym wieku 2	14,4	44,4	0,3
Osoby w podeszłym wieku 3	Rozdział 14,3	37,7	0,4
Dorosły 1	Rozdział 12.3	Rozdział 29,1	0,4
Dorosły 2	Rozdział 16,5	30,4	0,5
Dorosły 3	Rozdział 16.1	31,7	0,5
TŁUSZCZ CIAŁA
Identyfikator zwierzęcia	Masa tkanki tłuszczowej (g)	Waga (g)	Normalizacja (waga)
Osoby w podeszłym wieku 1	6,4	37,4	0,2
Osoby w podeszłym wieku 2	8,2	44,4	0,2
Osoby w podeszłym wieku 3	5.3	37,7	0,1
Dorosły 1	4.4	Rozdział 29,1	0,2
Dorosły 2	2.7	30,4	0,1
Dorosły 3	3.4	31,7	0,1
SKELETALICZNY
Identyfikator zwierzęcia	Masa szkieletowa (g)	Waga (g)	Normalizacja (waga)
Osoby w podeszłym wieku 1	2.3	37,4	0,06
Osoby w podeszłym wieku 2	2.3	44,4	0,05
Osoby w podeszłym wieku 3	2.4	37,7	0,06
Dorosły 1	2.0	Rozdział 29,1	0,07
Dorosły 2	2.3	30,4	0,08
Dorosły 3	2.2	31,7	0,07

Tabela 1: Normalizacja mas według wagi zwierzęcia w dniu obrazowania. Jak wyjaśniono w sekcji 3.7, masę tkanki można znormalizować na podstawie masy ciała zwierzęcia w dniu badania. Ta normalizacja została zastosowana do tkanki beztłuszczowej, tłuszczowej i kostnej w oparciu o masę ciała zwierzęcia.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt.

Skład ciała (g)
	Objętość segmentacji x 1,05	Objętość segmentacji x 0,95	Objętość segmentacji x 1,92	Szczupłe + Tkanka tłuszczowa + Szkieletowa
Identyfikator zwierzęcia	Beztłuszczowa masa (g)	Masa tkanki tłuszczowej (g)	Masa szkieletowa (g)	Masa całkowita (g)
Osoby w podeszłym wieku 1	Rozdział 15.1	6,4	2.3	Rozdział 23,8
Osoby w podeszłym wieku 2	Rozdział 14,3	8,2	2.3	24,9
Osoby w podeszłym wieku 3	Rozdział 14,3	5.3	2.4	22,0
Dorosły 1	Rozdział 12.3	4.4	2.0	Rozdział 18,6
Dorosły 2	Rozdział 16,5	2.7	2.3	21,5
Dorosły 3	Rozdział 16.1	3.4	2.2	21,7
Skład ciała (%)
Identyfikator zwierzęcia	Beztłuszczowa masa (%)	Masa tkanki tłuszczowej (%)	Masa szkieletu (%)	Masa całkowita (%)
Osoby w podeszłym wieku 1	63,6	26,8	9,6	100
Osoby w podeszłym wieku 2	58,1	32,8	9,0	100
Osoby w podeszłym wieku 3	64,9	Rozdział 24,1	11,0	100
Dorosły 1	65,9	23,5	Rozdział 10.6	100
Dorosły 2	76,8	Rozdział 12.4	Rozdział 10,9	100
Dorosły 3	74,3	Rozdział 15,7	Pytanie 9,9	100

Tabela 2: Skład ciała. (A) Skład ciała zwierząt w gramach; (B) procentowy skład ciała.

Tabela uzupełniająca S1: Skład ciała oceniany przez różne operatory. Dla każdej oceny zarejestrowano masę beztłuszczową, masę tkanki tłuszczowej, masę szkieletową oraz czas potrzebny na analizę (w minutach). Analitycy 1, 2 i 5 byli doświadczonymi operatorami, podczas gdy analitycy 3 i 4 byli niedoświadczeni i przestrzegali tylko protokołu opisanego w badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Zakres gęstości różnych materiałów biologicznych i niebiologicznych. Rysunek ilustruje zakresy gęstości różnych tkanek biologicznych i substancji niebiologicznych. Wartości uzyskano z literatury i dostosowano w celu uzyskania optymalnego różnicowania tkanek. Największą gęstość wykazują kości, następnie tkanka beztłuszczowa, natomiast tkanka tłuszczowa wykazuje znacznie mniejszą gęstość. Urządzenie zostało skalibrowane z wodą jako punktem odniesienia przy gęstości 0. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ocena za pomocą tomografii jest skuteczną i nieinwazyjną metodą uzyskiwania szczegółowych informacji o składzie ciała. W szczególności mikrotomografia komputerowa oferuje cenne mierniki wyników w badaniach przedklinicznych. W dziedzinie kości mikrotomografia komputerowa ma różne zastosowania, ponieważ analiza mikroarchitektury²³ i przebudowa kości²⁴ są szczególnie interesujące. Ocena morfologii wewnętrznej struktury biologicznej jest również istotna w badaniach biomedycznych, ponieważ analiza gęstości naczyń krwionośnych w określonej tkance może ocenić jej funkcję i wywnioskować o metabolizmie²⁵. W badaniach endokrynologicznych i metabolicznych masy tłuszczowej zastosowanie mikrotomografii komputerowej dostarcza podstawowych informacji u żywych małych zwierząt^26,27. Ponadto mikrotomografia komputerowa może być stosowana w innych dziedzinach, takich jak zoologia i botanika, gdzie służy do oceny struktur małych owadów i roślin^28,29.

Istotnym ograniczeniem mikrotomografii komputerowej jest wysoki koszt i ograniczony dostęp do oprogramowania do analizy obrazu. Ponadto wcześniejsza wiedza anatomiczna, zwłaszcza z zakresu anatomii zwierząt, jest niezbędna do prawidłowych pomiarów. Ten manuskrypt przedstawia oprogramowanie 3D slicer, które jest w stanie uzyskać wyniki porównywalne z komercyjnymi alternatywami. System ten zmniejsza również zapotrzebowanie na rozległą wiedzę anatomiczną, ponieważ jest półautomatyczny³⁰.

Obrazy uzyskane za pomocą mikro-CT i przeanalizowane przez oprogramowanie wykazały, że skład ciała myszy podąża podobną trajektorią do człowieka podczas starzenia się, charakteryzując się wzrostem całkowitej tkanki tłuszczowej i jednoczesnym spadkiem beztłuszczowej masy ciała³¹. Wyniki te były widoczne podczas porównywania dorosłych myszy (6 miesięcy) z myszami w podeszłym wieku (22 miesiące).

Ze względu na ograniczenia sprzętu, maska anestezjologiczna blokuje nabycie głowy. W związku z tym nie udało nam się uchwycić i dokładnie podzielić całej głowy. W rezultacie ustaliliśmy konwencję używania kości atlasu (C1) jako anatomicznego punktu odniesienia, koncentrując naszą analizę na obszarze poniżej tego punktu w użytym tu sprzęcie. W związku z tym wszystkie obrazy powyżej C1 zostały wybrane do usunięcia. Sprzęt nie uzyskał pełnej długości ogona. W ten sposób ogon został usunięty z obszaru podstawy we wszystkich analizach. Sugerujemy, aby użytkownik ustalił punkty anatomiczne dla wybranych wykluczonych obszarów, aby zachować powtarzalność między eksperymentami.

W artykule przedstawiono metodę analizy obrazów tomograficznych przy użyciu dostępnego i opłacalnego protokołu. Oprogramowaniu udało się rozróżnić trzy typy tkanek: masę beztłuszczową, tkankę tłuszczową i tkankę szkieletową. Nie był jednak w stanie odróżnić mięśni szkieletowych od narządów trzewnych, co jest częstym wyzwaniem w analizie składu ciała myszy.

Mikrotomografia komputerowa nie ma zdolności do różnicowania tkanki trzewnej i masy mięśni szkieletowych. Pomimo tego ograniczenia, nasze wyniki pokazują wartość oprogramowania w badaniu chorób wpływających na skład ciała, szczególnie tych wpływających na mięśnie szkieletowe, takich jak przerost lub atrofia. Można go powtórzyć jako badanie nieinwazyjne, umożliwiające podłużne monitorowanie składu ciała. Ta zdolność pomaga w ocenie leczenia ochronnego i opracowywaniu protokołów modelowania wielu chorób metabolicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3DSlicer, wersja 5.6.2		3D Slicer	Darmowe oprogramowanie typu open source do analizy obrazów i wizualizacji naukowej.
Amide, wersja 1.0.1	Platforma		Darmowe oprogramowanie typu open source służące do korygowania wartości jednostek Hounsfielda w przetwarzanych obrazach DICOM.
Amira, wersja 4.1	Thermo Fisher Scientific		Służy do ekstrakcji powietrza i wody wartości jednostki Hounsfielda z surowych danych fantomu oraz do konwersji obrazów na pliki DICOM.
Izoforyna	Crist&aaostry; lia		Isoflurane jest niepalnym płynnym środkiem znieczulającym do stosowania w ogólnym znieczuleniu wziewnym przez waporyzację.
Podsystem Triumph XO	Gamma Medica-Ideas Flex		Zaawansowany podsystem obrazowania przeznaczony do przedklinicznego obrazowania małych zwierząt, oferujący możliwości CT i PET o wysokiej rozdzielczości do analizy ilościowej i jakościowej.