Pomimo znacznych wysiłków w leczeniu ran przewlekłych, sukces był ograniczony. Procesy komórkowe i molekularne, które zakłócają normalne gojenie i przyczyniają się do inicjacji i rozwoju ran przewlekłych, nie są dobrze poznane. W rezultacie, opracowanie skutecznych metod leczenia tych ran okazało się wyzwaniem. Dzieje się tak przede wszystkim z powodu braku modeli zwierzęcych, które naśladują rany przewlekłe u ludzi oraz dlatego, że eksperymenty na ludziach z ranami przewlekłymi są ograniczone. Wcześniej opublikowaliśmy model mysi do badania ran przewlekłych, które mają wiele cech wspólnych z przewlekłymi ranami cukrzycowymi u ludzi. Model ten uwzględnia obecność biofilmów powstałych naturalnie z bakterii występujących w mikrobiocie skóry i środowisku bez konieczności wprowadzania bakterii zewnętrznych do ran. W związku z tym model ten może potencjalnie przyczynić się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób rany stają się przewlekłe. Tutaj przedstawiamy aktualizację oryginalnego protokołu rozwoju tego modelu myszy. Skoncentrowaliśmy się na zmniejszeniu śmiertelności myszy z ~30% do ~5%. Opisujemy również, w jaki sposób model ten został wykorzystany do zrozumienia inicjacji i progresji przewlekłości ran poprzez zastosowanie podejść transkryptomicznych nowej generacji, wyjaśnienie dynamiki populacji bakterii podczas infekcji i rozwoju biofilmu oraz wykazanie wartości testowania skuteczności leczenia, w tym małych cząsteczek. Jak dotąd jest to jedyny model rany przewlekłej, który nie goi się bez interwencji.
Artykuł metodologiczny
Protokół tworzenia ran przewlekłych u myszy z cukrzycą - aktualizacja opublikowanego protokołu
W tym artykule
Streszczenie
Wprowadzenie
To jest aktualizacja istniejącego artykułu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć oryginalną wersję.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
AKTUALIZACJE:
To jest aktualizacja protokołu przedstawionego wcześniej1
Wszystkie eksperymenty zostały zakończone zgodnie z przepisami federalnymi oraz polityką i procedurami Uniwersytetu Kalifornijskiego, które zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski, Riverside IACUC.
1. Zwierzę
Dodaj następującą notatkę do kroku 1.1:
UWAGA: Jeśli homozygotyczne myszy z cukrzycą są kupowane bezpośrednio od dostawców, trzymaj je w konwencjonalnym wiwarium, aby umożliwić kolonizację skóry normalną florą skórną. Można stosować zarówno mężczyzn, jak i kobiety.
Dodaj następującą sekcję po kroku 1.3:
1.4.Wykonaj genotypowanie
UWAGA: Przeprowadź genotypowanie po hodowli zwierzęcia zgodnie z wcześniejszym opisem do kroku 1.31. Poniższy protokół został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej procedury2. Zarówno samce, jak i samice myszy mogą być genotypowane już po 14-21 dniach po odsadzeniu.
1.4.1. Ekstrakcja surowego DNA
1.4.1.1. Pobrać biopsję z przebicia ucha od myszy i umieścić próbkę tkanki w probówce do mikrowirówki.
1.4.1.2. Dodaj 180 μL z 50 mM NaOH, upewniając się, że próbka jest zanurzona.
1.4.1.3. Inkubować próbkę w temperaturze 95 °C przez 10 minut, rozhermetyzować i wirować probówkę co 5 minut.
1.4.1.4. Schłodzić próbkę na lodzie przez co najmniej 1 minutę.
1.4.1.5. Dodaj 20 μL 1 M Tris HCl o pH 8,0 i wiruj.
1.4.1.6. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
1.4.2. Reakcja łańcuchowa polimerazy
1.4.2.1 Złóż następującą mieszankę starterów w probówce do mikrowirówek (Tabela Starterów).
UWAGA: Startery wzmacniają obszar wokół punktowej mutacji LepR.
1.4.2.2. Ustaw 20 μL reakcji łańcuchowych polimerazy w probówkach PCR. Dodać 10 μl 2x głównej mieszanki polimerazy Taq (która zawiera polimerazę DNA Taq, dNTP, MgCl2 i KCI), 1 μl mieszaniny starterów (patrz Tabela starterów), 4 μl surowego ekstraktu DNA i 5 μl H2O.
1.4.2.3. Ustaw parametry termocyklingu w następujący sposób: 94 °C przez 2 min; 40 cykli po 97 °C przez 30 s, 52 °C przez 45 s i 72 °C przez 45 s; następnie 72 °C przez 2 minuty i 10 °C przez nieskończone podtrzymanie.
1.4.2.4. Po zakończeniu PCR, dodaj 4 μL 6x barwnika ładującego DNA do produktów PCR i rozdziel na 2% żelu agarozowym (Rysunek 1).
UWAGA: Każda reakcja PCR generuje 3 produkty PCR: wspólny produkt 610 pz, zmutowany produkt allelu T 406 pz i 264 pz allel G typu dzikiego. Genotyp typu dzikiego składa się z produktów 610 pz i 264 pz, genotyp heterozygoty składa się ze wszystkich trzech produktów, a genotyp db/db składa się z produktów 610 pz i 406 pz.
2. Wiwarium i hodowla
Zamień Krok 2.1 na następujący krok i notatkę:
2.1 Myszy db/db należy przechowywać w konwencjonalnym wiwarium (nie w obiekcie barierowym/wolnym od specyficznych patogenów), aby mikroflora mogła zadomowić się na skórze myszy db/db. Aby konkretnie modelować ludzi, którzy cierpią z powodu przewlekłych ran, nie należy podejmować specjalnych środków ostrożności, aby zapobiec narażeniu na naturalne patogeny występujące w środowisku myszy, ponieważ kluczowe patogeny w badaniu mogą zostać utracone w bardziej rygorystycznych warunkach czystości wiwarium.
UWAGA: Ponieważ te myszy są bardzo duże i chorują na cukrzycę, najlepiej jest trzymać do 3 myszy db / db na klatkę przed użyciem ich do eksperymentów z przewlekłymi ranami.
3. Wymagania dotyczące rozwoju ran przewlekłych
Dodaj następujący krok po kroku 3.2
3.3. Utrzymuj ranę przykrytą przezroczystą folią przez cały czas, aby uniknąć wysuszenia tkanki rany.
5. Konfiguracja odczynnika
Dodaj następującą notatkę po 5.2
UWAGA: Używaj tylko ATZ firmy wymienionej w Table of Materials. ATZ innych firm nie jest kompatybilny z tym modelem i zwiększy śmiertelność.
6. Chirurgia
6.1. Leczenie i znieczulenie
UWAGA: Zaktualizowany schemat znieczulenia jest opisany poniżej.
6.1.5. W systemie otwartym, podaj 5% izofluranu dostarczonego zO2 do myszy o natężeniu przepływu (2-3,5 L/min) w celu wywołania znieczulenia. Stale monitoruj stan myszy.
UWAGA: Gdy mysz jest nieprzytomna lub już się nie rusza, umieść ją na białej podkładce chirurgicznej i dopasuj do głowy stożek nosowy, który jest przymocowany do waporyzatora, aby umożliwić ciągłe podawanie izofluranu podczas operacji.
6.1.6. W systemie otwartym, podawaj 1% izofluranu przy tym samym natężeniu przepływu podczas operacji i dostosuj przepływ izofluranu, aby utrzymać głębokość znieczulenia.
6.3. Ranienie
6.3.5. Na koniec procedury należy przerwać podawanie 1% izofluranu myszy.
7. Leczenie pooperacyjne i rekonwalescencja
Zamień Krok 7.1 w oryginalnym protokole na następujący krok i zwróć uwagę:
7.1. Po nałożeniu przezroczystego opatrunku filmowego zaraz po operacji, za pomocą strzykawki insulinowej, umieść MSA miejscowo na wierzchu rany powstałej na grzbiecie myszy, penetrując przezroczystą folię opatrunkową za pomocą igły. Zużyć 150 mg/kg MSA w sterylnym roztworze PBS w ciągu 10 minut po zabiegu. Stężenie to zostało określone po szeroko zakrojonym przeszukiwaniu literatury, jak wyjaśniono wcześniej3,4.
UWAGA: MSA ma tendencję do wytrącania się, jeśli nie jest stale poruszony. Upewnij się, że MSA jest całkowicie rozpuszczony w roztworze przed nałożeniem go na ranę, aby dostarczyć obliczoną dawkę myszy.
Zamień krok 7.4 w oryginalnym protokole na następujący krok:
7.4. Drugą dawkę leku Buprenex należy podać 6 godzin po zabiegu. Następnie należy okresowo podawać dawki myszom zgodnie z lokalnymi zasadami IACUC przez pierwsze 48 godzin
UWAGA: Nie zaleca się stosowania preparatów przeciwbólowych o przedłużonym uwalnianiu, które muszą być podawane podskórnie w tym modelu myszy. Buprenorfina związana z lipidami może być zawieszona w oleju z trójglicerydów średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych (MCT). Podczas gdy wpływ oleju MCT został przetestowany na bardzo młodych myszach db/db, wpływ MCT na starsze lub geriatryczne otyłe myszy db/db nie został przetestowany5,6. Biorąc pod uwagę masę myszy, duże ilości leków przeciwbólowych wstrzykiwanych podskórnie w pobliżu rany mogą znacząco wpływać na komórkowe i molekularne procesy gojenia się ran oraz inicjacji i rozwoju ran przewlekłych. Ponadto ten środek przeciwbólowy rozpuści się w wysokim poziomie tłuszczu u tych myszy, a zatem może nie być skuteczny w zabijaniu bólu i może stać się toksyczny.
8. Zbieranie danych, postępowanie z myszami po zranieniu, strategie przetrwania i dodatkowe wskazówki
8.1 Zbieranie danych
Dodaj następujące kroki po kroku 8.1.3.
8.1.4. Upewnij się, że tkanka pobrana do analizy powinna zawierać tylko tkankę, która jest oddalona o 2 mm od brzegu rany zarówno w przypadku ran kontrolnych, jak i przewlekłych. Rany można pobrać przez wycięcie już po 1-2 godzinach od aplikacji MSA.
8.1.5. Zebrać nadmiar płynu nagromadzonego z rany lub wysięk z rany za pomocą sterylnej strzykawki, przebijając przezroczystą folię. Przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku badań bakteryjnych lub -80 °C w przypadku badań chemicznych i molekularnych.
8.1.6 Aby zebrać całe tkanki rany, w tym biofilm, po 10 dniach, nałóż 4% PFA w PBS na ranę, miejscowo na 10 minut przed wycięciem kleszczami i nożyczkami. Podczas usuwania tkanki należy dodać dodatkowy margines rany o szerokości 5-10 mm, aby tkanka rany była wsparta dodatkową normalną tkanką. Kontynuować utrwalanie w 4% PFA w PBS, a następnie pranie i przygotowanie do zatapiania.
UWAGA: Rany przewlekłe 10 dni po operacji mogą stać się zbyt delikatne, aby można je było pobrać do badania histologicznego.
8.5. Strategie przetrwania
8.5.1. Zapewnij dodatkowe wsparcie w nawadnianiu: Sprawdź, czy myszy stają się ospałe i nie jedzą ani nie piją, ponieważ operacja i generowanie przewlekłości są stresujące. Ciepłą (35-38 °C) sól fizjologiczną podawać podskórnie lub dootrzewnowo w objętości 0,25 ml na 10 g masy ciała w ciągu pierwszych 48-72 godzin po operacji. Wsparcie nawodnienia może być potrzebne do 2-3 razy dziennie, w zależności od tego, jak ospałe są myszy. Ponadto granulki pokarmowe i żele wodne można umieścić w ściółce, aby zapewnić łatwy dostęp, chociaż może być wymagana częstsza zmiana klatki.
8.5.2. Zapewnij dodatkowe wsparcie ciepła: Przeżywalność po operacji jest znacznie zwiększona, jeśli myszy są umieszczane w klatkach na podkładce ogrzanej przez krążącą wodę (93 oC) bezpośrednio po operacji i podczas pobytu w wiwarium. Umieść klatkę 1/2 na podkładce i 1/2 poza podkładką, aby zwierzę mogło odsunąć się od ciepła, jeśli jest mu zbyt gorąco i przesunąć się na wierzchu podkładki, jeśli zmarznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1: Genotypowanie w celu identyfikacji heterozygot w celu stworzenia hodowców. Przykładowy żel pokazuje wyniki 8 nieznanych próbek myszy. Próbki 2 i 5 są heterozygotami, ponieważ zawierają 3 prążki (610 pz, 406 pz i 264 pz). Próbki 1, 3, 4, 6, 7 i 8 są typami dzikimi, ponieważ zawierają tylko 2 pasma (610 pz i 264 pz).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wyniki badań przeprowadzonych przy użyciu tego modelu ran przewlekłych:
Model ten został wykorzystany do przeprowadzenia kilku badań w celu zrozumienia komórkowych i molekularnych mechanizmów inicjacji i progresji ran przewlekłych. Wykazano, że poprzez hamowanie enzymów przeciwutleniających u myszy db / db mogą powstawać przewlekłe rany. Rany początkowo zawierały społeczność wielodrobnoustrojową, która z czasem została wyselekcjonowana pod kątem określonych bakterii ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dziurkacz do uszu 1 mm | Fisherbrand | 13812201 | Średnica otworu 2 mm |
| 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% etanol | |||
| Acu Punch 7mm stemple do biopsji skóry | Acuderm Inc. | P750 | |
| agaroza | |||
| Klasa B6. BKS(D)-Leprdb/J | Laboratorium Jacksona | 00697 | Dostępne homozygoty i heterozygoty |
| Buprenex (chlorowodorek buprenorfiny) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0,3 mg / ml, barwnik |
| ładujący żel klasy 3, fioletowy (6X) | New England Biolabs | B7024S Rękawiczki | |
| Balsam do depilacji z kojącym aloesem i lanoliną | Nair | chemiczna depilacja | |
| Terapia cieplna Pompa (woda) HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Poduszka grzewcza | Conair | Moist Dry Adaptery węży do podkładek grzewczych | |
| Adroit MedicalSystems | |||
| Strzykawki insulinowe | BD | 329461 | 0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2") |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Waporyzator izofluranowy | JA Baulch & Współpracownicy | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Koc Hiperhipotermia | Cincinnati Sub-Zero | Nr kat. 247 | 22" x30" Wielorazowa podkładka HeavyDuty Kwas |
| merkaptobursztynowy (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Stożek | |||
| Zbiornik tlenu | musi być kompatybilny z systemem waporyzacji | ||
| Roztwór buforu fosforanowego (PBS) | sterylizowany w autoklawie | ||
| Ostre nożyczki | |||
| małe plastikowe pojemniki | |||
| Wodorotlenek sodu | |||
| Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Przezroczysty opatrunek foliowy (6 cm x 7 cm) |
| Cienka metalowa szpatułka | |||
| Tri-HCl | |||
| Pęseta | |||
| do rurki | |||
| Maszynka do strzyżenia włosów | Wahl | Lithium Ion Pro |
Bibliografia
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie