Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Summary

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Abstract

Organoidy ludzkiego mózgu to trójwymiarowe (3D) struktury pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), które rekapitulują aspekty rozwoju mózgu płodu. Fuzja organoidów mózgowych grzbietowych z brzusznymi określonymi regionalnie in vitro generuje asembloidy, które mają funkcjonalnie zintegrowane mikroobwody z neuronami pobudzającymi i hamującymi. Ze względu na swoją złożoność strukturalną i zróżnicowaną populację neuronów, asembloidy stały się użytecznym narzędziem in vitro do badania nieprawidłowej aktywności sieci. Zapisy z matrycą wieloelektrodową (MEA) służą jako metoda wychwytywania potencjałów pola elektrycznego, skoków i dynamiki sieci podłużnej z populacji neuronów bez naruszania integralności błony komórkowej. Jednak przyklejanie asembloidów do elektrod w celu długotrwałych nagrań może być trudne ze względu na ich duży rozmiar i ograniczoną powierzchnię styku z elektrodami. W tym miejscu demonstrujemy metodę umieszczania asembloidów na płytkach MEA w celu rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej w okresie 2 miesięcy. Chociaż obecny protokół wykorzystuje organoidy ludzkiej kory mózgowej, można go w dużym stopniu dostosować do organoidów zróżnicowanych w celu modelowania innych obszarów mózgu. Protokół ten ustanawia solidny, podłużny, elektrofizjologiczny test do badania rozwoju sieci neuronalnej, a platforma ta ma potencjał do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków w celu opracowania terapii padaczki.

Introduction

Organoidy mózgowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są przestrzennie samoorganizującymi się strukturami 3D, odzwierciedlającymi architekturę tkanek i trajektorie rozwoju in vivo. Składają się z wielu typów komórek, w tym komórek progenitorowych (komórki neuronabłonkowe, glej promieniowy, progenitory neuronalne, progenitory glejowe), neurony (neurony pobudzające podobne do kory mózgowej i interneurony hamujące) oraz komórki glejowe (astrocyty i oligodendrocyty)^1,2. Assembloidy reprezentują następną generację organoidów mózgowych, zdolnych do integracji wielu regionów mózgu i/lub linii komórkowych w kulturze 3D. Stanowią one użyteczne narzędzie do modelowania połączeń między różnymi regionami mózgu przypominającymi ich odpowiedniki in vivo, rejestrowania interakcji między neuronami i astrocytami w celu lepszego naśladowania dojrzałych i złożonych sieci neuronowych oraz badania montażu obwodów neuronowych. W związku z tym asembloidy stają się szeroko stosowanym narzędziem do podsumowania cech charakterystycznych patofizjologii padaczki, w której niezbędne są środki funkcjonalne do zbadania nieprawidłowych sieci neuronowych, które mogą leżeć u podstaw przyczyny choroby^3,4,5,6.

Aby modelować interakcje między neuronami glutaminergicznymi kory mózgowej a interneuronami GABA-ergicznymi, kilka grup rozwinęło oddzielne organoidy przypominające grzbietowy i brzuszny mózg, a następnie połączyło je razem w wieloregionalny assembloid7^,8,9,10. W tym przypadku zastosowano wcześniej opisany protokół hodowli asembloidów z regionalnie specyficznymi podtypami neuronalnymi⁹. Jednak istotną barierą jest brak powtarzalnych testów funkcjonalnych do monitorowania aktywności sieci neuronowych podczas rozwoju neurologicznego. Wiele testów funkcjonalnych sieci w organoidach daje wyniki, które wykazują dużą zmienność między partiami różnicowania i liniami komórkowymi. Techniki, które polegają na krojeniu lub dysocjacji organoidów, zmieniają ich nieodłączne sieci poprzez zerwanie połączeń synaptycznych⁸.

Matryce wieloelektrodowe (MEA) zapewniają duży wgląd w aktywność sieci w czasie z wysoką rozdzielczością czasową, aby scharakteryzować właściwości elektrofizjologiczne organoidów bez zakłócania warunków hodowli lub integralności błony komórkowej¹¹. W porównaniu z elektrofizjologią patch clamp, MEA umożliwia wysokoprzepustowe pozyskiwanie danych w oparciu o duże populacje neuronów, a nie pojedyncze komórki. Platformy MEA różnią się gęstością elektrod, zaspokajając różne potrzeby w badaniach nad organoidami mózgu¹². Powszechnie stosowane systemy, jak pokazano w tym protokole, rejestrują od 8 do 64 elektrod na studzienkę^13,14,15. MEA o dużej gęstości z maksymalnie 26 400 elektrodami na odwiert umożliwiają zwiększenie rozdzielczości przestrzennej i czasowej, kwantyfikację szybkości propagacji potencjału czynnościowego oraz połączenie ze stymulacją optogenetyczną^14,16,17. Dlatego MEA służy jako potężne narzędzie do modelowania padaczki in vitro i paradygmat translacyjny do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych.

Jednym z głównych wyzwań jest ustabilizowanie dużych asembloidów na hydrofobowej powierzchni metalowej dla długotrwałych zapisów. Protokół ten przedstawia szczegółową metodologię powlekania nienaruszonych asembloidów na płytkach MEA w celu długoterminowego zapisu podłużnego wraz z testami farmakologicznymi. Unikalne zalety protokołu obejmują stabilne przyleganie asembloidów do powierzchni elektrody bez utraty aktywności elektrycznej, wykorzystanie dostępnych na rynku neurofizjologicznych pożywek podstawowych w celu przyspieszenia dojrzewania sieci funkcjonalnej po posiewaniu, możliwość przeprowadzania dalszych testów funkcjonalnych, takich jak leczenie farmakologiczne, oraz szerokie zastosowanie do organoidów generowanych za pomocą innych protokołów specyficznych dla regionu.

Celem jest dostarczenie funkcjonalnego testu o wysokiej rozdzielczości czasowej do badania aktywności sieci, badania zmian specyficznych dla choroby i testowania leków o potencjale terapeutycznym w padaczce. Instrukcje wideo są dostępne dla najtrudniejszych etapów tego protokołu, pokazując techniki powlekania asembloidów na płytach MEA, a także reprezentatywne nagrania z tych kultur.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne przedstawione poniżej zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Michigan oraz Komitetu Nadzoru nad Ludzkimi Pluripotencjalnymi Komórkami Macierzystymi. Linie iPSC użyte w tym protokole i reprezentatywnych eksperymentach pochodziły z ludzkich fibroblastów napletka uzyskanych ze źródła komercyjnego. Szczegółowe informacje na temat linii komórkowych, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wyprowadzanie organoidów mózgowych specyficznych dla losu z iPSC

UWAGA: Ten protokół zawiera informacje dotyczące przygotowania 3 dołków na płytce do hodowli mikrodołków z 5 zlewających się (~85%) studzienek płytki 6-dołkowej. Protokół konserwacji iPSC różni się w zależności od linii komórkowych.

1. Przygotować poszczególne podłoża do hodowli komórkowych, stosując skład wyszczególniony w tabeli 1. Przechowywać w chronić przed światłem w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
2. Przepłukać wszystkie studzienki, które mają być użyte na płytce do hodowli mikrostudzienki, 1 ml DMEM/F-12 jeden raz. Dodać 1 ml/studzienkę mTeSR plus + 50 μM Y-27632 i obracać płytkę o masie 2000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mikrostudzienek. Przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%_CO2.
3. Oczyść obszary zróżnicowanych iPSC za pomocą sterylnej końcówki pipety P10 pod mikroskopem w czystym stanowisku z przepływem laminarnym. Zmyć resztki komórek z monowarstwy za pomocą 1 ml / studzienka PBS bez wapnia i magnezu.
4. Zdysocjuj monowarstwę na pojedyncze komórki, dodając 1 ml / studzienkę wstępnie podgrzanego odczynnika do dysocjacji komórek i umieszczając płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO₂ na 4-7 minut (w zależności od charakterystyki i zbiegu linii komórkowych), aż większość komórek oderwie się, z delikatnym mieszaniem co 2-3 minuty.
5. Dodać 4 ml DMEM/F-12 do każdej studzienki w celu rozcieńczenia odczynnika do dysocjacji komórek i umiarkowanie rozcierać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Zawiesinę komórek ze wszystkich studzienek tej samej linii zebrać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
6. Wirować w temperaturze 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej, odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i ponownie zawiesić komórki w 2 ml mTeSR plus + 50 μM Y-27632. Wyjmij 10 μl zawiesiny komórek, wymieszaj 1:1 (v/v) z błękitem trypanowym i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
7. Płytka 3 x 10⁶ żywych komórek na studzienkę, 3 dołki na linię. W razie potrzeby dodaj dodatkowy mTeSR plus + 50 μM Y-27632, aby zwiększyć całkowitą objętość do 2 ml / studzienkę. Obracać płytkę o masie 100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i umieścić z powrotem w inkubatorze.
   UWAGA: Zastosowana tutaj płytka do hodowli mikrodołków zawiera 300 mikrodołków na studzienkę, więc posiew 3 x 10⁶ komórek daje 10 000 komórek/mikrostudzienkę.
8. Następnego dnia należy zmienić pożywkę o połowę, delikatnie usuwając 1 ml pożywki i powoli dodając 1 ml pożywki mTeSR plus (bez Y-27632) za pomocą końcówki do pipety P1000. Trzymaj końcówkę blisko powierzchni podłoża i zasysaj tak wolno, jak to możliwe, aby nie przeszkadzać komórkom agregującym na dole.
9. Sprawdź pod odwróconym mikroskopem jeden dzień po zmianie pożywki, a zobaczysz wyraźny zarys każdego agregatu. Usuń oryginalne media z każdej studzienki za pomocą końcówek do pipet P1000.
10. Umiarkowanie spryskaj 0,5 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM) z grzbietomorfiną (DM) i SB-4321542 (SB) do każdej studzienki za pomocą sterylnych, ciętych końcówek P1000. Natychmiast delikatnie odpipetować kruszywa zawieszone w pożywce i przenieść je do sterylnego naczynia do hodowli zawiesiny o średnicy 10 cm. Powtarzaj, aż wszystkie agregaty zostaną przeniesione. NIE rozcierać.
11. W razie potrzeby dodaj więcej NIM + SB/DM, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 ml / naczynie. Umieścić naczynie na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO_{2 ,} aby zapobiec spontanicznemu łączeniu się agregatów. Oznacz datę transferu jako dzień 0 hodowli organoidów.
12. Od dnia 1 do końca postępuj zgodnie z przepisem na media w Tabeli 1 i osią czasu zmiany nośnika⁹ w Rysunek 1. Warto zauważyć, że organoidy są podzielone na dwie zawiesinowe płytki hodowlane oznaczone jako "grzbietowe" i "brzuszne" w dniu 4.
    UWAGA: Kilka kluczowych punktów czasowych, o których należy pamiętać: ekspansja organoidów rozpoczyna się w dniu 6, kiedy pożywka jest przełączana na pożywkę różnicowania neuronalnego (NDM) z EGF/FGF. Różnicowanie neuronów jest wspierane od 25 dnia przez NDM + BDNF / NT3, a organoidy są utrzymywane w NDM bez czynników wzrostu, począwszy od 46 dnia.

2. Etykietowanie wirusów i generowanie asembloidów

UWAGA: Etykietowanie wirusów^7,9jest zalecane do rozpoznawania tożsamości każdego organoidu specyficznego dla regionu w asembloidzie i przypisywania aktywności elektrofizjologicznej z określonych elektrod do regionów asembloidu. Optymalnie jest, jeśli dla każdego dołka MEA posiewany jest tylko jeden organoid. Protokół ten może mieć również zastosowanie do posiewu pojedynczych organoidów.

1. Obliczyć objętości materiału wyjściowego wirusa i pożywki rozcieńczającej, które należy zastosować: do każdego organoidu, który ma być oznakowany, potrzeba 200 μl pożywki z wirusem. Organoidy grzbietowe są znakowane pAAV1-CAG-tdPomidor, zwykle w stosunku rozcieńczenia 1:1000 (v/v) lub około 2 x^{10 10} vg / ml. W przypadku organoidów brzusznych stosuje się wirusa 1:300 (v/v) lub 2 x 10¹¹ vg/mL wirusa pAAV1-mDLX-GFP.
   UWAGA: Rozcieńczenia należy miareczkować do pożądanego efektu i ma na nie wpływ miano wirusa.
2. Rozgrzać odpowiednią ilość podłoża do temperatury 37 °C. Rozmrozić zapas wirusa przechowywany w temperaturze -80 °C na lodzie. Oznacz wystarczającą ilość 48-dołkowych płytek, aby pomieścić wszystkie oznakowane organoidy.
3. Umieść zlewkę zawierającą 10% wybielacza w kapturze. Wszelkie materiały mające kontakt z wirusami należy usunąć do zlewki. Rozcieńczyć całkowicie rozmrożone wirusy w pożywkach hodowlanych w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml, oznaczonych jako "grzbietowe" i "brzuszne".
4. Przenieś organoidy z dnia 56 z szalek hodowlanych na płytki 48-dołkowe. Zaleca się jeden organoid na studzienkę, aby zapobiec spontanicznemu fuzji w hodowli statycznej. Usuń jak najwięcej resztek pożywki hodowlanej.
5. Dodać odpowiednio 200 μl mieszaniny wirusa i pożywki do każdej studzienki. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO₂ . Przechyl płytki na sterylnej pustej płytce, aby pomóc skoncentrować cząsteczki wirusa na dnie studzienki i zoptymalizować wydajność transdukcji.
   UWAGA: Cząsteczki wirusa mają tendencję do opadania na dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dlatego częste odwracanie probówki w celu zmieszania wirusów z pożywką przed dodaniem ich do każdej studzienki jest bardzo ważne, aby zapewnić jednolitą wydajność transdukcji dla wszystkich organoidów.
6. Następnego dnia (dzień 57) dodać dodatkowe 800 μl pożywki hodowlanej do każdego dołka, aby zwiększyć całkowitą objętość do 1 ml / studzienkę.
7. Trzy dni później (dzień 60) należy przeprowadzić pełną zmianę pożywki na znakowanych organoidach. Wybielać wszelkie materiały mające kontakt z cząsteczkami wirusa.
8. Trzy dni później (dzień 63) sprawdź ekspresję fluorescencji pod odwróconym mikroskopem epifluorescencji. Jeśli sygnał jest silny, rozpocznij generowanie asembloidów (patrz krok 2.9).
9. Przepłukać wszystkie znakowane organoidy dwukrotnie 1 ml/studzienkę PBS, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu pozostałymi cząstkami wirusa podczas fuzji organoidów. Użyj przeciętej końcówki pipety P1000, aby przenieść jeden organoid brzuszny do każdej studzienki grzbietowej (lub odwrotnie) i odpowiednio oznaczyć płytkę asembloidu. Przechyl płytki jak w kroku 2.5, aby uzyskać lepsze połączenie.
10. Ostrożnie przeprowadzić wymianę pożywki o połowę objętości 3 dni po zabiegu fuzji (dzień 66) bez przerywania asembloidów. Zwykle potrzeba około tygodnia, aby utworzyć stabilne asembloidy (dzień 70).

3. Umieszczanie asembloidów na wstępnie przygotowanych płytach MEA

UWAGA: Przygotowanie powierzchni płyt MEA przed montażem galwanicznym zajmuje co najmniej 4 dni. Aby zaoszczędzić czas, równolegle można przeprowadzić zespolenie organoidów grzbietowych i brzusznych (tj. krok 2.9) oraz wstępną obróbkę MEA.

1. Przygotuj odczynniki do wstępnej obróbki powierzchni i powlekania.
   1. Aby przygotować 1% roztwór detergentu/enzymu, rozpuść 0,5 g enzymu/detergentu w proszku w 50 ml wody dejonizowanej. Dokładnie mieszaj, aż proszek całkowicie się rozpuści. Wysterylizuj roztwór za pomocą sterylnego filtra próżniowego z rurką w komorze bezpieczeństwa biologicznego przed dodaniem go do studzienek MEA. Przygotuj świeże przed każdym użyciem.
      UWAGA: Detergent/enzym sterylizuje powierzchnię MEA, usuwa wszelkie pozostałości olejów z procesu produkcyjnego MEA i zapewnia, że powierzchnia jest wystarczająco hydrofilowa, aby sprzyjać interakcjom ze związkiem hydrofilowym polietylenoiminą (PEI)¹⁸.
   2. Aby przygotować 0,07% roztwór PEI¹⁹, zacznij od przygotowania podstawowego 7% roztworu PEI, mieszając 1 ml 50% roztworu PEI w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 6 ml buforu 1x boran. Rozcieńczyć 1 ml podstawowego 7% roztworu PEI w 99 ml 1x buforu boranowego, aby osiągnąć końcowe stężenie robocze. W celu sterylizacji przed użyciem przefiltruj przez jednostkę filtrującą 0,22 μm w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: PEI, dodatnio naładowany polimer, jest używany w procesie powlekania pierwotnego, aby ułatwić dołączenie ujemnie naładowanej powłoki wtórnej za pomocą matrycy membrany podstawnej (BMM) i assembloids²⁰. Pobrać 1 ml 50% PEI, wlewając zamiast pipetować do stożkowej probówki, ponieważ roztwór podstawowy jest bardzo lepki. Potrzebną ilość można łatwiej zmierzyć, ważąc ją w stożkowej probówce, a 50% roztwór PEI ma gęstość 1,08 g/ml. 7% podstawowy roztwór PEI może być przechowywany w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca. Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Biorąc pod uwagę rozmiar każdego asembloidu, 6-dołkowe płytki MEA z 64 elektrodami na studzienkę są używane do umieszczenia jednego asembloidu na studzienkę. Oblicz liczbę płytek MEA potrzebnych do eksperymentów, aby zapewnić wystarczającą liczbę kontrprób biologicznych.
3. Dodaj 1 ml 1% roztworu detergentu/enzymu do każdego dołka sterylnej płytki MEA. Uważaj, aby nie uszkodzić elektrod z końcówką pipety. Jeśli używasz aspiratora próżniowego do prania, nie pozwól, aby końcówka dotykała układu elektrod. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
4. Usuń detergent/enzym i umyj każdą studzienkę pięć razy 1,5 ml sterylnej wody dejonizowanej. Ponieważ detergent/enzym nie jest biokompatybilny, ważne jest, aby upewnić się, że pozostałe chemikalia zostały całkowicie zmyte.
5. Napełnij każdą studzienkę 1 ml pożywki hodowlanej w celu wstępnego kondycjonowania. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C 5% CO₂ na 2 dni. Wystawienie powierzchni MEA na warunki hodowli komórkowej sprzyja przyłączaniu się komórek.
6. Usunąć pożywkę hodowlaną i przykryć elektrody MEA w każdym studzience 50 μl 0,07% roztworu PEI do wstępnego powlekania. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
7. Całkowicie odessać roztwór PEI. Umyj każdą studzienkę 1 ml sterylnej wody dejonizowanej. Wykonaj w sumie 3 szybkie prania. Suszyć płytki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego bez pokrywy.
8. Przykryj obszar elektrody w każdym studzience 50 μl BMM w skali 1:20 (v/v) rozcieńczonego w pożywce hodowlanej w celu wtórnego powlekania. Płytki MEA należy umieścić z powrotem na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Dodaj sterylną wodę do komór otaczających studzienki, aby zapewnić wystarczającą wilgotność przez cały czas powlekania.
9. Następnego dnia odessaj rozcieńczony BMM za pomocą próżni, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Jeśli utworzyła się gruba warstwa, mocno spryskaj obszar styku elektrody pożywką hodowlaną za pomocą końcówki do pipety P1000. Umyj tyle razy, ile potrzeba, aby usunąć wszelkie grube kawałki.
   UWAGA: Resztkowy gruby BMM może zakłócać kontakt elektrody z ogniwami.
10. Zbierz asembloid z szeroko naciętą końcówką P1000 i umieść go na elektrodach w studzience, przenosząc jak najmniej nośnika.
11. W okapie z przepływem laminarnym pod lunetą preparacyjną ostrożnie popchnij zespół za pomocą sterylnej igły preparacyjnej lub końcówki P20 w żądane miejsce, gdzie zarówno organoidy grzbietowe, jak i brzuszne mogą być w większości pokryte elektrodami. Użyj końcówki P20, aby usunąć płyn wokół zespołu. Powtórz to dla wszystkich asembloidów lub podzbioru, co można zrobić w ciągu kilku minut.
    UWAGA: Staraj się NIE dotykać ani nie drapać powierzchni MEA końcówką pipety i/lub igłą. Staraj się NIE szturchać ani nie rozrywać asembloidu końcówkami pipet. Zakończ powlekanie tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć całkowitego wyschnięcia organoidu.
12. Inkubować asembloidy w temperaturze 37 °C przez 10 minut (bez pożywki). Przenieś płytki z inkubatora do okapu z przepływem laminarnym i nałóż 2-3 małe krople 1:50 BMM rozcieńczone w pożywkach hodowlanych na wierzch asembloidów pod zakresem preparacji. Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut.
13. Ostrożnie dodaj 3 krople pożywki hodowlanej w pobliżu asembloidów pod zakresem sekcji. Dzięki temu organoidy są nawodnione. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
    UWAGA: Jeśli asembloid porusza się lub pływa w którymkolwiek z kolejnych kroków, poszycie należy wznowić od kroku 3.11.
14. Co godzinę ostrożnie dodawaj 20-50 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka pod zakresem sekcji. Można to zrobić w ciągu jednego dnia. Celem jest osiągnięcie co najmniej 250 μl całkowitej objętości na koniec dnia.
15. Następnego dnia sprawdź, czy wszystkie asembloidy są osadzone i ustabilizowane pod zakresem sekcji. Dodaj dodatkowe 750 μl pożywki hodowlanej, aby osiągnąć całkowitą objętość 1 ml / studzienkę. Pozostaw talerze w spokoju przez co najmniej 2 dni.
16. Ostrożnie wykonuj cotygodniowe zmiany pożywki, wyjmując 500 μl pożywki hodowlanej i dodając 700 μl neurofizjologicznej pożywki podstawowej. Dodatkowa objętość dodawanego medium odpowiada za parowanie i może być regulowana w zależności od stopnia parowania używanej płyty MEA. W razie potrzeby dodaj sterylną wodę wokół studzienek, aby zminimalizować parowanie ze studni MEA.

4. Rejestracja MEA i analiza danych

1. Zapis MEA należy rozpocząć około tygodnia po przejściu na neurofizjologiczne podłoże podstawowe (zwykle około 78 dnia).
2. Poczekaj, aż komora nagrywająca osiągnie ustawioną temperaturę (zwykle 37 °C). Przenieś płytkę do urządzenia i pozwól im się zrównoważyć przez co najmniej 5 minut przed nagraniem.
3. Sprzętowe ustawienia na żywo
   1. Ustaw częstotliwość próbkowania, tj. szybkość, z jaką rejestrowane są surowe dane dotyczące napięcia. Zalecane jest ustawienie domyślne (12,5 kHz).
   2. Określ tryb analogowy (zwykle neuronowe skoki, jak w tym przypadku), aby skonfigurować przepustowość sprzętową i wzmocnienie dla określonych aplikacji. Do wizualnego monitorowania aktywności podczas nagrywania użyj modułów Spike Detector i Burst Detector.
      UWAGA: Ustawienia analogowe wpływają na sposób rejestrowania surowego napięcia i nie można ich zmienić po zarejestrowaniu danych.
   3. (Opcjonalnie) Zastosuj sprzętowy filtr cyfrowy do danych nagrania. Opcje filtrów dolnoprzepustowych obejmują okno Kaisera 2 kHz lub 3 kHz. Ustawienia domyślne można modyfikować po wybraniu ustawień analogowych.
   4. Ustaw odwoływanie się według mediany (domyślnie), co jest wysoce zalecane w przypadku nagrywania neuronowego, jak w tym przypadku. Odniesienie poprawia jakość sygnałów o niskiej amplitudzie poprzez redukcję zakłóceń typowych dla grup kanałów.
      UWAGA: Powyższe parametry mogą być dostosowywane w zależności od potrzeb w zależności od aktywności obserwowanej w asembloidach, ale powinny być spójne dla wszystkich nagrań w danym eksperymencie.
4. Dodaj mapy tablic rejestracyjnych i opisy (w razie potrzeby). Zaimportuj mapę tablic z poprzedniego nagrania dla tej samej płyty, aby zapewnić spójność i ułatwić przetwarzanie danych wsadowych. Upewnij się, że pliki mają poprawne nazwy.
5. Jeśli sygnały wyglądają dobrze (minimalny szum i artefakt), zapisz surowe dane. Zazwyczaj 2-5 minut nagrania wystarcza na reprezentatywną próbkę.
6. Rejestruj wzdłużnie aktywność elektryczną raz lub dwa razy w tygodniu, przez 5-15 minut, w zależności od projektu eksperymentalnego. Odczekaj co najmniej 24 godziny po każdej zmianie nośnika przed rozpoczęciem następnej rundy nagrywania, ponieważ aktywność elektryczna spada natychmiast po każdej zmianie nośnika.
7. (Opcjonalnie) Jeśli aktywność elektryczna musi być zlokalizowana i rozróżniona między organoidami grzbietowymi i brzusznymi, lub jeśli aktywność każdej elektrody musi być analizowana oddzielnie, uzyskaj obraz każdego asembloidu w jasnym polu i epifluorescencji (Rysunek 2B) po każdym nagraniu.
8. Podczas analizowania danych zastosuj konfigurację analizy, w tym detektor skoków/serii i kompilator statystyk. Użyj progu adaptacyjnego ustawionego na 5,5-6 odchyleń standardowych od linii bazowej do wykrywania skoków. Zidentyfikuj zrywy jako aktywność z ≥5 skokami w ciągu 100 ms¹³. Zdefiniuj aktywność sieci, gdy ponad 25% wszystkich aktywnych elektrod wystrzeliwuje w ciągu 100 ms z minimum 50 impulsami na sieć burst^13,14.
   UWAGA: Parametry te są modulowane w zależności od charakterystyki wypalania konkretnego eksperymentu. Aby zwiększyć czułość na skoki o niskiej amplitudzie, można obniżyć próg adaptacyjny do wykrywania skoków. Do wykrywania impulsów można stosować różne metody, a parametry można dostosować do wykrywania impulsów skoków, które znacznie różnią się od aktywności w tle. Parametry aktywności sieci mogą być modulowane do mniejszego procentu elektrod, zwłaszcza gdy asembloidy nie pokrywają całego pola elektrod. Wszystkie parametry powinny pozostać spójne przez cały czas trwania eksperymentu, aby umożliwić porównania w czasie.
9. Uruchom moduł kompilatora statystyk w celu przetwarzania wsadowego podczas odtwarzania zarejestrowanych danych. Eksportuj zaawansowane metryki i/lub pliki wyjściowe spajków w celu zaawansowanej analizy.
   UWAGA: Dane wyjściowe zaawansowanych metryk zawierają plik .csv ze średnimi elektrodami, studzienkami i grupami dla średniego wypalania, pękania i synchronizacji. Dane wyjściowe Spike (plik .spk) zawierają ślady fal dla wszystkich spajków, które można zaimportować do innych platform w celu zaawansowanej analizy, np. sortowania spajków.

5. Końcowy test farmakologiczny i recykling płytek

UWAGA: Testy leczenia farmakologicznego mogą być wykonywane po osiągnięciu przez asembloidy wystarczającej dojrzałości i osiągnięciu szczytów aktywności elektrycznej. Rejestrowanie aktywności wyjściowej/przed leczeniem i aktywności po leczeniu należy przeprowadzić tego samego dnia.

1. Dodaj 1-10 μl roztworu leku bezpośrednio na wierzch zespołu i delikatnie obracaj płytką, aby uzyskać jednolitą mieszaninę. W niektórych przypadkach zaleca się dłuższy czas inkubacji w pożywkach zawierających leki, np. testy leczenia farmakologicznego związane z synapsami z agenistami/antagonistami receptora glutaminianu/GABA (Rysunek 2E) (szczegóły w sekcji Wyniki).
   UWAGA: Dodanie niewielkiej ilości roztworu leku do każdej studzienki jest zalecane w celu osiągnięcia końcowego stężenia roboczego, ponieważ duża zmiana objętości tymczasowo zmniejszy ogólną aktywność elektryczną. Ważne jest, aby upewnić się, że dodanie nośnika, w którym rozpuszczają się interesujące leki, nie powoduje znaczących zmian parametrów elektrofizjologicznych.
2. Wykonaj wystarczającą liczbę płukań PBS (zwykle 3) i wypłucz leki po nagraniu po zabiegu. Następnego dnia po wypłukaniu leku należy przeprowadzić dodatkowe nagranie, aby sprawdzić, czy aktywność elektryczna powróci do poziomu wyjściowego.
3. Opcjonalnie, na siłę pipetować pożywkę, aby oddzielić asembloidy od płytki MEA na końcu nagrań w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów, np. obrazowania na żywo, utrwalania 4% paraformaldehydu w celu barwienia immunologicznego w całości lub lizy w celu ekstrakcji RNA lub białka.
4. Do celów analizy należy użyć co najmniej trzech kontrprób technicznych i biologicznych dla każdego warunku. Wyrazić dane elektrofizjologiczne jako średnią n ≥ 3 powtórzeń.
5. Aby poddać płytkę recyklingowi po zakończeniu eksperymentów, należy zassać pozostały nośnik po usunięciu dołączonych asembloidów. Umyć raz sterylnym PBS. Całkowicie przykryj metalowy obszar 200 μl/studzienkę 0,25% trypsyny-EDTA i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc.
6. Następnego dnia odessać trypsynę, przemyć dwukrotnie 70% sterylnym etanolem i trzy razy sterylną wodą dejonizowaną.
7. Suszyć płytkę na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 15 minut bez pokrywy lub do całkowitego wyschnięcia. Oczyszczoną płytkę należy zamknąć w plastikowej torbie i przechowywać w temperaturze pokojowej do przyszłego użycia.
   UWAGA: Dobrze oczyszczona płyta MEA może być ponownie użyta trzy razy bez znacznej utraty jakości nagrywania.

Results

Ludzkie zespoły grzbietowo-brzuszne zostały posiane na 6-dołkowej płytce MEA (n = 6 na różnicowanie, 3 różnice), przy czym każda studzienka zawierała 64 elektrody (Rysunek 2A). Dziewięć z dziesięciu asembloidów zaplanowanych do zapisu wzdłużnego było mocno przymocowanych do elektrod przez ponad 50 dni in vitro (Ryc. 2D). 6 z 8 asembloidów przeznaczonych do testów farmakologicznych zostało pomyślnie osadzonych w fazie wymywania z aktywnością sieci odpowiednią do etapu rozwoju (Rysunek 2E). Pokazano obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji z jednej reprezentatywnej studzienki (Ryc. 2B), w których łatwo można odróżnić organoidy brzuszne znakowane AAV-CAG-tdPomidorem i AAV-mDLX-GFP^7,9.

Aktywność neuronów na MEA może być analizowana w celu oceny ogólnej pobudliwości komórkowej i aktywności sieci, za pomocą różnych parametrów. Ogólne tempo wypalania w całej kulturze dostarcza informacji na temat pobudliwości komórkowej i sieciowej, podczas gdy częstotliwość zsynchronizowanych impulsów na wielu elektrodach wskazuje na zakres synaptycznie aktywnych sieci neuronów. Wielokrotne, powtarzające się skoki występujące na przestrzennie odrębnych elektrodach w krótkim okresie czasu (pękanie sieci) mogą służyć jako biologiczny korelat aktywności podobnej do napadów, chociaż asembloidy na MEA pozostają ograniczone w porównaniu z całym organizmem, który może mieć napady w dobrej wierze. Rysunek 2C ilustruje wzorce pękania sieci u asembloidów hodowanych w komercyjnie dostępnych neurofizjologicznych pożywkach podstawowych w dniach 84 i 91, ze zwiększonym czasem trwania pękania w późniejszym momencie, prawdopodobnie z powodu funkcjonalnego dojrzewania neuronów. W tym przypadku aktywność komórkowa i sieciowa stopniowo wzrasta od dnia, w którym asembloidy są powlekane, zwykle osiągając szczyt w dniu 92 i prawie zanikając w dniu 125 (Rysunek 2D). Zwiększone dojrzewanie na późniejszym etapie prawdopodobnie przyczynia się do wydłużenia czasu trwania zsynchronizowanej serii w późniejszym punkcie czasowym nagrywania.

Bicuculline, antagonista receptora GABA_A, zwiększa zsynchronizowaną aktywność sieciową asembloidów, co pokazują znacznie wyższe szybkości odpalania i częstotliwości wybuchów (sieciowych) po dodaniu leku w dniu 108 (Rysunek 2E). Jest to podobne do tego, co zostało wcześniej wykazane w zapisach elektrofizjologii pojedynczych komórek²¹. Analizę mocy dla testu farmakologicznego przeprowadzono przy użyciu zasady G*Power3 na wielkości efektu 0,94 i alfa 0,05. Całkowita próbka 15 asembloidów z trzema równymi grupami o równej wielkości n = 5 była potrzebna do osiągnięcia potęgi 0,8 (Rysunek 2E). Do zestawu dołączono sterowanie pojazdem w celu sprawdzenia, czy odpowiedź jest prawdziwym zdarzeniem sygnalizacyjnym, a nie tylko zmianą intensywności sygnału, która może wynikać z dodania niewielkiej ilości nośnika (rysunek 2E).

Rysunek 1: Przegląd badania. Protokół generowania i powlekania podwójnie znakowanych asembloidów na osi czasu MEA protokołu różnicowania wyszczególniającego etapy krytyczne i odpowiadające im suplementy małocząsteczkowe (dodatkowe informacje na temat składu znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli materiałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zapis MEA asembloidów. (A) Mapa cieplna średniej aktywności wypalania z pojedynczej płytki MEA (n = 6 dołków) w dniu 82, tj. po posiewie w 10 dniu. Wszystkie studnie reprezentują kultury o tym samym stanie i genotypie. (B) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego i konfokalne asembloidu, z assembloidem grzbietowym oznaczonym na czerwono i brzusznym na zielono. Białe groty strzałek wskazują migrowane interneurony GABA-ergiczne od strony brzusznej do grzbietowej. Podziałka = 500 μm. (C) Raster reprezentatywny wykreśla ponad 120 s czasu rejestracji z jednego dołka. Impulsy sieciowe są wyróżnione fioletowym polem. Pokazano dwa oddzielne punkty czasowe, dzień 78 (1 tydzień po posiewie, dzień rozpoczęcia rejestracji) i dzień 92 (3 tygodnie po posiewie, również wtedy, gdy aktywność osiąga szczyt). (D) Kwantyfikacja średnich szybkości odpalania, częstotliwości wybuchów i częstotliwości pękania sieci od dnia 78 do dnia 127 (n = 3 różnice, 3 asembloidy/zróżnicowanie). Każda krzywa wskazuje jeden indywidualny asembloid, złożony z 3 różnic (oznaczonych kolorami). Czerwona krzywa pokazuje wartość średnią. (E) Kwantyfikacja wyników testu bicukuliny (n = 6 assembloidów / warunek). Wykres słupkowy był wyświetlany jako średnia ± SEM. Każda kropka reprezentuje jeden asembloid, skompilowany z 3 partii różnicowania (oznaczonych kolorami). Przeprowadzono nieparametryczny test Friedmana. **p < 0,01; ns, nie ma znaczenia. MEA, układy wieloelektrodowe. Mapa skupień i wykresy rastrowe są generowane za pomocą oprogramowania analitycznego Neural Metric Tool. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składniki mediów na różnych etapach różnicowania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

Metody oparte na MEA do elektrofizjologicznych zapisów aktywności sieci w asembloidach pochodzących z iPSC zostały wykorzystane do modelowania padaczki in vitro ^22,23. Proponowana platforma integrująca pobudzające i hamujące połączenia synaptyczne może potencjalnie zająć się mechanizmami nadpobudliwości neuronów i rolą interneuronów korowych w procesie epileptogenezy. Dodatkowo platforma ta pozwala na stabilizację asembloidów i zbieranie podłużnych danych elektrofizjologicznych przez około 50 dni in vitro, nawet w przypadku zaburzeń farmakologicznych, zapewniając w ten sposób podejście do testowania związków o potencjalnych celach terapeutycznych.

Stabilizacja dojrzałych, stosunkowo dużych asembloidów na hydrofobowej powierzchni przez długi czas in vitro była wyzwaniem technicznym. Aby pokonać tę przeszkodę, stosuje się strategię dwukrotnego powlekania odwrotnie naładowanymi substancjami chemicznymi, aby ułatwić krótko- i długoterminowe przyleganie organoidów do powierzchni elektrody. Protokół ten optymalizuje poprzednio stosowaną metodę²⁴ poprzez zamianę odczynników do powlekania płytek z poli-L-ornityny (PLO)/lamininy na PEI/BMM, uzyskując stałe przyleganie o wysokich wskaźnikach sukcesu i niskiej toksyczności. Co więcej, ten ustabilizowany, długoterminowy system hodowli ma potencjał, aby dostarczyć danych o wysokiej przepustowości. Na przykład wstępne znakowanie za pomocą podwójnych wirusów może uzupełniać sortowanie impulsów za pomocą pojedynczych elektrod w celu zlokalizowania i porównania aktywności z różnych regionów. Proponowana platforma zapewnia również stabilne narzędzie do rejestrowania lokalnych potencjałów pola, co ma duże znaczenie dla funkcji interneuronów bez naruszania nienaruszonej struktury asembloidów²⁵. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest to, że asembloidy są spłaszczane po poszyciu, co budzi obawy o to, czy początkowe struktury 3D są zachowane, czy nie. Hodowanie organoidów wokół elektrod przy użyciu bardziej zaawansowanych platform MEA, które otaczają organoid elektrodami²⁶ , może potencjalnie przezwyciężyć to ograniczenie.

Jedną z głównych przeszkód w metodach elektrofizjologicznego zapisu organoidów opartych na MEA jest zmienność i odtwarzalność wyników eksperymentalnych w różnych protokołach różnicowania, a nawet w partiach różnicowania. Wcześniejsze badania pokazują, że aktywność sieciowa neuronów mierzona za pomocą MEA zależy od stanu dojrzewania neuronów zarówno organoidów grzbietowych, jak i brzusznych²⁷. Nagrywanie z asembloidów w późniejszym punkcie czasowym ze stosunkowo dojrzałymi neuronami i obwodami jest jednym ze sposobów na poprawę spójności. Co więcej, wybór wielodołkowych systemów MEA generujących dane o wysokiej przepustowości pozwoli na porównania statystyczne w świetle zmienności eksperymentalnej. Jeśli aktywność elektrofizjologiczna hodowli jest niezgodna z tym, czego oczekuje się w danym punkcie czasowym, ważne i pomocne będzie pobranie nienaruszonej kultury z platformy funkcjonalnej w celu przeprowadzenia kontroli jakości, w tym analizy immunocytochemicznej i transkryptomicznej.

Kluczowe znaczenie dla proponowanej platformy ma funkcjonalna integracja regionalnie określonych pobudzających neuronów korowych po stronie grzbietowej i interneuronów hamujących po stronie brzusznej. Protokoły generowania organoidów specyficznych dla regionu mózgu znalezione w literaturze różnią się znacznie w odniesieniu do warunków pożywki, czasu hodowli, profilu plonu i dojrzewania, a także innych czynników²⁸. Chociaż protokół ten jest specyficzny dla kory mózgowej i zwojów pod względem zdolności do generowania neuronów pobudzających i interneuronów GABA-ergicznych, dobrze ugruntowane techniki różnicowania można wykorzystać do generowania neuronów pochodzących z iPSC wykazujących inne tożsamości, takie jak neurony ruchowe²⁹ i komórki Purkinjego³⁰. W związku z tym proponowana platforma ma potencjał do modelowania obwodów neuronalnych między korą mózgową a rdzeniem kręgowym/móżdżkiem. Po pewnej optymalizacji związanej z czasem posiewu i wizualizacji typów komórek za pomocą znakowania wirusowego, metodę tę można przełożyć na inne modele chorób poza padaczką, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Naczynia hodowlane bez TC	Corning	08-772-32	Do hodowli zawiesinowej na wytrząsarce
100 ml Zlewka	Fisher Scientific	FB100100
100% etanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-merkaptoetanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Stężenie robocze 100 μ M
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Fisher Scientific	50-202-140
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Wirówka z chłodzeniem Allegra X-14R	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Zawieszone 5 mg w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Podwielokrotność i zamrozić na − 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 000 do użycia. Stężenie robocze 100 nM.
Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA płytki 6-dołkowe	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Platforma Axion Maestro MEA	Axion Biosystems	Maestro	Z tymczasową kontrolą środowiska
Suplement B-27 (zwykły, z witaminą A)	Suplement Thermo Fisher	21985023
B-27 (bez witaminy A)	Thermo Fisher	12587010
Matryca membrany podstawnej - Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Wanna z koralikami	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Mikroskop odwrócony	Olympus	CKX53	Utrzymywany w przepływie laminarnym czysta ławka
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Stężenie robocze 10 μ M
Bleach	CLOROX	67619-26
Bufor boranowy 20x	Thermo Fisher	28341	Stężenie robocze przy 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Odczynnik do dysocjacji komórek (StemPro Accutase)		Thermo Fisher
Celltron	HT-Infors	I69222
Detergent/enzym (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Stężenie robocze 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamina	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Rozpuść 5 mg w DMSO, aby uzyskać 10 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotność i zamrozić na − 20 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:2000 do użycia. (stężenie robocze 5 μ M)
D-PBS bez wapnia lub magnezu	Thermo Fisher	14190144
Neurotroficzny (GDNF) pochodzenia komórek glejowych (GDNF)	Peprotech	450-10	Rozpuścić 100 μ g w 1 ml PBS do 100 μ g/ml. Podwielokrotność i zamrozić na − 20 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:5000 do użycia. (stężenie robocze 20 ng/ml).
Suplement GlutaMAX	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometr	Mikroskopia Wyborcza Nauki	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Termo Fisher	51029692
Inkubator do hodowli komórkowych z kontrolowaną wilgotnością	Thermo Fisher	370	ustawiony na 37 & deg; C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Podwielokrotność i zamrozić przy − 80 stopni Celsjusza. Wytrąca się, jeśli zostanie rozmrożony w temperaturze pokojowej. Zamrożone podwielokrotności należy umieścić bezpośrednio w 37 °; C przed użyciem.
Zamiennik surowicy nokautującej (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (pożywka + suplementy)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilizowana pożywka bez podawania dla ludzkich komórek iPSC
Suplement N2	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Aminokwasy endogenne (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Rozpuścić 100 μ g w 1 ml PBS do 100 μ g/ml. Podwielokrotność i zamrozić na − 20 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:5000 do użycia. (stężenie robocze 20 ng/ml).
NuFF Ludzkie fibroblasty napletka noworodków	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Pipeta do penicyny/streptomycyny	Thermo Fisher	15140122
(P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoklawizowane końcówki P1000 do pobierania organoidów
Poly (etylenimina) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Rozcieńczyć materiał w sterylnym buforze boranowym. Stężenie robocze 0,07%. Zobacz szczegóły w rękopisie.
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	R& D Systems	236-EG-200	zawieszony w PBS. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -20 °C.
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	zawieszony w PBS. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -20 °C.
Rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego i mózgu (BDNF)	Peprotech	450-02	Wirować na krótko przed rozpuszczeniem. Rozpuścić 100 μ g w 1 ml PBS do 100 μ g/ml. Podwielokrotność i zamrozić na − 20 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:5000 do użycia. (stężenie robocze 20 ng/ml).
Kwas retinowy (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Rozpuść 100 mg w 3,3 ml DMSO, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego. Porcja zapasu 100 μ L / probówkę i zamrozić przy − 80 stopni Celsjusza. Weź 200 μ L 100 mM zapasu i rozcieńczyć 10x (dodać 1,8 ml DMSO), aby uzyskać 10 mM zapasu. Podwielokrotność 50 μ L/tubę i przechowywać w temperaturze − 80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 000 do użycia. (stężenie robocze 100 nM).
Inhibitor ROCK Y-27632	Tocris	1254	1:200 z 10 mM zapas
SAG (wygładzony agonista)	Selleckchem	S7779	Podwielokrotność i zamrozić przy − 80 °C. Koncentracja zapasów 1mM. Stosować w rozcieńczeniu 1:10 000 (stężenie robocze 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Rozpuść 5 mg w 1,3 ml DMSO, aby uzyskać 10 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotność i zamrozić na − 80 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 μ M)
Serologiczny napełniacz pipet	Fisher Scientific	14-387-166
Filtr górny rurki próżniowej Steriflip	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterylne kaptury do hodowli komórkowych	Baker Company	SG-600
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher	25200056
Mikroskop stereoskopowy zmiennoogniskowy	Olympus	SZ61/SZ51	Utrzymywany w czystej ławce z przepływem laminarnym