Artykuł metodologiczny

Barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka

DOI:

10.3791/67398

⸱

25 kwietnia 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Eastern Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje procedurę ilościowego oznaczania komórek zdolnych do życia, ale nie hodowanych (VBNC) w kulturach bakteryjnych traktowanych miodem Manuka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oporność na antybiotyki i tolerancja wśród bakterii stanowią poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia. Mechanizmy przyczyniające się do oporności i tolerancji na antybiotyki obejmują odpowiednio mutacje genetyczne i nabywanie genów oporności oraz przejście do żywotnych, ale nie kulturowych (VBNC) i innych stanów uśpienia. Chociaż genetycznie identyczne z ich odpowiednikami nietolerującymi antybiotyków, komórki VBNC unikają działania antybiotyków, pozostając metabolicznie nieaktywne. Antybiotyki są skuteczne tylko wtedy, gdy aktywne są ich docelowe procesy, takie jak replikacja DNA lub transkrypcja. Ponieważ stresory środowiskowe, w szczególności antybiotyki, mogą prowadzić bakterie do stanu uśpienia, potrzebne są alternatywne środki przeciwdrobnoustrojowe, aby zminimalizować lub zapobiec tej reakcji. Przeciwdrobnoustrojowy miód Manuka (MH) jest skuteczny przeciwko wielu bakteriom, z rzadkim rozwojem oporności. Jego wieloaspektowe mechanizmy przeciwdrobnoustrojowe sprawiają, że jest cennym środkiem w leczeniu infekcji bakteryjnych. W ramach tego badania zbadano oporność MH na rozwój oporności na antybiotyki, testując hipotezę, że MH indukuje mniej komórek VBNC niż konwencjonalne antybiotyki. Aby to zbadać, opracowano protokół leczenia bakterii powodujących rany Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa za pomocą minimalnych hamujących stężeń MH lub konwencjonalnych antybiotyków tobramycyny lub meropenemu, w którym następnie wykorzystano liczbę żywotnych bakterii do identyfikacji metabolicznie aktywnych komórek hodowlanych oraz barwienie żywe/martwe w celu zidentyfikowania wszystkich żywych komórek. Liczba komórek VBNC była równa liczbie komórek zdolnych do przeżycia pomniejszonej o liczbę komórek zdolnych do hodowli. W niektórych eksperymentach liczba komórek zdolnych do hodowli była wyższa niż liczba komórek zdolnych do życia, co dawało ujemną liczbę komórek VBNC; w związku z tym numery komórek VBNC nie zostały bezpośrednio porównane. Zamiast tego porównano liczbę komórek zdolnych do hodowli i żywotnych dla każdego leczenia. Tylko P. aeruginosa leczony tobramycyną miał znacznie mniej komórek zdolnych do hodowli niż komórki żywotne, co wskazuje na większą liczbę komórek VBNC. Protokół ten jest szybki i łatwy i może być stosowany do oceny indukcji MH komórek VBNC w innych bakteriach chorobotwórczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie w stanie spoczynku żywotnego, ale nie kulturowego (VBNC) przeżywają leczenie antybiotykami i powodują nawracające, a czasem śmiertelne choroby zakaźne1,2,3. Bardziej znana jest nam oporność na antybiotyki, która występuje w wyniku dziedzicznej zmiany genetycznej4. Zmiana genetyczna zapewnia oporność na określony antybiotyk poprzez kilka mechanizmów, w tym ograniczenie wchłaniania antybiotyku, zwiększenie wypływu antybiotyku, modyfikację celu antybiotyku lub dezaktywację antybiotyku4. Z kolei bakterie w stanie uśpienia wykazują szerszą i niedziedziczną tolerancję na antybiotyki poprzez zmniejszenie ich metabolizmu2,3. Antybiotyki są ukierunkowane na określone procesy metaboliczne, w tym replikację DNA i syntezę ściany komórkowej, i są nieskuteczne przeciwko metabolicznie nieaktywnym komórkom VBNC4. Komórki VBNC istnieją stochastycznie w niewielkiej liczbie wraz ze swoim genetycznie identycznym rodzeństwem podatnym na antybiotyki w większości populacji bakterii5. Jednak stresory środowiskowe, w tym ekspozycja na antybiotyki, indukują wrażliwe komórki bakteryjne do wejścia w stan tolerancyjny na antybiotyki VBNC3,6. Antybiotykoterapia zabije wrażliwe na antybiotyki komórki w populacji, podczas gdy uśpione komórki VBNC pozostają. Jak sama nazwa wskazuje, komórki VBNC nie nadają się do hodowli na pożywkach odpowiednich do wzrostu ich metabolicznie aktywnego rodzeństwa. Jednak ich błony i materiał genetyczny są nieuszkodzone i mogą się rozmnażać7,8. Po usunięciu antybiotyków wymagane są określone bodźce, takie jak składniki odżywcze, temperatura lub czynniki gospodarza, aby obudzić komórki VBNC ze stanu uśpienia i przywrócić wzrost3,9. Komórki VBNC zostały udokumentowane u wielu patogennych gatunków bakterii, w tym P. aeruginosa i S. aureus, głównych czynników etiologicznych zakażeń ran10,11.

Miód od dawna jest używany w zastosowaniach medycznych, w tym w leczeniu ran, ze względu na swoje właściwości antybakteryjne12. Miód Manuka (MH), pozyskiwany z kwiatów krzewu Manuka (Leptospermum scoparium), został zauważony ze swojego szerokiego spektrum działania bakteriobójczego (recenzja w13,14,15). Skutecznie zabija większość badanych bakterii wywołujących infekcje u ludzi, w tym szczepy bakteryjne, takie jak Staphylococcus aureus oporny na metycylinę i Enterococcus oporny na wankomycynę, które wykazują dziedziczną oporność na tradycyjne antybiotyki16,17. Dodatkowo, indukowana oporność bakterii na MH jest rzadka, wykrywana tylko w biofilmach P. aeruginosa narażonych na kontakt z miodem i Escherichia coli hodowanych w rosnących stężeniach podzbioru badanego miodu18,19,20,21. Sugeruje to, że mechanizmy przeciwdrobnoustrojowe MH różnią się od konwencjonalnych antybiotyków i mogą indukować mniej komórek VBNC lub nie powodować ich braku. Hipoteza ta została przetestowana poprzez określenie, w jaki sposób MH wpływa na populacje VBNC w porównaniu z konwencjonalnymi antybiotykami.

Komórki VBNC muszą być odróżniane od ich metabolicznie aktywnego rodzeństwa hodowlanego i martwych komórek. Komórki zdolne do hodowli są liczone przy użyciu techniki liczenia żywotnych płytek, w której komórki są przenoszone do rutynowych pożywek hodowlanych i inkubowane przez okres wystarczający do wystarczającej liczby podziałów komórkowych, aby uzyskać obserwowalne kolonie. Opracowano kilka metod odróżniania komórek VBNC od martwych komórek w oparciu o ich nienaruszone błony i transkrypcję niskiego poziomu. Absorpcja substratu i barwnika fluorescencyjnego, w połączeniu z mikroskopią lub cytometrią przepływową, pozwala na bezpośrednie zliczanie komórek za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej z kolorem wskazującym nienaruszone błony22,23. Testy oddychania, które wymagają, aby łańcuch transportu elektronów był obecny w nienaruszonej błonie komórkowej, zostały również wykorzystane do rozróżnienia między komórkami żywymi i martwymi24. Opracowano również ilościowe metody PCR (qPCR) w połączeniu z barwnikami modyfikującymi DNA, które zapobiegają amplifikacji; amplifikowane zostanie tylko DNA z żywotnych komórek, ponieważ nienaruszone błony wykluczają klasę barwnika25. Chociaż komórki VBNC są uśpione, nadal transkrybują geny na niskim poziomie, co można również wykorzystać do odróżnienia ich od martwych komórek za pomocą odwrotnej transkrypcji PCR26.

W tej pracy opracowano test do ilościowego oznaczania komórek VBNC u dwóch patogennych bakterii powodujących rany, S. aureus i P. aeruginosa, leczonych MH. Opisano w nim leczenie bakterii za pomocą MH i konwencjonalnych antybiotyków oraz zastosowanie liczby żywotnych płytek i barwienia żywych/martwych w celu wykrycia komórek zdolnych do hodowli i zdolnych do życia. Ten prosty i niedrogi protokół pozwoli na analizę zdolności MH do indukowania opornych na antybiotyki komórek VBNC w wielu patogenach bakteryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ P. aeruginosa (ATCC9721) i S. aureus (ATCC29213) są klasyfikowane jako czynniki poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, pomieszczenia, w których prowadzone są prace, muszą mieć ograniczony dostęp i być wyposażone w komorę bezpieczeństwa biologicznego do manipulacji, które mogłyby powodować rozpryski lub aerozole, takich jak mieszanie i wirowanie kultur. Na wszystkich etapach tego protokołu należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice. Wszystkie odczynniki i sprzęt używany w eksperymentach są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie sterylnego bulionu i pożywki do hodowli agarowych

  1. Przygotuj Luria Bertani i Mueller Hinton, NaCl (0,85%), antybiotyki i szkło.
    1. Przygotuj podłoże bulionowe zgodnie z instrukcjami producenta, dodając proszek agarowy do 1,5% na podłoże agarowe. Dodaj 0,85 g NaCl do 100 ml dH20, aby przygotować 0,85% NaCl. Na naczynia nałożyć taśmę autoklawową, umieścić je w pojemniku bezpiecznym dla autoklawu i autoklawować w cyklu płynnym odpowiednim do użytych objętości.
    2. Po zakończeniu cyklu autoklawu schłodzić agar do temperatury około 60 °C przed przelaniem go do sterylnych szalek Petriego.
  2. Przygotować 100 μg/ml roztworów podstawowych antybiotyków tobramycyny i meropenemu w dH2O do rozcieńczenia i leczenia bakterii. Wysterylizuj zapasy antybiotyków za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml podłączonej do sterylnego filtra 0,2 μm.
    1. Wysterylizowane zapasy antybiotyków należy przechowywać w temperaturze -20 °C w wielu małych porcjach, aby zapobiec utracie aktywności z powodu wielu cykli zamrażania i rozmrażania.

2. Pobieranie archiwalnych szczepów Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa z -80 °C (Dzień 1)

  1. Zebrać materiał do naniesienia niewielkiej porcji zamrożonych szczepów bakteryjnych z ich fiolek zamrażarki o temperaturze 80 °C na agar Luria Bertani (LB). Obejmuje to wiele sterylnych drewnianych patyczków i płytkę agarową LB oznaczoną organizmem i datą.
  2. Otwórz zamrażarkę w temperaturze -80 °C, szybko wyjmij interesujące Cię fiolki i zamknij drzwiczki zamrażarki. Otwórz kolejno każdą fiolkę i za pomocą sterylnego patyczka zeskrob niewielką ilość zamrożonych bakterii na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową LB. Założyć nakrętkę fiolki i szybko umieścić ją z powrotem w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  3. Inkubować zaszczepione płytki agarowe LB, stroną agarową do góry, w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych (atmosferycznych) przez 18-24 godziny. Po okresie inkubacji zapieczętować zaszczepione płytki agarowe LB taśmą do szczepienia i przechowywać je w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień. W razie potrzeby należy co tydzień zaszczepiać świeże kultury bakterii z zamrożonego wywaru w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie S. aureus i P. aeruginosa do leczenia miodem Manuka (MH) i antybiotykiem (Dzień 2)

  1. Zbierz materiały potrzebne do rozpoczęcia hodowli bulionu LB dla każdego szczepu, w tym małe sterylne probówki, pipety serologiczne o pojemności 5 ml, sterylny bulion LB i pętlę zaszczepiającą. Zaopatrz się również w pipet ręczny lub elektryczny do użytku z pipetami serologicznymi, palnikiem Bunsena i inkubatorem do wytrząsania.
  2. Pracując obok płomienia palnika Bunsena, za pomocą pipety serologicznej przenieś 2 ml bulionu LB do dwóch sterylnych probówek. Wysterylizuj pętlę zaszczepiającą w płomieniu palnika Bunsena, a następnie przenieś ćwiartkę pętli pełnej bakterii z płytek agarowych LB do odpowiednio oznakowanej probówki z bulionem LB.
    1. Probówkę należy inkubować w warunkach tlenowych w inkubatorze z wytrząsaniem (~250 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.

4. Przygotowanie MH i przygotowanie MH oraz leczenie antybiotykami S. aureus i P. aeruginosa (T = 0) (Dzień 3)

  1. Zbierz materiały potrzebne do eksperymentu, w tym bulion Muellera Hintona i płytki agarowe, kultury bakterii bulionu LB z dnia 2, sterylne probówki, wywary antybiotykowe na lodzie, pipety (P20, P200 i P1000) i końcówki, probówki 15 ml, pipety serologiczne i pipetor oraz probówki do mikrofuge.
    1. Przygotuj 25% i 50% roztwory podstawowe MH świeże w dniu założenia eksperymentu. W oparciu o gęstość MH (1,47 g/ml) zważyć odpowiednią ilość MH w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i dodać odpowiednią ilość sterylnego bulionu Mueller Hinton. Ponownie zawieś MH, umieszczając rurki w ciepłej wodzie i odwracając je w razie potrzeby.
  2. Przygotować rozcieńczenie w stosunku 1:1000 (około 106 jtk/ml) nocnych kultur bakteryjnych w sterylnych probówkach o pojemności 15 ml, dodając 10 μl kultury bakteryjnej do 10 ml bulionu Muellera Hintona.
    1. Użyć rozcieńczonych kultur do przygotowania trzech próbek dla każdego gatunku bakterii: próbki kontrolnej niepoddanej działaniu substancji, próbki poddanej działaniu MH (przy minimalnym stężeniu hamującym, MIC) i próbki poddanej działaniu antybiotyku (tobramycyna dla S. aureus lub meropenem dla P. aeruginosa, w MIC).
    2. Dodać rozcieńczoną kulturę bakteryjną, MH i odpowiedni antybiotyk do próbek w objętościach wskazanych w Tabeli 1 i Tabeli 2.
  3. Przenieść 0,1 ml i 0,5 ml próbki niepoddanej działaniu substancji do sterylnych probówek mikrowirówek w celu zliczenia żywych płytek (etap 5) i barwienia żywych/martwych (etap 6) odpowiednio dla próbek T = 0.
    1. Próbki kontrolne niepoddane działaniu substancji poddanej działaniu MH i poddane działaniu antybiotyków (tobramycyna lub meropenem) należy inkubować w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (250 obr./min) przez 24 godziny. Przeprowadzić techniki liczenia żywotnych płytek (etap 5) i barwienia żywych/martwych (etap 6) na próbkach niepoddanych działaniu środka T= 0.

5. Określanie komórek nadających się do hodowli w próbkach przy użyciu metody liczenia żywych płytek (Dzień 3 - 5)

  1. W dniu 4, po 24-godzinnej inkubacji próbki, zebrać 0,1 ml i 0,5 ml każdej próbki w probówkach do mikrowirówek, aby uzyskać odpowiednio liczbę żywotnych płytek i barwienie żywych/martwych (etap 6). Będą to próbki T = 24 h.
  2. Przeprowadzić liczenie żywotnych płytek na próbkach T = 0 i T = 24 h w dniu ich pobrania, przygotowując 10-krotne rozcieńczenia żywych próbek liczby płytek w bulionie LB w celu uzyskania policzalnej liczby komórek (~25-150).
    1. Rozprowadzić 50 μl każdej rozcieńczonej próbki na 1/2 płytki agarowej LB. Inkubować płytki agarowe LB w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  3. Następnego dnia wyjmij płytki agarowe LB z inkubatora i zidentyfikuj płytkę rozcieńczającą, która ma ~ 25-150 kolonii. Policz dokładną liczbę kolonii na płytce i użyj wzoru na jednostki tworzące kolonie (CFU) (jtk/ml= # zliczone kolonie/ (objętość platerowana, ml) (użyte rozcieńczenie)) w celu określenia liczby komórek nadających się do hodowli na ml.
    UWAGA: Próbka T = 0 zostanie posiana w dniu 3 i poddana analizie w dniu 4; próbki T = 24 h zostaną posiane w dniu 4 i poddane analizie w dniu 5.

6. Określanie żywotnych komórek w próbkach za pomocą barwienia żywych/martwych i mikroskopii fluorescencyjnej (Dzień 3 lub 4)

  1. Zbierz materiały potrzebne do barwienia żywych/martwych, w tym 0,85% sterylnego NaCl, aby utrzymać korzystne środowisko osmotyczne dla komórek, pipety (P20, P200 i P1000) oraz sterylne końcówki pipet, zestaw do barwienia żywych/martwych bakterii oraz jednorazowy hemocytometr. Uzyskaj dostęp do mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w celu wykrycia barwnika SYTO 9, który barwi żywe komórki.
  2. Dodać 0,5 ml 0,85% NaCl do 0,5 ml każdej z następujących żywych/martwych próbek: wszystkie nierozcieńczone próbki T = 0, nierozcieńczone T = 24 h MH i próbki poddane działaniu antybiotyku oraz rozcieńczenie 1:1000 T = 24 h niepoddanej działaniu substancji próbki kontrolnej.
    1. Upewnij się, że końcowa liczba żywych komórek we wszystkich próbkach została pomnożona przez dwa i rozcieńczoną kontrolę T = 24 godziny bez poddawania działaniu substancji należy pomnożyć przez 1000. Połączyć 1,5 μl SYTO 9 i 1,5 μl jodku propidyny na próbkę, a następnie dodać 3 μl mieszaniny do każdej próbki. Próbki inkubować w temperaturze 21 °C w ciemności przez 15 minut.
  3. Przenieś 6 μl każdej barwionej, delikatnie wymieszanej próbki do jednorazowego hemocytometru i obejrzyj ją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC i soczewką obiektywu 40x. Zrób zdjęcie, na którym widać zarówno linie siatki hemocytometru, jak i żywe zielone komórki.
    1. Policz zielone komórki w sześciu polach na próbkę, zwracając uwagę na wymiary siatki, aby można było obliczyć liczbę zielonych komórek na objętość.
      UWAGA: Wymiary pola w obecnych eksperymentach to 1,05 mm x 0,6 mm x 0,1 mm, co odpowiada 0,063 mm3 lub 6,3 x 10-5 mL. Aby uzyskać liczbę żywotnych komórek na ml, podziel liczbę żywych komórek policzoną przez 6,3 x 10-5 ml, a następnie pomnóż je przez dwa (lub 2000, jeśli jest to kontrola T = 24 godziny bez leczenia).

7. Określanie liczby żywotnych, ale nienadających się do hodowli komórek (VBNC)

UWAGA: Użyj liczby komórek hodowlanych uzyskanych z liczby żywych płytek i liczby żywych komórek uzyskanych z barwienia żywych/martwych, aby określić liczbę VBNC.

  1. Oblicz VBNC/ml, odejmując liczbę komórek zdolnych do hodowli/ml od liczby żywotnych komórek na ml.
  2. Użyj testu Wilcoxona z dopasowanymi parami, aby porównać VBNC / ml lub komórki hodowlane / ml z komórkami żywotnymi / ml dla każdego leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywotne, ale nie hodowlane (VBNC) formy życia bakterii są wywoływane przez czynniki stresogenne, w tym leczenie antybiotykami, i powodują powtarzające się infekcje ze względu na ich tolerancję na antybiotyki. Ponieważ MH jest środkiem przeciwdrobnoustrojowym o szerokim spektrum działania, na który rzadko wykrywano oporność, postawiono hipotezę, że MH indukuje mniej VBNC niż konwencjonalne antybiotyki. Opisana tutaj metoda została wykorzystana do ilościowego określenia VBNC utworzonych przez dwie bakterie powodujące rany,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala na wykrycie populacji komórek VBNC u bakterii powodujących rany leczonych minimalnymi stężeniami hamującymi (MIC) MH i konwencjonalnymi antybiotykami. Krytyczne kroki w protokole obejmowały przygotowanie rozcieńczeń MH w dniu eksperymentu, zapobieganie utracie próbki podczas barwienia żywych/martwych oraz prawidłowe obliczenie analizowanej objętości. W tym i innych badaniach eksperymentalnie określono wartości MIC MH dla S. aureus i P. aeruginosa 27...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z dwóch grantów Eastern Washington University, Faculty Research and Creative Works Grant dla A.R.C oraz Undergraduate Research & Creative Activities Grant dla L.T.B. Bill i Connie Cross przekazali fundusze na rzecz EWU na zakup odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMIL z kamerą cyfrową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół Mueller HintonBioodczynnikiFisher B12322
Rosół Luria Bertani (LB) Fisher BioodczynnikiBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
chlorek soduSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramycynaSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCC ATCC29213
  Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
inkubator z wytrząsaniemEppendorfM13520000
inkubatorBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Miód Manuka AmazonNA
DMIL odwrócony mikroskop fluorescencyjny Leica Microsystems11521265
Aparat cyfrowyLeica Microsystems12730522
probówki sokoła 15 mlGenesee Scientific28-103
pipety serologiczneDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipetor wspomagający pipetyDrummond Scientific Company4-000-101
Palnik BunsenaFisher NaukoweS48108
RaininPipette.comwaga L-20, L-200, L-1000
PłytkaXS603S
Pętla inokulacyjnaFalcon
Szkło Fisher ScientificBP2618-1
rozsiewaczdomowej robotyNA
Zestaw do barwienia żywych trupów dla bakteriiInvitrogenL7012
probówki do mikrofugeFirma badawcza Biologix SKU80-1500/P80-1500
folia aluminiowaCostcoNA
Oprogramowanie do tworzenia figurGraphPadNAGraphPad Prism służył do tworzenia figur i przeprowadzania analiz statystycznych.
pipety 96-dołkowa Falcon 351172 Fisher Scientific 13-104-5

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258(2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374(2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739(2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569(2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

leczenie miodem manukaoporno na antybiotykimetoda przeliczania koloniiStaphylococcus aureusPseudomonas aeruginosamikroskopia fluorescencyjnajednostki tworz ce kolonie

Powiązane artykuły