Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67400

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Streszczenie

Ostatnie badania poszerzyły zrozumienie miażdżycy jako przezściennej przewlekłej choroby zapalnej obejmującej wszystkie trzy warstwy ściany tętnicy, w tym blaszkę wewnętrzną, środek i przydankę, która tworzy zewnętrzną powłokę tkankową tętnic. Nasze ostatnie badania sugerują, że przydanka jest wykorzystywana przez obwodowy układ nerwowy jako kanał docierający do wszystkich komórek tkankowych. Odkryliśmy również, że obwodowy układ nerwowy, czyli czuciowy i współczulny układ nerwowy, przechodzi poważne procesy przebudowy obejmujące neogenezę sieci aksonów sąsiadujących z blaszkami miażdżycowymi. W tym kontekście zrozumienie struktury sieci neuronowej i jej interakcji z komponentami naczyniowymi chorych tętnic daje duże nadzieje na lepsze zrozumienie patogenezy chorób sercowo-naczyniowych. Aby osiągnąć te cele, potrzebne są metody wizualizacji subkomórkowej architektury nienaruszonych zdrowych i chorych tętnic wraz z otaczającymi je przedziałami okołonaczyniowymi. Oczyszczanie tkanek umożliwia nienaruszone obrazowanie tkanek głębokich większych przedziałów tkankowych, które są niedostępne w inny sposób. Umożliwia obrazowanie wolumetryczne nienaruszonych tętnic dzięki integracji narzędzi do znakowania, oczyszczania, zaawansowanego obrazowania mikroskopowego i przetwarzania obrazu. W tym miejscu opisujemy dwa odrębne, ale uzupełniające się podejścia do pasywnego oczyszczania tkanek, to znaczy usuwanie 2, 2-tiodieetanolu (TDE) na bazie wody i trójwymiarowe obrazowanie narządu oczyszczonego rozpuszczalnikowo (iDISCO) za pomocą znakowania immunologicznego w celu zobrazowania izolowanych segmentów aorty lub całej aorty in-situ u całej myszy.

Wprowadzenie

Techniki histologiczne dostarczają podstawowego zrozumienia próbek biologicznych poprzez cięcie tkanek/organów. Jednak nakreślenie złożonych anatomicznych interakcji komórka/komórka i tkanka/tkanka w trzech direzydencjach (3D) było - do niedawna - trudne do osiągnięcia. Ta niezaspokojona potrzeba była szczególnie widoczna w kontekście układu sercowo-naczyniowego w stanach zdrowych i chorych. Obrazowanie nienaruszonych tkanek było w przeszłości wyzwaniem ze względu na absorpcję i rozpraszanie światła, co sprawiało, że były one z natury nieprzezroczyste. Oczyszczanie tkanek sprawia, że nienaruszona próbka biologiczna jest przezroczysta, minimalizując te ograniczenia. Najnowsze osiągnięcia w technikach oczyszczania tkanek umożliwiają obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości niewyciętych przezroczystych tkanek w celu uzyskania znacznego wglądu w mikroarchitekturę komórkową i strukturalną całych narządów z rozdzielczością mikrometrów, umożliwiając w ten sposób zdefiniowanie anatomicznych sieci łączności.

Miażdżyca obejmuje trzy warstwy ściany tętnicy, w tym wewnętrzną warstwę wewnętrzną, środkową warstwę medialną i zewnętrzną warstwę tkanki łącznej, która jest określana jako adventitia. Blaszki miażdżycowe w wewnętrznej warstwie tętnic są od dziesięcioleci konwencjonalnym celem badań1,2. Jednak warstwa przydanki zawiera naczynia krwionośne, naczynia limfatyczne i włókna nerwowe obwodowego układu nerwowego. Ponadto przydanka jest połączona z okołonaczyniową tkanką tłuszczową i składnikami tkanki neuronalnej, w tym nerwami obwodowymi i zwojami okołonaczyniowymi3,4. Wiadomo, że nerwy obwodowe wykorzystują przydankę jako kanały do dotarcia do odległych tkanek docelowych, a nawet komórek5. Nasze ostatnie badania posunęły naprzód postęp w zrozumieniu wielowarstwowych interakcji głównych układów biologicznych, w tym układu odpornościowego, układu nerwowego i układu sercowo-naczyniowego. Nazwaliśmy te interakcje interfejsami neuroimmunologiczno-sercowo-naczyniowymi6,7. Podczas miażdżycy elementy ściany tętnicy ulegają solidnej restrukturyzacji i przebudowie. Na przykład, w sąsiedztwie progresji blaszki miażdżycowej w błonie wewnętrznej, tworzą się agregaty komórek odpornościowych, a neogeneza aksonów neuronalnych zachodzi w mysiej przydance aortalnej6,8,9. W miarę postępu miażdżycy agregaty komórek odpornościowych przekształcają się w dobrze zbudowane trzeciorzędowe narządy limfatyczne tętnic (ATLO) z wyraźnymi obszarami komórek T, B i komórek plazmatycznych10. Jednak nakreślenie tych zmian w 3D, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości nienaruszonej tkanki było wyzwaniem ze względu na niewystarczającą przepuszczalność błony i nieodłączne rozpraszanie światła11. Metody oczyszczania tkanek przezwyciężyły główne ograniczenia konwencjonalnych metod histologicznych11,12,13,14,15 ze zwiększoną penetracją przeciwciał, aby dotrzeć głęboko do nienaruszonych tkanek lub narządów poprzez równomierne dostosowanie indeksu refrakcji (RI), co prowadzi do obrazów o rozdzielczości mikrometrowej i większej głębokości obrazowania w woksele. RI próbek można dopasować do glicerolu (RI 1,46) lub olejku immersyjnego (RI 1,52), co znacznie zmniejsza rozpraszanie światła i aberracje sferyczne, umożliwiając wysoką rozdzielczość. Ostatnie postępy w technikach oczyszczania tkanek całego narządu lub całego ciała, takie jak 2,2-tiodieetanol (TDE) na bazie wody i obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem (iDISCO) z wykorzystaniem immunoznakowania, wraz z technikami obrazowania wolumetrycznego (w tym obrazowaniem konfokalnym, wielofotonowym i mikroskopią świetlną) umożliwiły rekonstrukcję mikroanatomii architektury naczyń krwionośnych poprzez skonstruowanie ich łączności atlas11,16. Wizualizacja tych komórkowych i strukturalnych połączeń w 3D może dostarczyć nowych informacji, które pozwolą odpowiedzieć na dotychczas nierozwiązane pytania biologiczne.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi lokalnego i krajowego komitetu ds. użytkowania i opieki nad zwierzętami. W niniejszym badaniu wykorzystano hiperlipidemiczne samce myszy Apoe-/- na tle C57BL/6J, utrzymywane na standardowej diecie gryzoni, u których spontanicznie rozwija się miażdżyca podczas starzenia.

1. Całościowe obrazowanie izolowanej aorty i oczyszczanie TDE

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Przygotować środek znieczulający w dawce 150 mg/kg ketaminy i 30 mg/kg ksylazyny (patrz tabela materiałów) na mysz. Głęboko znieczulij myszy przez wstrzyknięcie dootrzewnowe i potwierdź to brakiem reakcji na test głębokiego bólu.
      UWAGA: Stężenie i objętość wstrzyknięcia są następujące: Ketamina 100 mg/ml; Ksylazyna 20 mg/ml; Objętość iniekcji 50:50 objętościowo mieszanina ketaminy i ksylazyny w stężeniu 3 μl/g.
    2. Umieść mysz na piankowej płytce pokrytej papierowymi ręcznikami chirurgicznymi i przymocuj ręce i nogi w pozycji leżącej za pomocą taśm. Zdezynfekuj klatkę piersiową 75% etanolem (patrz Tabela Materiałów) i pobierz krew przez lewą komorę za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml w celu usunięcia krwi dla lepszej perfuzji.
      UWAGA: Można również zastosować pobieranie krwi sercowej za pomocą torakotomii.
    3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na klatce piersiowej, aby odsłonić serce i małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić perfuzję przezsercową. Ukrwić mysz przez lewą komorę 10 ml 5 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; patrz tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut, a następnie 20 ml PBS przez 5-10 minut, aż krew zostanie wypłukana. Na koniec perfaktor z 10 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 min.
      UWAGA: Wszystkie zabiegi można wykonać za pomocą perfuzyjnej pompy perfuzyjnej o ciśnieniu 100-125 mm Hg w temperaturze pokojowej (RT). Igła perfuzyjna jest wprowadzana do serca myszy przez ten sam otwór, co ekstrakcja krwi.
    4. Usuń narządy wewnętrzne, w tym śledzionę, wątrobę, płuca oraz narządy żołądkowo-jelitowe i rozrodcze, za pomocą narzędzi chirurgicznych. Utrzymuj serce, aortę i nerki w stanie nienaruszonym in situ.
      UWAGA: Narzędzia chirurgiczne używane do preparowania i usuwania narządów to nożyczki preparacyjne, nożyczki do cienkiej tęczówki, nożyczki sprężynowe, kleszcze, kleszcze zakrzywione i zakrzywione kleszcze cienkie.
    5. Wystaw całą aortę od aorty wstępującej do rozwidlenia biodrowego pod preparacyjnym mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 30-40x). Ostrożnie usuń grasicę i tkankę tłuszczową bez uszkodzenia aorty.
      UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć aorty. W przypadku myszy Apoe-/- utrzymuj minimalnie otoczoną okołonaczyniową tkankę tłuszczową aorty dla połączonej struktury.
    6. Zbierz całą aortę na szalkę Petriego wypełnioną PBS. Podziel aortę na różne segmenty i podziel całą aortę wzdłużnie za pomocą tęczówki lub nożyczek sprężynowych, aby odsłonić powierzchnię wewnętrzną zgodnie z kolejnością i kierunkiem wskazanym w Rysunek 1A dla czyszczenia TDE.
    7. Przypnij aortę en face do płaskiej czarnej płytki woskowej w kształcie litery Y, jak pokazano w Rysunek 1A. Postfix w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Przypnij aortę do płytki woskowej przed utrwaleniem, aby uniknąć fałdowania i zwijania się w kolejnych krokach.
    8. Odepnij aortę i przenieś ją do PBS. Dokładnie myj aortę przez 5 minut przez 5 razy.
      UWAGA: Przenieś aortę do różnych probówek wypełnionych PBS za każdym razem w celu umycia.
  2. Barwienie przeciwciał w aorcie twarzowej
    UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji są wykonywane w probówkach safe-lock o pojemności 2 ml z delikatnym obracaniem lub wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
    1. Przenieść stałą aortę do roztworu blokującego na 2 godziny w celu zablokowania i przepuszczalności.
      UWAGA: Roztwór blokujący różni się w zależności od przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Na przykład roztwór blokujący: 0,5 mg/ml CD16/32 (1:100), 10% normalna surowica osła, 2% Triton X-100 w PBS (patrz tabela materiałów)
    2. Inkubować aortę z pierwszorzędowymi przeciwciałami w roztworze blokującym powyżej (krok 1.2.1), na przykład CD3e (rozcieńczenie 1:100), NF200 (rozcieńczenie 1:200) i B220 (rozcieńczenie 1:200) przez 24 godziny (patrz tabela materiałów). Umyj aortę w PBS przez 5 minut przez 5 razy.
    3. Inkubować aortę z przeciwciałami drugorzędowymi w 10% normalnej surowicy osła (rozcieńczenie 1:300) i 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI; 1 mg / ml) do barwienia jądrowego przez noc (patrz Tabela materiałów). Przemyć aortę w PBS przez 5 minut 5 razy i przechowywać aortę w PBS w temperaturze 4 °C do czasu procedury oczyszczania tkanki.
      UWAGA: Przenieś aortę do różnych probówek wypełnionych PBS za każdym razem w celu umycia. Przykryj probówki folią aluminiową, aby utrzymać je w ciemności dla kroku 1.2.3.
  3. Oczyszczanie tkanek TDE
    UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji są wykonywane w probówkach safe-lock o pojemności 2 ml, delikatnie obracających się w temperaturze pokojowej i przykrytych folią aluminiową w ciemności. Roztwory robocze TDE (patrz tabela materiałów) są wysoce przepuszczalne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie w dygestorium. Zbieraj i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
    1. Przebarwioną aortę przenieść do 20% roztworów roboczych TDE i inkubować przez 1 godzinę.
    2. Przenieś aortę do 47% roztworów roboczych TDE i inkubuj przez 12 godzin. Przenieś aortę do 60% roztworów roboczych TDE i inkubuj przez 24-36 godzin, aż próbki staną się przezroczyste w świetle widzialnym, aby dopasować się do RI.
    3. Przechowuj aortę w 60% TDE przy RT w ciemności do momentu obrazowania.
      UWAGA: Roztwory robocze należy odświeżać co 30 minut w przypadku krótkiego okresu inkubacji (na przykład krok 1.3.1) i co 4 godziny w przypadku długotrwałego okresu inkubacji (na przykład krok 1.3.2). Czas inkubacji dla każdego etapu można dostosować w zależności od wielkości tkanki, aby uzyskać lepszą penetrację przeciwciał lub przezroczystość usuwania. W przypadku aorty myszy Apoe-/- otoczonej tkanką tłuszczową czas inkubacji powinien być odpowiednio wydłużony.
  4. Obrazowanie udrażniania aorty TDE za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM)
    1. Stosować dostępne w handlu dwustronne, lepkie, prostokątne wgłębienia dystansowe do obrazowania o grubości 0.2 mm (patrz Tabela materiałów). Przyklej studzienkę do czystego szkiełka i przenieś oczyszczoną aortę. Upewnij się, że przydanka aorty en face jest skierowana w stronę szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Delikatnie postukaj aortę en face płasko z abluministyczną stroną aorty en face na górze za pomocą kątowych kleszczyków. W razie potrzeby ułóż wiele dołków dystansowych do obrazowania, aby dopasować rozmiar tkanki.
    2. Zamontuj aortę za pomocą kropli 60% roztworu TDE. Ostrożnie przymocuj szkiełko nakrywkowe do studzienki, unikając pęcherzyków powietrza między próbką a szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Ostrożnie usuń bąbelki igłą przed szkiełkiem nakrywkowym. Nie używaj nadmiernej ilości roztworu montażowego, ponieważ sample może unosić się wokół.
    3. Użyj odwróconego instrumentu CLSM (patrz Tabela materiałów) wyposażonego w obiektyw z 20-krotnym zanurzeniem (NA: 0.75).
      UWAGA: CLSM umożliwia obrazowanie wolumetryczne do głębokości 70 μm z wyższą rozdzielczością, która jest potrzebna do analizy średnicy nerwu i interakcji komórek nerwowo-immunologicznych w przydance aortalnej.
    4. Wybierz obiektyw immersyjny (olejkowy) 20x/0,75. Dostosuj hybrydowe detektory diodowe w oparciu o barwione barwniki. Dostosuj ustawienia wyświetlania i wybierz format XY 1024 x 1024 pikseli do obrazowania.
      UWAGA: Soczewka obiektywowa zanurzona w oleju przechwytuje sygnały lepiej niż woda.
    5. Upuść olejek immersyjny (z glicerolem) równomiernie wzdłuż aorty na szkiełko nakrywkowe. Przesuń obiektyw 63x grubo w kierunku próbki, aż dotknie olejku immersyjnego/szkiełka nakrywkowego.
    6. Delikatnie przesuń obiektyw 63x pod mikroskopem, aby zlokalizować obszar zainteresowania. Uzyskaj stos Z od strony przydanki aorty en face w kroku 2-4 μm do głębokości 60 μm do obrazowania 3D.
    7. Nazwij plik ze szczegółami próbki, zeskanuj szczegóły i zapisz dane.
  5. Obrazowanie udrażniania aorty TDE za pomocą mikroskopu wielofotonowego
    1. Wykonaj kroki 1.4.1-1.4.2, aby zamontować aortę en face na suwaku.
    2. Użyj pionowego mikroskopu wielofotonowego (patrz tabela materiałów) wyposażonego w obiektyw o powiększeniu 20x (zanurzenie w wodzie, NA: 1,00, odległość robocza = 2 mm), umożliwiający obrazowanie wolumetryczne do głębokości 1,5 mm.
    3. Pobieraj stosy Z od strony abluminalnej w krokach co 10-15 μm do głębokości 700 μm. Nazwij plik i zapisz dane jak w kroku 1.4.7.

2. Barwienie immunologiczne całego ciała i oczyszczanie tkanek iDISCO

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.3 powyżej, aby uzyskać znieczulenie, naprawienie myszy i perfuzję.
    2. Usuń skórę i narządy wewnętrzne, w tym śledzionę, wątrobę, płuca oraz narządy żołądkowo-jelitowe i rozrodcze, za pomocą narzędzi chirurgicznych. Utrzymuj serce, aortę i nerki w stanie nienaruszonym in situ.
    3. Wypreparuj część ciała powyżej poziomu przepony i przymocuj dolną część ciała za pomocą 4% PFA przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wykonaj utrwalanie, płukanie i inkubację w probówkach o pojemności 50 ml na delikatnie obracającym się wytrząsarce. Odśwież roztwór w nowych probówkach 2-3 razy.
    4. Dokładnie myć próbkę przez 10 minut 3 razy w temperaturze RT.
      UWAGA: Za każdym razem przenoś aortę do różnych probówek wypełnionych PBS.
    5. Inkubuj próbkę w 20% przezroczystych, niezakłóconych koktajlach obrazowania mózgu/ciała i roztworze do analizy obliczeniowej (CUBIC) przez 48 godzin w celu odbarwienia.
      UWAGA: Aby uzyskać 20% roztwór sześcienny, rozpuść 25 g mocznika w 15 ml Triton X-100 i 28 ml Quadrolu i dodaj PBS do końcowej objętości 100 ml. Przygotuj go w kapturze, ponieważ składniki są stymulujące (patrz tabela materiałów).
    6. Dokładnie myć próbkę przez 1 godzinę pięciokrotnie w PBS w temperaturze pokojowej temperatury.
  2. Barwienie przeciwciałami
    UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji przeprowadza się w probówkach safe-lock o pojemności 50 ml z delikatnym obracaniem lub wytrząsaniem w temperaturze 4 °C.
    1. Próbkę inkubować przez noc w roztworze PBS-żelatyna-Triton X-100-surowica (PGST) w celu przepuszczalności i blokowania.
      UWAGA: Roztwór blokujący różni się w zależności od przeciwciał. Na przykład roztwór blokujący: PBS-żelatyna-Triton X-100-serum (PGST, patrz tabela materiałów): 0,2% żelatyny ze skóry świni, 0,5% Triton X-100 i 5% surowicy koziej w PBS.
    2. Inkubować próbkę z pierwszorzędowymi przeciwciałami w roztworze PGST, na przykład NF200 (rozcieńczenie 1:200, patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C i delikatnie wstrząsać przez 10-12 dni. Następnie dokładnie umyć próbkę w PGST przez 1 godzinę 5 razy w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować próbkę z roztworem przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:300) i DAPI (1 mg/ml) w PGST w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
    4. Dokładnie myć próbkę w PGST przez 1 godzinę 5 razy w temperaturze pokojowej. Przenieść próbkę do PBS i przechowywać aortę w PBS w temperaturze 4 °C w celu podjęcia dalszych kroków.
      UWAGA: Przykryj probówki folią aluminiową, aby były ciemne dla kroków 2.2.3-2.2.4.
  3. Zmodyfikowane oczyszczanie tkanek iDISCO
    UWAGA: Podczas czyszczenia rurki powinny być przykryte folią aluminiową, aby uniknąć wybielania/gaszenia sygnału z powodu bezpośredniej ekspozycji na światło naturalne/sztuczne. Wszystkie odczynniki organiczne używane do oczyszczania DISCO są szkodliwe, a wszystkie etapy oczyszczania powinny być wykonywane w dygestorium. Podczas pracy z odczynnikami należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę, aby uniknąć wdychania i kontaktu ze skórą i oczami. Zbierz i wyrzuć odpady z usuwania do odpowiednich pojemników na odpady w okapie.
    1. Przenieść barwione próbki z kroku 2.2.4 do serii roztworów roboczych tetrahydrofuranu o zwiększonych stężeniach (THF, patrz Tabela materiałów) do odwodnienia, to znaczy 50%, 70%, 90% i 100% (dwa razy 100%). Inkubować przez 12 godzin w jednym stężeniu.
      UWAGA: Rozcieńczyć odczynnik THF (99%-100%) w wodzie destylowanej, aby uzyskać roztwory robocze o różnych stężeniach w okapie. Odświeżaj działające roztwory co 6 godzin.
    2. Przenieść próbkę do bezwzględnego roztworu dichlorometanu (DCM, patrz tabela materiałów) na 3 godziny w celu usunięcia lipidów.
    3. Przenieść próbkę do RI pasującego roztworu roboczego benzoesanu benzylu (BABB) (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 3-6 godzin, aż tkanka stanie się przezroczysta i przeważnie przezroczysta w świetle widzialnym.
      UWAGA: Aby przygotować roztwór roboczy BABB, wymieszaj 1 część alkoholu benzylowego i 2 części benzoesanu benzylu (1:2) w szklanej butelce. Delikatnie potrząsaj nim przez 5 minut w kapturze.
  4. Obrazowanie tkanki oczyszczającej iDISCO za pomocą mikroskopu arkuszowego
    UWAGA: Zobrazuj oczyszczoną próbkę, gdy tylko zostanie osiągnięta optymalna przezroczystość. Do obrazowania używa się mikroskopu z arkuszami świetlnymi, takiego jak ultramikroskop II (patrz tabela materiałów). Napełnij zbiornik obrazowania końcowym roztworem czyszczącym, roztworem BABB. Uważaj, aby nie rozlać BABB na instrument, aby uniknąć uszkodzenia instrumentu.
    1. Użyj obiektywu pneumatycznego 1x, aby uzyskać obrazy o małym powiększeniu, obejmujące całą szerokość całej próbki. Delikatnie przenieść próbkę z roztworu czyszczącego na papierową szmatkę i krótko ją wysuszyć.
      UWAGA: Użyj kleszczy, aby uniknąć ściskania próbki.
    2. Wybierz uchwyt na próbkę o odpowiedniej wielkości w zależności od rozmiaru próbki/tkanki i przymocuj tylną stronę próbki do uchwytu próbki za pomocą super-glue.
      UWAGA: Poczekaj 1-2 minuty, aż próbka zostanie mocno przymocowana do uchwytu próbki.
    3. Napełnij zbiornik obrazowania mikroskopu arkuszowego roztworem BABB i delikatnie umieść w nim próbkę. Wyreguluj uchwyt próbki, aby upewnić się, że próbka jest prostopadła do arkusza świetlnego i prawidłowo oświetlona.
    4. Opuść obiektyw, aby ustawić ostrość próbki i dostosuj ustawienia wyświetlania podczas ustawiania ostrości, aby prawidłowo view próbka. Wybierz odpowiednie arkusze świetlne w oprogramowaniu mikroskopu i dostosuj ich szerokość, aby równomiernie oświetlić całe pole widzenia.
      UWAGA: W systemie ultramikroskopowym z obustronnym oświetleniem laserowym należy rozpocząć od wyrównania i ustawienia ostrości lasera po jednej stronie. Po ustawieniu obu stron aktywuj lasery po obu stronach, aby obserwować scalony obraz skanowania z obu iluminacji.
    5. Wybierz kanał dalekiej czerwieni (680 nm), aby zobrazować struktury neuronalne barwione NF200 oraz kanał autofluorescencji (488 nm), aby zobrazować niezabarwioną aortę i tkanki łączne. Dostosuj moc lasera w zależności od intensywności sygnału fluorescencyjnego, aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu, czas ekspozycji i szerokość arkusza świetlnego.
    6. Wybierz tryb skanowania x-y-z. Ustaw skanowanie stosu z krokiem z 2-8 μm i wybierz nakładanie 25%-60% wzdłuż podłużnej osi y skanów kafelków (16 bitów) obejmujących brzuszne i grzbietowe powierzchnie próbek, aby zobrazować całą objętość próbki (do 6-8 mm głębokości).
    7. Nazwij skan, podając szczegółowe informacje, w tym datę skanowania, nazwę próbki, użyte przeciwciało, obiektyw, współczynnik powiększenia, kroki z i użyte lasery. Zapisz dane.
    8. Zmień powiększenie na większe (2x lub 4x) za pomocą funkcji powiększania, aby zobrazować określone obszary ciała.
    9. Wykonaj kroki 2.4.4-2.4.7 powyżej, aby obrazować i zapisać dane.

3. Przetwarzanie i analiza obrazu

UWAGA: Do przetwarzania potrzebna jest stacja robocza o dużej mocy. Zapewnij kopię zapasową danych natychmiast po przetworzeniu ze względu na dużą ilość obrazowania (5-100 GB na obraz).

  1. Przetwarzanie obrazów CLSM i obrazów wielofotonowych
    1. Załaduj kafelkowe obrazy Z-stack z CLSM i mikroskopów wielofotonowych do stacji roboczej przetwarzania obrazu wyposażonej w oprogramowanie Las X, Imaris lub Fiji do wizualizacji 3D i dwuwymiarowej (2D), segmentacji i kwantyfikacji.
    2. Aby oznaczyć kolorami głębię objętości komórki lub struktury, użyj oprogramowania do przywracania obrazu (patrz tabela materiałów) w celu dekonwolucji surowego obrazu i wygenerowania projekcji maksymalnej intensywności zdekonwoluowanych danych przy użyciu czasowego kodowania kolorami w Las X lub Fidżi.
  2. Przetwarzanie obrazów na arkuszach świetlnych
    1. Załaduj serię kafelkowych obrazów TIFF Z-stack do oprogramowania Fiji. Zszywaj obrazy za pomocą wtyczki do szycia Fidżi i zapisuj zszyte obrazy w formacie TIFF.
      UWAGA: W razie potrzeby skompresuj zszyte obrazy w formacie LZW, aby umożliwić szybkie przetwarzanie za pomocą innego oprogramowania.
    2. Załaduj zszyte obrazy do oprogramowania do wizualizacji 3D (patrz tabela materiałów) w celu segmentacji obrazu. Ręcznie śledź struktury neuronalne i naczyniowe w osi x-y-z. Aby ręcznie śledzić małe włókna nerwowe, ręcznie wybierz sygnały NF200+ piksel po pikselu w każdej płaszczyźnie z wzdłuż całej ścieżki włókna nerwowego między aortą a zwojami.
    3. Załaduj wstępnie przetworzone obrazy do oprogramowania do analizy obrazów (patrz tabela materiałów) w celu generowania filmów, wizualizacji 2D i 3D obrazów.
    4. Użyj autofluorescencji do segmentacji aorty i tkanek łącznych, w tym węzłów chłonnych i mięśni, w oprogramowaniu do analizy obrazu. Zastosuj oddzielne pseudokolory w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby zobrazować odrębne segmenty aorty, takie jak ściana aorty i płytka nazębna.
    5. Użyj funkcji adaptacyjnej korekcji histogramu z ograniczonym kontrastem (CLAHE) w oprogramowaniu Fiji, aby zwiększyć lokalny kontrast na tle przetwarzanych obrazów.

Wyniki

Aby zademonstrować mikroanatomię nienaruszonej aorty zdrowej i chorej oraz ujawnić fizyczne połączenia między układem odpornościowym, układem nerwowym i układem sercowo-naczyniowym w mysich modelach miażdżycy, zastosowaliśmy dwa komplementarne podejścia do utrudniania tkanek (clearing): utrudnianie TDE wyizolowanej aorty oraz utrudnianie iDISCO całej myszy (Rysunek 1). Po immunobarwieniu całego preparatu (whole-mount), aortę en face utrudniono za pomocą serii roztworów roboczych TDE. Wskaźnik załamania światła (RI) dopasowano do wartości 1,4-1,5, w zależności od stężenia TDE w ostatnim kroku, aby uzyskać optymalną przejrzystość tkanki aorty bez zmiany jej objętości (Rysunek 1A). W przeciwieństwie do utrudniania TDE, protokół utrudniania iDISCO obejmuje etapy odbarwiania i permeabilizacji przed immunobarwieniem całego preparatu, a następnie delipidację i odwodnienie przy użyciu różnych rozpuszczalników chemicznych oraz dopasowanie RI do wartości 1,56 (Rysunek 1B). Utrudnianie iDISCO umożliwia wizualizację tkanek o dużym rozmiarze, a nawet całego ciała myszy, ze względu na kurczenie się tkanki.

Konfokalne i wielofotonowe obrazowanie 3D całego preparatu aorty en face po utrwaleniu metodą TDE umożliwia wizualizację struktur, w tym blaszek miażdżycowych w intima, komórkowości błony zewnętrznej oraz projekcji neuronalnych błony zewnętrznej, wśród innych struktur, podczas gdy obrazowanie arkuszem światła (light-sheet) myszy utrwalonej metodą iDISCO pozwala na wizualizację i rekonstrukcję drzewa tętniczego wraz z okołynacznową tkanką tłuszczową, węzłami chłonnymi nerek i powiązanymi komponentami nerwowymi, w tym nerwami i zwojami (Ryc. 1C). Na przykład konfokalne obrazowanie aorty miażdżycowej utrwalonej metodą TDE wykazało obecność wielu limfocytów T barwionych na CD3e w blaszce oraz rozległą neogenezę włókien nerwowych o różnych średnicach barwionych na NF200 w ATLO, natomiast wielofotonowe obrazowanie całego preparatu chorej aorty brzusznej z wiekowych myszy Apoe-/- utrwalonej metodą TDE wykazało terytorialność kiełkowania aksonów wykazujących ekspresję NF200 w obszarach ATLO wolnych od limfocytów T (B220 negatywnych) (Ryc. 2A). Z kolei obrazowanie arkuszem światła całego brzucha myszy utrwalonej metodą iDISCO pozwoliło zwizualizować relację przestrzenną między aortą a sąsiednimi zwojami współczulnymi. Segmentacja obrazu 3D i śledzenie poszczególnych aksonów od zwojów do powierzchni aorty ujawniło silną przebudowę neuronalną, w tym nowo powstałe aksony barwione na NF200 w błonie zewnętrznej aorty w sąsiedztwie blaszki miażdżycowej (Ryc. 2B).

Schemat metod klarowania aorty, etapy TDE i iDISCO, obrazowanie 3D, barwienie przeciwciałami.
Rycina 1: Schemat badawczy. (A) Klarowanie aorty en faced metodą TDE opartą na roztworach wodnych. (B) Klarowanie całego organizmu myszy metodą iDISCO opartą na rozpuszczalnikach. (C). Obrazowanie wolumetryczne 3D oraz przetwarzanie obrazów optycznie sklarowanych próbek izolowanej aorty lub całych myszy. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Sun i wsp.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przezroczystość TDE i iDISCO w roztworach wodnych; mikroskopia konfokalna i wielofotonowa ujawniająca włókna nerwowe.
Rycina 2: Przykład obrazów 3D tkanek utrwalonych metodami TDE i iDISCO. (A) Obrazowanie 3D aorty poddanej utrwalaniu TDE en face. Panel górny: obrazy konfokalne wykazały limfocyty T CD3e+ (czerwony, strzałka) w blaszce nowotworowej intimy oraz aksony nerwowe NF200+ (zielony) w błonie zewnętrznej aorty miażdżycowej (ATLO); Panel dolny: obrazy wielofotonowe wykazały aksony nerwowe NF200+ (zielony, groty strzałek), limfocyty B B220+ (czerwony, pusty trójkąt) oraz generację drugiej harmonicznej pochodną kolagenu (SHG, biały) w ATLO 78-tygodniowych samców myszy Apoe-/-. Sytox (niebieski) i DAPI (niebieski) wybarwiły jądra komórkowe. (B) Zrekonstruowane i segmentowane obrazy 3D całego brzucha myszy utrwalonego metodą iDISCO. Rekonstrukcja 3D za pomocą arkusza światła, segmentacja i śledzenie nerwów oraz aksonów NF200+ (strzałki, zielony) i ich relacja przestrzenna z zwojami współczulnymi (groty strzałek) nienaruszonej aorty brzusznej. Pusty trójkąt wskazuje nowo powstały akson sąsiadujący z blaszkami miażdżycowymi. Autofluorescencja (auto) została wykorzystana do obrazowania aorty i tkanki łącznej, w tym blaszki (cyjan) i węzła chłonnego nerkowego (RLN, niebieski). CG, zwoje trzewne, SycG, zwoje łańcucha współczulnego. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Mohanta et al.6 oraz Sun et al.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Miażdżyca może być postrzegana jako przezścienna choroba zapalna tętnic obejmująca wszystkie trzy warstwy ściany tętnicy. Ponadto tętnice otoczone są okołonaczyniową tkanką tłuszczową i tkanką neuronalną. Podczas progresji miażdżycy każda z tych tkanek ulega znacznym zmianom komórkowym i strukturalnym, co wymaga metod uzyskania subkomórkowego dostępu optycznego do nienaruszonych tkanek otaczających zdrowe i chore tętnice. Metody te zostały przedstawione w celu lepszego zrozumienia interakcji komórka-komórka i komórka-tkanka oraz pogłębienia wiedzy na temat patogenezy chorób sercowo-naczyniowych. Oczyszczanie tkanek i późniejsze obrazowanie mikroskopowe 3D pozwala na obrazowanie wielkoskalowych, dotychczas niedostępnych nienaruszonych przedziałów tkankowych, odsłaniając szczegółowe rekonstrukcje tętnic. W tym miejscu przedstawiamy protokoły dla technik oczyszczania tkanek TDE i iDISCO, podkreślając ich skuteczność i prostotę w osiąganiu niemal całkowitej przezroczystości tkanek, wydajnym obrazowaniu za pomocą mikroskopii konfokalnej/wielofotonowej lub mikroskopii arkuszowej, a jednocześnie zachowaniu integralności strukturalnej.

Oczyszczanie TDE wykorzystuje rozpuszczalny w wodzie odczynnik w celu uzyskania przezroczystości tkanek poprzez regulację RI, skutecznie zachowując w ten sposób sygnały fluorescencyjne w tkance. Stanowi skuteczną metodę oczyszczania tkanek dla naczyń krwionośnych o mniejszych rozmiarach, czyli objętości tkanki o wielkości od mikrometra do milimetra bez kurczenia się tkanek. Wymaga jednak dłuższego czasu przetwarzania w przypadku większych tkanek, to znaczy objętości tkanek o rozmiarach od milimetra do centymetra. Co ważne, procedura może być dostosowana do potrzeb użytkownika poprzez dostosowanie stężenia odczynników oraz czasu inkubacji. Z drugiej strony, iDISCO wykorzystuje szereg rozpuszczalników organicznych do usuwania lipidów i wody, co prowadzi do lepszej przezroczystości tkanek w przypadku większych tkanek, całych narządów lub całych tkanek myszy lub większych tkanek ludzkich. Oferuje unikalne zalety krótkiego czasu przetwarzania i przydatności do dużych objętości tkanek. Prowadzi to jednak do kurczenia się oczyszczonych próbek, wygaszania sygnałów fluorescencyjnych i usuwania lipidów, co jest głównym ograniczeniem dla bogatych w lipidy tkanek miażdżycowych. Ponadto mikroskopia arkuszowa światła, w przeciwieństwie do mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej, nie może wizualizować szczegółów subkomórkowych na poziomie mikrometru i wizualizować projekcji neuronalnych o małej średnicy, takich jak pojedyncze aksony i ich połączenia z innymi komórkami naczyniowymi.

Unerwienie naczyń odgrywa istotną rolę w rozwoju miażdżycy 6,7,18. Badanie rozmieszczenia nerwów obwodowych wzdłuż drzewa tętniczego i ich zmian pomoże zrozumieć postęp choroby. Ze względu na wydajną zdolność przetwarzania, iDISCO jest powszechnie stosowany do obrazowania całej sieci naczyniowej w modelach miażdżycy u szczurów i myszy 12,19,20,21, zapewniając trójwymiarowe obrazy o wysokiej rozdzielczości. Z drugiej strony TDE nadaje się do badań wymagających zachowania znaczników fluorescencyjnych, takich jak obserwacja określonych markerów neuronalnych, co pozwala dokładnie ujawnić delikatną strukturę i zmiany w unerwieniu naczyńkrwionośnych 6. Oba protokoły oczyszczania tkanek są wymagane, ponieważ usuwanie TDE nie obejmuje kurczenia się i może obrazować lipidy, podczas gdy iDISCO prowadzi do kurczenia się tkanek z powodu odwodnienia i delipidacji. Co więcej, zmodyfikowany protokół iDISCO może być stosowany do oczyszczania tkanek ludzkich komórek sercowo-naczyniowych22,23. Obie techniki oczyszczania oferują uzupełniające się korzyści w badaniu przebudowy tętnic w miażdżycy. Dzięki połączeniu mocnych stron obu metod można uzyskać bardziej kompleksowe i dogłębne zrozumienie patologicznych mechanizmów miażdżycy.

Oświadczenia

SKM, CJY i AJRH są współzałożycielami Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) SFB1123/Z1, Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK) DZHK 81X2600282 oraz grant Fundacji Corona (S199/10087/2022) dla SKM; oraz ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 oraz grant rządowy dla AJRH w Easemedcontrol R&D GmbH and Co. KG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,2'-tiodieetanol (TDE)Sigma 166782Odczynnik czyszczący
AmiraThermo Fisher Scientificoprogramowanie do wizualizacji 3D; Oprogramowanie do przetwarzania obrazu służące do ręcznej segmentacji i śledzenia w obrazach 3D
Alkohol benzylowySigma W213713Odczynnik czyszczący
Benzoesan benzyluSigmaB6630Odczynnik czyszczący
CD16/32eBioscience14-0161-82Roztwór blokujący
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica MicrosystemsTCS-SP8 3XUrządzenie do obrazowania do wielowymiarowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych tkanek biologicznych lub skrawków o wysokiej swoistości w rozdzielczości subkomórkowej.
DAPIInvitrogenD3571Marker jąder
Dichlorometan (DCM)Sigma 270997Odczynnik czyszczący
do misek czarnych Thermo Scientific S17432Rozwarstwienie i stabilizacja aorty 
Mikroskop stereoskopowyLeica Microsystems Stemi 2000Sekcja narządów myszy
Etanol Ucieczka SigmaE7023 
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Roth 8040.1Bufor perfuzyjny 
Fidżi (ImageJ, NIH)Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 2D i 3D
Kozioł anty-chomik IgG, Cy3Dianova 127-165-099Przeciwciało drugorzędowe
Kozioł anty-królicze IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Przeciwciało drugorzędowe 
Koza anty-Rat IgG, Cy5Dianova712-175-150Przeciwciało drugorzędowe
Chomik Anty-CD3e BD Bioscience145-2C11 Marker komórek Pan-T
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, HolandiaWersja 19.10Oprogramowanie do przywracania obrazów; Oprogramowanie do przetwarzania obrazów wykorzystywane głównie do dekonwolucji obrazów 2D i 3D
Stacja robocza do przetwarzania obrazuMIFCOM MIFCOM X5wyposażona we wszystkie programy do przetwarzania obrazu, w tym pakiet aplikacji Leica X, Fiji i Imaris do przetwarzania końcowego obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopów konfokalnych, wielofotonowych i arkuszy świetlnych
ImarisBitplanew wersji 8.4Oprogramowanie do analizy obrazu; Oprogramowanie do przetwarzania obrazów wykorzystywane do automatycznej segmentacji obrazów 3D
Inkubator i rotator Marshall Naukowy Innova 4230Urządzenie do inkubacji i rotacji podczas oczyszczania tkanki
 
iSpacerSunjin LabIS4020Studzienka prostokątna wraz z uchwytem na próbkę
KetaminaLivistoAnesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica MicrosystemsWersja 3.5Oprogramowanie do przetwarzania obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopu Leica
Mikroskop świetlnyLeica MicrosystemsDM LBUrządzenie do obrazowania z jasnym polem
Arkusz świetlny  mikroskopLaVision BioTechUltramikroskop IITechnika obrazowania do szybkiego obrazowania w wysokiej rozdzielczości dużych próbek biologicznych lub całej myszy przy słabym naświetleniu poprzez szybkie pozyskiwanie obrazów cienkich przekrojów optycznych.
Mikroskopia wielofotonowaLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Metoda obrazowania do wielowymiarowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych i żywotnych tkanek biologicznych na poziomie subkomórkowym i molekularnym przez dłuższy czas, głęboko w próbce i przy minimalnej inwazji.
Normalna surowica kozia SigmaG9023Roztwór blokujący
Paraformaldehyd (PFA) Sigma P-6148 Mocowanie 
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma P4417-100TAB Bufor do mycia
Żelatyna ze skóry świńSigma G1890Bufor inkubacyjny
QuadrolSigma122262CUBIC odczynnik czyszczący
Królik Anti-NF200SigmaN4142Marker panneuronalny
Szczur Anty-B220 BD BioscienceRA3-6B2Marker komórek Pan-B
SacharozaSigma 90M003524V Odwodnienie 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Marker jąder
TetrahydrofuranSigma 401757Odczynnik czyszczący 
Triton X-100Roth 3051.1Penetracja
MocznikSigma U5128CUBIC odczynnik czyszczący
Ksylen Fisher Chemical x/0250/17 Znieczulenie 
Wosk Stacja robocza do przetwarzania obrazu

Bibliografia

  1. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
  5. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).
  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
  8. Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity. Front Immunol. 10, 1101(2019).
  9. Newland, S. A., et al. Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Commun. 8, 15781(2017).
  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
  11. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies. Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).
  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).
  15. Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain. STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).
  16. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  17. Sun, T., et al. Tissue clearing approaches in atherosclerosis. Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).
  18. Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis. Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).
  19. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Mol Metab. 14, 71-81 (2018).
  20. Kirst, C., et al. Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature. Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).
  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
  22. Bhatia, H. S., et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).
  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie tkanki aortyprogresja mia d ycyklarowanie tkanekmikroskopia konfokalnaobrazowanie wielofotonoweimmunoznakowanieprzebudowa tuniki zewn trznejwizualizacja sieci neuronowychsegmentacja obrazu
Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.