Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostatnie badania poszerzyły zrozumienie miażdżycy jako przezściennej przewlekłej choroby zapalnej obejmującej wszystkie trzy warstwy ściany tętnicy, w tym blaszkę wewnętrzną, środek i przydankę, która tworzy zewnętrzną powłokę tkankową tętnic. Nasze ostatnie badania sugerują, że przydanka jest wykorzystywana przez obwodowy układ nerwowy jako kanał docierający do wszystkich komórek tkankowych. Odkryliśmy również, że obwodowy układ nerwowy, czyli czuciowy i współczulny układ nerwowy, przechodzi poważne procesy przebudowy obejmujące neogenezę sieci aksonów sąsiadujących z blaszkami miażdżycowymi. W tym kontekście zrozumienie struktury sieci neuronowej i jej interakcji z komponentami naczyniowymi chorych tętnic daje duże nadzieje na lepsze zrozumienie patogenezy chorób sercowo-naczyniowych. Aby osiągnąć te cele, potrzebne są metody wizualizacji subkomórkowej architektury nienaruszonych zdrowych i chorych tętnic wraz z otaczającymi je przedziałami okołonaczyniowymi. Oczyszczanie tkanek umożliwia nienaruszone obrazowanie tkanek głębokich większych przedziałów tkankowych, które są niedostępne w inny sposób. Umożliwia obrazowanie wolumetryczne nienaruszonych tętnic dzięki integracji narzędzi do znakowania, oczyszczania, zaawansowanego obrazowania mikroskopowego i przetwarzania obrazu. W tym miejscu opisujemy dwa odrębne, ale uzupełniające się podejścia do pasywnego oczyszczania tkanek, to znaczy usuwanie 2, 2-tiodieetanolu (TDE) na bazie wody i trójwymiarowe obrazowanie narządu oczyszczonego rozpuszczalnikowo (iDISCO) za pomocą znakowania immunologicznego w celu zobrazowania izolowanych segmentów aorty lub całej aorty in-situ u całej myszy.
Wprowadzenie
Techniki histologiczne dostarczają podstawowego zrozumienia próbek biologicznych poprzez cięcie tkanek/organów. Jednak nakreślenie złożonych anatomicznych interakcji komórka/komórka i tkanka/tkanka w trzech direzydencjach (3D) było - do niedawna - trudne do osiągnięcia. Ta niezaspokojona potrzeba była szczególnie widoczna w kontekście układu sercowo-naczyniowego w stanach zdrowych i chorych. Obrazowanie nienaruszonych tkanek było w przeszłości wyzwaniem ze względu na absorpcję i rozpraszanie światła, co sprawiało, że były one z natury nieprzezroczyste. Oczyszczanie tkanek sprawia, że nienaruszona próbka biologiczna jest przezroczysta, minimalizując te ograniczenia. Na....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi lokalnego i krajowego komitetu ds. użytkowania i opieki nad zwierzętami. W niniejszym badaniu wykorzystano hiperlipidemiczne samce myszy Apoe-/- na tle C57BL/6J, utrzymywane na standardowej diecie gryzoni, u których spontanicznie rozwija się miażdżyca podczas starzenia.
1. Całościowe obrazowanie izolowanej aorty i oczyszczanie TDE
- Przygotowanie tkanek
- Przygotować środek znieczulający w dawce 150 mg/kg ketaminy i 30 mg/kg ksylazyny (patrz tabela materiałów) na mysz. Głęboko znieczulij myszy przez wstrzyknięcie do....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zademonstrować mikroanatomię nienaruszonej aorty zdrowej i chorej oraz ujawnić fizyczne połączenia między układem odpornościowym, układem nerwowym i układem sercowo-naczyniowym w mysich modelach miażdżycy, zastosowaliśmy dwa komplementarne podejścia do utrudniania tkanek (clearing): utrudnianie TDE wyizolowanej aorty oraz utrudnianie iDISCO całej myszy (Rysunek 1). Po immunobarwieniu całego preparatu (whole-mount), aortę en face utrudniono za pomocą serii roztworów roboczych TDE.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Miażdżyca może być postrzegana jako przezścienna choroba zapalna tętnic obejmująca wszystkie trzy warstwy ściany tętnicy. Ponadto tętnice otoczone są okołonaczyniową tkanką tłuszczową i tkanką neuronalną. Podczas progresji miażdżycy każda z tych tkanek ulega znacznym zmianom komórkowym i strukturalnym, co wymaga metod uzyskania subkomórkowego dostępu optycznego do nienaruszonych tkanek otaczających zdrowe i chore tętnice. Metody te zostały przedstawione w celu lepszego zrozumienia interakcji komórka-komórka i komórka-tka.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
SKM, CJY i AJRH są współzałożycielami Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) SFB1123/Z1, Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK) DZHK 81X2600282 oraz grant Fundacji Corona (S199/10087/2022) dla SKM; oraz ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 oraz grant rządowy dla AJRH w Easemedcontrol R&D GmbH and Co. KG.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,2'-tiodieetanol (TDE) | Sigma | 166782 | Odczynnik czyszczący |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | oprogramowanie do wizualizacji 3D; Oprogramowanie do przetwarzania obrazu służące do ręcznej segmentacji i śledzenia w obrazach 3D | |
| Alkohol benzylowy | Sigma | W213713 | Odczynnik czyszczący |
| Benzoesan benzylu | Sigma | B6630 | Odczynnik czyszczący |
| CD16/32 | eBioscience | 14-0161-82 | Roztwór blokujący |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Leica Microsystems | TCS-SP8 3X | Urządzenie do obrazowania do wielowymiarowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych tkanek biologicznych lub skrawków o wysokiej swoistości w rozdzielczości subkomórkowej. |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Marker jąder |
| Dichlorometan (DCM) | Sigma | 270997 | Odczynnik czyszczący |
| do misek czarnych | Thermo Scientific | S17432 | Rozwarstwienie i stabilizacja aorty |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica Microsystems | Stemi 2000 | Sekcja narządów myszy |
| Etanol | Ucieczka Sigma | E7023 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Roth | 8040.1 | Bufor perfuzyjny |
| Fidżi | (ImageJ, NIH) | Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 2D i 3D | |
| Kozioł anty-chomik IgG, Cy3 | Dianova | 127-165-099 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Kozioł anty-królicze IgG, Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific / Invitrogen | A-21109 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Koza anty-Rat IgG, Cy5 | Dianova | 712-175-150 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Chomik Anty-CD3e | BD Bioscience | 145-2C11 | Marker komórek Pan-T |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging, Holandia | Wersja 19.10 | Oprogramowanie do przywracania obrazów; Oprogramowanie do przetwarzania obrazów wykorzystywane głównie do dekonwolucji obrazów 2D i 3D |
| Stacja robocza do przetwarzania obrazu | MIFCOM | MIFCOM X5 | wyposażona we wszystkie programy do przetwarzania obrazu, w tym pakiet aplikacji Leica X, Fiji i Imaris do przetwarzania końcowego obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopów konfokalnych, wielofotonowych i arkuszy świetlnych |
| Imaris | Bitplane | w wersji 8.4 | Oprogramowanie do analizy obrazu; Oprogramowanie do przetwarzania obrazów wykorzystywane do automatycznej segmentacji obrazów 3D |
| Inkubator i rotator | Marshall Naukowy | Innova 4230 | Urządzenie do inkubacji i rotacji podczas oczyszczania tkanki |
| iSpacer | Sunjin Lab | IS4020 | Studzienka prostokątna wraz z uchwytem na próbkę |
| Ketamina | Livisto | Anesthetic | |
| Leica Application Suite X (LAS-X) | Leica Microsystems | Wersja 3.5 | Oprogramowanie do przetwarzania obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopu Leica |
| Mikroskop świetlny | Leica Microsystems | DM LB | Urządzenie do obrazowania z jasnym polem |
| Arkusz świetlny mikroskop | LaVision BioTech | Ultramikroskop II | Technika obrazowania do szybkiego obrazowania w wysokiej rozdzielczości dużych próbek biologicznych lub całej myszy przy słabym naświetleniu poprzez szybkie pozyskiwanie obrazów cienkich przekrojów optycznych. |
| Mikroskopia wielofotonowa | Leica Microsystems | TCS-SP5II MP | Metoda obrazowania do wielowymiarowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych i żywotnych tkanek biologicznych na poziomie subkomórkowym i molekularnym przez dłuższy czas, głęboko w próbce i przy minimalnej inwazji. |
| Normalna surowica kozia | Sigma | G9023 | Roztwór blokujący |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma | P-6148 | Mocowanie |
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma | P4417-100TAB | Bufor do mycia |
| Żelatyna ze skóry świń | Sigma | G1890 | Bufor inkubacyjny |
| Quadrol | Sigma | 122262 | CUBIC odczynnik czyszczący |
| Królik Anti-NF200 | Sigma | N4142 | Marker panneuronalny |
| Szczur Anty-B220 | BD Bioscience | RA3-6B2 | Marker komórek Pan-B |
| Sacharoza | Sigma | 90M003524V | Odwodnienie |
| Sytox | Thermo Fisher Scientific | S11380 | Marker jąder |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | Odczynnik czyszczący |
| Triton X-100 | Roth | 3051.1 | Penetracja |
| Mocznik | Sigma | U5128 | CUBIC odczynnik czyszczący |
| Ksylen | Fisher Chemical | x/0250/17 | Znieczulenie |
Bibliografia
- Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
- Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
- Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., W....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
