Ustalenie mysiego modelu powierzchownego raka pęcherza moczowego za pomocą techniki dopęcherzowego podawania komórek

Podsumowanie

Ten protokół opisuje unikalną metodę konstruowania ortotopowego modelu powierzchownego raka pęcherza moczowego.

Streszczenie

To badanie przedstawia innowacyjną metodę tworzenia ortotopowego modelu guza mysiego pęcherza moczowego o wysokiej skuteczności i precyzyjnej lokalizacji guza. Po znieczuleniu samic myszy C57BL/6J w pozycji leżącej, do pęcherza wprowadza się igłę dożylną o sile 24 G w celu usunięcia jej zawartości. Następnie przez cewnik wprowadza się igłę dozującą o wadze 34 G, obraca się ją pięć razy, aby spowodować ogniskowe uszkodzenie błony śluzowej kopuły pęcherza moczowego, a następnie usuwa. Zawiesina komórek MB49 jest zasysana i podłączana do igły dozującej 30 G, która jest wprowadzana do pęcherza moczowego za pośrednictwem cewnika. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane podśluzówkowo do pęcherza moczowego pod ciśnieniem. Ta technika powoduje minimalny uraz myszy, wysoki wskaźnik wchłaniania guza i stałą lokalizację guza. Charakteryzuje się prostotą i doskonałą powtarzalnością. Model ten stanowi idealną platformę eksperymentalną do opracowywania dopęcherzowych terapii raka pęcherza moczowego, ułatwiając postęp i optymalizację strategii leczenia tego nowotworu.

Wprowadzenie

Rak pęcherza moczowego stanowi znaczące globalne obciążenie zdrowotne, z zauważalnymi różnicami w występowaniu i rokowaniach w zależności od płci. Ten nowotwór złośliwy charakteryzuje się odrębnymi podtypami molekularnymi, z których każdy jest związany z różnymi szlakami patogennymi. Cechy molekularne i patologiczne różnią się znacznie między nieinwazyjnym rakiem pęcherza moczowego (NMIBC) a inwazyjnym rakiem pęcherza moczowego (MIBC)^1,2. NMIBC stanowi około 75% przypadków, w tym guzy pochodzenia nabłonkowego przejściowego, które pozostają zlokalizowane bez przerzutów lub rozprzestrzeniania się. I odwrotnie, MIBC charakteryzuje się infiltracją komórek rakowych do warstwy mięśniowej pęcherza moczowego, czemu towarzyszy wysokie ryzyko rozsiewu, co często wymaga cystektomii w praktyce klinicznej³.

W badaniach przedklinicznych modele, które dokładnie reprezentują powierzchowne stadium choroby, są niezbędne do oceny terapii lekowych. Opracowanie modelu powierzchownego raka pęcherza moczowego in situ ma zatem ogromne znaczenie, służąc jako kluczowe narzędzie badawcze dla rozwoju leków klinicznych i innowacyjnych terapii wkraplania.

Rozwój mysich modeli ortotopowego raka pęcherza moczowego tradycyjnie napotykał wyzwania. Modele indukowane chemicznie często zaczynają się jako powierzchowne guzy, ale mogą ewoluować w formy inwazyjne, ze zmiennością, która ogranicza ich użyteczność w eksperymentach na dużą skalę⁴. Tradycyjne modele implantacji ortotopowej, które polegają na wstrzykiwaniu komórek nowotworowych przez ścianę pęcherza moczowego⁵, mają trudności z wiernym odtworzeniem powierzchownego raka pęcherza moczowego. Alternatywne metody, w tym uszkodzenie błony śluzowej połączone z wkropleniem komórek nowotworowych^6,7,8,9,10, zostały podjęte, ale są ograniczone przez wysokie wskaźniki śmiertelności i niskie wskaźniki przyjmowania nowotworów, co utrudnia ich szersze zastosowanie.

To badanie ma na celu opracowanie nowej metody konstruowania modelu powierzchownego raka pęcherza moczowego, który wykazuje większą stabilność, niższą śmiertelność i stałe umiejscowienie guza w porównaniu do istniejących modeli. Uzyskując bardziej precyzyjne odwzorowanie choroby we wczesnych stadiach, obecny model może poprawić rygorystyczną ocenę interwencji profilaktycznych i terapeutycznych, przyspieszając w ten sposób leczenie raka pęcherza moczowego.

Protokół

Wszystkie protokoły i procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Oceny Etycznej ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Tianjin, Tianjin, Chiny (numer zatwierdzenia SYXK: 2020-0010). Do tego badania wykorzystano sześcio- do ośmiotygodniowych samic myszy C57BL/6J. Zwierzęta były trzymane w kontrolowanych warunkach środowiskowych, w tym w 12-godzinnym cyklu jasnym i ciemnym, temperaturach w zakresie 21-25 °C, regulowanym poziomie wilgotności w zakresie 30%-70% oraz nieograniczonym dostępie do pożywienia i wody, chyba że określono inaczej. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komórek

1. Hodowla linii komórkowej raka pęcherza moczowego MB49 w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu wsparcia optymalnego wzrostu.
2. Utrzymywać hodowle komórkowe w normalnych warunkach w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO_{2 .} Odświeżaj pożywkę co 2-3 dni, aby zapewnić zdrowie i żywotność komórek.
3. Zbierz komórki, stosując standaryzowaną procedurę trawienia trypsyny. Delikatnie odpipetować w celu usunięcia komórek z kolby hodowlanej po zastosowaniu trypsyny i inkubacji przez krótki okres.
4. Policz pobrane komórki za pomocą hemocytometru, aby określić dokładną gęstość komórek. Przygotować zawiesinę jednokomórkową przez ponowne zawieszenie komórek do 2 x 10³/μl w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj tę zawiesinę na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Myszy są trzymane w grupach (5 myszy w klatce) w indywidualnie wentylowanych klatkach z poliwęglanu.
2. Pozwól myszom zaaklimatyzować się przez 7 dni przed rozpoczęciem badania.

3. Generowanie modelu guza ortotopowego u zwierząt

1. Podaj znieczulenie myszom poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe przy użyciu 2,5% roztworu Avertin (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
2. Poczekaj, aż myszy osiągną odpowiedni poziom znieczulenia do zabiegu, na co wskazuje spadek częstości oddechów wraz ze wzrostem głębokości, brak odruchów powiek i rogówki, zmniejszone napięcie mięśniowe i reakcje odruchowe oraz brak reakcji na uszczypnięcie ogona.
3. Ustaw znieczuloną mysz w pozycji leżącej, aby ułatwić zabieg.
4. Do zabiegu cewnikowania cewki moczowej należy użyć cewnika dożylnego 24 G z usuniętym sztyftem igłowym. Nałóż wystarczającą ilość smaru na cewnik, aby zminimalizować dyskomfort i ułatwić płynne wprowadzanie.
5. Zidentyfikuj cewkę moczową, znajdującą się bezpośrednio za fałdami sromu i przed pochwą, utrzymując mysz w pozycji leżącej.
   1. Rozpocznij cewnikowanie, zbliżając się do cewki moczowej pod kątem 45 stopni, aby przejść pod kością łonową. Dostosuj do bardziej płytkiego kąta, aby poprowadzić cewnik przez cewkę moczową i do pęcherza.
6. Unikaj stosowania nadmiernej siły przeciwko oporowi, ponieważ może to prowadzić do perforacji cewki moczowej lub pęcherza moczowego. Potwierdź położenie cewnika w świetle pęcherza, sprawdzając, czy w cewniku nie ma moczu.
7. Delikatnie uciskaj dolną część brzucha myszy, aby ułatwić odpływ moczu z pęcherza. Upewnij się, że pęcherz jest całkowicie opróżniony, aby przygotować się do kolejnych etapów zabiegu.
8. Delikatnie popchnąć cewnik dożylny 24 G w kierunku górnej części pęcherza moczowego. Upewnij się, że końcówka cewnika styka się z wierzchołkiem pęcherza.
   1. Po potwierdzeniu kontaktu zwolnij cewnik, pozwalając mu się lekko cofnąć. Utrzymuj cewnik w stałej pozycji względem myszy, aby zapewnić stabilność i zapobiec przemieszczeniu.
9. Wprowadzić zmodyfikowaną igłę dozującą 34 G wzdłuż cewnika 24 G. Przesuwać igłę, aż dotrze do górnej części pęcherza.
   1. Po ustawieniu obróć igłę sześć razy, aby utworzyć miejscowe uszkodzenie błony śluzowej na wierzchołku pęcherza. Po zakończeniu obrotu ostrożnie wycofaj igłę wzdłuż cewnika.
10. Podłączyć igłę dozującą 30 G do górnej części strzykawki o pojemności 1 ml. Upewnić się, że igła jest bezpiecznie połączona ze strzykawką.
    1. Po podłączeniu należy pobrać do strzykawki wstępnie przygotowaną zawiesinę komórek MB49 o pojemności 2 x 10³/μl, delikatnie odciągając tłok. Sprawdzić, czy zawiesina komórek jest zasysana do strzykawki bez pęcherzyków powietrza.
11. Wprowadzić igłę dozującą 30 G wzdłuż cewnika 24 G. Upewnij się, że igła jest prawidłowo wyrównana i zabezpieczona w cewniku.
    1. Po umieszczeniu w pozycji należy nacisnąć tłok strzykawki o pojemności 1 ml w celu wstrzyknięcia zawartości (przygotowanej w kroku 1). Utrzymuj stały nacisk na tłok przez 60 sekund, aby upewnić się, że zawartość jest dostarczana bez znacznego zmniejszania objętości.
    2. Po upływie 60 s ostrożnie wyjąć strzykawkę i igłę dozującą 30 G z cewnika.

4. Monitorowanie pooperacyjne

1. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej, aż powróci odruch prostowania.
2. Upewnij się, że zwierzę nie jest pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności.
3. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.

Wyniki

Skuteczność wstrzyknięć podśluzówkowych oceniono początkowo poprzez podanie błękitu trypanowego. Po wstrzyknięciu wyraźnie zwizualizowano rozprzestrzenianie się barwnika w warstwie podśluzowej, co potwierdziło precyzyjne i kontrolowane dostarczanie wstrzykiwanych substancji (Rysunek 1).

Proces rozwoju guza był skrupulatnie monitorowany. Około 14 dni po implantacji zaobserwowano znaczną częstotliwość występowania krwiomoczu, co jest krytycznym objawem wskazującym n...

Dyskusja

Badania nad rakiem pęcherza moczowego opierają się na modelach zwierzęcych, które są niezbędne zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Aby lepiej naśladować środowisko wzrostu guza, ortotopowe modele guza pęcherza moczowego zapewniają lepsze podejście w porównaniu z podskórnymi modelami guzów¹¹.

Obecnie ortotopowe modele raka pęcherza moczowego można podzielić na dwa główne typy na dwa główne typy: te wykorzystujące myszy z niedoborem odporności, takie jak ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła dozująca 34 G	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, Chiny	SGL-362
Igła dozująca 30 G	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, Chiny	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan niebieski	Sigma-Aldrich LLC	302643