Charakterystyka biologicznych widm absorpcyjnych obejmujących zakres od światła widzialnego do krótkofalowej podczerwieni

Podsumowanie

Próbki biologiczne mają różne cechy optyczne w zakresie krótkofalowej podczerwieni (SWIR) w porównaniu do zakresu długości fal widzialnych (VIS) i bliskiej podczerwieni (NIR). Jednak rejestrowanie czystych widm absorpcyjnych SWIR jest trudne i rzadko przeprowadzane w przypadku cząsteczek biologicznych. W artykule przedstawiono metodę charakterystyki widm absorpcyjnych VIS-SWIR absorberów biologicznych.

Streszczenie

Dla nieinwazyjnego monitorowania fizjologicznego opartego na świetle, optymalne długości fal poszczególnych składników tkanki można określić za pomocą spektroskopii absorpcyjnej. Jednak ze względu na brak czułości sprzętu na dłuższych falach, spektroskopia absorpcyjna jest zwykle stosowana dla długości fal w zakresie widzialnym (VIS) i bliskiej podczerwieni (NIR) od 400 do 1000 nm. Postęp sprzętowy w zakresie krótkofalowej podczerwieni (SWIR) umożliwił badaczom zbadanie długości fal w zakresie od ~1000 nm do 3000 nm, w których występują charakterystyczne piki absorpcji lipidów, białek i wody. Cząsteczki te są trudne do wizualizacji w VIS-NIR i mogą stanowić wolne od znaczników źródła kontrastu biologicznego. Ponadto zaobserwowano niższe wchłanianie SWIR w przypadku melaniny, głównego chromoforu odpowiedzialnego za pigmentację skóry. Stwierdzono, że urządzenia optyczne in vivo, takie jak klinicznie standardowe pulsoksymetry, mają zmniejszoną dokładność u osób z ciemną pigmentacją skóry, prawdopodobnie z powodu silniejszej absorpcji melaniny w zakresie VIS. W ten sposób błąd związany z pigmentacją skóry można było zredukować poprzez zastosowanie urządzeń działających w SWIR. Projektowanie przyrządów optycznych jest ułatwione dzięki zrozumieniu właściwości absorpcyjnych podstawowych składników tkankowych z zakresu VIS do SWIR. W artykule opisano protokoły i oprzyrządowanie do uzyskiwania widm absorpcyjnych VIS-SWIR popularnych absorberów tkankowych: hemoglobiny utlenionej, hemoglobiny odtlenionej, melaniny, wody i lipidów.

Wprowadzenie

Większość absorberów biologicznych została optycznie scharakteryzowana w zakresie widma widzialnym (VIS, ~400-700 nm) i bliskiej podczerwieni (NIR, ~700-1,000 nm), ale nie w krótkofalowej podczerwieni (SWIR, ~1,000-3,000 nm)^1,2,3,4 (Rysunek 1). Dzieje się tak pomimo tego, że SWIR oferuje głębszą penetrację światła dzięki mniejszemu rozpraszaniu tkanek i zmniejszonej absorpcji melaniny, a także dodatkowemu kontrastowi biologicznemu bez znaczników dla wody, lipidów i białek^1,5^,6. Brak widm absorpcyjnych obejmujących VIS-SWIR stworzył lukę w wiedzy, która uniemożliwia rozwój biomedycznych urządzeń optycznych, które wykorzystują te zalety SWIR. Chociaż w przeszłości przedstawiono kilka prób scharakteryzowania widm, brakuje wysokiej jakości widm absorpcyjnych VIS-SWIR czystych składników bez znaczących artefaktów rozpuszczalnikowych^1,7,8. Na przykład, substancje rozpuszczalne w wodzie, takie jak hemoglobina, zostały scharakteryzowane w SWIR przy użyciu wody jako rozpuszczalnika i odjęciu absorpcji czystej wody od wynikowego widma⁹. Jednak dokładność tego podejścia jest niejasna, ponieważ woda jest dominującym absorberem w tym regionie.

Praca w SWIR ma dodatkową zaletę polegającą na zmniejszeniu lub ewentualnym usunięciu odchylenia spowodowanego silną absorpcją melaniny w VIS podczas korzystania z diagnostyki optycznej in vivo. Liczne badania wykazały, że pulsoksymetry przeszacowują natlenienie u czarnych pacjentów, w związku z czym czarni pacjenci są bardziej narażeni na niebezpiecznie niski poziom tlenu, którego pulsoksymetry nie wykryły¹⁰. To uprzedzenie pigmentacji skóry spowodowało opóźnione i nieodpowiednie leczenie wielu pacjentów z niedotlenieniem osób czarnoskórych^11,12 i skłoniło społeczności optyków i inżynierów do podjęcia działań w celu poprawy dokładności urządzeń optycznych dla wszystkich odcieni skóry¹³. Przejście z wysokich długości fal VIS pochłaniających melaninę na NIR i SWIR jest jedną z ekscytujących innowacji technicznych, które mogą zmniejszyć dysproporcje rasowe w krytycznie ważnych technologiach optyki biomedycznej.

Rejestrowanie widm absorpcyjnych biomolekuł jest niezbędne do zrozumienia właściwości optycznych próbek tkanek, które są wykorzystywane w różnych zastosowaniach inżynieryjnych i biomedycznych¹⁴. Spektroskopia absorpcyjna mierzy absorpcję światła specyficzną dla cząsteczki w funkcji długości fali. Złotym standardem metody uzyskiwania pomiarów absorpcji w roztworze jest skierowanie skolimowanego, monochromatycznego światła przez rozpuszczoną próbkę i zarejestrowanie przechodzącego światła za pomocą detektora umieszczonego po przeciwnej stronie próbki niż źródło światła. Absorpcja (A) próbki jest następnie definiowana przez równanie (1).

A = log₁₀(I₀/I) (1)

Gdzie I_o to natężenie światła padającego na próbkę, a I to intensywność światła przepuszczanego przez próbkę, które trafia do detektora. I_o uzyskuje się poprzez pomiar odniesienia, którym jest zazwyczaj rozpuszczalnik substancji rozpuszczonej będącej przedmiotem zainteresowania, przy użyciu tych samych ustawień akwizycji co I. Spektroskopia absorpcyjna zapewnia ilościowe właściwości absorpcyjne i podlega prawu Beera-Lamberta (równanie 2), które nie ma zastosowania do próbek z rozpraszaniem optycznym. Równanie to mówi, że absorpcja optyczna jest określana przez współczynnik absorpcji molowej próbki (ε, jednostki L·mol⁻¹·cm⁻¹) przy długości fali λ pomnożony przez jej stężenie molowe (C, jednostki mol∙^L-1) i długość ścieżki (L, jednostki cm), która jest zdefiniowana jako odległość przebyta przez próbkę¹⁵:

A(λ) = ε(λ)*L*C (2)

Co ważne, współczynnik absorpcji molowej jest unikalny dla każdego biologicznego absorbera i wskazuje, jak mocno próbka pochłania światło o określonej długości fali¹⁶.

Podczas wykonywania pomiarów spektroskopii absorpcyjnej od VIS do SWIR, wymagane są dostosowania sprzętu, przygotowania próbki i przetwarzania spektralnego poza standardowymi widmami VIS-NIR:

Hardware
Pomiary VIS-NIR zazwyczaj wykorzystują detektor krzemowy lub lampy fotopowielacza (PMT) z fotokatodami wrażliwymi na fotony UV-VIS, podczas gdy absorbancja SWIR wymaga fotodetektora wrażliwego na fotony SWIR, takiego jak detektor z arsenku indu i galu (InGaAs) ¹⁷. Systemy VIS, NIR i SWIR zazwyczaj wymagają również elementów dyspersyjnych specyficznych dla długości fali, takich jak siatki optyczne, do dyspersji światła w tych zakresach optycznych. Ponadto absorpcja SWIR wymaga kuwet szklanych lub kwarcowych, które mają wyższą transmisję niż kuwety plastikowe w SWIR, co czyni je bardziej odpowiednimi dla widm VIS-SWIR. Należy wybrać źródło lub źródła światła o szerokiej i względnie jednolitej emisji obejmującej VIS-SWIR, takie jak lampa halogenowa wolframowa (stosowana w niniejszym protokole). Regulacja mocy padającego światła, czasu ekspozycji lub czasu, przez jaki fotodetektor jest wystawiony na działanie światła, może pomóc w optymalizacji pomiarów absorbancji.

Przygotowanie próbki
Stężenie próbki lub długość drogi kuwety zmieni liniowo ilość absorpcji, która zachodzi, jak opisano powyżej w Korektorze (2), a zatem każda z nich może zostać zmieniona w celu osiągnięcia wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR, tutaj obliczany jako stosunek amplitudy piku do odchylenia standardowego odtrendowanego obszaru widma, zazwyczaj SNR > 30 jest uważany za wysokiej jakości) pomiary w różnych sekcjach widma o stosunkowo wysokiej lub niskiej absorbancji. Aby zoptymalizować pomiary SWIR w roztworze wodnym, zamiast wody (_H2O) można użyć tlenku deuteru (D₂O), zwanego również ciężką wodą lub wodą deuterowaną, ponieważ ma on znacznie niższe piki absorpcji w klasie SWIR1. Pozwala to na scharakteryzowanie substancji rozpuszczonej bez ingerencji w dominującą absorpcję wody w SWIR.

Spectral postprocessing
Przetwarzanie końcowe jest wymagane, ponieważ widma VIS-SWIR wymagają dwóch detektorów, jednego dla widzialnego NIR (zwykle PMT wrażliwego na krzem lub UV-VIS) i jednego dla SWIR (zwykle InGaAs), a widma muszą być zszyte razem, aby uzyskać pełne widmo VIS-SWIR. Gdy widma obejmują VIS-SWIR, absorpcja może się znacznie różnić w zależności od obszaru długości fali, a próbka może wymagać rozcieńczenia lub zmniejszenia długości ścieżki w niektórych obszarach, aby zapobiec nasyceniu. Widma muszą być skalowane liniowo, aby uwzględnić zmiany w stężeniu próbki lub długości ścieżki, a następnie zszyte razem, aby utworzyć pojedyncze widmo obejmujące dwa obszary długości fali.

Następujące protokoły szczegółowo opiszą przygotowanie i pomiar spektroskopowy od VIS do SWIR pięciu przykładowych absorberów biologicznych: woda (stanowi ~60% masy ciała), melanina (główny absorber pigmentacji skóry), olej kukurydziany (używany jako analog dla ludzkich lipidów, ponieważ ma niską zmienność między partiami, skład chemiczny zbliżony do lipidów ludzkich i zwierzęcych, i minimalne rozproszenie) oraz natleniona i odtleniona hemoglobina (główne absorbery we krwi).

Protokół

1. Przygotowanie próbek

1. Przygotowanie próbki wody
   1. Aby przygotować próbkę, napełnij czysty pojemnik ultraczystą wodą i przefiltruj go za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Upewnij się, że wyjście strzykawki jest skierowane do czystej szklanej lub kwarcowej kuwety w celu wykonania pomiarów spektroskopii absorpcyjnej próbki.
   2. Aby przygotować odniesienie, napełnij czysty pojemnik deuterowaną wodą i przefiltruj go za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Upewnij się, że wyjście strzykawki jest skierowane do identycznej czystej szklanej lub kwarcowej kuwety jak próbka kuweta, która służy jako odniesienie.
      UWAGA: Etap filtrowania zminimalizuje rozpraszanie optyczne od próbki poprzez odfiltrowanie małych cząstek w wodzie, które mają silny wpływ na obszar widzialny.
2. Przygotowanie próbki melaniny
   1. Przygotuj roztwór melaniny o stężeniu 1,7 mg/ml, dodając sproszkowaną melaninę do probówki wirówkowej wypełnionej 3,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Aby rozpocząć, pomiary należy rozpocząć od długości fal o najniższej oczekiwanej absorpcji, gdzie wymagane jest najwyższe stężenie melaniny. Rozpocznij pomiary melaniny od około 1,7 mg / ml dla SWIR i rozcieńcz go DMSO później do 10-krotnego rozcieńczenia (około 0,17 mg / mL) dla regionów VIS / NIR.
   2. Sonikuj probówkę przez 10 minut, aby upewnić się, że sproszkowana melanina rozpuści się w DMSO i przenieś roztwór do czystej szklanej lub kwarcowej kuwety w celu pomiarów spektroskopowych.
   3. Pozostać w liniowym zakresie absorbancji spektrometru i zapewnić wysokie pomiary SNR, zmieniając stężenie i/lub długość ścieżki (np. przełączając się z krótkiej długości ścieżki (1 lub 2 mm) na kuwetę o długości ścieżki 10 mm). Absorpcja melaniny ma szeroki zakres, od VIS do SWIR. W przypadku VIS należy użyć kuwety melaniny o najniższym stężeniu i/lub długości drogi ze względu na jej wysoki współczynnik ekstynkcji molowej; w przypadku SWIR należy użyć najwyższego stężenia melaniny i/lub kuwety o długości ścieżki, aby uzyskać jakościowo czysty pomiar spektroskopowy.
3. Przygotowanie próbki oleju kukurydzianego
   1. Dodaj olej kukurydziany do czystej szklanki lub kuwety kwarcowej do pomiarów spektroskopowych.
   2. Użyj otwartego powietrza jako odniesienia. Żadna kuweta ani roztwór nie będą używane jako odniesienie.
4. Przygotowanie natlenionej próbki hemoglobiny z pełną heparyną ludzką krwią
   UWAGA: Cała heparynizowana krew ludzka została zakupiona i pobrana w licencjonowanych przez FDA centrach pobierania próbek zlokalizowanych w Stanach Zjednoczonych.
   1. Aby wyizolować hemoglobinę z czerwonych krwinek (RBC) i usunąć jak najwięcej wody z krwi, najpierw należy pobrać pipetę 1800 μl pełnej heparynizowanej krwi ludzkiej do probówek mikrowirówkowych i odwirować przy 9,6 × g przez 10 min.
      UWAGA: Zalecane jest około 4-6 probówek do mikrowirówek
   2. Po odwirowaniu wyjmij probówki z mikrowirówki, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant (będzie to około 850 μl) z odwirowanej próbki krwi bez naruszania osadu (Rysunek 2). Supernatant składa się z cieczy (głównie osocza i płytek krwi) znajdującej się powyżej osadu krwinek czerwonych. Poszukaj osadu czerwonych krwinek na dnie probówki do mikrowirówki.
   3. Każdą osadkę należy rozpuścić w takiej samej objętości zdeuterowanej wody, jak objętość supernatantu, który został wyrzucony. Ponownie odwirować przy 9,6 × g przez 10 minut.
   4. Wyjąć probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.
   5. Rozpuść osad w tej samej objętości zdeuterowanej wody, co objętość supernatantu, który został odrzucony. Ponownie odwirować przy 9,6 × g przez 10 min.
   6. Wyjmij probówki z wirówki, a następnie usuń supernatant za pomocą pipety i wyrzuć go.
   7. Liza czerwonych krwinek (RBC): Rozpuść granulki krwinek czerwonych w dużej objętości (4,5 ml) deuterowanej wody, co spowoduje hipotoniczny wybuch. Jeśli granulka przykleja się do tuby, spłucz ją odmierzonymi 4,5 ml deuterowanej wody, aby ją poluzować.
      UWAGA: Objętość supernatantu będzie się zwiększać po każdym etapie wirowania. Ta objętość supernatantu może wynosić od 800 μl do 1 600 μl. Objętość deuterowanej wody do lizy może się zmieniać w zależności od pożądanego stężenia próbki, ale musi być wystarczająco wysoka, aby spowodować hipotoniczny.
   8. Usunąć zlizowany roztwór krwi z probówki za pomocą igły i strzykawki, a następnie ostrożnie wyjąć igłę strzykawki z końcówką i wyrzucić ją do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne. Podłączyć strzykawkę do filtra strzykawkowego 0,22 μm i przepchnąć zawartość strzykawki przez filtr do 10-milimetrowej kuwety szklanej lub kwarcowej o długości 10 mm, 3,5 mL.
      UWAGA: Etap filtrowania zminimalizuje rozpraszanie optyczne od próbki poprzez odfiltrowanie organelli komórkowych i błon w roztworze. Jeśli próbka jest bardzo skoncentrowana, a filtr strzykawkowy staje się trudny do wepchnięcia, należy użyć wielu filtrów strzykawkowych.
   9. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem nad kuwetą, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez parę wodną z powietrza. Foliuj zewnętrzną stronę korka, aby dodatkowo zapobiec zanieczyszczeniu i zapewnić hermetyczne uszczelnienie.
      UWAGA: W przypadku pomiarów od 600 nm do 1,600 nm, około 1,200-1,600 μl osadu rozpuszczonego w 4,5 ml deuterowanej wody da jakościowo czyste pomiary.
      UWAGA: W przypadku obszarów widmowych o wysokiej oczekiwanej absorbancji (od 400 nm do 600 nm) próbki będą musiały zostać rozcieńczone przy użyciu wody deuterowanej, aby uzyskać nienasycone wartości absorbancji i upewnić się, że wartości absorbancji mieszczą się w zakresie liniowym detektora. Ponadto próbki i odniesienie należy umieścić w kuwetach o krótkiej długości drogi (1 lub 2 mm). Dla widm pokazanych w niniejszym dokumencie, próbki rozcieńczono 10-krotnie dla 400-500 nm i 5-krotnie dla 500-600 nm i zmierzono w kuwetach o długości ścieżki 2 mm.
      Krótsza ścieżka (1 lub 2 mm) pozwoli na mniejszą absorpcję światła w przypadku wysoce absorbujących długości fal, pomagając zapewnić, że niektóre fotony przejdą do detektora i pozostaną w liniowym zakresie detekcji.
   10. Zaopatrzyć się w czystą kuwetę o tej samej długości i objętości drogi, co kuweta na próbkę zawierającą przefiltrowany roztwór krwi i napełnić ją deuterowaną wodą do pomiarów podstawowych i referencyjnych. W przypadku zmiany długości ścieżek kuwety dla różnych zakresów spektralnych, należy zarejestrować nowe widmo odniesienia dla każdej długości ścieżki kuwety.
5. Przygotowanie odtlenionej próbki hemoglobiny z pełną heparyną ludzką krwią
   1. Wykonaj kroki 1.4.1-1.4.8.
   2. Dodaj ditionian sodu do roztworu krwi w kuwecie i delikatnie wymieszaj. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem nad kuwetą, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez parę wodną z powietrza. Foliuj zewnętrzną stronę korka, aby jeszcze bardziej zapobiec zanieczyszczeniu i zapewnić hermetyczne uszczelnienie. Ostrożnie przechyl kuwetę na boki, aby upewnić się, że ditionian sodu rozpuści się w roztworze; Roztwór krwi zmieni kolor z czerwonego na ciemniejszy fioletowo-czerwony.
      UWAGA: Aby całkowicie odtlenić hemoglobinę, masa ditionianu sodu, która jest wymagana, wynosi około 0,007 g na ml roztworu krwi. Według Briley-Sӕbø i Bjørneruda, do pełnego odtlenienia krwi potrzeba co najmniej 2,5 mg ditionitu sodu/g krwi¹⁸. Jednak w badaniach tutaj stwierdzono, że stężenie to jest niewystarczające. Stwierdzono, że stężenie około 3,4 mg/g krwi pełnej całkowicie odtlenia roztwór krwi bez wprowadzania rozpraszania optycznego. W przypadku pomiarów od 400 do 600 nm roztwór krwi należy rozcieńczyć wodą deuterowaną. Obliczyć wymaganą masę ditionianu sodu na podstawie objętości użytego roztworu bood, a nie objętości po rozcieńczeniu. W przypadku pomiarów od 600 nm do 1,600 nm, około 1,200-1,600 μl osadu rozpuszczonego w 4,5 ml deuterowanej wody da wysokie pomiary SNR.
      Kuweta o krótszej długości ścieżki (1 lub 2 mm) pozwoli na mniejszą absorpcję światła w wysoce absorbujących długościach fal, pomagając zapewnić, że niektóre fotony przejdą do detektora i pozostaną w liniowym zakresie detekcji.
   3. Napełnij inną kuwetę o pasującej długości ścieżki, podobnie jak kuwetę, przefiltrowanym roztworem krwi z deuterowaną wodą do pomiarów podstawowych i referencyjnych. W przypadku zmiany długości ścieżek kuwety dla różnych zakresów spektralnych, należy zarejestrować nowe widmo odniesienia dla każdej długości ścieżki kuwety.

2. Uzyskiwanie wysokiej jakości pomiarów absorpcji

1. Przygotować próbki i odniesienie zgodnie z opisem w sekcji 1 i umieścić je w szklanych lub kwarcowych kuwetach do pomiarów VIS NIR-SWIR. Włącz lampę spektrometru i detektory i pozwól systemowi rozgrzać się przez co najmniej 5-20 minut, w zależności od systemu spektrometru i źródła światła.
   UWAGA: Pięć minut zapewniło wystarczające chłodzenie detektora i stabilność wyjściową lampy dla widm zebranych w niniejszym dokumencie, ale powinno to być scharakteryzowane dla każdego systemu przed wykonaniem pomiarów absorbancji.
   W tym okresie pobierania należy mieć pod ręką próbkę i odniesienie. Upewnij się, że pokrywki kuwet są dobrze zabezpieczone. Przestrzeń pomiarowa powinna być jak najciemniejsza, aby zapobiec zniekształceniu pomiarów absorpcji przez światło otoczenia.
2. Powtórz następujące kroki dla różnych obszarów widma ze względu na dużą wariancję absorpcji w VIS-SWIR.
   1. W przypadku korzystania z konfiguracji dwuwiązkowej (dwa oddzielne detektory dla próbki i odniesienia), upewnij się, że system jest oparty na linii bazowej. Uzyskać linię podstawową, umieszczając identyczne próbki referencyjne zawierające rozpuszczalnik przed każdym detektorem i pobrać pomiar absorbancji, stosując dokładne parametry akwizycji, które mają być wykorzystane do zbierania widma absorbancji próbki. Chociaż detektory teoretycznie powinny wykazywać zerową absorpcję, zwykle nie jest ona idealna. Odejmij wynikowe widmo absorbancji od wszystkich widm absorbancji próbki, które są uzyskiwane przy użyciu tych samych ustawień.
      UWAGA: Linię bazową należy powtarzać za każdym razem, gdy ustawienia akwizycji do zbierania danych są zmieniane.
   2. Umieść próbkę w spektrometrze i wybierz detektor, który jest odpowiedni dla mierzonego obszaru (VIS-NIR = krzem lub UV-VIS PMT, SWIR = InGaAs) i view absorbancja w trybie Live, w którym pomiar jest stale aktualizowany w miarę dostrajania parametrów pomiaru.
   3. Zaczynając od domyślnych parametrów spektrometru, dostosuj moc padającego światła i czas ekspozycji, aż do uzyskania jakościowo czystego widma absorpcyjnego bez nasycenia.
      1. Jeśli dostrojenie parametrów nie daje uzyskania jakościowo czystych widm, zmodyfikuj parametry, takie jak moc padającego światła, czas ekspozycji, długość ścieżki i stężenie próbki. Najpierw spróbuj dostosować moc i czas ekspozycji. Jeśli dostrojenie tych parametrów nie spowoduje uzyskania wysokiego widma SNR, zmień stężenie próbki lub długość ścieżki próbki i odniesienie.
         UWAGA: Domyślne parametry użyte w zbiorze widm przedstawionych w niniejszym dokumencie to moc światła padającego 15 nW przy 400 nm i 20 nW przy 1000 nm, czas ekspozycji 30 ms, długość drogi kuwety 10 mm oraz stężenia specyficzne dla próbki: 100% woda, melanina 1,7 mg/ml, 100% olej kukurydziany, hemoglobina utleniona (15,9 g/dl), i hemoglobina odtleniona (15,9 g/dl).
      2. Aby zwiększyć SNR, zwiększ liczbę odczytów danych uśrednionych na punkt danych. Im wyższa liczba odczytów danych jest uśredniona, tym dłuższy jest czas na pomiar.
      3. Aby zwiększyć rozdzielczość spektralną, zmniejsz rozmiar kroku (nm) pomiaru do limitu rozdzielczości spektrometru. Wydłuży to czas na pomiar. Dodatkowo zmniejsz pasmo mocy światła padającego do 1/10^części pełnej szerokości najwęższego piku przy połowie maksimum¹⁹.
      4. Po zoptymalizowaniu ustawień pomiaru dla próbki należy udokumentować ustawienia dla każdego uzyskanego widma.
      5. Aby uzyskać widmo, użyj zoptymalizowanych ustawień, aby wykonać pomiar tylko odniesienia. Następnie zastąp kuwetę referencyjną kuwetą sample i wykonaj kolejny pomiar. Upewnij się, że zarówno pomiary referencyjne, jak i sample są zapisywane oddzielnie.
         UWAGA: Konieczne jest, aby pomiar referencyjny nie uległ nasyceniu. Jeśli tak, zmniejsz moc padającego światła i/lub czas ekspozycji, aż nie będzie nasycenia. Wszystkie parametry systemu powinny być takie same między pomiarami odniesienia i próbki; Jeśli jeden będzie musiał zostać zmieniony, drugi również będzie musiał zostać powtórzony, aby go dopasować.
      6. Dla każdego parzystego zestawu pomiarów odniesienia i próbki należy obliczyć absorbancję A (Równanie 1), traktując pomiar odniesienia jako_Io, a pomiar próbki jako I.
      7. Aby zszyć ze sobą różne obszary, które wymagały różnic w stężeniu próbki lub długości ścieżki, zastosuj współczynnik mnożenia do jednego z obszarów spektralnych. Na przykład w przypadku pierwszego regionu, który miał 1/10 stężenia i identyczną długość ścieżki jak drugi region, pomnóż pierwszy region widmowy przez 10, aby odpowiednio przeskalować oba regiony razem.
         UWAGA: Współczynnikiem mnożenia powinna być różnica w stężeniu i/lub długości ścieżki między regionami.
      8. Po skorygowaniu widm o różnice w długości ścieżki lub stężeniu, wybierz nakładającą się długość fali w dwóch obszarach spektralnych, aby zszyć te dwa obszary razem.
      9. Skróć dwa widma tak, aby kończyły się na nakładającej się długości fali; wybierz jedno widmo, aby uwzględnić jego przejściową wartość widmową. Połącz dwa obcięte widma, aby utworzyć jedno wynikowe widmo o szerszym zakresie długości fali.

Wyniki

Dane są dostępne w Repozytorium Cyfrowych Materiałów Badawczych WUSTL (DRMR) doi: https://doi.org/10.7936/6RXS-108249

Charakterystyka spektralna wody
Woda, jeden z najpowszechniejszych absorberów biologicznych, ma charakterystyczne, wysoce absorbujące piki w NIR i SWIR. Te charakterystyczne piki są tak silne, że podczas pomiaru absorbancji wody często trzeba ją rozcieńczyć wodą deuterowaną, aby zapobiec nasyceniu. Różnica w absorbancji między wodą a wodą deuterowaną jest pokazana na Rysunek 3, podkreślając więcej niż rząd wielkości wzrost chłonności wody w porównaniu z wodą deuterowaną. Silna absorpcja wody w SWIR utrudnia również uzyskanie widm absorpcyjnych innych absorberów biologicznych, które zawierają wodę w próbce lub które wykorzystują wodę jako rozpuszczalnik i odniesienie. Jako rozwiązanie tego problemu zamiast wody można użyć wody deuterowanej. Woda deuterowana działa w podobny sposób jak woda, będąc jednocześnie znacznie słabszym absorberem SWIR, co czyni ją idealnym zamiennikiem wody w pomiarach spektroskopii SWIR.

Aby zmierzyć spektrum absorpcyjne wody, użyto wody jako próbki, a wody deuterowanej jako odniesienia. Aby zapobiec nasyceniu w SWIR, próbkę rozcieńczono deuterowaną wodą w obszarze SWIR. Uzyskane widmo absorpcji wody wykazuje niską absorpcję w VIS, która wzrasta przy dłuższych długościach fal. Charakterystyczne piki absorpcji można zaobserwować przy około 750 nm, 970 nm, 1,200 nm i 1,450 nm (Rysunek 4). Uzyskane widmo wody ma SNR 3536,6 i zostało porównane z widmem absorpcji wody Hale'a i Querry'ego²⁰, wykazując podobną krzywą absorpcji od ~500 nm do 1,600 nm. Jednak od 400 do 500 nm krzywe absorpcji różnią się, przy czym Hale i Querry wykazują wyższą wartość absorbancji przy niższych długościach fal. Różnica ta może wynikać z resztkowych małych cząstek w wodzie, które będą miały większe rozpraszanie na krótszych falach w porównaniu z dłuższymi falami³ i mogą unieważnić założenia o braku rozpraszania w pomiarach absorpcji opartych na prawie Beera-Lamberta.

Charakterystyka spektralna melaniny
Melanina, główny absorber optyczny skóry, została scharakteryzowana spektralnie przy użyciu sproszkowanej melaniny jako próbki i DMSO jako rozpuszczalnika i odniesienia. Wynikowe widmo ma SNR 172 i zostało porównane z danymi eumelaniny z Sarna et al.^21,22 i Crippa et al.²³ (Rysunek 5). Eumelanina jest głównym pigmentem odpowiedzialnym za kolor skóry, a zatem dostarcza najdokładniejszych danych na temat tego, jak melanina wpłynie na urządzenia optyczne. Widmo zebrane za pomocą opisanego w niniejszym dokumencie protokołu wykazuje wysoką korelację z tymi wartościami literaturowymi.

Charakterystyka spektralna oleju kukurydzianego
Do zbadania spektrum absorpcji lipidu wybrano olej kukurydziany ze względu na jego minimalne rozpraszanie optyczne w porównaniu z innymi lipidami oraz znane podobieństwo składu chemicznego do tłuszczów zwierzęcych¹. Aby uzyskać spektrum absorpcyjne oleju kukurydzianego, jako próbkę użyto oleju kukurydzianego, a jako odniesienia powołano powietrze. Jak widać na Rysunek 6, widmo oleju kukurydzianego zawiera charakterystyczne piki przy około 930 nm, 1,210 nm i 1,410 nm. Wynikowe widmo oleju kukurydzianego ma SNR 10363,1 i zostało nałożone na spektrum oleju kukurydzianego Cao et al. spectrum¹, wykazując silną korelację.

Charakterystyka spektralna hemoglobiny natlenionej i odtlenionej
Podczas gdy charakterystyka absorpcji natlenionej i odtlenionej hemoglobiny jest jednym z najważniejszych osiągnięć optyki biomedycznej, ich widma absorpcyjne obejmujące VIS do SWIR pozostają słabo poznane. Jednym z najtrudniejszych aspektów określania widma absorpcji hemoglobiny natlenionej i odtlenionej w SWIR jest usunięcie wody z krwi, która przytłacza stosunkowo małą absorpcję hemoglobiny. Aby rozplątać absorbancję hemoglobiny i wody, hemoglobinę najpierw wyizolowano z ludzkiej krwi pełnej za pomocą wirowania, a supernatant usunięto i zastąpiono wodą deuterowaną. Woda deuterowana była również używana jako odniesienie i rozpuszczalnik, w którym odtworzono hemoglobinę, powodując hipotoniczny. Jak pokazano na Rysunek 3, woda deuterowana ma znacznie niższą absorpcję optyczną niż woda, co czyni ją idealnym rozpuszczalnikiem i punktem odniesienia do pomiarów absorpcji SWIR. Wynikowe widmo hemoglobiny utlenionej rozciąga się od VIS do SWIR z SNR 23118.7 i bardzo ściśle pasuje do opublikowanego przez Prahla widma hemoglobiny utlenionej ⁴ (Rysunek 7). W VIS widmo hemoglobiny utlenionej wykazuje wysoką absorpcję z charakterystycznymi pikami absorpcji przy około 415 nm i pikiem dubletowym od około 540 do 575 nm. W NIR widmo hemoglobiny utlenionej wykazuje charakterystyczny pik obejmujący szerszy zakres długości fal, około 800 nm do 1,100 nm. W SWIR wchłanianie hemoglobiny jest niskie. Jednak od około 1,400 nm do 1,600 nm, widmo hemoglobiny wykazuje wyższą absorpcję z pikami, prawdopodobnie z powodu wody w hemoglobinie, której nie można było całkowicie usunąć podczas procesu wirowania.

Dla hemoglobiny odtlenionej, ditionin sodu został dodany do roztworu hemoglobiny, aby wprowadzić dysocjację ditlenu z hemoglobiny utlenionej i przekształcić próbkę w hemoglobinę odtlenioną. Uzyskane widmo ma SNR 9813,9 i zostało porównane z widmem odtlenionej hemoglobiny Prahla i wykazuje bardzo silną korelację między 400 nm a 1,000 nm⁴ (Rysunek 8). Powstałe widmo hemoglobiny odtlenionej wykazuje charakterystyczne piki absorpcji przy około 430 nm, 560 nm i 760 nm. Następnie absorpcja odtlenionej hemoglobiny spada, ale zawiera mniejsze piki absorpcji około 1,200 nm i od 1,400 nm do 1,600 nm. Absorpcja między 1,400 a 1,600 nm jest prawdopodobnie spowodowana wodą, która nie została całkowicie usunięta z próbki hemoglobiny podczas procesu wirowania.

Porównanie absorberów biologicznych z VIS-SWIR
Pełne widma VIS-SWIR ze wszystkich absorberów biologicznych scharakteryzowanych w tym protokole są pokazane na Rysunek 9, skalowane na podstawie ich stężenia biologicznego w tissue², które podkreślają wyraźne różnice spektralne między absorberami biologicznymi. Na przykład melanina, hemoglobina natleniona i hemoglobina odtleniona mają silną, charakterystyczną absorpcję w VIS, która na ogół zmniejsza się wraz z długością fali, podczas gdy woda i lipidy wykazują charakterystyczne piki w NIR i SWIR. W tkance biologicznej połączenie spadków melaniny i hemoglobiny oraz spadków rozpraszania optycznego zapewnia zwiększoną głębokość penetracji optycznej w NIR i SWIR. Dodatkowo, zmniejszona absorpcja melaniny przez NIR i SWIR umożliwia optyczne badanie natlenionej i odtlenionej hemoglobiny, lipidów i wody przy minimalnych efektach spowodowanych pigmentacją skóry.

Rysunek 1: Poprzednio opublikowane widma popularnych absorberów biologicznych w promieniowaniu UV do SWIR. Widma hemoglobiny natlenionej i odtlenionej zostały wykreślone przy użyciu danych z Prahl⁴. Widmo melaniny zostało wykreślone przy użyciu danych z Sarna²¹ i Crippa²³. Widmo lipidów zostało wykreślone przy użyciu danych z van Veen²⁴. Widmo wody zostało wykreślone przy użyciu danych z Hale and Querry²⁰. Skrót: SWIR = krótkofalowa podczerwień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zdjęcie supernatantu i granulki czerwonych krwinek z odwirowanej krwi pełnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Porównanie widma absorbancji wody i wody deuterowanej zebranej z identycznymi ustawieniami akwizycji w logarytmicznej (po lewej) i liniowej (po prawej) skali absorbancji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Porównanie widma absorbancji wody uzyskanego przy użyciu metod opisanych tutaj w porównaniu z Hale and Querry²⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Porównanie widma absorpcji melaniny uzyskanego przy użyciu metod opisanych tutaj w porównaniu z Sarna et al.^21,22 i Crippa et al.²³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Porównanie spektrum absorbancji oleju kukurydzianego uzyskanego przy użyciu metod opisanych tutaj w porównaniu z Cao et al.¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Porównanie widma absorbancji hemoglobiny utlenionej uzyskanego przy użyciu metod opisanych tutaj w porównaniu z Prahl⁴. Cechy spektralne od 1400 do 1600 nm prawdopodobnie przypisuje się resztkom wody w próbce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Porównanie widma absorbancji hemoglobiny odtlenionej uzyskanego przy użyciu metod opisanych tutaj w porównaniu z Prahl⁴. Cechy spektralne od 1400 do 1600 nm prawdopodobnie przypisuje się resztkom wody w próbce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Widma VIS-SWIR popularnych absorberów biologicznych. Skrót: VIS-SWIR = widzialna fala krótkofalowa w podczerwieni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokoły opisane w tym artykule mogą być wykorzystane do uzyskania widm absorpcyjnych VIS-SWIR absorberów biologicznych i środków kontrastowych. W tym miejscu pokazujemy konkretne kroki, aby uzyskać widma wody, melaniny, oleju kukurydzianego, utlenionej hemoglobiny i odtlenionej hemoglobiny o długości od 400 nm do 1,600 nm. Poniższa dyskusja obejmuje kluczowe kroki, wskazówki dotyczące optymalizacji pomiarów, ograniczenia metody i zastosowania tego protokołu w biomedycynie.

Chociaż wszystkie kroki protokołu są ważne, należy wykonać kilka krytycznych kroków, aby uzyskać dokładne widma za pomocą tego protokołu. Po pierwsze, próbka musi być nierozproszona; Na przykład, uzyskując natlenioną i odtlenioną hemoglobinę z krwi, rozpraszacze w próbce muszą zostać odfiltrowane (tutaj zastosowano filtr strzykawkowy 0,22 μm). Podczas przygotowywania odtlenionej hemoglobiny ilość dodanego ditionianu sodu nie powinna przekraczać podanej masy, ponieważ spowoduje to zmętnienie próbki przy wyższych procentach wagowych i unieważni wymagania prawa Beera-Lamberta.

Po drugie, woda deuterowana musi być używana jako rozpuszczalnik próbki i odniesienie dla rozpuszczalnych w wodzie substancji rozpuszczonych, takich jak hemoglobina. W SWIR absorpcja wody jest silna i może maskować inne absorbery. Po trzecie, pomiary muszą być wykonywane w zakresie liniowym detektora, zdefiniowanym jako obszar, w którym zmiana fotonów docierających do detektora powoduje liniową zmianę sygnału detektora. Jeśli absorpcja jest minimalna, detektor może zarejestrować absorbancję równą zeru, nawet jeśli występuje absorbancja. Dzieje się tak, gdy próbka jest zbyt rozcieńczona, czas ekspozycji jest zbyt krótki i/lub długość drogi kuwety jest zbyt krótka, ale można temu zaradzić poprzez zwiększenie stężenia próbki, długości ścieżki kuwety i/lub czasu ekspozycji. Podobnie, jeśli występuje wysoka absorpcja, detektor może nie zarejestrować żadnych fotonów i uzyskać płaską linię zwaną "nasyceniem", która nie jest wrażliwa na zmiany absorbancji. Dzieje się tak, gdy próbka jest zbyt zagęszczona, czas ekspozycji jest zbyt krótki i/lub długość ścieżki jest zbyt długa, ale można ją ustalić poprzez zwiększenie stężenia próbki, wydłużenie czasu ekspozycji i/lub zmniejszenie długości ścieżki kuwety.

Po czwarte, stosowane detektory muszą być liniowe. W przypadku niepewności, czy detektor wykazuje liniową odpowiedź na liczbę fotonów docierających do detektora, można zmierzyć różne rozcieńczenia próbki przy tych samych ustawieniach akwizycji, aby sprawdzić, czy ich wartości absorbancji pokazują oczekiwany trend liniowy między absorbancją a stężeniem. Alternatywnie można zmierzyć pojedynczą próbkę i wydłużyć czas ekspozycji, aby sprawdzić, czy następuje liniowy wzrost intensywności detektora. Oba testy powinny dać zależność liniową, jeśli użytkownik działa w granicach liniowych (patrz trzeci punkt krytyczny powyżej).

Po piąte, aby pozostać w liniowym zakresie detektora dla całego zakresu spektralnego VIS-SHIR, stężenie próbki, czas ekspozycji detektora i/lub długość ścieżki kuwety będą musiały zostać zmienione dla różnych obszarów spektralnych o znacznie wyższej lub niższej absorbancji od początkowego obszaru spektralnego.

Po szóste, widma uzyskane przy użyciu różnych stężeń próbek lub długości ścieżek dla różnych obszarów spektralnych muszą być zszyte razem przez liniowe skalowanie jednego regionu w oparciu o znane zmiany stężenia lub długości ścieżki. Po przeskalowaniu widma powinny zostać zszyte ze sobą na nakładającej się długości fali między dwoma obszarami. Jeśli pomiar będzie obejmował pomiary z różnych detektorów, powinny istnieć nakładające się widma absorbancji, które zawierają pożądaną długość fali przejścia detektora (800 nm jest powszechnie używane podczas łączenia obszarów UV-VIS i SWIR). Każde widmo jest obcinane na długości fali przejścia detektora, a jedno widmo jest wybierane tak, aby zawierało oryginalną wartość absorbancji przejścia detektora. Następnie dwa obcięte widma są łączone, aby utworzyć jedno wydłużone widmo.

Dodatkowe wskazówki dotyczące uzyskiwania wysokiej jakości widm absorpcyjnych obejmują wykorzystanie wcześniej opublikowanego widma próbki będącej przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli nie obejmuje ono pełnego zakresu widma, który ma być mierzony, w celu pokierowania pomiarami. Znając a priori zakres długości fal o najniższej absorbancji, pomiary można rozpocząć w tym obszarze od próbki o najwyższym stężeniu, a następnie dostosować i rozcieńczyć stamtąd. Może to pomóc w ustaleniu, ile oddzielnych regionów będzie musiało zostać zmierzonych w oparciu o oczekiwaną wielkość zmian absorbancji. Może również dać pewność, że oczekiwane widmo zostało uzyskane, jeśli pasuje do opublikowanych widm lub jeśli nie pasuje do opublikowanych widm, metoda przygotowania próbki może zostać ponownie zbadana wraz z kwestiami, które mogą zniekształcać widmo.

Widma absorpcyjne mogą wymagać obróbki końcowej. Na przykład cyfrowy filtr średniej ruchomej może być używany do wygładzania pomiarów absorpcji, a punkty znanego błędu mogą być usuwane za pomocą naprawy zestawu danych, w której błędne punkty są usuwane, a interpolacja jest wykonywana między niebłędnymi punktami.

Do ograniczeń tej metody należy nieprecyzja w przypadku próbek z rozpraszaniem optycznym, takich jak krew pełna. Aby dokładnie zmierzyć hemoglobinę, próbka krwi jest poddawana lizie, a następnie filtrowana strzykawką w celu usunięcia większości innych resztkowych składników komórkowych, które powodują rozpraszanie optyczne. Podobnie metoda ta nie jest stosowana in vivo ze względu na rozpraszanie tkanek. Chociaż pomiary absorbancji oparte na prawie Beera-Lamberta mogą być żmudne, a czasem trudne do wykonania, jest to złoty standard dla pomiarów czystej absorpcji optycznej. Ponadto niektóre rozpuszczalniki sprawiają, że uzyskanie czystego spektrum absorpcji niektórych substancji rozpuszczonych jest szczególnie trudne. Na przykład naturalnym rozpuszczalnikiem natlenionej i odtlenionej hemoglobiny jest woda, ale absorpcja wody jest silna w SWIR, dominując nad absorpcją natlenionej hemoglobiny. Dlatego staramy się usunąć wodę z krwi poprzez wielokrotne wirowanie, usunięcie supernatantu i ponowne rozpuszczenie w wodzie deuterowanej, która ma słabszą absorpcję SWIR. Podejrzewa się, że powstałe widma hemoglobiny natlenionej i odtlenionej z pełnej heparynizowanej krwi ludzkiej zawierają niewielką absorpcję resztkową z powodu absorpcji wody od około 1,300 nm do 1,600 nm, jak pokazano na rysunku 3. Chociaż prawdopodobnie nie jest to idealne rozplątanie wody z natlenionej i odtlenionej hemoglobiny, obserwujemy ścisłe dopasowanie do często cytowanych opublikowanych widm natlenionej i odtlenionej hemoglobiny od 400 nm do 1000 nm i rozszerzamy widmo o kilkaset nanometrów ^2,3.

Opisane w niniejszym dokumencie protokoły pomogą naukowcom rozszerzyć biblioteki widm absorpcyjnych o widma VIS-SWIR wielu składników biologicznych i środków kontrastowych. Wiedza ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia podstaw biologii i fizjologii poprzez nieinwazyjne obrazowanie biomedyczne i wykrywanie na głębszych długościach fal niż większość obecnie działających systemów. Dodanie długości fal SWIR poszerza zakres składników tkanki, które mogą być monitorowane w sposób nieinwazyjny i może przyczynić się do opracowania nowatorskiego monitorowania i diagnostyki. Co więcej, urządzenia działające w NIR i SWIR powinny pomóc zminimalizować stronniczość pigmentacji skóry, która została zgłoszona w przypadku urządzeń optycznych działających w zakresach VIS i NIR i jest obiecującą strategią tworzenia sprawiedliwych wyrobów medycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &mikro; średnica m strzykawka Filtry	Sigma-Aldrich	SLGPM33RS
1000 µ L Pipeta	Millipore Sigma	EP3124000121
200 & mikro; L Pipeta	Millipore Sigma	EP3124000083
Rurki stożkowe	Avantor VWR	21008-089
Olej kukurydziany	Happy Belly	n/a	48 Fl Oz
Tlenek deuteru	Isotope Laboratories	DLM-4-100
Tlenek deuteru	Sigma-Aldrich	7789-20-0
Sulfotlenek dimetylu (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879-1L
Jednorazowa strzykawka 1 ml	BH Supplies	BH1LL
Jednorazowa igła	Atshuhut/Amazon	66941
Zamrażarka (-80 ° C)	Fisher Scientific	IUE386FARK
Zlewki szklane	Millipore Sigma	CLS1000PACK
Kuwety szklane lub kwarcowe	Sigma-Aldrich	Z802875-1EA	700 i mikro; L objętość
Kuwety szklane lub kwarcowe	Thorlabs	CV10Q35EP	objętości 3500 ml
Heparynizowana ludzka krew	Lampire	7203710
Probówki do mikrowirówek	Costar	3213
- accuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
MilliQ Water	Millipore Sigma	ZMQSP0D01
Żarówka halogenowa OSRAM FCS 64640 150 W 24 V HLX		B0001221DG
Parafilm	Millipore Sigma	HS234526B
końcówki do pipet	Eppendorf	22492055
sproszkowana syntetyczna melanina	Sigma-Aldrich	8049-97-6
Skala	Sartorius	UX-11976-09
Ditionit	soduSigma-Aldrich	1065070500
Sonicator	Fisher Scientific	CPX1800
Szpatułka	Aozita	000 00 0 1 2 3
Spektrofotometr UV/VIS/SWIR	Systemy przyrządów on-line	Olis Cary 14
Łodzie wagowe	Amazon