Artykuł metodologiczny

Aktywna immunizacja w celu indukowania miastenii opartej na autoimmunologicznej kinazie swoistej dla mięśni (MuSK) u myszy

DOI:

10.3791/67408

⸱

3 lipca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, 2Department of Immunology, Hellenic Pasteur Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla eksperymentalnego mysiego modelu miastenii autoimmunologicznej kinazy specyficznej dla mięśni (MuSK), mający na celu zbadanie patofizjologii i potencjalnych strategii terapeutycznych dla tej choroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miastenia (MG) jest chorobą autoimmunologiczną wpływającą na połączenie nerwowo-mięśniowe. Podczas gdy większość pacjentów z MG wytwarza autoprzeciwciała przeciwko receptorowi acetylocholiny (AChR), podgrupa pacjentów wykazuje autoprzeciwciała skierowane przeciwko kinazie swoistej mięśniowo (MuSK). MuSK MG charakteryzuje się silnym osłabieniem mięśni, opornymi na leczenie objawami klinicznymi i kryzysami miastenicznymi, często wymagającymi wentylacji mechanicznej. W związku z tym pacjenci często wymagają długotrwałego stosowania leków immunosupresyjnych, co wiąże się z długotrwałymi działaniami niepożądanymi. Biorąc pod uwagę nasilenie i rzadkość występowania MuSK-MG, opracowanie eksperymentalnego modelu zwierzęcego ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowych metod leczenia i głębszego zrozumienia leżących u podstaw mechanizmów patofizjologicznych. Eksperymentalna miastenia autoimmunologiczna (EAMG) służy jako model zwierzęcy dla MuSK-MG, skutecznie, ale częściowo naśladując kliniczne i immunologiczne cechy ludzkiego MG. Indukcja autoimmunologicznych modeli zwierzęcych może być osiągnięta poprzez aktywną lub bierną immunizację. W przedstawionym w niniejszym protokole doświadczalnym zastosowano aktywną immunizację poprzez podskórne podanie oczyszczonej domeny zewnątrzkomórkowej ludzkiego MuSK zemulgowanej w kompletnym adiuwancie Freunda z zabitymi termicznie prątkami gruźlicy. Szczepienie przeprowadzono w czterech miejscach, a następnie w 28. dniu wykonano iniekcję przypominającą MuSK. Ten adiuwant z M. tuberculosis umożliwia aktywację układu odpornościowego poprzez TLR4 i zwiększoną fagocytozę podawanego antygenu. Ten artykuł szczegółowo opisuje rozwój i charakterystykę MuSK-EAMG od początku do końca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miastenia (MG) jest chorobą autoimmunologiczną, która rozwija się poprzez mechanizmy zależne od limfocytów T, za pośrednictwem przeciwciał. Jest ona wywoływana głównie przez przeciwciała przeciwko nikotynowym receptorom acetylocholiny (AChR) na błonie postsynaptycznej połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) u 80%-85% pacjentów oraz przez przeciwciała przeciwko kinazie swoistej mięśniowo (MuSK) u około 5% pacjentów, a także inne białka NMJ. MG stał się prototypem zaburzeń autoimmunologicznych i modelem do zrozumienia funkcji postsynaptycznej 1. Zwierzęce modele zaburzeń autoimmunologicznych można podzielić na dwie główne kategorie: (1) modele spontaniczne, w których zwierzęta naturalnie rozwijają chorobę autoimmunologiczną, oraz (2) modele indukowane, w których choroba autoimmunologiczna jest sztucznie naśladowana i replikowana. Badania nad miastenią (MG) wykazały, że zarówno czynna, jak i bierna immunizacja może wywołać chorobę, znacząco przyczyniając się do zrozumienia stanów zależnych od przeciwciał2.

Pasywny transfer jest wysoce skuteczną metodą oceny ostrych skutków chorób wywołanych przez autoprzeciwciała i jest szeroko stosowany do badania przeciwciał pochodzących od pacjentów w MG. Takie podejście przyniosło korzyści w poszerzeniu wiedzy na temat czynników immunologicznych leżących u podstaw choroby. Na przykład badania nad transferem pasywnym wykazały patogenny wpływ anty-MuSK IgG4 na redukcję klastrów AChR3. Istnieją jednak pewne ograniczenia modelu transferu biernego, takie jak różnice funkcjonalne między ludzkimi i gryzoniowymi IgG a układem odpornościowym oraz niewystarczalność modelu transferu pasywnego do naśladowania początkowych mechanizmów aktywacji autoimmunizacji anty-MuSK występującej w tkankach limfatycznych.

Z drugiej strony, potencjalnym ograniczeniem badań nad szczepieniami jest zmienność immunogenetyczna między różnymi szczepami myszy4. Na przykład, podczas gdy myszy C57BL/6 (B6) są podatne na aktywne uodparnianie AChR, myszy AKR/J są odporne. Dlatego podczas tworzenia modelu zwierzęcego EAMG kluczowe znaczenie ma prawidłowy wybór gatunku zwierzęcia, metody immunizacji i zawartości protokołu, aby dokładnie odzwierciedlić chorobę5.

Dodatkowo, użycie docelowego antygenu jako całego białka często skutkuje wysokimi mianami przeciwciał. Jednak nie wszystkie przeciwciała mogą reagować krzyżowo z antygenem myszy lub wytwarzać epitopy chorobotwórcze. Dlatego modele aktywnej immunizacji nie zawsze dokładnie odzwierciedlają ludzką patologię. Niemniej jednak, gdy uda im się stworzyć odpowiedni fenotyp kliniczny i fizjologiczny, modele te stanowią długoterminową platformę do testowania eksperymentalnych terapii.

Badania kliniczne wskazują na rozbieżne mechanizmy chorobowe i wymagania terapeutyczne dla MuSK-MG, podkreślając potrzebę dalszej identyfikacji specyficznych cech patogennych tego podtypu MG4,5,6. Poprzednie badania MuSK EAMG oparte na aktywnej immunizacji wykazały dominujący udział odporności typu Th2 i anty-mysiej IgG1 w autoimmunizacji MuSK i zidentyfikowały szereg potencjalnych metod leczenia (np. teryflunomid, mezenchymalne komórki macierzyste, FCRLB shRNA) dla ludzkiego MuSK MG7,8,9. Pokazało to znaczenie modelu MuSK EAMG w testowaniu nowych celów terapeutycznych i badaniu patofizjologii MuSK MG.

W tym artykule szczegółowo opisano procedury indukowania modelu zwierzęcego, monitorowania postępu choroby i walidacji indukcji EAMG. Ocena kliniczna polegała na monitorowaniu przez obserwatora wagi, postawy, siły chwytu i wyników klinicznych. Myszy poddano eutanazji 28 dni po drugim szczepieniu, a następnie pobrano różne tkanki, w tym krew, mięśnie kończyn tylnych, śledzionę oraz pachowe i pachwinowe węzły chłonne, aby potwierdzić ustalenie się choroby. Przeciwciała anty-MuSK oznaczono ilościowo w surowicy przy użyciu metody ELISA. Dodatkowo przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne na tkankach mięśniowych w celu uwidocznienia złogów na złączu nerwowo-mięśniowym. Aby zademonstrować i porównać odpowiedzi kliniczne i immunologiczne w grupach myszy o różnej wrażliwości na MuSK EAMG, myszy leczone KCNS3 shRNA wykazywały działanie prozapalne (niepublikowane), a shRNA FCRLB wykazywało działanie przeciwzapalne9, jak określono w poprzednich badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyki Uniwersytetu w Stambule ds. Eksperymentów na Zwierzętach (HADYEK) z numerem decyzji 2020/29. W naszych poprzednich badaniach7,8,9, model EAMG został indukowany u 8-10-tygodniowych myszy BALB/c lub B6 poprzez aktywną immunizację białkiem MuSK. W artykule przedstawiono przykładowe dane uzyskane z różnych eksperymentów na myszach BALB/C immunizowanych MuSK (4-8 myszy w grupie). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Produkcja i przygotowanie ludzkiego MuSK do immunizacji

  1. Sklonuj ludzkie aminokwasy zewnątrzkomórkowe MuSK 24-495 (sekwencja referencyjna NCBI: NP_005583.1) do wektora pPIC9.
  2. Wydziela ekspresję w systemie drożdży Pichia pastoris (szczep GS115).
  3. Indukować ekspresję przez dodanie metanolu (2,5% v/v) do pożywki wzrostowej.
  4. Dodaj znacznik A C-terminal 6xHIS w celu oczyszczenia.
  5. Ekspresja białka jako wydzielanego białka glikozylowanego i oczyszczanie go w warunkach natywnych. Dializować pożywkę hodowlaną w 50 mM buforze fosforanowym o pH 8,0, 300 mM NaCl.
  6. Kontynuuj chromatografię powinowactwa do jonów niklu przy użyciu agarozy Ni2+/nitrylotrioctanu (Ni-NTA). Oczyszczone białko po dodaniu 10% glicerolu należy przechowywać w temperaturze -80 °C, gdzie jest stabilne przez co najmniej dwa lata10.
    UWAGA: Poziomy ekspresji, oszacowane po oczyszczeniu Ni-NTA, wynoszą około 0,4 mg/L kultury. W próbkach analizowanych przez SDS-PAGE nie wykryto żadnych innych zanieczyszczeń białkowych.
  7. Przed immunizacją należy sprawdzić czystość wyizolowanej domeny zewnątrzkomórkowej białka MuSK za pomocą elektroforezy żelowej (rysunek uzupełniający 1).
  8. Przygotować MuSK dla każdej myszy w stężeniu 45 μg/100 μL PBS.
  9. Homogenizować (emulgować) MuSK w stosunku 1:1 z PBS (100 μL) i Complete Freund's Adjuwant (CFA-100 μL) zawierającym Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 mL) (całkowita objętość emulsji wynosi 200 μL na mysz).

2. Znieczulenie i procedura szczepień

  1. Przed szczepieniem należy rozcieńczyć propofol w PBS (w stosunku 1:5).
  2. Podawać dootrzewnowo w dawce 50 mg/kg na mysz.
    UWAGA: Izofluran może być również stosowany do znieczulenia drogą wziewną (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Stężenie początkowe jest zwykle ustawiane na 3%-5% przy natężeniu przepływu tlenu 1-2 l/min, podczas gdy stężenie podtrzymujące wynosi zwykle 1%-3% przy natężeniu przepływu tlenu 0,5-1 l/min.
  3. Pierwsze uodparnienie: Wstrzyknąć łącznie 45 μg/200 μL przygotowanego MuSK w CFA podskórnie w łopatki i wewnętrzną stronę tylnych łap (około 11,25 μg/50 μl na każdą część).
  4. Drugie uodparnienie: Wstrzyknąć łącznie 45 μg/200 μL przygotowanego MuSK w CFA podskórnie w ramiona i biodra (około 11,25 μg/50 μl na każdą część).
    UWAGA: Wstrzyknięcia należy podawać dwukrotnie w odstępie 28 dni w celu ustalenia modelu. Podanie domięśniowe wiąże się z bólem mięśni, który może zakłócać ocenę klinicznego osłabienia. Ponieważ EAMG jest chorobą mięśni, zastosowanie wstrzyknięcia domięśniowego może wywołać związane z bólem osłabienie niemiastenne, a tym samym działać jako czynnik zakłócający. Zalecana jest grupa kontrolna zaszczepiona tylko CFA (bez MuSK).

3. Punktacja kliniczna

  1. Ćwicz myszy, delikatnie przeciągając je 40 razy po górnej siatce klatki, gdy próbują chwycić siatkę, aby wywołać zmęczenie, ponieważ objawy miastenii u myszy stają się bardziej wyraźne po wysiłku i zmęczeniu.
  2. Po ćwiczeniach uważnie obserwuj myszy pod kątem zmian w aktywności, wadze i sile mięśni. Na podstawie tych obserwacji przypisz odpowiednie punkty, aby kierować kryteriami oceny.
    UWAGA: Wynik 0: Myszy pozostają aktywne i kontynuują eksplorację swojego otoczenia; Wynik 1: Po wysiłku obserwuje się zgarbioną postawę, ale myszy wracają do normalnej aktywności i towarzyskości. Pielęgnacja sierści jest ogólnie utrzymywana. Wynik 2: Zgarbiona postawa jest widoczna jeszcze przed ćwiczeniami i staje się bardziej wyraźna po wysiłku. Obserwuje się spadek samopielęgnacji i aktywności. Wynik 3: Dramatycznie zgarbiona postawa jest obserwowana przed i po ćwiczeniach. Następuje znaczny spadek ruchu, towarzyskości i siły mięśni, któremu towarzyszy utrata wagi o 1-2 gramy co 2-3 dni. Dochodzi do odwodnienia, co utrudnia myszom dotarcie do wody i pożywienia. Odwodnienie rozpoznaje się po tym, że skóra nie wraca szybko po uszczypnięciu i zmianach w kale. Myszy w bólu charakteryzują się mrużeniem oczu i zgarbioną postawą. Myszy wykazujące oznaki silnego bólu i utraty masy ciała przekraczającej 20% są składane w ofierze. Punktacja 4: Mysz zostaje znaleziona martwa w klatce. Zmarła mysz powinna zostać natychmiast usunięta, a klatka powinna zostać zmieniona5.
  3. Sprawdzaj myszy codziennie, ponieważ objawy szybko postępowały około 10 dni po drugim szczepieniu. Wykonuj ocenę kliniczną i pomiary co tydzień przez pierwsze 28 dni, a następnie dwa razy w tygodniu.
  4. Wykonaj pomiar masy.
    UWAGA: Pomiar masy ciała stanowi kluczowy parametr do śledzenia postępu choroby. Ze względu na wysokie tempo metabolizmu myszy masa ciała może się znacznie różnić. Ważne jest, aby używać tej samej skali do wszystkich pomiarów i przeprowadzać te pomiary o tej samej porze dnia, aby zachować spójność.
  5. Wykonaj pomiar siły mięśni. Użyj poziomego dynamometru z drutem siatkowym, aby zmierzyć siłę mięśni.
    1. Ćwicz myszy w celu uzyskania oceny klinicznej, delikatnie przeciągając je po klatce 40 razy, aby wywołać zmęczenie.
    2. Natychmiast umieść każdą mysz na siatce dynamometru i delikatnie pociągnij za ogon, upewniając się, że wszystkie łapy mocno chwytają siatkę. Weź pod uwagę tylko pomiary, w których myszy chwytają siatkę wszystkimi czterema łapami.
      UWAGA: Staraj się przykładać równą siłę podczas każdego pomiaru i zaleca się, aby ten sam badacz przeprowadzał wszystkie pomiary, aby zachować niezawodność i zmniejszyć zmienność. Ponieważ męczliwość jest cechą charakterystyczną słabości MG, należy przeprowadzić serię testów siły chwytu bez pomiaru siły chwytu. Następnie wykonano siedem pomiarów dla każdej myszy, a wartości maksymalne i minimalne zostały odrzucone. Średnia z pozostałych pięciu pomiarów jest obliczana w celu zapewnienia wiarygodnych wyników.

4. Przygotowanie próbki tkanki

UWAGA: Poświęć myszy 28 dni po drugim szczepieniu, postępując zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami. Pobranie krwi, mięśni, śledziony i węzłów chłonnych od poświęconych myszy będzie korzystne dla dalszych badań.

  1. Pobieranie krwi sercowej
    UWAGA: Aby pobrać krew sercową, znieczulij myszy za pomocą odpowiedniego środka znieczulającego (np. propofolu) zatwierdzonego przez komisję etyczną. Nakłucie serca wymaga znieczulenia i jest zabiegiem terminalnym, co oznacza, że zwierzęta muszą zostać natychmiast poddane eutanazji.
    1. Po głębokim znieczuleniu szczura połóż go na grzbiecie, otwórz brzuch i zlokalizuj serce, około 1 cm powyżej najniższego żebra i nieco po prawej stronie.
    2. Za pomocą igły o sile 25-35 G ostrożnie pobierz krew z lewej komory pod kątem 45 stopni, nie poruszając strzykawką, aby uniknąć powikłań11.
    3. Przenieść próbki krwi do suchych probówek w celu oddzielenia surowicy i/lub do probówek EDTA w celu izolacji RNA - jeśli jest to planowane.
    4. Oddzielić surowicę przez odwirowanie i przechowywać próbki surowicy w temperaturze -20 °C do momentu jej użycia.
  2. Konserwacja i przygotowanie próbek mięśni
    1. Zbierz mięsień piszczelowy przedni11,12,13. Spłucz lodowatym PBS.
    2. Umieścić próbki w krioprobówkach, natychmiast zanurzyć w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem w temperaturze -20 °C i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Próbki powinny być zamrażane zatrzaskowo, aby uzyskać dokładniejsze wyniki eksperymentów.
    3. Umieść chusteczki pionowo na uchwycie do cięcia; można użyć korka. Osadź próbki do barwienia immunofluorescencyjnego w OCT (związek o optymalnej temperaturze cięcia).
    4. Pozwól tkance unosić się na izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu rozdzielenia na sekcje za pomocą kriostatu.

5. Ocena połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego

  1. Cięcie i utrwalanie kriostatu
    1. Za pomocą kriostatu należy podzielić zamrożone tkanki osadzone w OCT w temperaturze -24 °C na grubość 7 μm.
    2. Utrwalić sekcje w acetonie schłodzonym do temperatury -20 °C. Myć PBS przez 5 minut.
    3. Umyć ponownie PBS zawierający 0,4% Triton X (PBS-T) przez 10 min.
      UWAGA: Można przeprowadzić etap przepuszczalności, aby skorygować konformację cząsteczek dotkniętych utrwalaniem, zapewniając dokładniejsze wiązanie. Permeabilizacja polegała na leczeniu PBS zawierającym 1% FBS przez 10 minut i PBS-T przez kolejne 10 minut.
    4. Zablokuj sekcje z PBS-T zawierającym 10% FBS na 30 minut, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne
    UWAGA: Do barwienia można użyć następujących przeciwciał: C3, IgG, marker receptora acetylocholiny α-bungarotoksyna.
    1. Rozcieńczyć wybrane przeciwciała w PBS-T zawierającym 1% FBS.
    2. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny.
    3. Umyć skrawki PBS-T zawierającym 1% FBS.
    4. Przeciwbarwienie za pomocą DAPI.
    5. Skrawki przechowywać do czasu badania pod mikroskopem fluorescencyjnym w ciemnym i wilgotnym środowisku w temperaturze 4 °C.
    6. Wykonywanie obrazowania i analizy.
      UWAGA: Połączenia nerwowo-mięśniowe z dodatnim wynikiem bungarotoksyny (BTX) w każdej sekcji należy policzyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Rób zdjęcia w 20-krotnym powiększeniu. Do analizy połączenia nerwowo-mięśniowe BTX i C3 lub IgG-dodatnie policzono ręcznie pod mikroskopem. Do analizy należy wykorzystać odsetek złączy podwójnie dodatnich w stosunku do całkowitej liczby złączy oznaczonych BTX w sekcjach szeregowych.

6. Western blot

  1. Izolacja i oznaczanie ilościowe białek
    1. Użyj próbek mięśni, które są zamrożone.
    2. Przygotować bufor do lizy z inhibitorami proteazy i fosfatazy.
    3. Dodać kulki tlenku cyrkonu o średnicy 0,5 mm równej masie próbki i 2x objętość buforu do lizy.
    4. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora.
    5. Odwirować lizat przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający lizat białkowy.
    7. Użyj zestawu do oznaczania BCA lub odczynnika Bradforda, aby określić ilościowo stężenie białka.
    8. Przygotuj próbki białka do pożądanego stężenia z buforem do lizy. 25 μg białka na studzienkę jest skuteczne do wykazania AChR.
  2. Elektroforeza żelowa SDS-PAGE
    1. Wymieszać próbki białek z 4x buforem Laemmli.
    2. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji.
    3. Załaduj równe ilości białka i drabinkę białkową do studzienek żelu SDS-PAGE.
    4. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 30 minut (czas może się różnić w zależności od zasilacza).
  3. Przenoszenie białek
    1. W przypadku transferu półsuchego z membraną nitrocelulozową, każdy składnik należy zwilżyć buforem do transferu na zimno.
    2. Ustaw kanapkę transferową: gąbka, bibuła filtracyjna, żel, membrana, bibuła filtracyjna, gąbka.
      UWAGA: Upewnij się, że między warstwami nie ma pęcherzyków. Program transferu należy dobrać zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  4. Blokowanie i inkubacja przeciwciał
    1. Zablokuj membranę w 5% odtłuszczonym mleku w proszku lub BSA w TBST na 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
    2. Inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-AChR) rozcieńczonym w 2,5% buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.
    3. Umyj membranę 3 razy po 10 minut w TBST.
    4. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (IgG HRP) rozcieńczonym w 2,5% buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj membranę 3 razy po 10 minut w TBST.
  5. Wykrywanie i obrazowanie
    1. Podłoże ECL należy nanieść na membranę zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Uchwyć sygnał chemiluminescencyjny za pomocą systemu obrazowania.
    3. Analizuj pasma za pomocą oprogramowania do obrazowania.
      UWAGA: Zawsze trzymaj białka i odczynniki na lodzie, aby zapobiec degradacji. Zapewnij równomierne obciążenie, uruchamiając białko porządkowe (np. beta-aktynę, alfa-tubulinę lub GAPDH) jako kontrolę. Zoptymalizuj stężenia przeciwciał i czas inkubacji, aby uzyskać najlepsze wyniki. Wykazanie, że białko AChR ulega mniejszej ekspresji u myszy uodpornionych MuSK, ma kluczowe znaczenie.

7. Domowy test ELISA anty-MuSK IgG

  1. Przygotować antygen MuSK w stężeniu 0,5 μg na basenik w 100 μl węglanowego buforu wodorowęglanowego (powlekanie płytki).
  2. Dozować 100 μl roztworu antygenu do każdej studzienki na płytce do testu immunologicznego.
  3. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Umyć płytkę PBS zawierającym 0,5% Tween 20 (roztwór myjący).
  5. Inkubować płytkę z PBS zawierającym 5% FBS (roztwór blokujący) przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania (blokowanie).
  6. Ponieważ badania optymalizacyjne wykazały wysoki poziom MuSK-IgG, próbki surowicy należy rozcieńczyć w stosunku 1/50 000 w roztworze blokującym.
  7. Bez mycia po zablokowaniu dodać rozcieńczone próbki surowicy do studzienek.
  8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
  9. Umyj talerz trzykrotnie roztworem myjącym.
  10. Rozcieńczyć sprzężone z HRP przeciwciało anty-mysie IgG (ab97023) 1/5000 w roztworze blokującym.
  11. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki.
  12. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
  13. Umyj talerz trzykrotnie roztworem myjącym.
  14. Dodaj 100 μl substratu TMB do każdej studzienki i obserwuj zmianę koloru.
  15. Zatrzymać reakcję w odpowiednim czasie, stosując 2 M H2SO4.
  16. Zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 450 nm za pomocą spektrofotometru.
  17. Wykonaj wszystkie próbki w dwóch egzemplarzach i na tej samej płytce, aby uzyskać spójność.
    UWAGA: Do analizy należy stosować wartości gęstości optycznej, ponieważ nie były dostępne żadne standardowe rozcieńczenia próbki. Nie powinno być zmiany koloru w studzienkach kontroli ujemnej (ślepej). Spodziewana jest szybka zmiana koloru, dlatego roztwór zatrzymujący należy trzymać w pobliżu, aby natychmiast zatrzymać reakcję w studzienkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas oceny i walidacji modelu MuSK Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG), kilka kluczowych parametrów i wyników eksperymentalnych jest kluczowych dla wykazania udanej indukcji i charakterystyki modelu choroby. Poniżej znajdują się reprezentatywne wyniki, które potwierdzają powstanie modelu MuSK EAMG.

Punktacja kliniczna
Myszy są monitorowane i oceniane pod kątem objawów klinicznych miastenii przy użyciu ustandaryzowanego systemu punktacji klinicznej. Ocena ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi MuSK-EAMG naśladuje ludzki MuSK-MG zarówno w aspekcie klinicznym, jak i immunopatogennym pod względem osłabienia mięśni, utraty masy ciała z powodu osłabienia mięśni opuszkowych, krążących przeciwciał anty-MuSK i zmniejszonego AChR mięśni. Jeśli chodzi o kamienie milowe i przewidywany harmonogram dla tego modelu MuSK-EAMG, kliniczne objawy osłabienia mięśni powinny pojawić się w ciągu pierwszego tygodnia po drugim szczepieniu. U około 5% myszy mogą wystąpić objawy choroby po pierwszym szczepieniu. Po dwóch szczepien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych ujawnień do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie i wkład Instytutu Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Stambule oraz Instytutu Medycyny Eksperymentalnej Aziza Sancara w ukończenie tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
125I-α-bungarotoxinInvitrogenBTX T1175
2-metylobutanSigma-AldrichM32631
40 μ m Sitko komórkoweNEST258369
96-dołkowa płytka MaxisorpSigma-AldrichM9410
Adiuwant NiekompletnyBecton Dickinson & Co. 263910
Anty-AChR alfa1 AlomoneANC-001
Anty-mysi IgG HRPAbcamab97023
Bullet Blender StormNext AdvanceHomogenizator tkankowy
C3NovusNB200-540G
Bufor węglanowo-wodorowęglanowyMerckC3041
KriostatLeicaCM1860 
Dynamometr Imada DST-50NMuromachiMK380Si
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaDM4M
Szklana strzykawka z blokadą typu luer lockISOLAB094.92.005
IgGAbcamab96871
Fotometr mikropłytkowy, Multiskan FCThermo Scientific51119000
Zestaw chirurgiczny myszyKent Scientific CorparationINSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37RaBecton Dickinson & Co. 
agarem złożonymOCTAGR1180
, 1 mlBecton Dickinson & Co. 
Strzykawki, 2 mlB. Braun7389
Uniwersalny krępujący zwierzętaMerckZ756911-1EA
Zestaw do wykrywania blottingu WesternBright Sirius-WesternAdvanstaK-12043-D10ECL
231141 Strzykawki z Scientific 309625

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keesey, J. A. A history of treatments for myasthenia gravis. Semin Neurol. 24, 5-16 (2004).
  2. Giannoccaro, M. P., Wright, S. K., Vincent, A. In vivo mechanisms of antibody-mediated neurological disorders: Animal models and potential implications. Front Neurol. 10, 1394(2020).
  3. Verschuuren, J. J. G. M., Plomp, J. J. Passive transfer models of myasthenia gravis with muscle-specific kinase antibodies. Ann N Y Acad Sci. 1413 (1), 111-118 (2018).
  4. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  5. Kusner, L. L., et al. Guidelines for pre-clinical assessment of the acetylcholine receptor-specific passive transfer myasthenia gravis model-recommendations for methods and experimental designs. Exp Neurol. 270, 3-10 (2015).
  6. Koneczny, I., et al. IgG4 autoantibodies in organ-specific autoimmunopathies: Reviewing class switching, antibody-producing cells, and specific immunotherapies. Front Immunol. 13, 834342(2022).
  7. Ulusoy, C., et al. Dental follicle mesenchymal stem cell administration ameliorates muscle weakness in MuSK-immunized mice. J Neuroinflammation. 12, 231(2015).
  8. Yilmaz, V., et al. Effects of teriflunomide on B cell subsets in MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis and multiple sclerosis. Immunol Invest. 50 (6), 671-684 (2021).
  9. Koral, G., et al. Silencing of Fcrlb by shRNA ameliorates MuSK-induced EAMG in mice. J Neuroimmunol. 383, 578195(2023).
  10. Trakas, N., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. J. Development of a highly sensitive diagnostic assay for muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) autoantibodies in myasthenia gravis. J Neuroimmunol. 240-241, 79-86 (2011).
  11. JoVE, Science Education Database. Blood withdrawal I. JoVE Sci Educ. , (2023).
  12. Peretti, A. L., et al. Action of vanillin (Vanilla planifolia) on the morphology of tibialis anterior and soleus muscles after nerve injury. Einstein (Sao Paulo). 15 (2), 186-191 (2017).
  13. Van Der Meulen, J. H., Kuipers, H., Stassen, F. R., Keizer, H. A., Van Der Vusse, G. J. High energy phosphates and related compounds, glycogen levels and histology in the rat tibialis anterior muscle after forced lengthening and isometric exercise. Pflugers Arch. 420 (3-4), 354-358 (1992).
  14. Kucukerden, M., et al. MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis does not require IgG1 antibody to MuSK. J Neuroimmunol. 295-296, 84-92 (2016).
  15. Ulusoy, C., et al. Preferential production of IgG1, IL-4 and IL-10 in MuSK-immunized mice. Clin Immunol. 151 (2), 155-163 (2014).
  16. Mori, S., et al. Antibodies against muscle-specific kinase impair both presynaptic and postsynaptic functions in a murine model of myasthenia gravis. Am J Pathol. 180 (2), 798-810 (2012).
  17. Wu, B., Goluszko, E., Huda, R., Tuzun, E., Christadoss, P. Experimental autoimmune myasthenia gravis in the mouse. Curr Protoc Immunol. Chapter 15, Unit 15.23. , (2011).
  18. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135 (Pt 4), 1081-1101 (2012).
  19. Vergoossen, D. L. E., et al. Functional monovalency amplifies the pathogenicity of anti-MuSK IgG4 in myasthenia gravis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (13), e2020635118(2021).
  20. Oh, S., et al. Precision targeting of autoantigen-specific B cells in muscle-specific tyrosine kinase myasthenia gravis with chimeric autoantibody receptor T cells. Nat Biotechnol. 41 (9), 1229-1238 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model autoimmunologicznyeksperymentalna autoimmunologiczna miasteniaprzeciwcia a przeciwko MuSKz cze nerwowo mi nioweterapia immunosupresyjnamodel zwierz cype ny adiuwant Freunda
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły