Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca²⁺) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca²⁺ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca²⁺ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Streszczenie

Obrazowanie pojedynczej komórki Ca²⁺ jest niezbędne do badania kanałów Ca²⁺ aktywowanych przez różne bodźce, takie jak temperatura, napięcie, związki natywne i chemikalia itp. Opiera się przede wszystkim na technologii obrazowania mikroskopowego i powiązanym wskaźniku Ca²⁺ Fura-2/AM (AM to skrót od Acetoxymethyl ester). Wewnątrz komórek Fura-2 / AM jest hydrolizowany przez esterazy do Fura-2, który może odwracalnie wiązać się z wolnym cytoplazmatycznym Ca²⁺. Maksymalna długość fali wzbudzenia zmienia się z 380 nm na 340 nm (po nasyceniu Ca²⁺) po związaniu. Intensywność emitowanej fluorescencji jest ilościowo związana ze stężeniem związanego^Ca2+. Mierząc stosunek 340/380, można określić stężenie Ca²⁺ w cytoplazmie, eliminując błędy spowodowane zmianami wydajności ładowania sondy fluorescencyjnej między różnymi próbkami. Technologia ta pozwala na ilościowe i jednoczesne monitorowanie zmian Ca²⁺ w czasie rzeczywistym. Wyniki są przechowywane w folderze ". XLSX" do późniejszej analizy, który jest szybki i generuje intuicyjne krzywe zmian, znacznie poprawiając skuteczność wykrywania. Z różnych perspektyw eksperymentalnych w artykule tym wymieniono zastosowanie tej technologii do wykrywania sygnałów Ca²⁺ w komórkach z endogennymi lub nadekspresyjnymi białkami kanałowymi. W międzyczasie pokazano i porównano różne metody aktywacji komórek. Celem jest zapewnienie czytelnikom lepszego zrozumienia zastosowania i zastosowań obrazowania pojedynczych komórek Ca²⁺.

Wprowadzenie

Ca²⁺ odgrywa kluczową rolę w transdukcji sygnału komórkowego, regulując różne funkcje komórkowe, takie jak skurcze mięśni¹, przewodnictwo nerwowe², secretion^3, oraz ekspresja genów⁴, wpływając tym samym na wiele procesów fizjologicznych. Nieprawidłowe stężenia Ca²⁺ mogą prowadzić do chorób takich jak zaburzenia rytmu serca⁵, zaburzenia krzepnięcia⁶ i zaburzenia równowagi hormonalnej⁷. Dlatego badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych zmian stężenia Ca²⁺ ma ogromne znaczenie.

Różne kanały jonowe są zaangażowane w regulację stężenia Ca²⁺ w komórkach, w tym wysoce selektywne 2+ sup class="xref">8 i nieselektywne kanały kationowe rodziny TRP⁹. Te kanały jonowe mogą być aktywowane przez bodźce, takie jak temperatura¹⁰, związki i składniki aktywne występujące w tradycyjnej medycynie chińskiej¹¹, odgrywające kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych związanych z Ca²⁺.

Skuteczne monitorowanie wewnątrzkomórkowych zmian stężenia^Ca2+ jest niezbędne do badania kanałów jonowych związanych z Ca²⁺, szczególnie w dziedzinie tradycyjnej medycyny chińskiej, gdzie regulacja sygnalizacji wapniowej odgrywa kluczową rolę w wielu podejściach terapeutycznych. Obecnie podstawowe metody pomiaru wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ można podzielić na dwa typy: pomiary elektryczne i optyczne. Podejście do pomiaru elektrycznego wykorzystuje technikę patch-clamp do oceny zmian potencjału błony komórkowej spowodowanych 2+ sup class="xref">12.

Podczas pomiarów optycznych, sondy fluorescencyjne specyficznie wiążą się z Ca²⁺, co pozwala badaczom śledzić zmiany intensywności fluorescencji komórkowej. Typowe metody optyczne obejmują techniki oparte na białkach fluorescencyjnych i barwnikach fluorescencyjnych. W metodach opartych na białkach fluorescencyjnych naukowcy mogą nadekspresję wrażliwych na Ca²⁺ białek fluorescencyjnych, takich jak Cameleon¹³ i GCaMP¹⁴ w komórkach i monitorować zmiany sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej, aby obserwować zmiany w cytoplazmatycznych stężeniach Ca^{2 +}. Ponadto naukowcy mogą nadekspresjonować te białka u myszy i wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną dwufotonową do monitorowania wewnątrzkomórkowych stężeń Ca^{2 +} w czasie rzeczywistym in vivo lub na poziomie tkankowym, zapewniając wysoką rozdzielczość i głęboką penetrację tkanek¹⁰.

Dla metod opartych na barwnikach fluorescencyjnych, powszechnie używane sondy Ca²⁺ to Fluo-3/AM, Fluo-4/AM i Fura-2/AM¹⁰. Naukowcy inkubują komórki w roztworze zawierającym te sondy fluorescencyjne, które przechodzą przez błonę komórkową i są rozszczepiane przez wewnątrzkomórkowe esterazy w celu wytworzenia związków aktywnych (np. Fluo-3, Fluo-4 i Fura-2), które pozostają w komórce. Sondy te wykazują minimalną fluorescencję w postaci wolnego liganda, ale emitują silną fluorescencję po związaniu z wewnątrzkomórkowym Ca^{2 +}, wskazując w ten sposób na zmiany w cytoplazmatycznych stężeniach Ca^{2 +}. W porównaniu z innymi białkami fluorescencyjnymi i barwnikami, Fura-2 jest zwykle wzbudzana przy długościach fal 340 nm i 380 nm. Po związaniu z wewnątrzkomórkowym wolnym Ca²⁺, Fura-2 ulega przesunięciu absorpcyjnemu, przesuwając szczyt długości fali wzbudzenia z 380 nm do 340 nm, podczas gdy pik emisji w pobliżu 510 nm pozostaje niezmieniony. Istnieje ilościowa zależność między intensywnością fluorescencji a stężeniem związanego^Ca2+, co pozwala na obliczenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ poprzez pomiar współczynnika intensywności fluorescencji na tych dwóch długościach fal wzbudzenia. Pomiary proporcji redukują skutki fotowybielania, wycieku z sondy fluorescencyjnej, nierównomiernego obciążenia i różnic w grubości komórek, dając bardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki (Rysunek 1).

Systemy obrazowania pojedynczych komórek Ca²⁺ wykorzystują głównie techniki mikroskopowe i wskaźnik Ca²⁺ Fura-2/AM do wykrywania wewnątrzkomórkowych stężeń Ca²⁺. Systemy te składają się z mikroskopu fluorescencyjnego, źródła światła do obrazowania Ca²⁺ oraz oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego, umożliwiającego ilościowe monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian Ca²⁺ w cytoplazmie wielu komórek jednocześnie (do 50 komórek na pole widzenia). Wyniki są zapisywane w formacie ".xlsx" w celu późniejszej analizy. System oferuje szybką szybkość analizy (około 1 minuty w przypadku analizy grupy komórek w jednym polu widzenia) i generuje intuicyjne krzywe zmian, co znacznie zwiększa skuteczność wykrywania. Obrazowanie Ca^{2 +} pojedynczych komórek jest niezbędnym podejściem technicznym do badania kanałów związanych z Ca^{2 +} i ma znaczną wartość w badaniach biomedycznych związanych z kanałami jonowymi. Oczekuje się, że jego zastosowanie w technologii obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach znacznie przyczyni się do postępu w badaniach nad mechanizmami leżącymi u podstaw tradycyjnej medycyny chińskiej.

Protokół

Metody eksperymentalne zostały zatwierdzone i przestrzegały wytycznych IACUC Uniwersytetu Tsinghua i Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej. Protokół ten wprowadza metody obrazowania pojedynczych komórek Ca^{2 +} dla różnych typów komórek, w tym pierwotnych keratynocytów wyizolowanych ze skóry kilku nowonarodzonych myszy (w ciągu trzech dni od urodzenia, z losowo dobranymi płciowo rodzeństwem z miotu, myszy C57BL / 6). Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie komórek

UWAGA: Komórki pierwotne, linie komórkowe z endogennymi genami docelowymi lub te transfekowane nadekspresyjnymi plazmidami są odpowiednie do obrazowania pojedynczej komórki Ca²⁺. Plazmidy użyte w tym badaniu zostały uzyskane z laboratorium profesora Xiao Bailonga na Uniwersytecie Tsinghua. Plazmidy te zostały skonstruowane przez włączenie sekwencji białka fluorescencyjnego GFP z ludzkim STIM1, białka fluorescencyjnego DsRed z ludzkim Orai1, białka fluorescencyjnego mRuby z króliczym TRPV1, a także białka czerwonej fluorescencji mCherry do wektorów plazmidu fagowego¹⁰.

1. Przygotować sterylne szkiełka podstawowe o średnicy 8 mm na płytce 24-dołkowej. Dodaj 500 μl buforu poli-D-lizyny (PDL) (50 μg/ml w DPBS) do każdego dołka.
2. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić powlekanie, a następnie wyrzucić roztwór powlekający za pomocą pipety.
3. Umyj szkiełka raz za pomocą DPBS i odłóż je na bok do późniejszego wykorzystania.
4. Hoduj pierwotne komórki i linie komórkowe oddzielnie, zgodnie z ich specyficznymi metodami hodowli¹⁰.
5. Komórki nasienne na przygotowaną 24-dołkową płytkę o gęstości około 1,5 x 10⁵ komórek na dołek. Użyj komórek do obrazowania Ca²⁺ po przyklejeniu się do szkiełka nakrywkowego.
6. W przypadku plazmidów z nadekspresją komórek, transfect^10,15 docelowego plazmidu (1 μg/dołek) za pomocą odczynnika do transfekcji Lipofectamine 2000 (lub Lipofectamine 3000) w stosunku 1:1 i inkubować w inkubatorze hodowli komórkowych przez około 24 godziny
   nuta: W przypadku większych białek może być konieczny dłuższy czas inkubacji.

2. Przygotowanie roztworu roboczego Fura-2/AM

1. Dodać 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki zawierającej 50 μg proszku Fura-2/AM i dobrze wymieszać, aby przygotować 1 μg/μl roztwór podstawowy Fura-2/AM.
2. Wymieszaj roztwór podstawowy Fura-2/AM i Pluronic F-127 z buforem Hanka zawierającym 1,3 mM Ca^{2 +}
   nuta: Końcowe stężenie Fura-2/AM i Pluronic F-127 w roztworze roboczym wynosi 2,5 μg/ml. Bufor Hanka przygotowuje się przez dodanie 10 mM HEPES do 1x bufora HBSS.
3. Użyj folii aluminiowej, aby chronić roztwór roboczy Fura-2/AM przed światłem.

3. Wstępne leczenie komórek do obrazowania pojedynczych komórek Ca²⁺

1. Przenieść szkiełka podstawowe z komórkami na nową 24-dołkową płytkę zawierającą bufor Hanka do mycia.
2. Odrzucić bufor za pomocą pipety i dodać 500 μl buforu roboczego Fura-2/AM do każdej studzienki.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić załadowanie sondy.
4. Usuń bufor roboczy Fura-2/AM i umyj komórki trzykrotnie buforem Hanka, aby wyeliminować nadmiar Fura-2/AM. Ogniwa są teraz gotowe do użycia.

4. Uruchamianie systemu obrazowania Ca²⁺

UWAGA: W tym badaniu, mikroskop fluorescencyjny jest używany do obrazowania Ca²⁺.

1. Uruchom kolejno następujące komponenty: światło DG4 (lampa ksenonowa), kamera, źródło światła białego, kontroler stolika mikroskopu, mikroskop, komputer i oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego.
   nuta: Jeśli wykryjesz aktywację kanałów jonowych przez temperaturę, włącz również następujące elementy: system perfuzyjny, system grzewczy, regulator temperatury i urządzenie do ogrzewania/chłodzenia cyrkulacji cieczy.

5. Procedura odpowiedzi komórkowej Ca²⁺

1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów).
   1. Wybierz pozycję Protokół, a następnie wybierz pozycję Plik, a następnie pozycję Załaduj protokół. Wybierz protokół i kliknij OK.
   2. Skonfiguruj eksperyment (na liście menu).
   3. Wybierz pozycję Nowy eksperyment.
2. Zamontuj komorę perfuzyjną w mikroskopie.
   nuta: Zawsze całkowicie opuszczaj obiektyw podczas montażu lub wyjmowania komór za pomocą pokrętła szorstkiego ustawiania ostrości, aby zapobiec uszkodzeniu obiektywu.
3. Usuń szkiełka komórkowe poddane działaniu Fura-2/AM i umieść je w komorze zawierającej bufor Hanka.
4. Uruchom system perfuzyjny.
5. Wybierz obiektyw DIC 20x i wyreguluj ostrość w białym świetle.
6. Kliknij Cfg Exp na pasku zadań.
   1. Wybierz żądane fluory do obrazowania.
   2. Określ częstotliwość akwizycji i ustawienia wyświetlania na ekranie (Pobieranie: sprawdź 340, 380, GFP; Interwał pozyskiwania: 1 s; Interwał zapisu: 1 s).
7. ognisko
   1. W panelu sterowania eksperymentu kliknij przycisk Skup się.
   2. Dostosuj czas akwizycji (zwykle 100 ms) i wzmocnienie w razie potrzeby, a następnie "zapisz na tę falę"
      nuta: W przypadku światła UV użyj wzmocnienia zamiast czasu ekspozycji.
   3. Wybierz żądaną długość fali do ustawiania ostrości (np. 380) i kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości.
   4. Przełącz widok z lornetki na komputer.
   5. Upewnij się, że przez lornetkę widoczny jest słaby zielonkawy kolor.
   6. Skoncentruj się na komórkach, używając najpierw przybliżonej ostrości, aby zbliżyć obiektyw, a następnie precyzyjnej ostrości.
      nuta: Mikroskop wyda sygnał dźwiękowy, jeśli zbliży się zbyt blisko sceny. Jeśli tak się stanie, opuść obiektyw, wyrównaj płytkę na stole montażowym i ponownie ustaw ostrość. Zminimalizuj czas spędzony na ustawianiu ostrości, aby zmniejszyć uszkodzenia komórek wywołane laserem.
   7. Sprawdź intensywność fluorescencji komórek podczas procesu ustawiania ostrości.
   8. Dostosuj intensywność fluorescencji komórek, modyfikując czas ekspozycji i wzmocnienie.
      nuta: Czas ekspozycji i wzmocnienie dla 340 i 380 muszą być spójne.
   9. Po uzyskaniu dobrej ostrości naciśnij przycisk na mikroskopie, aby przełączyć view na komputer.
   10. W razie potrzeby ponownie ustaw ostrość, aby uzyskać najostrzejszy obraz na komputerze, a następnie kliknij Zatrzymaj ustawianie ostrości.
8. Alternatywna procedura znajdowania komórek GFP dodatnich
   1. Najpierw użyj procedury 340/380, aby uzyskać dobre skupienie na komórkach.
   2. Wybierz FITC, a następnie kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości.
   3. Użyj kontrolera stopnia, aby znaleźć komórki GFP-dodatnie.
   4. Przełącz widok na komputer, a następnie kliknij Zatrzymaj ustawianie ostrości.
9. Wybór regionu
   1. Kliknij przycisk Region na pasku menu.
   2. Wybierz odpowiedni typ oświetlenia (340/380/FITC/TRITC). Filtry FITC i TRITC są wybierane odpowiednio dla GFP i mCherry/DsRed/mRuby, dla komórek z nadekspresją docelowych plazmidów; w przeciwnym razie wybierz Fura-2.
      nuta: Unikaj wybierania komórek, które są w złym stanie lub są martwe, takich jak te, które są wyraźnie zaokrąglone lub mają prześwietlone białka fluorescencyjne.
   3. Kliknij Pobierz obrazy, a następnie OK.
   4. Pojawi się nowe okno; zaznacz komórki, klikając narzędzie owalu, a następnie klikając komórkę.
   5. Wybierz żądane komórki pod wpływem fluorescencji przenoszonej przez białko docelowe (FITC lub TRITC). Wybierz komórki kontrolne, które nie wykazują ekspresji białka docelowego w warunkach 380 nm.
   6. Cofnij region, klikając prawym przyciskiem myszy okrąg, a następnie wybierając polecenie Usuń region.
   7. Wybierz próbkę tła jako ostatni region i zapisz jego numer identyfikacyjny.
   8. Kliknij Zapisz, a następnie Gotowe.
10. Odejmowanie tła
    1. Kliknij przycisk menu Referencje.
    2. Wskaż numer regionu tła.
       nuta: Jeśli tło było ostatnim wybranym regionem, wprowadzenie bardzo dużej liczby spowoduje automatyczne przełączenie na ostatnio wybrany region.
    3. Zaznacz pole Odejmij odwołania, a następnie kliknij OK.
11. Dane dziennika
    1. Kliknij przycisk Log Data (Dane dziennika) na panelu sterowania eksperymentu.
       nuta: Obrazy są zapisywane tylko wtedy, gdy istnieje chęć odtworzenia eksperymentu później; Zwykle wystarczy zaznaczyć pole danych.
    2. Upewnij się, że pojawi się monit z prośbą o preferowany typ pliku danych; wybierając . Zalecany jest format XLSX.
    3. Otworzy się arkusz typu ".xlsx". Zminimalizowanie arkusza roboczego zapobiegnie zajmowaniu przez niego miejsca na ekranie.
12. Akwizycja danych
    1. W sekcji Upływ czasu w panelu sterowania ustaw interwał zbierania danych na 1 s.
       nuta: Można to dostosować do rzeczywistych potrzeb.
    2. Kliknij Zegar Zerowy i Zdobądź na panelu sterowania eksperymentu, aby rozpocząć eksperyment. Linie bazowe będą widoczne na wykresie wskazującym każdy z wybranych regionów komórki.
    3. Wykonaj serię zabiegów na komórkach zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
    4. Aby zaobserwować reakcję temperaturową komórek, należy podgrzać bufor w układzie perfuzyjnym do odpowiedniej temperatury za pomocą regulatora temperatury.
    5. Aby zaobserwować wpływ leków na komórki, należy wykonać perfuzję lub ręcznie dodać bufor zawierający lek i zarejestrować zmiany w komórkach.
    6. Po zakończeniu zbierania danych kliknij Pause.
       nuta: Akwizycję danych można wstrzymać, a zegar można zresetować w dowolnym momencie eksperymentu.
    7. Zapisywanie i analizowanie danych.
13. Kliknij pozycję Plik i zamknij eksperyment, aby zakończyć eksperyment, a następnie wybierz opcję Nie w oknie dialogowym, aby zapisać protokół.
14. Otwórz nowy eksperyment, klikając Nowy w menu i powtórz proces.
15. Zamknięcie systemu
    1. Zamknij oprogramowanie i przenieś dane z komputera.
    2. Odwróć procedurę uruchamiania.
    3. Rejestruj godziny na arkuszu rejestracyjnym i posprzątaj bałagan.
16. analiza danych
    1. Przedstawić wewnątrzkomórkowe stężenie Ca²⁺ za pomocą stosunku Fura-2 340/380 lub przeliczyć na odpowiednie stężenie Ca²⁺.

Wyniki

Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej
Pierwotne keratynocyty
Pierwotne keratynocyty wyizolowano z nowonarodzonych myszy i przygotowano zgodnie z uznanymi protokołami¹⁰. Komórki te wysiano na płytki 24-dołkowe zawierające szkiełka przedmiotowe. Po załadowaniu sondy Fura-2 dostrójono ostrość pod mikroskopem przy długości fali 380 nm, aby uzyskać wyraźną wizualizację morfologii komórek, jak pokazano na Rysunku 2A. Jeśli sonda nie zostałaby pomyślnie załadowana podczas tego procesu, komórki nie byłyby widoczne. Bufor zewnątrzkomórkowy w komorze był stale wymieniany za pomocą systemu perfuzji, co zapewniało optymalne warunki dla komórek. System kontroli temperatury był połączony z systemem perfuzji, co umożliwiało wykrywanie termicznych odpowiedzi komórkowych poprzez kontrolowanie zmian temperatury w buforze zewnątrzkomórkowym. Proces ten polegał na stopniowym ogrzewaniu, a następnie stopniowym chłodzeniu buforu zewnątrzkomórkowego.

System obrazowania pojedynczych komórek pod kątem stężenia Ca²⁺ został wykorzystany do monitorowania zmian wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ w różnych warunkach eksperymentalnych. Jak pokazano na Rysunku 2B, keratynocyty wykazały wyraźną odpowiedź termiczną podczas ogrzewania, a także zauważalną odpowiedź w fazie chłodzenia. Co istotne, odpowiedź na temperaturę ta zanikła po usunięciu genu STIM1, który jest głównym odpowiedzialnym za tę reakcję (Rysunek 2C)¹⁰. Obrazowanie Ca²⁺ w pojedynczych komórkach pozwala na obserwację zmian wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na różne bodźce zewnętrzne, co umożliwia szczegółową analizę zachowania komórek i sygnalizacji.

Komórki HEK293T nadekspresujące plazmidy docelowe
Komórki HEK293T wysiano do płytki 24-dołkowej zawierającej szkiełka przedmiotowe zgodnie z metodą eksperymentalną. Następnie dokonano nadekspresji STIM1/Orai1 w komórkach, a ich pośrednią odpowiedź termiczną wykryto tą samą metodą, która została opisana powyżej dla komórek pierwotnych. W przypadku komórek nadekspresujących plazmid docelowy pomyślną transfekcję potwierdzono poprzez selekcję komórek wykazujących ekspresję odpowiedniego plazmidu, co objawiało się obecnością czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych przenoszonych przez plazmid pod długościami fal TRITC lub FITC. W tym eksperymencie wykorzystano plazmidy STIM1-GFP/Orai1-DsRed, gdzie GFP wykrywano przy FITC (emisja zielonej fluorescencji), a DsRed przy TRITC (emisja czerwonej fluorescencji). Jako kontrole negatywne zastosowano komórki nadekspresujące pusty mCherry (TRITC). Jak pokazano na Rysunku 3A, fluorescencyjne komórki obserwowane przy FITC wskazywały na pomyślną ekspresję STIM1, co umożliwiło ich selekcję i rejestrację odpowiedzi termicznej podczas procesów ogrzewania i chłodzenia. Komórki nietransfekowane służyły jako kontrola negatywna. Rysunek 3B wykazuje, że STIM1/Orai1 wykazywały znaczną odpowiedź termiczną podczas procesu chłodzenia, co kontrastuje z kontrolą negatywną przedstawioną na Rysunku 3C.

Wykrywanie odpowiedzi na leki
Technologia obrazowania Ca²⁺ w pojedynczych komórkach może być również wykorzystywana do wykrywania odpowiedzi komórkowych na związki chemiczne. Przygotowanie komórek do wykrywania odpowiedzi termicznej jest takie samo, jak opisano powyżej. Różnica między odpowiedzią na lek a odpowiedzią termiczną polega na tym, że odpowiedź termiczna zazwyczaj wymaga aktywacji komórek poprzez zmianę temperatury buforu zewnątrzkomórkowego za pomocą systemu perfuzji, natomiast związki mogą być podawane albo poprzez perfuzję, albo poprzez bezpośrednie dodanie ich za pomocą pipety. Bezpośrednie dodawanie pipetą pozwala skutecznie zredukować ilość zużytego związku; jednakże uzyskana w ten sposób krzywa może nie być zawsze tak estetyczna wizualnie jak ta otrzymana za pomocą perfuzji.

Przyjmując Rysunek 4 jako przykład, Rysunek 4A przedstawia odpowiedź w mechanizmie wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia zależnego od zapasów (SOCE) dla STIM1/Orai1, gdzie stężenie zewnątrzkomórkowego Ca²⁺ oraz zawartość kwasu cyklopiazonowego (CPA) są kolejno zmieniane za pomocą systemu perfuzyjnego w celu wywołania SOCE. Na Rysunku 4B agonista TRPV1, kapsaicyna, jest dodawana bezpośrednio za pomocą pipety do komórek nadekspresujących plazmid TRPV1. Kapsaicyna może aktywować TRPV1 i indukować napływ zewnątrzkomórkowego Ca²⁺.

Rysunek 1: Schemat Fura-2 AM. Fura-2 jest powszechnie stosowaną w biologii komórki sondą fluorescencyjną do wykrywania Ca²⁺, która selektywnie wiąże Ca²⁺ w stosunku 1:1 i emituje fluorescencję. Ze względu na wysoką polarność jako związku kwasowego, Fura-2 nie może przenikać do wnętrza komórek. Aby zwiększyć przepuszczalność komórkową, grupa ujemna związku jest koniugowana z grupą acetoksymetylową (AM), tworząc Fura-2/AM. Modyfikacja ta zwiększa jego rozpuszczalność w estrach i eliminuje ładunek ujemny. Wewnątrz komórek Fura-2/AM jest hydrolizowana przez esterazy do Fura-2, która może odwracalnie wiązać wolny cytoplazmatyczny Ca²⁺. Po związaniu maksymalna długość fali wzbudzenia przesuwa się z 380 nm na 340 nm (po nasyceniu Ca²⁺). Intensywność emitowanej fluorescencji jest ilościowo powiązana z koncentracją związanego Ca²⁺. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej pierwotnych keratynocytów. (A) Barwienie Fura-2 keratynocytów z noworodków myszy, obserwowane przy użyciu obiektywu 20x. (B,C) Odpowiedź temperaturowa keratynocytów WT (B) oraz keratynocytów z knockoutem STIM1 (C) z wykorzystaniem systemu obrazowania Ca²⁺ pojedynczych komórek. Powiększenie: 20x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej dla nadekspresji STIM1-GFP/Orai1-Dsred w komórkach HEK293T. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący komórki wykazujące ekspresję STIM1-GFP w kanale FITC. (B,C) Odpowiedź temperaturowa komórek HEK293T wykazujących ekspresję odpowiedniego plazmidu, wykryta za pomocą systemu obrazowania Ca²⁺ w pojedynczych komórkach. Powiększenie: 20x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Wykrywanie odpowiedzi na lek z wykorzystaniem obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach²⁺ obrazowanie. (A) odpowiedź SOCE komórek HEK293T z nadekspresją STIM1/Orai1. Bufor zewnątrzkomórkowy zostaje zmieniony z Ca²⁺zawierający Ca²⁺– bez użycia systemu perfuzyjnego. W przypadku braku Ca²⁺, dodaje się CPA w celu usunięcia jonów Ca²⁺ z retikulum endoplazmatycznego. Następnie bufor zewnątrzkomórkowy zastępuje się buforem zawierającym Ca²⁺bufor zawierający [składnik], aby wywołać pozakomórkowe Ca²⁺ napływ, reprezentujący zależny od magazynów napływ Ca²⁺ wpis. Pojedyncza komórka Ca²⁺ obrazowanie jest wykorzystywane do dynamicznego rejestrowania zmian w stężeniu wapnia cytozolowego (Ca2+)²⁺ stężenie indukowane przez te procesy. (B) komórki HEK293T nadekspresujące TRPV1-mRuby, gdzie mRuby jest białkiem fluorescencyjnym służącym do weryfikacji stanu transfekcji białka TRPV1. Kapsaicynę dodaje się za pomocą pipety, podczas gdy Ca²⁺ pomiar napływu wykonuje się za pomocą detekcji Ca w pojedynczych komórkach²⁺ obrazowanie Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Zastosowanie jednokomórkowych systemów obrazowania Ca^{2 +} jest szerokie, umożliwiając badanie sygnałów Ca^{2 +} w różnych typach komórek, w tym keratynocytach, komórkach macierzystych¹⁶, komórkach wątroby, komórkach serca¹⁷, podocytach¹⁸, komórkach odpornościowych i liniach komórkowych z nadekspresją białek docelowych^10,19. Technika ta mierzy zmiany i wartości bezwzględne stężeń komórkowych Ca²⁺ i odgrywa kluczową rolę w badaniu kanałów jonowych związanych z Ca²⁺, co czyni ją jednym z podstawowych instrumentów w laboratoriach badawczych kanałów jonowych.

Wraz z postępem badań znaczenie kanałów jonowych związanych z sygnałem Ca²⁺ zyskuje coraz większe uznanie wśród badaczy tradycyjnej medycyny chińskiej. Ich celem jest rozszyfrowanie podstawowych zagadnień tradycyjnej medycyny chińskiej przez pryzmat kanałów jonowych. Na przykład, gorące i zimne właściwości medycyny chińskiej wpływają na zasadę "traktowania ciepła zimnem i traktowania zimna ciepłem". Wiele wrażliwych na temperaturę kanałów jonowych, które pośredniczą w sygnałach Ca²⁺ , jest ściśle związanych z tą zasadą. Ponadto wiele chińskich leków wywiera efekty terapeutyczne poprzez działanie przeciwzapalne, przy czym wiele kanałów jonowych związanych z Ca^{2 +} odgrywa znaczącą rolę w regulacji stanu zapalnego²⁰.

Niezbędne jest zbadanie wpływu ważnych składników tradycyjnej medycyny chińskiej na charakterystykę kanałów jonowych, aby ujawnić właściwości farmakologiczne tych leków na poziomie molekularnym. Obecnie badacze tradycyjnej medycyny chińskiej skupiają się przede wszystkim na wykrywaniu ekspresji odpowiednich kanałów jonowych. Jednak monitorowanie w czasie rzeczywistym dotyczące wpływu tradycyjnej medycyny chińskiej na kanały jonowe związane z Ca²⁺ jest nadal stosunkowo ograniczone, a wiele podstawowych mechanizmów pozostaje niejasnych.

Ta grupa badawcza poświęciła się badaniom kanałów jonowych związanych z Ca^{2 +}, takich jak STIM1 / Orai1, STIM1 / Orai3, TRPA1¹⁰ i TRPV1 i jest dobrze zorientowana w zastosowaniu i szczegółowym wykorzystaniu jednokomórkowych systemów obrazowania Ca^{2 +} . Badanie to demonstruje specyficzne zastosowanie obrazowania Ca^{2 +} pojedynczych komórek do różnych celów badawczych, mając na celu zapewnienie czytelnikom kompleksowego zrozumienia jego rozległych zastosowań i szczegółowego wykorzystania. W porównaniu z wcześniej opublikowanymi powiązanymi badaniami²¹, badania te oferują nową perspektywę i metodologię stosowania obrazowania Ca²⁺ pojedynczych komórek pod różnymi kątami i w połączeniu z innymi systemami. Na przykład pierwotne komórki lub linie komórkowe z endogenną ekspresją genów docelowych mogą być bezpośrednio ładowane za pomocą sondy Fura-2 w celu monitorowania zmian w wewnątrzkomórkowych sygnałach Ca^{2 +} w czasie rzeczywistym pod różnymi czynnikami stymulującymi przy użyciu systemu obrazowania Ca^{2 +} pojedynczej komórki. Dodatkowo można przeprowadzić nadekspresję plazmidów zawierających białka fluorescencyjne w liniach komórkowych. Początkowo komórki są ładowane sondą Fura-2, jak opisano wcześniej. Następnie komórki z udaną ekspresją białka docelowego są wybierane na podstawie sygnałów FITC lub TRITC, które są następnie podświetlane w celu późniejszego monitorowania sygnałów Fura-2 Ca²⁺ w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie Ca²⁺ w pojedynczej komórce to system detekcji, który można zintegrować z różnymi innymi konfiguracjami eksperymentalnymi zgodnie z celami eksperymentu. Na przykład, jeśli zachodzi potrzeba wykrycia reakcji wrażliwych na temperaturę kanałów jonowych na zmiany temperatury, system można połączyć z systemem operacyjnym kontroli temperatury i urządzeniem perfuzyjnym, aby jednocześnie monitorować zmiany w wewnątrzkomórkowych sygnałach Ca^{2 +} poprzez kontrolowanie temperatury zewnątrzkomórkowego roztworu buforowego¹⁹. Takie podejście potwierdza reakcję odpowiednich kanałów jonowych na temperaturę. Co więcej, obrazowanie Ca^{2 +} w pojedynczych komórkach można również połączyć z odpowiednimi urządzeniami do dostarczania leków lub innymi urządzeniami do stymulacji komórek w powiązanych eksperymentach.

W rzeczywistości jednokomórkowy system obrazowania Ca²⁺ pozwala nie tylko na monitorowanie w czasie rzeczywistym stosunku 340/380, ale także wartości FITC lub TRITC za pomocą określonych ustawień. Co więcej, technologia obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach ma zastosowanie do wykrywania zmian stężenia jonów wapnia nie tylko w cytoplazmie, ale także w retikulum endoplazmatycznym (ER), co świadczy o jej szerokim^{zastosowaniu19}. Dane uzyskane przez ten system są jednolicie zapisywane w formacie ".xlsx", który można szybko przeanalizować w celu uzyskania wyników. Krzywa zmian ułatwia szybkie zrozumienie stanu aktywacji i charakterystyki komórek, tworząc wygodny system monitorowania sygnału Ca²⁺ . Oczekuje się, że ten raport z badań będzie skutecznie promował powszechne zastosowanie jednokomórkowego systemu obrazowania Ca^{2 +} w dziedzinie badań nad tradycyjną medycyną chińską i przyczyni się do dekodowania tradycyjnej medycyny chińskiej.

Jednak zastosowanie technologii obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach ma pewne ograniczenia, takie jak niemożność uzyskania wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Na przykład w niektórych eksperymentach, gdy konieczne jest badanie przesiewowe w kierunku agonistów lub antagonistów określonego kanału, obrazowanie wapnia wymaga badań przesiewowych jeden po drugim, co jest bardzo czasochłonne. W takich przypadkach technika ta może wymagać połączenia z innymi technologiami, takimi jak FLIPR²², w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych przed dalszą walidacją wyników za pomocą obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach. Dodatkowo obrazy uzyskane z obrazowania pojedynczych komórek wapnia są generowane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, która ma niższą rozdzielczość w porównaniu z mikroskopią konfokalną¹⁵. W związku z tym skuteczne połączenie technologii obrazowania pojedynczych komórek wapnia z innymi technikami w celu wykorzystania ich zalet jest ważnym podejściem do rozwiązywania problemów w tej dziedzinie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aparat	fotograficzny Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 regulator temperatury	Warner Instruments
Kwas cyklopiazonowy (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 lekki	Sutter Instrument Company Sulftlenek
dimetylu (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego (MetaFluor, oprogramowanie płatne)			molekularne
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS bufor	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poli-D-lizyna	Beyotime	ST508
SC-20 urządzenie grzewcze/chłodzące z cyrkulacją cieczy	Harvard Apparatus
Źródło światła białego	Nikon

Urządzenia