Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67412

⸱

13 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Streszczenie

Obrazowanie pojedynczej komórki Ca2+ jest niezbędne do badania kanałów Ca2+ aktywowanych przez różne bodźce, takie jak temperatura, napięcie, związki natywne i chemikalia itp. Opiera się przede wszystkim na technologii obrazowania mikroskopowego i powiązanym wskaźniku Ca2+ Fura-2/AM (AM to skrót od Acetoxymethyl ester). Wewnątrz komórek Fura-2 / AM jest hydrolizowany przez esterazy do Fura-2, który może odwracalnie wiązać się z wolnym cytoplazmatycznym Ca2+. Maksymalna długość fali wzbudzenia zmienia się z 380 nm na 340 nm (po nasyceniu Ca2+) po związaniu. Intensywność emitowanej fluorescencji jest ilościowo związana ze stężeniem związanegoCa2+. Mierząc stosunek 340/380, można określić stężenie Ca2+ w cytoplazmie, eliminując błędy spowodowane zmianami wydajności ładowania sondy fluorescencyjnej między różnymi próbkami. Technologia ta pozwala na ilościowe i jednoczesne monitorowanie zmian Ca2+ w czasie rzeczywistym. Wyniki są przechowywane w folderze ". XLSX" do późniejszej analizy, który jest szybki i generuje intuicyjne krzywe zmian, znacznie poprawiając skuteczność wykrywania. Z różnych perspektyw eksperymentalnych w artykule tym wymieniono zastosowanie tej technologii do wykrywania sygnałów Ca2+ w komórkach z endogennymi lub nadekspresyjnymi białkami kanałowymi. W międzyczasie pokazano i porównano różne metody aktywacji komórek. Celem jest zapewnienie czytelnikom lepszego zrozumienia zastosowania i zastosowań obrazowania pojedynczych komórek Ca2+.

Wprowadzenie

Ca2+ odgrywa kluczową rolę w transdukcji sygnału komórkowego, regulując różne funkcje komórkowe, takie jak skurcze mięśni1, przewodnictwo nerwowe2, secretion3, oraz ekspresja genów4, wpływając tym samym na wiele procesów fizjologicznych. Nieprawidłowe stężenia Ca2+ mogą prowadzić do chorób takich jak zaburzenia rytmu serca5, zaburzenia krzepnięcia6 i zaburzenia równowagi hormonalnej7. Dlatego badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych zmian stężenia Ca2+ ma ogromne znaczenie.

Różne kanały jonowe są zaangażowane w regulację stężenia Ca2+ w komórkach, w tym wysoce selektywne 2+ sup class="xref">8 i nieselektywne kanały kationowe rodziny TRP9. Te kanały jonowe mogą być aktywowane przez bodźce, takie jak temperatura10, związki i składniki aktywne występujące w tradycyjnej medycynie chińskiej11, odgrywające kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych związanych z Ca2+.

Skuteczne monitorowanie wewnątrzkomórkowych zmian stężeniaCa2+ jest niezbędne do badania kanałów jonowych związanych z Ca2+, szczególnie w dziedzinie tradycyjnej medycyny chińskiej, gdzie regulacja sygnalizacji wapniowej odgrywa kluczową rolę w wielu podejściach terapeutycznych. Obecnie podstawowe metody pomiaru wewnątrzkomórkowego Ca2+ można podzielić na dwa typy: pomiary elektryczne i optyczne. Podejście do pomiaru elektrycznego wykorzystuje technikę patch-clamp do oceny zmian potencjału błony komórkowej spowodowanych 2+ sup class="xref">12.

Podczas pomiarów optycznych, sondy fluorescencyjne specyficznie wiążą się z Ca2+, co pozwala badaczom śledzić zmiany intensywności fluorescencji komórkowej. Typowe metody optyczne obejmują techniki oparte na białkach fluorescencyjnych i barwnikach fluorescencyjnych. W metodach opartych na białkach fluorescencyjnych naukowcy mogą nadekspresję wrażliwych na Ca2+ białek fluorescencyjnych, takich jak Cameleon13 i GCaMP14 w komórkach i monitorować zmiany sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej, aby obserwować zmiany w cytoplazmatycznych stężeniach Ca2 +. Ponadto naukowcy mogą nadekspresjonować te białka u myszy i wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną dwufotonową do monitorowania wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2 + w czasie rzeczywistym in vivo lub na poziomie tkankowym, zapewniając wysoką rozdzielczość i głęboką penetrację tkanek10.

Dla metod opartych na barwnikach fluorescencyjnych, powszechnie używane sondy Ca2+ to Fluo-3/AM, Fluo-4/AM i Fura-2/AM10. Naukowcy inkubują komórki w roztworze zawierającym te sondy fluorescencyjne, które przechodzą przez błonę komórkową i są rozszczepiane przez wewnątrzkomórkowe esterazy w celu wytworzenia związków aktywnych (np. Fluo-3, Fluo-4 i Fura-2), które pozostają w komórce. Sondy te wykazują minimalną fluorescencję w postaci wolnego liganda, ale emitują silną fluorescencję po związaniu z wewnątrzkomórkowym Ca2 +, wskazując w ten sposób na zmiany w cytoplazmatycznych stężeniach Ca2 +. W porównaniu z innymi białkami fluorescencyjnymi i barwnikami, Fura-2 jest zwykle wzbudzana przy długościach fal 340 nm i 380 nm. Po związaniu z wewnątrzkomórkowym wolnym Ca2+, Fura-2 ulega przesunięciu absorpcyjnemu, przesuwając szczyt długości fali wzbudzenia z 380 nm do 340 nm, podczas gdy pik emisji w pobliżu 510 nm pozostaje niezmieniony. Istnieje ilościowa zależność między intensywnością fluorescencji a stężeniem związanegoCa2+, co pozwala na obliczenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ poprzez pomiar współczynnika intensywności fluorescencji na tych dwóch długościach fal wzbudzenia. Pomiary proporcji redukują skutki fotowybielania, wycieku z sondy fluorescencyjnej, nierównomiernego obciążenia i różnic w grubości komórek, dając bardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki (Rysunek 1).

Systemy obrazowania pojedynczych komórek Ca2+ wykorzystują głównie techniki mikroskopowe i wskaźnik Ca2+ Fura-2/AM do wykrywania wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2+. Systemy te składają się z mikroskopu fluorescencyjnego, źródła światła do obrazowania Ca2+ oraz oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego, umożliwiającego ilościowe monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian Ca2+ w cytoplazmie wielu komórek jednocześnie (do 50 komórek na pole widzenia). Wyniki są zapisywane w formacie ".xlsx" w celu późniejszej analizy. System oferuje szybką szybkość analizy (około 1 minuty w przypadku analizy grupy komórek w jednym polu widzenia) i generuje intuicyjne krzywe zmian, co znacznie zwiększa skuteczność wykrywania. Obrazowanie Ca2 + pojedynczych komórek jest niezbędnym podejściem technicznym do badania kanałów związanych z Ca2 + i ma znaczną wartość w badaniach biomedycznych związanych z kanałami jonowymi. Oczekuje się, że jego zastosowanie w technologii obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach znacznie przyczyni się do postępu w badaniach nad mechanizmami leżącymi u podstaw tradycyjnej medycyny chińskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Metody eksperymentalne zostały zatwierdzone i przestrzegały wytycznych IACUC Uniwersytetu Tsinghua i Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej. Protokół ten wprowadza metody obrazowania pojedynczych komórek Ca2 + dla różnych typów komórek, w tym pierwotnych keratynocytów wyizolowanych ze skóry kilku nowonarodzonych myszy (w ciągu trzech dni od urodzenia, z losowo dobranymi płciowo rodzeństwem z miotu, myszy C57BL / 6). Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie komórek

UWAGA: Komórki pierwotne, linie komórkowe z endogennymi genami docelowymi lub te transfekowane nadekspresyjnymi plazmidami są odpowiednie do obrazowania pojedynczej komórki Ca2+. Plazmidy użyte w tym badaniu zostały uzyskane z laboratorium profesora Xiao Bailonga na Uniwersytecie Tsinghua. Plazmidy te zostały skonstruowane przez włączenie sekwencji białka fluorescencyjnego GFP z ludzkim STIM1, białka fluorescencyjnego DsRed z ludzkim Orai1, białka fluorescencyjnego mRuby z króliczym TRPV1, a także białka czerwonej fluorescencji mCherry do wektorów plazmidu fagowego10.

  1. Przygotować sterylne szkiełka podstawowe o średnicy 8 mm na płytce 24-dołkowej. Dodaj 500 μl buforu poli-D-lizyny (PDL) (50 μg/ml w DPBS) do każdego dołka.
  2. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić powlekanie, a następnie wyrzucić roztwór powlekający za pomocą pipety.
  3. Umyj szkiełka raz za pomocą DPBS i odłóż je na bok do późniejszego wykorzystania.
  4. Hoduj pierwotne komórki i linie komórkowe oddzielnie, zgodnie z ich specyficznymi metodami hodowli10.
  5. Komórki nasienne na przygotowaną 24-dołkową płytkę o gęstości około 1,5 x 105 komórek na dołek. Użyj komórek do obrazowania Ca2+ po przyklejeniu się do szkiełka nakrywkowego.
  6. W przypadku plazmidów z nadekspresją komórek, transfect10,15 docelowego plazmidu (1 μg/dołek) za pomocą odczynnika do transfekcji Lipofectamine 2000 (lub Lipofectamine 3000) w stosunku 1:1 i inkubować w inkubatorze hodowli komórkowych przez około 24 godziny
    nuta: W przypadku większych białek może być konieczny dłuższy czas inkubacji.

2. Przygotowanie roztworu roboczego Fura-2/AM

  1. Dodać 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki zawierającej 50 μg proszku Fura-2/AM i dobrze wymieszać, aby przygotować 1 μg/μl roztwór podstawowy Fura-2/AM.
  2. Wymieszaj roztwór podstawowy Fura-2/AM i Pluronic F-127 z buforem Hanka zawierającym 1,3 mM Ca2 +
    nuta: Końcowe stężenie Fura-2/AM i Pluronic F-127 w roztworze roboczym wynosi 2,5 μg/ml. Bufor Hanka przygotowuje się przez dodanie 10 mM HEPES do 1x bufora HBSS.
  3. Użyj folii aluminiowej, aby chronić roztwór roboczy Fura-2/AM przed światłem.

3. Wstępne leczenie komórek do obrazowania pojedynczych komórek Ca2+

  1. Przenieść szkiełka podstawowe z komórkami na nową 24-dołkową płytkę zawierającą bufor Hanka do mycia.
  2. Odrzucić bufor za pomocą pipety i dodać 500 μl buforu roboczego Fura-2/AM do każdej studzienki.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić załadowanie sondy.
  4. Usuń bufor roboczy Fura-2/AM i umyj komórki trzykrotnie buforem Hanka, aby wyeliminować nadmiar Fura-2/AM. Ogniwa są teraz gotowe do użycia.

4. Uruchamianie systemu obrazowania Ca2+

UWAGA: W tym badaniu, mikroskop fluorescencyjny jest używany do obrazowania Ca2+.

  1. Uruchom kolejno następujące komponenty: światło DG4 (lampa ksenonowa), kamera, źródło światła białego, kontroler stolika mikroskopu, mikroskop, komputer i oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego.
    nuta: Jeśli wykryjesz aktywację kanałów jonowych przez temperaturę, włącz również następujące elementy: system perfuzyjny, system grzewczy, regulator temperatury i urządzenie do ogrzewania/chłodzenia cyrkulacji cieczy.

5. Procedura odpowiedzi komórkowej Ca2+

  1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów).
    1. Wybierz pozycję Protokół, a następnie wybierz pozycję Plik, a następnie pozycję Załaduj protokół. Wybierz protokół i kliknij OK.
    2. Skonfiguruj eksperyment (na liście menu).
    3. Wybierz pozycję Nowy eksperyment.
  2. Zamontuj komorę perfuzyjną w mikroskopie.
    nuta: Zawsze całkowicie opuszczaj obiektyw podczas montażu lub wyjmowania komór za pomocą pokrętła szorstkiego ustawiania ostrości, aby zapobiec uszkodzeniu obiektywu.
  3. Usuń szkiełka komórkowe poddane działaniu Fura-2/AM i umieść je w komorze zawierającej bufor Hanka.
  4. Uruchom system perfuzyjny.
  5. Wybierz obiektyw DIC 20x i wyreguluj ostrość w białym świetle.
  6. Kliknij Cfg Exp na pasku zadań.
    1. Wybierz żądane fluory do obrazowania.
    2. Określ częstotliwość akwizycji i ustawienia wyświetlania na ekranie (Pobieranie: sprawdź 340, 380, GFP; Interwał pozyskiwania: 1 s; Interwał zapisu: 1 s).
  7. ognisko
    1. W panelu sterowania eksperymentu kliknij przycisk Skup się.
    2. Dostosuj czas akwizycji (zwykle 100 ms) i wzmocnienie w razie potrzeby, a następnie "zapisz na tę falę"
      nuta: W przypadku światła UV użyj wzmocnienia zamiast czasu ekspozycji.
    3. Wybierz żądaną długość fali do ustawiania ostrości (np. 380) i kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości.
    4. Przełącz widok z lornetki na komputer.
    5. Upewnij się, że przez lornetkę widoczny jest słaby zielonkawy kolor.
    6. Skoncentruj się na komórkach, używając najpierw przybliżonej ostrości, aby zbliżyć obiektyw, a następnie precyzyjnej ostrości.
      nuta: Mikroskop wyda sygnał dźwiękowy, jeśli zbliży się zbyt blisko sceny. Jeśli tak się stanie, opuść obiektyw, wyrównaj płytkę na stole montażowym i ponownie ustaw ostrość. Zminimalizuj czas spędzony na ustawianiu ostrości, aby zmniejszyć uszkodzenia komórek wywołane laserem.
    7. Sprawdź intensywność fluorescencji komórek podczas procesu ustawiania ostrości.
    8. Dostosuj intensywność fluorescencji komórek, modyfikując czas ekspozycji i wzmocnienie.
      nuta: Czas ekspozycji i wzmocnienie dla 340 i 380 muszą być spójne.
    9. Po uzyskaniu dobrej ostrości naciśnij przycisk na mikroskopie, aby przełączyć view na komputer.
    10. W razie potrzeby ponownie ustaw ostrość, aby uzyskać najostrzejszy obraz na komputerze, a następnie kliknij Zatrzymaj ustawianie ostrości.
  8. Alternatywna procedura znajdowania komórek GFP dodatnich
    1. Najpierw użyj procedury 340/380, aby uzyskać dobre skupienie na komórkach.
    2. Wybierz FITC, a następnie kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości.
    3. Użyj kontrolera stopnia, aby znaleźć komórki GFP-dodatnie.
    4. Przełącz widok na komputer, a następnie kliknij Zatrzymaj ustawianie ostrości.
  9. Wybór regionu
    1. Kliknij przycisk Region na pasku menu.
    2. Wybierz odpowiedni typ oświetlenia (340/380/FITC/TRITC). Filtry FITC i TRITC są wybierane odpowiednio dla GFP i mCherry/DsRed/mRuby, dla komórek z nadekspresją docelowych plazmidów; w przeciwnym razie wybierz Fura-2.
      nuta: Unikaj wybierania komórek, które są w złym stanie lub są martwe, takich jak te, które są wyraźnie zaokrąglone lub mają prześwietlone białka fluorescencyjne.
    3. Kliknij Pobierz obrazy, a następnie OK.
    4. Pojawi się nowe okno; zaznacz komórki, klikając narzędzie owalu, a następnie klikając komórkę.
    5. Wybierz żądane komórki pod wpływem fluorescencji przenoszonej przez białko docelowe (FITC lub TRITC). Wybierz komórki kontrolne, które nie wykazują ekspresji białka docelowego w warunkach 380 nm.
    6. Cofnij region, klikając prawym przyciskiem myszy okrąg, a następnie wybierając polecenie Usuń region.
    7. Wybierz próbkę tła jako ostatni region i zapisz jego numer identyfikacyjny.
    8. Kliknij Zapisz, a następnie Gotowe.
  10. Odejmowanie tła
    1. Kliknij przycisk menu Referencje.
    2. Wskaż numer regionu tła.
      nuta: Jeśli tło było ostatnim wybranym regionem, wprowadzenie bardzo dużej liczby spowoduje automatyczne przełączenie na ostatnio wybrany region.
    3. Zaznacz pole Odejmij odwołania, a następnie kliknij OK.
  11. Dane dziennika
    1. Kliknij przycisk Log Data (Dane dziennika) na panelu sterowania eksperymentu.
      nuta: Obrazy są zapisywane tylko wtedy, gdy istnieje chęć odtworzenia eksperymentu później; Zwykle wystarczy zaznaczyć pole danych.
    2. Upewnij się, że pojawi się monit z prośbą o preferowany typ pliku danych; wybierając . Zalecany jest format XLSX.
    3. Otworzy się arkusz typu ".xlsx". Zminimalizowanie arkusza roboczego zapobiegnie zajmowaniu przez niego miejsca na ekranie.
  12. Akwizycja danych
    1. W sekcji Upływ czasu w panelu sterowania ustaw interwał zbierania danych na 1 s.
      nuta: Można to dostosować do rzeczywistych potrzeb.
    2. Kliknij Zegar Zerowy i Zdobądź na panelu sterowania eksperymentu, aby rozpocząć eksperyment. Linie bazowe będą widoczne na wykresie wskazującym każdy z wybranych regionów komórki.
    3. Wykonaj serię zabiegów na komórkach zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
    4. Aby zaobserwować reakcję temperaturową komórek, należy podgrzać bufor w układzie perfuzyjnym do odpowiedniej temperatury za pomocą regulatora temperatury.
    5. Aby zaobserwować wpływ leków na komórki, należy wykonać perfuzję lub ręcznie dodać bufor zawierający lek i zarejestrować zmiany w komórkach.
    6. Po zakończeniu zbierania danych kliknij Pause.
      nuta: Akwizycję danych można wstrzymać, a zegar można zresetować w dowolnym momencie eksperymentu.
    7. Zapisywanie i analizowanie danych.
  13. Kliknij pozycję Plik i zamknij eksperyment, aby zakończyć eksperyment, a następnie wybierz opcję Nie w oknie dialogowym, aby zapisać protokół.
  14. Otwórz nowy eksperyment, klikając Nowy w menu i powtórz proces.
  15. Zamknięcie systemu
    1. Zamknij oprogramowanie i przenieś dane z komputera.
    2. Odwróć procedurę uruchamiania.
    3. Rejestruj godziny na arkuszu rejestracyjnym i posprzątaj bałagan.
  16. analiza danych
    1. Przedstawić wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ za pomocą stosunku Fura-2 340/380 lub przeliczyć na odpowiednie stężenie Ca2+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej
Pierwotne keratynocyty
Pierwotne keratynocyty wyizolowano z nowonarodzonych myszy i przygotowano zgodnie z uznanymi protokołami10. Komórki te wysiano na płytki 24-dołkowe zawierające szkiełka przedmiotowe. Po załadowaniu sondy Fura-2 dostrójono ostrość pod mikroskopem przy długości fali 380 nm, aby uzyskać wyraźną wizualizację morfologii komórek, jak pokazano na Rysunku 2A. Jeśli sonda nie zostałab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie jednokomórkowych systemów obrazowania Ca2 + jest szerokie, umożliwiając badanie sygnałów Ca2 + w różnych typach komórek, w tym keratynocytach, komórkach macierzystych16, komórkach wątroby, komórkach serca17, podocytach18, komórkach odpornościowych i liniach komórkowych z nadekspresją białek docelowych10,19. Technika ta mierzy zmiany i wartości bezwzględne st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania dla Bailong Xiao z Uniwersytetu Tsinghua za udostępnienie systemu obrazowania Ca2+ jednokomórkowego oraz systemu operacyjnego kontroli temperatury, a także za wsparcie i pomoc w tym projekcie. Badania te zostały sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32000705), Program Sponsorowania Młodych Elitarnych Naukowców przez Chińskie Stowarzyszenie Medycyny Chińskiej (CACM-(2021–QNRC2–B11)), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2020–JYB–XJSJJ–026), (2024-JYB-KYPT-06).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aparatfotograficzny Nikon
CapsaicineSigma211275
CL-100 regulator temperaturyWarner Instruments
Kwas cyklopiazonowy (CPA)SigmaC1530
DG-4 lekkiSutter Instrument Company Sulftlenek
dimetylu (DMSO) Amresco231
DPBSThermofisher14190144
Oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego (MetaFluor, oprogramowanie płatne) molekularne
Mikroskop fluorescencyjnyNikon
Fura-2/AMInvitrogenF1201
HBSS buforGibco14175103
HEPES SigmaH3375
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
Pluronic F-127  BeyotimeST501
poli-D-lizyna  BeyotimeST508
SC-20 urządzenie grzewcze/chłodzące z cyrkulacją cieczy Harvard Apparatus
Źródło światła białegoNikon
Urządzenia

Bibliografia

  1. Murthy, K. S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).
  2. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--eeg, ecog, lfp and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  3. Rogers, D. F. Physiology of airway mucus secretion and pathophysiology of hypersecretion. Respir Care. 52 (9), 1134-1146 (2007).
  4. Mitra, R., Hasan, G. Store-operated Ca(2+) entry regulates neuronal gene expression and function. Curr Opin Neurobiol. 73, 2022(2022).
  5. Landstrom, A. P., Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. Calcium signaling and cardiac arrhythmias. Circ Res. 120 (12), 1969-1993 (2017).
  6. Zheng, C., Zhang, B. Combined deficiency of coagulation factors v and viii: An update. Semin Thromb Hemost. 39 (6), 613-620 (2013).
  7. Ahmadian Elmi, M., Motamed, N., Picard, D. Proteomic analyses of the g protein-coupled estrogen receptor gper1 reveal constitutive links to endoplasmic reticulum, glycosylation, trafficking, and calcium signaling. Cells. 12 (21), 2571(2023).
  8. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the crac channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  9. Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: A heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  10. Liu, X., et al. Stim1 thermosensitivity defines the optimal preference temperature for warm sensation in mice. Cell Res. 29 (2), 95-109 (2019).
  11. Bharate, S. S., Bharate, S. B. Modulation of thermoreceptor trpm8 by cooling compounds. ACS Chem Neurosci. 3 (4), 248-267 (2012).
  12. Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483 (7388), 176-181 (2012).
  13. Behera, S., et al. Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots. New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).
  14. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  15. Liu, X., et al. Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation. Cells. 12 (22), 2613(2023).
  16. Wang, S., et al. ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells. Cell Discov. 4, 2(2018).
  17. Jiang, F., et al. The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction. Nat Commun. 12 (1), 869(2021).
  18. Tao, Y., et al. Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury. J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).
  19. Guo, L., et al. Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies. Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).
  20. Gouin, O., et al. Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization. Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).
  21. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am. J Vis Exp. (23), e1067(2009).
  22. Wang, Y., et al. A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel. Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Fura-2 AMmikroskopia fluorescencyjnaagoniści TRPV1termiczna sygnalizacja wapniowawapniowe wejście sterowane zapasamiodpowiedź wapniowa keratynocytówanaliza ekspresji genówfluorescencyjny wskaźnik jonów wapnia
Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.