Formulacja nanomateriałów na bazie z wykorzystaniem ekstraktu z kory Eucommia ulmoides i ich potencjał gojenia ran

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół syntezy nanocząsteczek tlenku (ZnO) przy użyciu bogatego w poliizopren wodnego ekstraktu uzyskanego z kory drzewa Eucommia ulmoides. Potencjał gojenia się ran wykazywany przez zsyntetyzowane nanocząstki ZnO na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) oceniono za pomocą testu scratch, który jest prostą, opłacalną i wydajną metodą.

Streszczenie

Wodny ekstrakt z kory Eucommia ulmoides służy jako bogate źródło związków bioaktywnych o licznych korzyściach zdrowotnych. Protokół ten ma na celu zbadanie przygotowania nanocząstek tlenku (ZnO) przy użyciu wodnego ekstraktu wodnego bogatego w poliizopren za pośrednictwem kory Eucommia ulmoides. Tymczasem proponowany protokół wiąże się z przygotowaniem materiału gojącego rany poprzez ułatwienie tego procesu. Ponadto potencjał gojenia się ran zsyntetyzowanych nanocząstek (Eu-ZnO-NPs) oceniono za pomocą prostego testu zarysowania na monowarstwie ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Po 24 godzinach leczenia Eu-ZnO-NPs oceniono proliferację i migrację komórek HUVEC. Pod koniec badania zaobserwowano proliferację i migrację komórek w porysowanej monowarstwie potraktowanej różnymi stężeniami Eu-ZnO-NPs, podczas gdy w komórkach kontrolnych zaobserwowano słabe tempo migracji i proliferacji komórek. Spośród wybranych stężeń 20 μg/ml nanomateriały Eu-ZnO wykazały lepszą migrację komórek i zwiększony potencjał gojenia się ran.

Wprowadzenie

Wykazano, że rośliny lecznicze i związki pochodzenia roślinnego wykazują liczne korzyści zdrowotne¹. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) poinformowała, że 80% światowej populacji polega na tradycyjnych roślinach leczniczych w podstawowej opiece zdrowotnej. Chiny są dobrze rozpoznawalne i popularne ze względu na praktyki Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM). Doniesiono, że chińskie zioła lecznicze leczą różne choroby i są wykorzystywane ze względu na ich potencjał biologiczny. Rośliny lecznicze służą jako rezerwuary związków bioaktywnych i pełnią wiele ról terapeutycznych. Rośliny lecznicze były również wykorzystywane do leczenia ran. Istnieje kilka rodzajów podejść stosowanych w leczeniu ran przewlekłych². Niedawne badania wykazały, że rośliny lecznicze są zaangażowane w proces gojenia się ran, zapewniając dogodne warunki do gojenia, wolne od infekcji i przyspieszając regenerację tkanek³. Tymczasem właściwości przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze związków bioaktywnych obecnych w roślinach leczniczych mogą pomóc w leczeniu ran i zwiększyć skuteczność gojenia się ran⁴.

Nanomateriały na bazie metalu zyskują na popularności ze względu na swoje właściwości biokompatybilne i biodegradowalne. Eucommia ulmoides, potocznie nazywana chińskim drzewem kauczukowym, jest rodzimym gatunkiem Chin. Liście i kora drzewa są wykorzystywane w praktykach leczniczych. Co najważniejsze, gatunek rośliny był uprawiany w centralnych i zachodnich prowincjach Chin⁵. Peng et al.⁶stwierdzili, że liście, kora i kwiaty pręcikowe są jadalne o potencjale terapeutycznym. Ponadto E. ulmoides jest najlepszym źródłem lignanów, fenylopropanoidów, irydoidów, flawonoidów, aminokwasów i pierwiastków śladowych. Ponadto kora została wykorzystana do różnych zastosowań biomedycznych, takich jak kontrolowanie ciśnienia krwi, obniżanie poziomu tłuszczu oraz promowanie antyosteroporozy i aktywności hipoglikemicznej⁷. Stąd niewątpliwie udowodniono, że ekstrakt z kory E. ulmoides ma długą historię w tradycyjnej medycynie chińskiej. Wcześniejsze doniesienia sugerowały, że naturalny polimer poliizoprenu jest bogaty w korę Eucommia ulmoides⁸. W oparciu o powyższe informacje, niniejsze prace mają na celu wytworzenie nanomateriałów z wykorzystaniem ekstraktów z kory Eucommia ulmoides. Połączenie z ekstraktem z kory jest atrakcyjnym wyborem do otrzymywania nanomateriałów. Ogólnie rzecz biorąc, ostatecznym celem niniejszego badania było wytworzenie nowatorskiego hybrydowego nanomateriału do zastosowań związanych z gojeniem się ran.

Protokół

UWAGA: Przed przygotowaniem ekstraktu, uzyskany materiał kory został dwukrotnie umyty wodą dejonizowaną i wysuszony w zacienionym miejscu. Wysuszoną w cieniu korę przechowywano w hermetycznym pojemniku.

1. Przygotowanie ekstraktu z kory Eucommia ulmoides

1. Pokrój korę zebraną z drzewa Eucommia ulmoides na małe kawałki za pomocą nożyczek.
2. Umyj posiekane materiały z kory dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną.
3. Suszyć kawałki kory w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w zacienionych warunkach.
   1. Dostosuj czas trwania procesu suszenia w zależności od ilości kory użytej do badania. Upewnij się, że kora jest całkowicie wysuszona przed pokrojeniem kory na małe kawałki. Unikaj bezpośredniego światła słonecznego.
4. Przenieść 20 g suszonej w cieniu kory do stożkowej kolby zawierającej 220 ml sterylnej, podwójnie destylowanej wody i ogrzewać w temperaturze 130 °C przez 20 minut.
   1. Kolor roztworu reakcyjnego zmienia się na jasnożółty. Zmiany koloru roztworu następują po 10 minutach. Pozwól roztworowi podgrzać się przez kolejne 10 minut. Dostosuj objętość wody podwójnie destylowanej w zależności od ilości próbki.
5. Surowy ekstrakt zawierający poliizopren należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania. Powstanie nitkowatej struktury wskazuje na obecność poliizoprenu w ekstraktach.

2. Biosynteza nanocząstek ZnO za pośrednictwem kory E. ulmoides

1. Dodać 1 M dwuwodnego azotanu Zn (NO₃)₂ do 50 ml wody dejonizowanej w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml. Mieszać w sposób ciągły za pomocą mieszania magnetycznego (60 obr./min). Zn (NO₃)₂ potrzebuje 30 minut, aby całkowicie się rozpuścić.
2. Dodać kroplami 15 ml ekstraktu z kory E. ulmoides do 20 ml 1 M roztworu dwuwodnego azotanu (Zn (NO₃)₂).
3. Umieść przykrytą mieszaninę reakcyjną na mieszadle magnetycznym, włącz mieszadło i wiruj z prędkością (60 obr./min) przez 3 godziny.
4. Dodać kroplami 1 N roztwór wodorotlenku sodu NaOH (3 ml) do mieszaniny reakcyjnej, aby dostosować pH do 9. Dodawać NaOH, aż mieszanina roztworu zmieni kolor na mlecznobiały, a pH nie będzie większe niż 9. Roztwór nabiera mlecznobiałego koloru, gdy powstają nanocząstki ZnO.
   1. Przygotowanie 1 M roztworu azotanu dwuwodnego Zn (NO₃)₂ objętości może się różnić w zależności od potrzeb doświadczalnych. Upewnij się, że używasz świeżo przygotowanych ekstraktów z kory. Jeśli pH przekroczy 10, spowoduje to agregację nanocząstek.
5. Przenieść zsyntetyzowane eu-ZnO-NPs do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować ją przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Zanieczyszczeń można uniknąć poprzez natychmiastowe pranie.
6. Umyte Eu-ZnO-NPs zebrać na szklanej płytce i wysuszyć w temperaturze 45-50 °C przez 1 godzinę w piecu z gorącym powietrzem.
   UWAGA: Jeśli Eu-ZnO-NP są przechowywane dłużej niż 30 minut, może to mieć wpływ na fizykochemiczny charakter nanocząstek

3. Potwierdzenie rozmiaru za pomocą TEM

1. Przygotować 1 mg/ml nanocząstek w DDH₂O i załadować 5 μl próbki Eu-ZnO-NP do siatki miedzianej i poczekać, aż całkowicie wyschnie. Zwiruj próbkę przed załadowaniem na miedzianą siatkę.
2. Załadować miedzianą siatkę zawierającą Eu-ZnO-NP do uchwytu próbki TEM i uzyskać obrazy w powiększeniach 50x i 100x.
   UWAGA: Na tym etapie siatki należy podnieść za pomocą pęsety.

4. Ocena cytotoksyczności

1. Wysiewać 1 × 10⁴ HUVEC w każdym dołku 96-dołkowej płytki i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 5% CO₂ 37 °C.
2. Dodać 10 μl o różnych stężeniach 0, 10, 20, 30, 40 i 50 μg/ml Eu-ZnO-NPs do 90% zlewających się komórek i inkubować przez 24 godziny.
3. Po inkubacji usunąć starą pożywkę bez naruszania komórek, dodać 10 μl roztworu CCK-8 do każdej studzienki zawierającej 90 μl świeżej pożywki DMEM i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.
4. Zmierzyć absorbancję komórek poddanych działaniu roztworu CCK8 przy długości fali 450 nm za pomocą spektrofotometru.
   UWAGA: Absorbancję zmierzono natychmiast w ciągu 15 minut, aby uniknąć zmian absorbancji.

5. Przygotowanie komórek HUVEC do testu scratch

1. Wysiać odpowiednią ilość (1 × 10⁵) HUVEC na 12-dołkowych płytkach hodowlanych zawierających zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% paciorkowcem piórkowym i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ 37 °C.
   1. Przed wykonaniem testu zarysowania należy sprawdzić zbieg za pomocą mikroskopu odwróconego.
      UWAGA: Do przeprowadzenia testu zarysowania zostaną użyte płytki 6-dołkowe lub 12 płytek w zależności od wymagań, a gęstość komórek będzie się różnić dla różnych płytek hodowlanych. Zastosowanie 70%-80% zlewających się komórek jest idealne i zalecane do testów zarysowania. Objętość pożywki DMEM może się różnić w zależności od płytek hodowlanych wykorzystanych w badaniu. Na przykład płytki 6-dołkowe wymagają 1-1,5 ml pożywki hodowlanej, a płytki 12-dołkowe wymagają 0,5-1,0 ml pożywki wzrostowej.
2. Delikatnie wykonać rysę za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl w reprezentatywnej ranie o szerokości rany 200 μm.
3. Upewnij się, że końcówka używana do wykonywania zadrapań na monowarstwie ogniw styka się z powierzchnią komórek.
   UWAGA: Za każdym razem, gdy wykonuje się zadrapanie, użyj sterylnej końcówki.
4. Usuń całe podłoże i umyj monowarstwę HUVEC za pomocą 1 ml 1x PBS w celu usunięcia oderwanych komórek.
   UWAGA: Upewnij się, że odłączone komórki jednowarstwowe zostały całkowicie usunięte z odpowiednich studzienek. Upewnij się, że w obszarze utworzonym przez ranę nie doszło do uszkodzenia.
5. Aby ocenić potencjał gojenia się ran zsyntetyzowanych Eu-ZnO-NPs, dodaj do studzienek 0 (kontrola), 10 i 20 μg/ml stężenia nanocząstek Eu-ZnO w połączeniu z kompletną pożywką z 10% FBS. Utrzymywać płytki doświadczalne w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2.
   UWAGA: Nie naruszaj monowarstwy komórek podczas dodawania świeżej, kompletnej pożywki. Upewnij się, że komórki jednowarstwowe pozostają nienaruszone podczas inkubacji.
6. Wykonać mikrofotografię po 0 h i 24 h za pomocą mikroskopu odwróconego. Użyj narzędzia do adnotacji, aby zmierzyć zamknięcie rany w różnych odstępach czasu.
   1. Obliczyć procent zamknięcia rany, korzystając z następującego wzoru: Zamknięcie rany (%) = [(migracja komórek (w μm) po 0 h - migracja komórek (w μm) po 24 godzinach)/ migracja komórek (w μm) po 0 godzinach] x 100.

Wyniki

Celem niniejszego badania jest synteza nanocząsteczek z wykorzystaniem kory drzewa Eucommia ulmoides. Materiał z kory został całkowicie wysuszony w zacienionym środowisku (Rysunek 1). Materiały z kory wykorzystano do przygotowania wodnego ekstraktu surowego w gorącej wodzie poprzez podgrzewanie próbek w temperaturze 130 °C przez 20 min. Niewielka zmiana temperatury i czasu trwania procesu może doprowadzić do rozkładu fitozwiązków i uczynić je niezdatnymi do przygotowania ekstraktu w...

Dyskusja

Uważa się, że kora, nasiona i liście E. ulmoides wykazują liczne korzyści zdrowotne. Nasze wyniki pokazały, że synteza nanocząstek EU-ZnO została osiągnięta przy użyciu prostego i opłacalnego podejścia. Do syntezy nanocząstek wykorzystano ekstrakt wodny. Podgrzewanie materiału kory w wysokich temperaturach może powodować degradację niektórych fitoskładników i obniżać wydajność ekstrakcji. Fitoskładniki obecne w wodnym ekstrakcie ziołowym mogą redukować jony metali, tworząc nanocząsteczki. Dwuwodny azotan jest wy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 12-dołkowa	NEST	703011	Służy do hodowli komórkowych i oznaczania
Wirówka	SCILOGEX	SC1406	Służy do oddzielania nanocząstek od mieszaniny koloidalnej
Probówka wirówkowa – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	Do odwirowania zsyntetyzowanego roztworu
Probówka wirówkowa – 5 ml	Biosharp	BS-50-CM-S	Do przechowywania nanocząstek
Inkubator CO2	Thermo scientific	3010	Do hodowli komórek HUVEC
Woda odnotowana	Millipore	Nie dotyczy	Do przygotowania ekstraktu
Pożywka DMEM	Cytiva	SH30243.01	Służy do prac związanych z hodowlami komórkowymi
Lejek	Thermo naukowy	42600060	Do przytrzymywania bibuły filtracyjnej podczas filtracji
Zlewki	szklane borokrzemianowe	1102-50	Służy do przygotowania ekstraktu wodnego
Piec z gorącym powietrzem	Genetimes	Nie dotyczy	Służy do suszenia nanocząstek i zbierania w postaci proszku
Mieszadło magnetyczne	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Służy do syntezy nanocząstek
Mikroskop	Nikon Eclipse	Ts2	Służy do wykonywania mikrofotografii
szalka	Petriego NEST	753001	Służy do zbierania nanocząstek
Pipeta 1 ml	Nauka laboratoryjna	YEA17AD0055580	Aby wziąć/dodać określoną objętość roztworu/ekstraktu
Końcówki do pipet 1 ml	SAINING	3014200-T	Aby wziąć/dodać określoną objętość roztworu/wyekstrahować
Mieszalnik magnetyczny PTFE Mieszadła	LAN RAN	Nie dotyczy	Służy do procesu syntezy nanomateriałów
Wodorotlenek sodu	Sigma Alrich	71690	Służy do regulacji pH podczas syntezy
Nożyczki ze stali nierdzewnej	Deli	6034	Służy do rozdrabniania materiałów z kory
Kolba do hodowli tkankowych T25	NEST	707001	Służy do utrzymania komórek
Waga wagowa	Radwag	AS220R2	Służy do ważenia chemikaliów
Bibuła filtracyjna Whatman nr 1	Newstar	GB/T1914-2017	Służy do filtrowania ekstraktu do syntezy
Azotan	Sigma Alrich	13778-30-8	Używany jako prekursor nanocząstki" s synteza