Tradycyjna medycyna chińska (TCM) stanowi bogatą skarbnicę naturalnych opcji leczenia i odgrywa ważną rolę w zaspokajaniu różnorodnych potrzeb zdrowotnych na całym świecie. Niniejsze badanie przedstawia kompleksowe eksperymentalne badania dotyczące ekstrakcji, separacji i właściwości fizykochemicznych rutyny, kluczowego aktywnego składnika Flos sophorae immaturus.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja i charakterystyka rutyny flawonoidowej z tradycyjnej medycyny chińskiej Flos sophorae immaturus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tradycyjna medycyna chińska (TCM) od dawna stanowi bogate źródło naturalnych rozwiązań terapeutycznych, odgrywając kluczową rolę w zaspokajaniu różnorodnych potrzeb zdrowotnych na całym świecie. Spośród różnych ziół stosowanych w TCM, Sophora flavescens słynie z szerokiego wachlarza właściwości leczniczych. Jego zastosowanie sięga wieków wstecz, a do dziś jest wysoko cenione we współczesnej medycynie, szczególnie ze względu na korzyści terapeutyczne w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych. Rutyn, bioaktywny związek flawonoidowy, jest szeroko rozpowszechniony w królestwie roślinnym, z najwyższym stężeniem występującym w Flos sophorae immaturus. Rutyna wykazuje zmniejszenie nieprawidłowej przepuszczalności i kruchości naczyń włosowatych oraz działa jako środek ochronny dla naczyń sercowo-naczyniowych i mózgowych. Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół eksperymentalny dotyczący ekstrakcji, rozdzielania i charakteryzacji właściwości fizykochemicznych rutyny pochodzącej z Flos sophorae immaturus. Dodatkowo wprowadzono i opisano protokół ekstrakcji flawonoidów z TCM przy użyciu metody ekstrakcji alkalicznej i wytrącania kwasowego.
Wprowadzenie
Flos sophorae immaturus (FSI), suszony pąk kwiatu Sophora japonica L., od wieków stanowi fundament tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM). Główne aktywne składniki to rutyna, izoquercytryna, Sophorae Flos oraz inne flawonoidy i saponiny. Te składniki łącznie wywołują różnorodne efekty farmakologiczne, takie jak oczyszczanie ciepła i detoksykacja, chłodzenie krwi i hemostazy oraz obniżanie ciśnienia krwi. W praktyce klinicznej FSI jest przede wszystkim cenione za zdolność do ochrony przepuszczalności naczyń włosowatych1, utrzymania funkcji układu sercowo-naczyniowego2, chłodzenia krwi, zatrzymywania krwawienia oraz regulacji ognia wątrobowego3. Jego właściwości terapeutyczne przypisuje się wysokiemu stężeniu rutyny (kwercetyna-3-rutyozyd), bioaktywnego flawonoidu, który stanowi do 20%-30% jego masy suchej4.
Rutyn to flawonoid szeroko rozpowszechniony w roślinach. Jego nazwa chemiczna to Que-3-O-rutin (C27H30O16) (Rysunek 1). W temperaturze pokojowej rut ma jasny od żółtego do żółto-zielonego proszku krystalicznego. Jego temperatura topnienia zmienia się w zależności od formy kryształu i czystości, zazwyczaj waha się od 125 °C do 195 °C. Rutyn wykazuje wyraźne cechy polarne: jest lekko rozpuszczalny w zimnej wodzie, wysoko rozpuszczalny w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak etanol i metanol, oraz niemal nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak eter i chloroform. Ponadto jego rozpuszczalność jest wrażliwa na pH i znacząco wzrasta w warunkach zasadowych z powodu dysocjacji fenolowych grup hydroksylowych, tworząc sole sodu lub potasu. Te właściwości fizyczne są ściśle powiązane z grupami polihydroksylowymi i glikozydowymi w jego strukturze molekularnej5, bezpośrednio wpływając na proces ekstrakcji oraz zastosowania w medycynie, spożywczym i innych branżach6. Rutyn, choć wszechobecny w roślinach, jest najliczniejszy w FSI i wykazuje wiele właściwości farmakologicznych, w tym stabilizację naczyń włosowatych7, przeciwzapalne, antyoksydanty8, antybakteryjne9 oraz efekty metaboliczne10.
Pomimo potencjału klinicznego11, słaba rozpuszczalność rutyna w wodzie i stabilność stanowią wyzwanie dla ekstrakcji i formułowania5. Aby rozwiązać te ograniczenia, metoda ekstrakcji alkalicznej i kwasowej precipitacji (AEAP) stała się skuteczną alternatywą, wykorzystującą pH-zależne zachowanie swoich fenolowych grup hydroksylowych.
Na podstawie właściwości fizycznych rutyny, metoda AEAP stała się ustandaryzowaną techniką izolowania rutyny od FSI, wykorzystującą jej rozpuszczalność w roztworach zasadowych i późniejszą krystalizację w warunkach kwaśnych12. AEAP wykorzystuje pH-przełączalną jonizację grup fenolowych hydroksylowych do poprawy wydajności i uzyskania ekstrakcji rutyny o wysokiej czystości z FSI. W warunkach zasadowych (pH >10) grupy fenolowe -OH deprotonują, tworząc jony hydrofilowe -O- , umożliwiając całkowitą rozpuszczalność w tkankach roślinnych przy jednoczesnym minimalizowaniu rozkładu oksydacyjnego. Zakwaszenie do pH 2-3 odwraca tę jonizację, wytrącając celowe fenole przy minimalnej współwytrąceniu zanieczyszczeń polarnych. Jako polifenol o rozpuszczalności zależnej od pH rutyna łatwo rozpuszcza się w roztworach zasadowych (np. wodorotlenku sodu), ale wytrąca się w warunkach kwaśnych dzięki protonacji grupy hydroksylowej. AEAP oferuje opłacalną, skalowalną i przyjazną środowisku alternatywę, zgodną z zasadami zielonej chemii poprzez unikanie toksycznych rozpuszczalników13. Odzwierciedla szerszy trend w chemii produktów naturalnych, który sprzyja technikom separacji opartej na pH14. Podobne metody stosuje się do izolacji kurkuminy (z kurkumy) i berberyny (z Coptis chinensis), wykorzystując zmiany rozpuszczalności przy określonych wartościach pH do selektywnej ekstrakcji. Metoda AEAP jest idealna do produkcji rutyny o wysokiej wydajności ze źródeł bogatych w flawonoidy, takich jak FSI, wymagając jedynie podstawowego sprzętu laboratoryjnego (np. mierników pH, wirówek). Dla macierzy roślinnych o niskiej zawartości rutyny lub złożonych związków interferujących w przyszłości można rozważyć wstępną obróbkę enzymatyczną hydrolizą w celu zwiększenia efektywności ekstrakcji.
Podsumowując, AEAP stanowi wygodne podejście do ekstrakcji rutyny, równoważąc skuteczność, bezpieczeństwo i skalowalność. Jego rola w modernizacji TCM podkreśla potencjał łączenia tradycyjnych praktyk z nowoczesnymi standardami farmaceutycznymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Rutyn to flawonoid zawierający wiele grup fenolowych hydroksylowych i rozpuszcza się w gorących roztworach zasadowych, po których następuje zakwaszenie i wytrącanie. Można ją wydobyć za pomocą procesu ekstrakcji alkalicznej i kwasowej wytrącenia. Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie eksperymentalne
- Pobierz następujące materiały: Flos sophorae immaturus (20 g), boraks (0,8 g), kilka zlewek, wapno (1,5 g), skoncentrowany kwas solny, termometr oraz paski testujące pH. Zobacz Rysunek 2 , aby zobaczyć większą wersję tego obrazu.
2. Ekstrakcja rutyny
UWAGA: Stosuj stosunek boraksu do wody 0,8 g boraksu do 200 mL wody. Stosuj proporcję mleka wapno-wapnowego 1,5 g wapna w proszku do 10 ml wody. Szybko i dokładnie dostosuj pH. Uzupełniać utraconą wodę w razie potrzeby.
- Ekstrakcja alkaliczna
UWAGA: Przefiltruj za pomocą okrągłego papieru filtrującego o średnicy 6 cm.- Dodaj 250 mL wody i 0,8 g boraksu do zlewki o pojemności 500 mL. Podgrzej do wrzenia, a następnie dodaj 20 g Flos sophorae immaturus. Gotuj dalej przez 2-3 minuty.
- Po gotowaniu dostosuj pH do 8-9 z mlekiem wamonkowym pod mieszaniem. Podgrzewaj przez 20 minut. Przefiltruj przez gazę na gorąco, aby uzyskać żółto-brązowy filtrat.
- Ekstrakcja kwaśna
- Dostosuj ekstrakt do pH 2-3 za pomocą skoncentrowanego kwasu solnego i pozwól mu się osadzić. Zmiana z przezroczystego żółto-brązowego roztworu na mętny, wraz z stopniowym powstawaniem pomarańczowo-żółtego osadu na dnie pojemnika, wskazuje na skuteczne rozdzielanie rutyny.
- Po stanie przez 6 godzin poddaj osad filtracji ssącej pod ciśnieniem atmosferycznym. Zbieraj i susz, aby uzyskać prymitywną rutynę.
UWAGA: Przetnij warstwę filtrującą zgodnie z rozmiarem lejka Brinella (średnica 150 mm). - Osad myj wodą aż do neutralnego podczas filtracji ssącej pod ciśnieniem atmosferycznym.
3. Udoskonalanie rutyny
- Po zgrubionym ważeniu rekrystalizuj rutynę przy użyciu gorącej wody o stosunku rozpuszczalności 1:200. Gotuj roztwór wodny przez 30 minut i filtruj na gorąco. Upewnij się, że ostateczna objętość roztworu rutynowego wynosi 210 mL.
- Przefiltruj resztki. Pozwól filtratowi stać niezakłócony, następnie ponownie przefiltruj i wysusz w próżni w piecu w temperaturze 60-70 °C, aby uzyskać rafinowaną rutynę (Rysunek 3).
UWAGA: Przetnij warstwę filtrującą zgodnie z rozmiarem lejka Brinella (średnica 150 mm).
4. Fizykochemiczna identyfikacja rutyny
- Reakcja chlorowodorkowo-magnezowa – identyfikacja jąder macierzystych flawonoidów
- Rozpuść 1-2 mL próbki w metanolu i dodać 50 mg proszku magnezu.
- Dodaj kilka kropli skoncentrowanego kwasu solnego. Potrząśnij delikatnie. Rozwiązanie powinno stać się czerwone (Rysunek 4).
- Reakcja Molischa – identyfikacja związków cukrowych
- Dodaj 10% roztwór etanolu α-naftolu i wstrząśnij. Przechyl probówkę i ostrożnie dodaj skoncentrowany kwas siarkowy kroplami wzdłuż wewnętrznej ściany.
- Obserwuj powstawanie brązowego pierścienia na granicy (rysunek 5).
- Reakcja zazieleniania cyrkonu i kwasu cytrynowego
- Dodaj 1-2 mL roztworu 10% α-naftolu do roztworu etanolowego próbki. Wstrząsnąć. Powoli dodaj 10 kropel skoncentrowanego H2SO4 wzdłuż ścianki rurki, nie potrząsając.
- Dodaj 2% roztwór metanolu kwasu cytrynowego. Kolor roztworu powinien się rozjaśnić (rysunek 6).
- Rozróżnianie cienkich warstw
- Używaj zarówno refined rutin, jak i rut standard.
- Użyj chloroformu:metanolu:kwasu mrówkowego (15:5:1) jako czynnika wywołującego oraz 1% roztworu etanolowego AlCl3jako czynnika chromogennego. Obserwuj fluorescencję pod lampą UV na 365 nm.
5. Badanie rutyny przez TLC
UWAGA: Zastosowano metodę chromatografii cienkowarstwowej (TLC) do oceny czystości rutyny. Jako faza stacjonarna stosowano płytkę żelu krzemionkowego.
- Umieść na płytce próbkę rafinowanego rutynu i standard ruty (1 mg/mL metanolu). Wywołaj płytkę w fazie komórkowej składającej się z octana etylu:kwasu mrówkowego:wody (8:1:1, v/v/v).
- Po wyschnięciu zwizualizuj płytę pod światłem UV na 254 nm.
- Oblicz współczynnik retencji (Rf) dla punktu próbki i porównaj go ze standardem.
UWAGA: Pojedyncza plama o identycznej wartości Rf (około 0,35-0,50 w tych warunkach) wskazuje na wysoką czystość, podczas gdy dodatkowe plamy wskazują na obecność zanieczyszczeń.
6. Określenie czystości rutyny przez HPLC
UWAGA: Czystość rutyny została ilościowo przeanalizowana za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC). Warunki analizy były następujące: kolumna chromatograficzna (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); roztwór wodny fazy fazy (A) oraz 0,2% kwasu octowego (B). Program elucii gradientu liniowego: 0-15 min, 20%-30% A; 15-30 min, 30%-60% A. Przepływ – 1 mL/min. Objętość wtrysku - 10 μL. Długość fali detekcji - 355 nm. Temperatura kolumny – 40 °C.
- Precyzyjnie odważ 0,1 g proszku rutynowego i przelej go do probówki wirówki o pojemności 10 mL. Dodaj 5,0 mL roztworu etanolu 60% i dokładnie wstrząśnij.
- Ustaw kąpiel wodną lub piekarnik kolumnowy w stałej temperaturze na 30 °C i ultrasonikanuj próbkę przez 30 minut.
- Wiruj próbkę w temperaturze 55 900 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Używaj supernatantu jako rozwiązania testowego do analizy HPLC.
7. Określenie rutyny przez LC-MS
UWAGA: Izolowane związki zostały zidentyfikowane za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Warunki LC odpowiadały metodzie HPLC. Spektrometria mas wykonano za pomocą jonizacji elektrosprayowej (ESI) w trybie jonów ujemnych przy napięciu kapilarnym 3,5 kV. Temperatura rozpuszczenia – 350 °C; Zakres skanowania masowego-M/Z 100-1000.
- Waż 10 mg oczyszczonej próbki rutyny i przelej ją do probówki mikrowirówki o pojemności 2 mL. Dodaj 0,6 mL deuterowanego DMSO za pomocą pipety, aż próbka całkowicie się rozpuści. Przygotuj standardowe rozwiązania rutynowe stosując tę samą procedurę.
- Analizuj obrobione próbki i standardy za pomocą spektroskopii magnetycznej rezonansu jądrowego (1H NMR).
- Przetwarzaj dane spektralne przy użyciu kompatybilnego oprogramowania15.
- Porównaj dane spektralne z literaturą lub odniesieniami w bazach danych, takimi jak NIST czy PubChem, aby to zweryfikować.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W eksperymencie fizykochemicznym rutyny roztwór zmienił kolor na czerwony po dodaniu proszku magnezu i niewielkiej ilości skoncentrowanego kwasu solnego, a następnie wstrząsaniu, co wskazywało na obecność flawonoidowego jądra macierzystego. W reakcji Molischa na granicy utworzył się fioletowy pierścień, co wskazuje na pozytywny wynik i obecność części cukrowych w strukturze molekularnej. Roztwór próbki stał się jaskrawo żółty po dodaniu 2% odczynnika chloroutleniającego do metanolu, co sugeruje obecność struktur flawonow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ekstrakcja rutyny opiera się głównie na metodzie ekstrakcji alkalicznej i kwasowej (AEAP)6, która oferuje zalety w postaci prostych wymagań sprzętowych, łatwości obsługi, wysokiej wydajności i niskich kosztów. Technika ta jest często uzupełniana przez ekstrację wspomaganą mikrofalą (MAE)7 oraz ekstrakcję wspomaganą ultrasonografią (UAE)8, które zmniejszają zużycie odczynników, przyspieszają czas ekstrakcji i poprawiają ogólną wydajność.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy niniejszego artykułu niniejszym oświadczają, że ujawnili wszelkie konflikty interesów, które mogły pojawić się podczas prowadzenia tych badań i pisania artykułu. Potwierdzamy, że nie mamy żadnych relacji finansowych, osobistych ani zawodowych, które mogłyby potencjalnie wpłynąć na naszą interpretację wyników lub wniosków przedstawionych w tej pracy. Konkretnie, nie mamy żadnych powiązań z żadnymi firmami farmaceutycznymi, instytucjami badawczymi ani innymi podmiotami, które mogłyby skorzystać z przedstawionych tutaj ustaleń. Na koniec potwierdzamy, że nasze ustalenia i wnioski opierają się wyłącznie na danych i analizach przedstawionych w niniejszym artykule i nie są pod wpływem żadnych czynników zewnętrznych. Pozostajemy zaangażowani w najwyższe standardy uczciwości akademickiej i etycznego postępowania we wszystkich naszych działaniach badawczych.
Podziękowania
Chcielibyśmy wyrazić głęboką wdzięczność Laboratorium Chemii Farmaceutycznej na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Pekinie za udostępnienie platformy eksperymentalnej. Ich wsparcie i zasoby okazały się nieocenione w prowadzeniu naszych badań i eksperymentów. Głęboko doceniamy ich zaangażowanie w doskonałość naukową oraz zaangażowanie w wspieranie rozwoju młodych badaczy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1-Naftol | MACKLIN | C16245764 | |
| Kwas octowy | MACKLIN | C12662811 | |
| Acetonitrylu | MACKLIN | C16129374 | |
| Chlorek glinu | MACKLIN | C16485922 | |
| Kwas cytrynowy | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20230306 | |
| Etanol | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20250102 | |
| Octan etylu | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Pekin Tongrentang | 10092026329782 | |
| Kwas mrówkowy | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20150402 | |
| MestReNova | Badania Mestrelab | / | |
| Metanol | innochem | C16365684 | |
| Żel krzemionkowy 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Ośmiohidratan chlorku cyrkonylu | MACKLIN | C15350627 |
Bibliografia
- Drew, A. K., et al. Chinese herbal medicine toxicology database: Monograph on Radix Sophorae Flavescentis, "ku shen". J Toxicol Clin Toxicol. 40 (2), 173-176 (2002).
- Chua, L. S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 150 (3), 805-817 (2013).
- Huang, R., et al. Evaluation of the synergetic effect of Yupingfeng San and Flos Sophorae Immaturus based on free radical scavenging capacity. Biomed Pharmacother. 128, 110265(2020).
- Li, R., Wang, C., Lei, P., Huang, L., Yuan, S. Chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 35 (5), 607-609 (2010).
- Ghorbani, A. Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin. Biomed Pharmacother. 96, 305-312 (2017).
- Calabrese, E. J., et al. Rutin, a widely consumed flavonoid, that commonly induces hormetic effects. Food Chem Toxicol. 187, 114626(2024).
- Li, R. R., Yuan, S. T., Li, Z. H., Qin, H. L. Studies on chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 30 (16), 1255-1257 (2005).
- Nikfarjam, B. A., Adineh, M., Hajiali, F., Nassiri-Asl, M. Treatment with rutin - a therapeutic strategy for neutrophil-mediated inflammatory and autoimmune diseases: Anti-inflammatory effects of rutin on neutrophils. J Pharmacopuncture. 20 (1), 52-56 (2017).
- Singh, S., et al. Rutin protects t-butyl hydroperoxide-induced oxidative impairment via modulating the Nrf2 and iNOS activity. Phytomedicine. 55, 92-104 (2019).
- Cushnie, T. P., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
- Budzynska, B., et al. Rutin as neuroprotective agent: From bench to bedside. Curr Med Chem. 26 (27), 5152-5164 (2019).
- Tan, Y. Q., et al. Pharmacological properties of total flavonoids in Scutellaria baicalensis for the treatment of cardiovascular diseases. Phytomedicine. 107, 154458(2022).
- Tobar-Delgado, E., Mejía-España, D., Osorio-Mora, O., Serna-Cock, L. Rutin: Family farming products' extraction sources, industrial applications and current trends in biological activity protection. Molecules. 28 (15), 5864(2023).
- Wang, S., et al. Effect of combined ultrasonic and enzymatic extraction technique on the quality of noni (Morinda citrifolia L.) juice. Ultrason Sonochem. 92, 106231(2023).
- Dos Santos Dantas, T., et al. Phytochemical profile analysis by LC-ESI-MS(n) and LC-HR-ESI-MS and validated HPLC method for quantification of rutin in herbal drug and products from leaves of Croton blanchetianus. Biomed Chromatogr. 37 (9), e5665(2023).
- Santiago, M., Strobel, S. Thin layer chromatography. Methods Enzymol. 533, 303-324 (2013).
- Ravber, M., et al. Hydrothermal degradation of rutin: Identification of degradation products and kinetics study. J Agric Food Chem. 64 (48), 9196-9202 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effect of pH regulation on the components and functional properties of proteins isolated from cold-pressed rapeseed meal through alkaline extraction and acid precipitation. Food Chem. 327, 126998(2020).
- Lv, H., et al. Extraction and separation of vitisin D, ampelopsin B and cis-vitisin A from Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz by alkaline extraction-acid precipitation and high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr Sci. 54 (5), 744-751 (2016).
- Yang, Y., Chu, X., Li, Y., Meng, H., Qin, L. Alkali-extracted rhamnogalactoarabinan from Chaetomorpha linum: Characterisation and anti-type 2 diabetic effect. Carbohydr Polym. 356, 123388(2025).
- Gao, S., et al. Unveiling polysaccharides of Houttuynia cordata Thunb.: Extraction, purification, structure, bioactivities, and structure-activity relationships. Phytomedicine. 138, 156436(2025).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
