Artykuł metodologiczny

Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

DOI:

10.3791/67425

⸱

25 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kompleksową metodę analizy cytometrii masowej (cytometria czasu przelotu [CyTOF]) do oceny zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (HCC). Podejście to ma na celu zapewnienie wglądu w krajobraz immunologiczny HCC, oferując głębsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i powiązanych mechanizmów immunologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiercionośnych postaci raka wątroby na całym świecie. Pomimo postępów w leczeniu, rokowanie dla pacjentów z HCC pozostaje niekorzystne ze względu na złożoną interakcję czynników genetycznych, środowiskowych i immunologicznych, które napędzają jego progresję. Zrozumienie immunologicznego krajobrazu HCC jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii, szczególnie w dziedzinie immunoterapii, która daje duże nadzieje na poprawę wyników leczenia pacjentów. To badanie wykorzystuje technologię cytometrii masowej (cytometria z wykorzystaniem czasu lotu [CyTOF]) do zbadania zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych reakcji odpornościowych u pacjentów z HCC. Poprzez analizę krwi obwodowej i próbek nowotworowych, badania mają na celu zidentyfikowanie unikalnych populacji komórek odpornościowych oraz ich stanów funkcjonalnych związanych z progresją HCC. Wyniki zapewniają kompleksowy przegląd krajobrazu immunologicznego w HCC, podkreślając potencjalne biomarkery i cele terapeutyczne. Takie podejście oferuje cenne wglądy w mechanizmy immunologiczne leżące u podstaw HCC i otwiera drogę do opracowania bardziej skutecznych immunoterapii dla tej nowotworowości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym rakiem wątroby i istotnym globalnym problemem zdrowotnym ze względu na wysoką zachorowalność i wskaźniki śmiertelności1. Według Światowej Organizacji Zdrowia, HCC zajmuje piąte miejsce pod względem najczęstszych nowotworów i jest drugą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie2. Jest szczególnie rozpowszechniony w regionach o wysokich wskaźnikach przewlekłych infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i C, takich jak Azja Wschodnia i Afryka Subsaharyjska3. Głównymi czynnikami ryzyka są wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby i zespół metaboliczny4. HCC wymaga długotrwałego leczenia, obciążając znacznym fizycznym i finansowym ciężarem, co podkreśla potrzebę skutecznej prewencji, wczesnego wykrywania i innowacyjnych strategii leczenia5.

Układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w rozwoju HCC. Wątroba jest narządem immunologicznie aktywnym z obfitością komórek odpornościowych, w tym makrofagów rezydujących w wątrobie, komórek naturalnych zabójców (NK) i komórek T, które są niezbędne do monitorowania i eliminowania nieprawidłowych komórek6. Jednak HCC może unikać immunologicznej obserwacji poprzez wydzielanie cząstek immunosupresyjnych, rekrutację komórek immunosupresyjnych i zmiany mikrośrodowiska nowotworowego7,8. Ta ucieczka odpornościowa nie tylko promuje wzrost i przerzuty nowotworowe, ale także wpływa na odpowiedź na immunoterapię9,10.

Odpowiedzi odpornościowe ogólnoustrojowe i lokalne w mikrośrodowisku nowotworowym są kluczowymi czynnikami wpływającymi na progresję raka i wyniki leczenia. Odpowiedzi odpornościowe ogólnoustrojowe obejmują krążące komórki odpornościowe, które mogą rozpoznawać i atakować oddalone komórki nowotworowe, takie jak obwodowe komórki T, komórki NK i monocyty, które mogą atakować komórki nowotworowe w całym ciele. Odpowiedzi odpornościowe lokalne koncentrują się na aktywności komórek odpornościowych w mikrośrodowisku nowotworowym, w tym na limfocytach infiltrujących guz (TIL), makrofagach związanych z guzem (TAM) i komórkach T regulacyjnych (Treg). Podczas gdy TIL często wywierają cytotoksyczne działanie przeciwko komórkom nowotworowym, TAM i Treg zwykle przyczyniają się do stworzenia środowiska immunosupresyjnego, które wspomaga wzrost guza11,12. Komórki nowotworowe i komórki stromy mogą przekształcać mikrośrodowisko guza, aby promować immunosupresję i uniknąć immunologicznej obserwacji. Interakcja między odpowiedziami odpornościowymi ogólnoustrojowymi i lokalnymi decyduje o ogólnej skuteczności odpowiedzi przeciwnowotworowej11. Zrozumienie tej interakcji może pomóc w opracowaniu bardziej efektywnych strategii immunoterapii.

Tradycyjna cytometria przepływowa i immunohistochemia, choć szeroko stosowane w badaniach immunologicznych, wykazują znaczne ograniczenia, jeśli chodzi o analizę złożonych krajobrazów odpornościowych, ze względu na niezdolność do przeprowadzenia kompleksowej, wielowymiarowej analizy. Cytometria przepływowa jest wysoce skuteczna w wykrywaniu markerów powierzchniowych i funkcjonalnych na poziomie pojedynczych komórek; jednak jej zdolność do jednoczesnej analizy wielu markerów jest ograniczona, często ograniczona przez nakładanie widmowe i praktyczne ograniczenia dotyczące liczby stosowanych fluorescencyjnych znaczników13,14. Z kolei immunohistochemia dostarcza cennych informacji na temat kontekstu tkankowego określonych markerów, ale podobnie jak cytometria przepływowa, jest ograniczona przez ograniczoną liczbę analizowanych markerów oraz związane z tym trudności z uzyskaniem solidnych, ilościowych, wielowymiarowych ocen15.

Aby skutecznie scharakteryzować złożone środowiska odpornościowe, niezbędne są techniki wielowymiarowe, takie jak cytometria masowa (cytometria w czasie przelotu [CyTOF]). Cytometria masowa to zaawansowana technologia, która wykorzystuje spektrometrię mas do analizy wielu markerów białkowych w pojedynczych komórkach. Umożliwia wieloparametrową analizę pojedynczych komórek bez problemów z nakładaniem widmowym, jak w przypadku tradycyjnej cytometrii przepływowej16. Dzięki stosowaniu przeciwciał z metalowymi znacznikami może mierzyć dziesiątki markerów jednocześnie, oferując kompleksowy i bezstronny widok fenotypów i funkcji komórek17. Na przykład Gadalla i wsp. opracowali panel CyTOF z ponad 40 parametrami do analizy krwinek obwodowych (PBMC) i tkanki nowotworowej, demonstrując jego przewagę w wielowymiarowej immunofenotypizacji18. Tradycyjna cytometria przepływowa, z ograniczonymi parametrami do wykrywania, nie była w stanie zidentyfikować tych rzadkich populacji komórek o unikalnych fenotypach. W przeciwieństwie do tego, cytometria masowa umożliwiła kompleksową ocenę stanu funkcjonalnego tych komórek, zapewniając bardziej szcz

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki pobierania próbek krwi i HCC, izolowaniu komórek jednordzeniowych z krwi obwodowej (PBMC), dysocjacji pojedynczych komórek i barwieniu zostały szczegółowo opisane w poniższym planie. Wszystkie eksperymentalne reagenty i materiały są wymienione w Tabeli Materiałów. Wszystkie eksperymenty były przeprowadzane za zgodą Komitetu Etycznego Pierwszego Szpitala Afiliacyjnego, Szkoły Medycznej Uniwersytetu Zhejiang, zapewniając, że pobieranie próbek nowotworowych nie zakłóciło diagnozy patologicznej. Pisemną zgodę świadomą uzyskaono od wszystkich ludzkich podmiotów badawczych.

1. Izolowanie PBMC

  1. Pobrać próbkę krwi z żyły pacjentów z HCC i użyć probówki wypełnionej antykoagulantem, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Próbki krwi zostały pobrane od 4 pacjentów (2 mężczyzn i 2 kobiet) w wieku 50-60 lat, ze średnim wiekiem 55 lat. Dla każdego pacjenta zebrać 10-20 ml krwi obwodowej, aby zapewnić wystarczającą objętość do późniejszego izolowania PBMC, jednocześnie minimalizując dyskomfort pacjenta.
  2. Pobrać określoną objętość krwi (np. 6 ml) i dodać równą objętość płynu do separacji limfocytów krwi obwodowej (Ficol-paque lub Lymphoprep) do 15 ml probówki do wirowania.
    UWAGA: Całkowita objętość powinna idealnie nie przekraczać 12 ml, aby pozostawić miejsce na właściwe mieszanie i zapobiec przelewaniu; maksymalna zalecana objętość dla 15 ml probówki do wirowania to 14 ml.
  3. Przechylić probówkę wirującą pod kątem 45° i powoli wleć krew wzdłuż ścianki probówki, ostrożnie układając krew powoli na powierzchni płynu do separacji limfocytów krwi obwodowej, aby uniknąć zmieszania się dwóch warstw.
    UWAGA: Można użyć pipety do powolnego wlania krwi wzdłuż ścianki probówki.
  4. Umieścić probówkę wirującą w wirówce i ustawić przyspieszenie na 8 oraz zwolnienie na 3. Wirować z prędkością 450 x g, 4 °C, przez 30 minut. Po wirowaniu, w probówce powstają 4 warstwy, od góry do dołu: warstwa osocza, warstwa PBMC (biała warstwa błony), warstwa Ficol-Paque i warstwa czerwonych krwinek i granulocytów.
  5. Za pomocą pipety ostrożnie zebrać warstwę PBMC do nowej sterylnej probówki do wirowania. Dodać 3 razy większą objętość PBS i wirować z prędkością 500 x g w 4°C przez 5 minut. Po wirowaniu, na dnie probówki powstaje pellet.
  6. Odstawić nadstan przy użyciu pipety, dodać 1 ml 2% Fetalnego Surowicy Bydlęcej-Tamponu Buforowego z Fosfatem (FBS-PBS) do resuspendacji komórek, a następnie dodać 3 ml buforu lizy czerwonych krwinek (RBC). Wirować z prędkością 500 x g w 4°C przez 5 minut.
  7. Upewnić się, że na dnie probówki nie ma czerwonych krwinek, co wskazuje, że czerwone krwinki zostały całkowicie lizysowane. Resuspendować komórki w 2% FBS-PBS i przejść bezpośrednio do następnych eksperymentów lub dodać roztwór do krioprezerwacji komórek i przechowywać w -80°C przez 2-3 miesiące.
    UWAGA: Jako ogólną zasadę, do resuspendacji użyć 0,5 ml 2% FBS-PBS na 1 x 106 komórek. Liczba komórek jest ustalana za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek po barwieniu niebieską trypanu, aby odróżnić żywe komórki od martwych. Ten stosunek pomaga zapewnić optymalne odzyskanie i żywotność komórek podczas kolejnych procedur.

2. Izolowanie komórek tkanki nowotworowej

UWAGA: Metoda izolowania komórek tkanki nowotworowej została zaadaptowana z Song i wsp.22.

  1. Po resekcji HCC, pod wskazówkami patologa, użyć sterylnego skalpela do wycięcia części tkanki nowotworowej. Blok tkanki powinien mieć około 1 cm3 wielkości. Spłukać wszelkie plamy powierzchniowe za pomocą chłodzonego wstępnie 1x PBS. Zanurzyć tkankę w probówce 15 ml zawierającej około 5 ml medium RPMI 1640 zawierającego 10% FBS. Umieścić probówkę na lodzie i przetransportować z powrotem do laboratorium w celu dalszej obróbki.
  2. Dokładnie spłukać plamy krwi i ręcznie usunąć tkankę tłuszczową i łączną za pomocą kleszczy, aby zapewnić całkowite oczyszczenie tkanki za pomocą chłodzonego wstępnie 2% FBS-PBS. Przenieść tkankę do naczynia hodowlany, zawierającego roztwór do trawienia. Zabezpieczyć tkankę nowotworową za pomocą kleszczy i pokroić ją na kawałki mniejsze niż 1 mm3 za pomocą skalpela. Przenieść roztwór do trawienia tkanki do 50 ml probówki do wirowania, dodając więcej roztworu do trawienia tkanki, aż łączna objętość wynosi około 15 ml.
  3. Umieścić probówkę zawierającą mieszankę do trawienia tkanki w szekerze. Przechylić lub spłaszczyć ją i zabezpieczyć do trawienia z prędkością 150 rpm i 37 °C przez 1 godzinę. Przefiltrować

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyjaśnić cechy immunologiczne związane z HCC, przeprowadzono kompleksową analizę populacji komórek immunologicznych. Zebrano powiązane komórki PBMC oraz próbki tkanki HCC od 4 pacjentów z HCC. Profilowanie cytometrią masową zostało przeprowadzone, aby zbadać populacje komórek immunologicznych na poziomie pojedynczej komórki proteomicznej, stosując dwa panele przeciwciał zarówno dla komórek PBMC, jak i próbek tkanki HCC.

Po k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to wykorzystuje technologię cytometrii masowej w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy zarówno układowych, jak i lokalnych reakcji odpornościowych w HCC. Zastosowanie cytometrii masowej w tym kontekście umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu markerów na poziomie pojedynczych komórek, oferując szczegółową immunofenotypową charakterystykę, która jest kluczowa dla zrozumienia złożonego układu odpornościowego HCC. Cytometria masowa zrewolucjonizowała badania immunologiczne, umożliwiając wielowymiarową analizę poj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło było wspierane przez Narodowy Program Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (grant 2019YFA0803000 dla J.S.), Fundusz Doskonałej Młodzieży Ze Scientifique Zhejiang (grant R22H1610037 dla J.S.), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant 82173078 dla J.S.), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (grant 2022C03037 dla J.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD74

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mass CytometryHepatocellular CarcinomaImmune ProfilingCyTOF AnalysisPeripheral BloodTumor Immune ResponseSingle Cell AnalysisImmune Cell SubsetsBiomarker DiscoverySPADE Clustering

Powiązane artykuły