Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip

Podsumowanie

Technika iChip wykorzystuje niedrogie i proste urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa tempo odkrywania nowych mikroorganizmów z gleby. Nowe mikroorganizmy mogą być wykorzystywane m.in. do dalszych badań nad mikrobiomem glebowym lub odkrywaniem produktów naturalnych.

Streszczenie

Technika izolacji iChip wykorzystuje urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa możliwość uprawy wcześniej nienadających się do hodowli mikroorganizmów. Mikroorganizmy są ważnym źródłem nowych substancji chemicznych i potencjalnie bioaktywnych cząsteczek. Jednak tylko 1% mikroorganizmów środowiskowych można hodować przy użyciu konwencjonalnych metod laboratoryjnych. Wraz ze wzrostem oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe znalezienie nowych leków do zwalczania infekcji i chorób ma ogromne znaczenie, a kluczową metodą poszukiwania nowych cząsteczek jest odkrywanie nowych mikroorganizmów. Poprzez inkubację kolonii mikroorganizmów glebowych w studzienkach 96-dołkowej płytki, uszczelnionych półprzepuszczalną membraną i inkubowanych na powierzchni gleby, mikroorganizmy mają kontakt z wodą i czynnikami wzrostu z gleby, co pozwala na izolację nowych drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych. Po okresie udomowienia w iChipie, mikroorganizmy mogą być potencjalnie przenoszone na konwencjonalne podłoża i wykorzystywane do dalszych badań. To urządzenie jest cenne dla odkrywania bioaktywnych cząsteczek i badań nad mikrobiomem glebowym i było wcześniej wykorzystywane w obu zastosowaniach.

Wprowadzenie

Bakterie środowiskowe są bogatym źródłem naturalnych produktów (NPs)¹. Metabolity te nie są niezbędne do przetrwania mikroorganizmów, ale zamiast tego są wytwarzane w celu ułatwienia ich kolonizacji poprzez konkurencję z innymi mikroorganizmami w ich otoczeniu². Ewolucja doprowadziła do dopracowania struktur chemicznych i aktywności nanocząsteczek, dzięki czemu stają się one skutecznymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Takim przykładem jest daptomycyna, antybiotyk zatwierdzony przez FDA w 2003 roku³. W ostatnich latach oporność drobnoustrojów wzrosła pod względem występowania i nasilenia, a nowe leki, takie jak daptomycyna, są ostatnim rzutem w leczeniu infekcji, które rozwinęły oporność na starsze antybiotyki⁴. Opracowywanie nowych antybiotyków i innych leków jest niezbędne do utrzymania uleczalności powszechnych infekcji i chorób.

Chociaż NP często stanowią dobre tropy leków, przemysł farmaceutyczny zwrócił się ku syntetycznym metodom odkrywania leków po złotej erze antybiotyków w latach 1950-tych i 1960-tych⁵. W latach siedemdziesiątych XX wieku te same mikroorganizmy i metabolity przeciwdrobnoustrojowe były nadal wielokrotnie izolowane, przy czym odkrywano coraz mniej nowych kandydatów na leki^1,6. Mikrobiom glebowy charakteryzuje się dużą różnorodnością mikrobiologiczną, ale w konwencjonalnych warunkach laboratoryjnych można wyizolować tylko niewielką liczbę mikroorganizmów. Zdecydowana większość mikroorganizmów glebowych wykrytych przez genomikę nie jest obserwowana podczas hodowli przy użyciu konwencjonalnych metod hodowli, co prowadzi do ukucia problemu "anomalii wielkiej liczby płyt"⁷. Te nienadające się do hodowli mikroorganizmy zostały nazwane mikrobiologicznymi ciemną materią, ponieważ wiadomo, że istnieją, ale nie można ich badać in vitro, dopóki nie będzie można ich wyizolować jako czystych kultur. Te nienadające się do hodowli mikroorganizmy mogą prawdopodobnie wytworzyć wiele kandydatów na leki, co ma ogromne znaczenie w dobie oporności drobnoustrojów.

Technika iChip to jedna z metod, która może być wykorzystana do zwiększenia odzysku nowych mikroorganizmów ze środowiska^8,9. Technologia ta pomaga w symulowaniu naturalnego środowiska bakterii podczas inkubacji, zwiększając w ten sposób zdolność do hodowli mikroorganizmów, które w przeciwnym razie nie mogłyby przetrwać w konwencjonalnych warunkach laboratoryjnych¹⁰. Zmodyfikowane układy iChip zostały już opracowane i wykorzystane do izolowania mikroorganizmów z wielu różnych źródeł, takich jak gleba, osady, środowisko morskie i jelita zwierząt^{11,12,13,14,15,16}. Być może najbardziej znaczącym przypadkiem zastosowania tej technologii była firma NovoBiotic Pharmaceuticals, gdzie odkryto nową bakterię, Eleftheria terrae¹⁷. Stwierdzono, że mikroorganizm ten wytwarza tejksobaktynę, antybiotyk nowej klasy, który hamuje kilka opornych gatunków bakterii istotnych dla zdrowia ludzkiego bez wykrytego rozwoju oporności^5,18. Było to znaczące odkrycie, ponieważ tejksobaktyna jest pierwszą nową klasą antybiotyków odkrytą od dziesięcioleci i jest znakiem, że ta technika jest obiecującą drogą do odkrycia nowych leków i pokonania anomalii wielkiej liczby płytek¹⁹. W niniejszym artykule przedstawiono zmodyfikowany iChip oparty na poprzedniej publikacji Berdy'ego i wsp., który został zoptymalizowany pod kątem łatwości użytkowania i zapobiegania zanieczyszczeniom⁹.

Protokół

1. Przygotowanie i sterylizacja podłoża

1. Przygotuj i wysterylizuj pożywkę z minimalnymi solami bursztynianowymi (SMS), która składa się z 0,1 g skrobi ziemniaczanej, 1 g kazaaminokwasów, 0,125 g trawienia kazeiny i 15 g agaru bakteriologicznego lub technicznego w 1 l wody.
2. Autoklaw sterylizuje pożywkę i 100 ml wody molekularnej w 20-minutowym cyklu cieczy w temperaturze 121 °C.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie inne przedmioty, które będą miały kontakt z mieszaniną komórek agarowych, są zakupione w stanie sterylnym, w tym końcówki do pipet i probówki wirówkowe, w przeciwnym razie należy je również sterylizować w autoklawie.

2. Zmodyfikowana konstrukcja iChip

1. Usunąć dna studzienek z czterech 96-dołkowych płytek za pomocą narzędzia do dziurkowania agaru o średnicy 5 mm.
2. Pokrój membrany poliwęglanowe o grubości 0,05 μm na prostokąty o wymiarach 7,6 cm x 11 cm lub równe wymiarom dna płytki 96-dołkowej.
3. Za pomocą szczeliwa silikonowego przyklej membrany poliwęglanowe 0,05 μm do dna płytek 96-dołkowych, upewniając się, że klej uszczelnia studzienki, ale nie zakrywa całkowicie otworów studzienek. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 24 godziny lub postępuj zgodnie z instrukcją na kleju.
   UWAGA: Szczeliwo musi być wodoodporne, nietoksyczne i w 100% silikonowe. Większość uszczelniaczy akwariowych będzie działać dobrze.

3. Przygotowanie zawiesin komórkowych

1. Oznacz cztery 15 ml probówek wirówkowych A-D i cztery 50 ml probówek wirówkowych E-H i dodaj do każdej z nich 4,5 ml sterylnej wody.
2. Odmierz 1 g gleby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodaj 10 ml sterylnej wody i wiruj przez 10 minut.
3. Pozostaw zawiesinę gleby na 10 minut.
4. Odmierzyć pipetą 0,5 ml supernatantu zawierającego komórki z gleby do probówki A i dokładnie wymieszać.
5. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórek z probówki A do probówki B i dokładnie wymieszać. Przenieść 0,5 ml roztworu B do probówki C i dokładnie wymieszać. Powtórz to dla wszystkich pozostałych probówek wirówkowych, wykonując serię 10-krotnych rozcieńczeń w ośmiu probówkach wirówkowych.
6. Usunąć 0,5 ml z probówki H, aby uzyskać równą objętość we wszystkich probówkach.
   UWAGA: Stężenia te są zoptymalizowane dla lokalnych gleb. Próbując wykonać tę procedurę po raz pierwszy, należy przeprowadzić większy zakres rozcieńczeń, aby znaleźć odpowiednie stężenie próbki.

4. Zmodyfikowana inokulacja iChip

1. Całkowicie zanurz iChips w 95% etanolu na co najmniej 15 minut.
2. Wyjmij płytki z etanolu i połóż je na sterylnym ręczniku papierowym. Pozwalając etanolowi odparować, włącz sterylizator UV w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut, aby je dalej wysterylizować.
3. Odpipetować 360 μl sterylnego podłoża SMS do pierwszej kolumny płytki, aby działało jako studzienki kontrolne.
4. Dodać 45 ml SMS schłodzonego do temperatury 50 °C do zawiesiny komórek w probówce E i dokładnie wymieszać, aby połączyć zawiesinę komórek i agar.
5. Odpipetować 360 μl mieszaniny agar-komórka z kroku 4.4 do wszystkich pozostałych studzienek płytki 96-dołkowej.
   UWAGA: Zalecana jest pipeta wielokanałowa, ponieważ agar szybko krzepnie. Nie zaleca się ponownego podgrzewania mieszaniny komórek agarowych po zmieszaniu ze względu na ryzyko zabicia mikroorganizmów.
6. Po ustawieniu podłoża uszczelnij górną część płytek pokrywą płytki PCR.
7. Powtórz kroki od 3.3 do 3.6 z probówkami F-H, aby napełnić łącznie cztery chipy iChip z dziesięciokrotnymi różnicami stężeń.
   UWAGA: W razie potrzeby media można podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund z poluzowaną nakrętką lub przechowywać w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 60 °C między płytkami, aby zapewnić, że pozostaną stopione dla każdej z nich.

5. Inkubacja

1. Umieść płytki w pudełku zawierającym około jednego cala gleby użytej w kroku 3.2, membraną do dołu i umieść pokrywę.
2. Inkubować płytki w przykrytym pojemniku, w ciemnym miejscu o temperaturze 25 °C.
   UWAGA: Po tygodniu sprawdź zawartość zmodyfikowanych iChipsów, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia podczas instalacji. Na zanieczyszczenie wskazuje przerost jednego lub kilku mikroorganizmów we wszystkich studzienkach płytki.
3. Po 6 tygodniach sprawdź iChips. Do izolacji kolonii należy używać płytek zawierających wzrost w mniej niż 25% studzienek.

6. Izolacja kolonii

1. Opłucz zmodyfikowane iChipsy 3x sterylną wodą, aby usunąć wszystkie cząstki brudu.
2. Przetrzyj górną i boki płytki 95% etanolem, omijając stronę z membraną półprzepuszczalną.
3. Za pomocą sterylnego ostrza przeciąć pokrywę płytki wokół jednej studzienki zawierającej kolonię.
4. Za pomocą sterylnego narzędzia do smug nakłuć kolonię i smugi na agarze SMS na płytkach 100 x 15 mm metodą czterokwadrantową.
5. Powtórz te czynności dla wszystkich innych kolonii w iChips, które rosną po jednej kolonii na studzienkę.
   UWAGA: W przypadku kolonii, które są niewielkie, płytkę można umieścić z powrotem na glebie i inkubować, aż będą wystarczająco duże, aby można było przeprowadzić subkulturę, o ile pokrywa płytki nie została usunięta wokół studni.
6. Inkubować płytki SMS w temperaturze 25 °C i monitorować wzrost.
7. Zbadaj kolonie, aby upewnić się, że kultury aksoniczne zostały wyizolowane.

7. Identyfikacja mikroorganizmów

1. Sekwencjonowanie genomów odzyskanych izolatów²⁰.
2. Oceń genomy za pomocą JSpeciesWS lub innej platformy identyfikacji opartej na genomie, aby określić stopień podobieństwa każdego izolatu do znanych mikroorganizmów w GenomesDB.
3. Kategoryzować izolaty poniżej przyjętych przez społeczność progów identyfikacji gatunków jako przypuszczalnie nowe.

Wyniki

Wizualny przegląd protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Udany zmodyfikowany eksperyment iChip skutkuje tym, że co najmniej jedna płytka zawiera wzrost w mniej niż 25% studzienek, przy czym w studzienkach kontrolnych nie występuje żaden wzrost. Ta liczba studzienek ze wzrostem na ogół zapewnia, że pojedyncze kolonie są izolowane w studniach. Dodatkowo liczba kolonii, czyli liczba studzienek zawierających kolonie, powinna zmniejszać się dziesięciokrotnie z każdą kolejną płytką przygotowaną z serii rozcieńczeń. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2. gdzie płytki 7 i 8 są udanymi iChips, ponieważ zawierają wzrost w mniej niż 25% studzienek, a odsetek studzienek zawierających kolonie zmniejsza się z każdą płytką, jak pokazano w tabeli 1. Jeśli wszystkie płytki w badaniu zawierają więcej niż jedną kolonię na studzienkę lub nie ma żadnych kolonii w żadnym dołku, stanowi to wynik negatywny.

Rysunek 1: Schemat użycia zmodyfikowanego iChipa do hodowli mikroorganizmów glebowych. (A,B) Budowa płyty (Krok 2). (C) Przygotowanie inokulum (Etap 3). (D,E) Konfiguracja iChip (krok 4). (f) Inkubacja iChip (krok 5). (G-I) Przeniesienie izolatów na konwencjonalne podłoża (krok 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział:

Ichip	Zagęszczenie gleby w zawiesinie agaru	Studnie z koloniami	Jednostki tworzące kolonie
E	5,0 x 10-6 g/ml	cały	Zbyt wiele, by je zliczyć
Z	5,0 x 10-7 g/ml	cały	Zbyt wiele, by je zliczyć
Z	5,0 x 10-8 g/ml	22 Rozdział 22	22 Rozdział 22
H	5,0 x 10-9 g/ml	6	6

Tabela 1: Reprezentatywne dane z udanego eksperymentu iChip, w którym liczba studzienek zawierających kolonie zmniejsza się z każdym rozcieńczeniem w serii.

Rysunek 2: Przykładowe wyniki dwóch udanych zmodyfikowanych iChipsów. Chipy iChip pochodziły z tego samego eksperymentu, w którym (A) płytka przygotowana z mieszaniny komórka-agar G zawiera 22 kolonie, oraz (B) płytka przygotowana z mieszaniny komórka-agar H zawiera sześć kolonii, co jest zgodne z 10-krotną różnicą rozcieńczeń między mieszaninami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Można wizualizować kolonie gołym okiem lub mikroskopią, jak pokazano w Rysunek 3A-G. Kolonie mogą rosnąć na powierzchni agaru, jak widać na Rysunek 3B lub osadzone w agarze, takie jak kolonia w Rysunek 3F. Mogą wystąpić przypadki, w których w tym samym dołku znajdują się dwie kolonie w udanym zmodyfikowanym chipie iChip, na przykład w Rysunek 3G. W niektórych przypadkach kolonie są na tyle daleko od siebie, że można je przekłuć igłą osobno i poddać subkulturze; jednak jest mało prawdopodobne, aby te z klasy Rysunek 3G mogły być łatwo hodowane jako mikroorganizmy akseniczne. Przykłady kolonii przeniesionych z iChip na konwencjonalne nośniki SMS są pokazane na Rysunek 4.

Rysunek 3: Reprezentatywny mikroskopowy widok kolonii rosnących w iChipie po 6 tygodniach inkubacji. (A-F) Obserwuje się pojedyncze kolonie, z których powinny być hodowane, a w (G) w bliskim sąsiedztwie obserwuje się dwie kolonie, które są trudne do uzyskania jako kultury aksoniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywny wynik bakterii wyizolowanej ze zmodyfikowanego iChipa rosnącego na płytce agarowej SMS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zdolność do izolowania kolonii z zmodyfikowanego iChipa na konwencjonalnych płytkach agarowych również decyduje o powodzeniu eksperymentu. Nie wszystkie rodziny rosnące w zmodyfikowanym układzie iChip przetrwają przeniesienie na konwencjonalne płytki. W iChip kolonie są narażone na działanie czynników wzrostu i składników odżywczych gleby, co zwiększa ich zdolność do uprawy. W przypadku niektórych mikroorganizmów okres udomowienia nie wystarczy, aby można je było hodować w konwencjonalnych warunkach. Tempo odzyskiwania kolonii z iChip do płytek będzie się różnić w zależności od eksperymentu, ale niektóre powinny rosnąć na płytkach, ponieważ ta metoda pozwoli również na hodowlę łatwych do hodowli mikroorganizmów. Na przykład zmodyfikowane iChipsy w Rysunek 2 zawierały w sumie 28 kolonii, a liczba kolonii, które wyrosły na płytkach agarowych po subkulturze, wynosiła 16, podczas gdy 12 nie przetrwało transferu. Izolaty mogą być zidentyfikowane i wykorzystane do dalszych badań po wyhodowaniu na pełnowymiarowych płytkach agarowych, jak pokazano na Rysunek 4.

Udany eksperyment z modyfikowanym iChipem powinien doprowadzić do wyizolowania mikroorganizmów, które różnią się od znanych mikroorganizmów na poziomie gatunku. Stopień podobieństwa każdego izolatu do znanych mikroorganizmów uzyskuje się, porównując wyizolowane DNA z genomami znanych mikroorganizmów. Wyniki tetra Z mikroorganizmów najbliżej spokrewnionych z każdym izolatem opisują procentowe podobieństwo. Rysunek 5 pokazuje, że z dwunastu wyizolowanych bakterii, cztery były nowymi gatunkami lub wyższymi, dwie były prawdopodobnie nowymi szczepami, a sześć było znanymi mikroorganizmami. Odtworzenie kilku nowych gatunków lub szczepów jest zgodne z wcześniej opublikowanymi eksperymentami iChip, co wskazuje, że ta zmodyfikowana konstrukcja iChip nie hamuje wzrostu odzysku nowych gatunków¹¹.

Rysunek 5: Poziom klasyfikacji taksonomicznej izolatów odzyskanych z eksperymentu iChip. Procentowe podobieństwo określono na podstawie wyników tetra Z, które opisują podobieństwo izolatów do znanych bakterii, gdzie podobieństwo >99,9% wskazuje na zgodność gatunkową, 98,9%-99,9% podobieństwo wskazuje na możliwy nowy gatunek, a <98,9% podobieństwo wskazuje na nowy gatunek lub więcej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Liczne metody, takie jak eksploracja genomu i badanie cichych szlaków biosyntezy, ułatwiły odkrycie nowych bioaktywnych substancji chemicznych w ostatnich latach^21,22. Jednak nanocząsteczki odkryte za pomocą takich metod często wykazują duże podobieństwo strukturalne do znanych związków. Uzyskanie dostępu do wcześniej niehodowanych mikroorganizmów odblokuje większą różnorodność chemiczną i nanocząsteczki dzięki nowym sposobom działania, które mogą lepiej pomóc w zwalczaniu oporności drobnoustrojów. Wykazano, że technika izolacji iChip zwiększa możliwości hodowli nowych mikroorganizmów, które można wykorzystać do budowy bibliotek mikroorganizmów w celu odkrycia nowych nanocząsteczek.

Najwcześniejsza koncepcja iChip została opublikowana w 2002 roku, która składała się z pojedynczych metalowych pierścieni zawierających mieszaninę komórek agarowych uszczelnionych półprzepuszczalnymi membranami i inkubowanych in situ²³. W 2010 r. został on zmodyfikowany, aby zawierał mały chip z wieloma dołkami¹¹, a następnie opracowano niedrogi iChip zbudowany z powszechnych materiałów laboratoryjnych we wpływowej publikacji Nature Protocols w 2017 r.⁹. W tej publikacji wprowadzono kilka modyfikacji do protokołu Nature, aby poprawić jego praktyczność i łatwość użycia. Protokół Nature polega na przyklejeniu półprzepuszczalnej membrany po obu stronach chipa w porównaniu z tą metodą, która wykorzystuje samoprzylepną osłonę płyty z jednej strony. Mogą wystąpić problemy podczas używania kleju silikonowego do mocowania membrany po załadowaniu iChip. Według naszej wiedzy wszystkie nietoksyczne kleje silikonowe wydzielają kwas octowy podczas wiązania, co może wpływać na żywotność komórek²⁴. Protokół przedstawiony w tym filmie również znacznie zmniejsza ilość czynności wymaganych po inokulacji poprzez użycie pokrywy płytki PCR do uszczelnienia napełnionej płytki, co dodatkowo zapewnia sterylność i skraca czas przygotowania. Opierając się na identyfikacji wielu nowych izolatów w tym eksperymencie, użycie tylko jednej półprzepuszczalnej membrany hamuje wzrost wskaźników odkrywania nowych organizmów, który odnotowano w przypadku iChipów zbudowanych z dwóch półprzepuszczalnych membran. Konieczne byłyby jednak dalsze eksperymenty z większą próbą, aby określić ilościowo wpływ.

Inną modyfikacją metody jest subkulturowanie tylko ze zmodyfikowanych iChipsów, które zawierają wzrost w mniej niż 25% odwiertów. Jeśli kolonie rosną w większości studzienek płytki, prawdopodobnie istnieją studnie, które zawierają wiele mikroorganizmów, nawet jeśli nie są łatwo widoczne. Podczas opracowywania metody stwierdzono, że w dużej mierze niemożliwe jest uzyskanie kultur aksenicznych podczas hodowli ze studni zawierających więcej niż jedną kolonię. Izolacja kultur nieaksenicznych stwarza poważne problemy na dalszych etapach łańcucha dostaw w zakresie oznaczania bioaktywności i identyfikacji. Dlatego, dla uproszczenia, zaleca się subhodowlę tylko zmodyfikowanych iChipsów z koloniami rosnącymi w części studni.

Najważniejszym problemem, który może pojawić się w przypadku metod iChip, jest zanieczyszczenie studni lub całych iChipów innymi mikroorganizmami. Na zanieczyszczenie wskazują kolonie rosnące w studzienkach kontrolnych lub ten sam mikroorganizm rosnący w kilku studzienkach lub na całym obszarze zmodyfikowanego iChipa. Źródłem zanieczyszczenia może być nieodpowiednia sterylizacja materiałów podczas ustawiania lub niewłaściwa technika aseptyczna. W takich przypadkach należy upewnić się, że wszystkie użyte materiały są sterylizowane w autoklawie lub etanolem, jak wskazano w metodzie, i upewnić się, że nie dochodzi do kontaktu między żadnymi niesterylnymi przedmiotami a zmodyfikowanym iChipem innym niż mieszanina komórek agarowych. Jeśli zaobserwuje się przerost pojedynczego mikroorganizmu na dnie lub na górze wielu zmodyfikowanych studzienek iChip, najprawdopodobniej jest to wynik niepełnego uszczelnienia między studzienkami a membraną. W takim przypadku należy upewnić się, że użyty klej jest w 100% silikonem, który nie ulega degradacji w etanolu, oraz upewnić się, że półprzepuszczalna membrana i pokrywa płytki PCR są całkowicie uszczelnione wokół każdej studzienki podczas budowy.

Seria rozcieńczeń stosowana w obecnym protokole powinna zapewniać odpowiednie rozcieńczenie dla większości rodzajów gleb o okresie przechowywania krótszym niż jeden tydzień, ponieważ obejmuje tysiąckrotny zakres rozcieńczeń. Mogą jednak występować znaczne różnice w liczbie mikroorganizmów w zależności od rodzaju gleby. Jeśli studzienki kontrolne nie zawierają wzrostu, ale w każdym dołku ze wszystkich czterech zmodyfikowanych iChipów rośnie wiele kolonii, użyte stężenia komórek nie były wystarczająco niskie. Seria rozcieńczeń powinna zostać zmodyfikowana w celu osiągnięcia niższych stężeń komórek w mieszaninach komórek i pożywek stosowanych do tworzenia zmodyfikowanych iChips. Podobnie, jeśli nie obserwuje się wzrostu na żadnej z tych płytek, należy zwiększyć stężenia stosowane w mieszaninach pożywki komórkowej. Alternatywnie możliwe jest, że temperatura użytych pożywek była zbyt wysoka, aby mikroorganizmy mogły przetrwać. W takim przypadku pożywka powinna ostygnąć tak bardzo, jak to możliwe, bez krzepnięcia przed dodaniem do rozcieńczonej zawiesiny komórek.

Technologia ta stanowi ważny krok naprzód w kierunku przezwyciężenia anomalii związanej z liczeniem płyt. Jest on jednak nadal ograniczony przez nieprzydatność konwencjonalnych technik hodowli, na co wskazuje liczba mikroorganizmów, które nie przeżywają przeniesienia ze zmodyfikowanego iChipa na konwencjonalne płytki agarowe. Wcześniejsze publikacje informowały, że wielokrotne rundy subkultur i inkubacji w iChips dodatkowo zwiększają zdolność do uprawy mikroorganizmów. Wydłużony czas udomowienia i narażenie na czynniki wzrostu gleby podczas korzystania z agary w iChip zwiększa szanse na wzrost kolonii na samym agarze . Nie stwierdzono jednak, aby podejście to dawało większe prawdopodobieństwo wystąpienia nowych mikroorganizmów niż pojedyncza inkubacja iChip^25,26.

Wiele innych taktyk jest badanych i modyfikowanych w celu zwiększenia możliwości hodowli nowych mikroorganizmów. Na przykład zaproponowano wykonanie całego urządzenia iChip z materiału półprzepuszczalnego, aby ułatwić kokulturę mikroorganizmów w sąsiednich studniach²⁷. Biorąc to pod uwagę, zaletą konstrukcji przedstawionej w tej publikacji jest jej niski koszt, przy czym koszt zbudowania jednej płytki wynosi około 12 USD (4 USD za płytkę 96-dołkową, 8 USD za membranę, 2 USD za okładkę PCR). Co więcej, jego prosta konstrukcja sprawia, że jest to nieskomplikowane narzędzie, gdy jest używane zgodnie z opisem i zapewnia wiele możliwości personalizacji. Chociaż protokół ten wykorzystuje pożywkę selektywną dla bakterii, zestaw eksperymentalny można teoretycznie dostroić tak, aby był ukierunkowany na pożądaną populację drobnoustrojów poprzez modyfikację zastosowanej pożywki, na przykład przy użyciu pożywki tłumiącej bakterie do zwalczania grzybów lub agaru o niskiej zawartości składników odżywczych dla mikroorganizmów zarodnikujących.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1-20 i mikro; L końcówki do pipet	VWR	76322-158	Opakowanie 768
probówek do PCR 0,2 ml	ThermoFisher Scientific	AB0337	Opakowanie 1000
pipet jednokanałowych 0,5-5 ml	VWR	CA11020-004
Butelka szklana 1 L	Millipore Sigma	CLS13951L	Musi być autoklawowalny.
Płytki Petriego 100 x 15 mm	VWR	25384-342	Etui 500
100% Uszczelniacz silikonowy	Marineland	31003
1000 µ L Wielokanałowe końcówki do pipet	ThermoFisher Scientific 9401113		Etui 960
100-1000 µ L końcówki do pipet	VWR	76322-164	Opakowanie 768
100-1000 µ Pipeta jednokanałowa L	VWR	76169-240
100-1200 µ L pipeta wielokanałowa	ThermoFisher Scientific	46300800	Musi mieć 360 i mikro; L pojemność objętościowa.
1-10 &mikro; Pipeta jednokanałowa L	VWR	76169-232
Końcówki do pipet 1-5 ml	VWR	CA11020-008	Zestaw 500
sterylnych probówek wirówkowych 15 ml	VWR	CA21008-918	Opakowanie 500
16s startera rRNA-F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) – 10mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-06	10 µ g
16s starter rRNA-R (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) – 10mM	Zintegrowane technologie DNA	51-01-19-07	10 &mikro; g
4 mm świdr korkowy	VWR	470121-860
50 ml sterylne probówki wirówkowe	VWR	CA21008-940	Opakowanie 500
95% etanolu	Thermo Fisher Scientific	A412-500	500 ml
96-dołkowa płytka	VWR	10062-900	Skrzynka 100
autoklaw	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L, 115 VAC
Agar bakteriologiczny	ThermoFisher Scientific	443570010	Pojemnik 1 kg
	Thomas Scientific	1216H91	5 pojemników w opakowaniu
Casaminokwasy	ThermoFisher Scientific	223120	500 g
Digest kazeinowy	ThermoFisher Scientific	211610	500 g
Agaroza klasy elektrofluorezy	Thermo Fisher Scientific	J66501.30	250 g
System obrazowania iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44115
Okap z przepływem laminarnym	CleanTech	1000-6-A
Minion Nanopore Sequencer	Oxford Nanopore Technologies	MinIon Mk1C
NanoDrop Jeden/Jedna mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis	ThermoFisher	Scientific ND-ONE-W
Woda wolna od nukleaz	Thermo Fisher Scientific	AM9937	10 x 50 ml
Zestaw DNA Nucleobond HMW	Takara	740160.2
Ręcznik papierowy	VWR	89402-824
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	F566L	500 Reactions
Skrobia ziemniaczana	ThermoFisher Scientific	419690025	2,5 kg
Oprogramowanie QIAGEN CLC Genomics Workbench lub podobne	Zestaw Qiagen
Rapid Barcoding 24 Oxford	Nanopore Technologies	SQK-RBK114.24
Termocykler SimpliAmp	Applied Biosystems	A24811
Sterylne pętle do inokulacji z igłą	VVWR	76534-512	Etui na 1000
Sterylne ostrze chirurgiczne	VWR	76457-444
SYBR Bezpieczny lub podobny	ThermoFisher Scientific	S33101
UltraCzysta Agaroza	ThermoFisher Scientific	16500-500
Vortex	VWR	76549-928	Musi pomieścić probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml Stereoskopowy
mikroskop trójokularowy VWR z zoomem	VWR 89404-476
Whatman  Nuklepore  Membrany trawione	Millipore Sigma	WHA113502	dł. x szer. 8  w. x 10  in., wielkość porów 0,03  μ mln