Artykuł metodologiczny

Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67426

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1Charlottetown Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada, 2Department of Chemistry, University of Prince Edward Island

W tym artykule

Podsumowanie

Technika iChip wykorzystuje niedrogie i proste urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa tempo odkrywania nowych mikroorganizmów z gleby. Nowe mikroorganizmy mogą być wykorzystywane m.in. do dalszych badań nad mikrobiomem glebowym lub odkrywaniem produktów naturalnych.

Streszczenie

Technika izolacji iChip wykorzystuje urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa możliwość uprawy wcześniej nienadających się do hodowli mikroorganizmów. Mikroorganizmy są ważnym źródłem nowych substancji chemicznych i potencjalnie bioaktywnych cząsteczek. Jednak tylko 1% mikroorganizmów środowiskowych można hodować przy użyciu konwencjonalnych metod laboratoryjnych. Wraz ze wzrostem oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe znalezienie nowych leków do zwalczania infekcji i chorób ma ogromne znaczenie, a kluczową metodą poszukiwania nowych cząsteczek jest odkrywanie nowych mikroorganizmów. Poprzez inkubację kolonii mikroorganizmów glebowych w studzienkach 96-dołkowej płytki, uszczelnionych półprzepuszczalną membraną i inkubowanych na powierzchni gleby, mikroorganizmy mają kontakt z wodą i czynnikami wzrostu z gleby, co pozwala na izolację nowych drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych. Po okresie udomowienia w iChipie, mikroorganizmy mogą być potencjalnie przenoszone na konwencjonalne podłoża i wykorzystywane do dalszych badań. To urządzenie jest cenne dla odkrywania bioaktywnych cząsteczek i badań nad mikrobiomem glebowym i było wcześniej wykorzystywane w obu zastosowaniach.

Wprowadzenie

Bakterie środowiskowe są bogatym źródłem naturalnych produktów (NPs)1. Metabolity te nie są niezbędne do przetrwania mikroorganizmów, ale zamiast tego są wytwarzane w celu ułatwienia ich kolonizacji poprzez konkurencję z innymi mikroorganizmami w ich otoczeniu2. Ewolucja doprowadziła do dopracowania struktur chemicznych i aktywności nanocząsteczek, dzięki czemu stają się one skutecznymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Takim przykładem jest daptomycyna, antybiotyk zatwierdzony przez FDA w 2003 roku3. W ostatnich latach oporność drobnoustrojów wzrosła pod względem występowania i nasilenia, a nowe leki, takie jak daptomycyna, są ostatnim rzutem w leczeniu infekcji, które rozwinęły oporność na starsze antybiotyki4. Opracowywanie nowych antybiotyków i innych leków jest niezbędne do utrzymania uleczalności powszechnych infekcji i chorób.

Chociaż NP często stanowią dobre tropy leków, przemysł farmaceutyczny zwrócił się ku syntetycznym metodom odkrywania leków po złotej erze antybiotyków w latach 1950-tych i 1960-tych5. W latach siedemdziesiątych XX wieku te same mikroorganizmy i metabolity przeciwdrobnoustrojowe były nadal wielokrotnie izolowane, przy czym odkrywano coraz mniej nowych kandydatów na leki1,6. Mikrobiom glebowy charakteryzuje się dużą różnorodnością mikrobiologiczną, ale w konwencjonalnych warunkach laboratoryjnych można wyizolować tylko niewielką liczbę mikroorganizmów. Zdecydowana większość mikroorganizmów glebowych wykrytych przez genomikę nie jest obserwowana podczas hodowli przy użyciu konwencjonalnych metod hodowli, co prowadzi do ukucia problemu "anomalii wielkiej liczby płyt"7. Te nienadające się do hodowli mikroorganizmy zostały nazwane mikrobiologicznymi ciemną materią, ponieważ wiadomo, że istnieją, ale nie można ich badać in vitro, dopóki nie będzie można ich wyizolować jako czystych kultur. Te nienadające się do hodowli mikroorganizmy mogą prawdopodobnie wytworzyć wiele kandydatów na leki, co ma ogromne znaczenie w dobie oporności drobnoustrojów.

Technika iChip to jedna z metod, która może być wykorzystana do zwiększenia odzysku nowych mikroorganizmów ze środowiska8,9. Technologia ta pomaga w symulowaniu naturalnego środowiska bakterii podczas inkubacji, zwiększając w ten sposób zdolność do hodowli mikroorganizmów, które w przeciwnym razie nie mogłyby przetrwać w konwencjonalnych warunkach laboratoryjnych10. Zmodyfikowane układy iChip zostały już opracowane i wykorzystane do izolowania mikroorganizmów z wielu różnych źródeł, takich jak gleba, osady, środowisko morskie i jelita zwierząt11,12,13,14,15,16. Być może najbardziej znaczącym przypadkiem zastosowania tej technologii była firma NovoBiotic Pharmaceuticals, gdzie odkryto nową bakterię, Eleftheria terrae17. Stwierdzono, że mikroorganizm ten wytwarza tejksobaktynę, antybiotyk nowej klasy, który hamuje kilka opornych gatunków bakterii istotnych dla zdrowia ludzkiego bez wykrytego rozwoju oporności5,18. Było to znaczące odkrycie, ponieważ tejksobaktyna jest pierwszą nową klasą antybiotyków odkrytą od dziesięcioleci i jest znakiem, że ta technika jest obiecującą drogą do odkrycia nowych leków i pokonania anomalii wielkiej liczby płytek19. W niniejszym artykule przedstawiono zmodyfikowany iChip oparty na poprzedniej publikacji Berdy'ego i wsp., który został zoptymalizowany pod kątem łatwości użytkowania i zapobiegania zanieczyszczeniom9.

Protokół

1. Przygotowanie i sterylizacja podłoża

  1. Przygotuj i wysterylizuj pożywkę z minimalnymi solami bursztynianowymi (SMS), która składa się z 0,1 g skrobi ziemniaczanej, 1 g kazaaminokwasów, 0,125 g trawienia kazeiny i 15 g agaru bakteriologicznego lub technicznego w 1 l wody.
  2. Autoklaw sterylizuje pożywkę i 100 ml wody molekularnej w 20-minutowym cyklu cieczy w temperaturze 121 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie inne przedmioty, które będą miały kontakt z mieszaniną komórek agarowych, są zakupione w stanie sterylnym, w tym końcówki do pipet i probówki wirówkowe, w przeciwnym razie należy je również sterylizować w autoklawie.

2. Zmodyfikowana konstrukcja iChip

  1. Usunąć dna studzienek z czterech 96-dołkowych płytek za pomocą narzędzia do dziurkowania agaru o średnicy 5 mm.
  2. Pokrój membrany poliwęglanowe o grubości 0,05 μm na prostokąty o wymiarach 7,6 cm x 11 cm lub równe wymiarom dna płytki 96-dołkowej.
  3. Za pomocą szczeliwa silikonowego przyklej membrany poliwęglanowe 0,05 μm do dna płytek 96-dołkowych, upewniając się, że klej uszczelnia studzienki, ale nie zakrywa całkowicie otworów studzienek. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 24 godziny lub postępuj zgodnie z instrukcją na kleju.
    UWAGA: Szczeliwo musi być wodoodporne, nietoksyczne i w 100% silikonowe. Większość uszczelniaczy akwariowych będzie działać dobrze.

3. Przygotowanie zawiesin komórkowych

  1. Oznacz cztery 15 ml probówek wirówkowych A-D i cztery 50 ml probówek wirówkowych E-H i dodaj do każdej z nich 4,5 ml sterylnej wody.
  2. Odmierz 1 g gleby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodaj 10 ml sterylnej wody i wiruj przez 10 minut.
  3. Pozostaw zawiesinę gleby na 10 minut.
  4. Odmierzyć pipetą 0,5 ml supernatantu zawierającego komórki z gleby do probówki A i dokładnie wymieszać.
  5. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórek z probówki A do probówki B i dokładnie wymieszać. Przenieść 0,5 ml roztworu B do probówki C i dokładnie wymieszać. Powtórz to dla wszystkich pozostałych probówek wirówkowych, wykonując serię 10-krotnych rozcieńczeń w ośmiu probówkach wirówkowych.
  6. Usunąć 0,5 ml z probówki H, aby uzyskać równą objętość we wszystkich probówkach.
    UWAGA: Stężenia te są zoptymalizowane dla lokalnych gleb. Próbując wykonać tę procedurę po raz pierwszy, należy przeprowadzić większy zakres rozcieńczeń, aby znaleźć odpowiednie stężenie próbki.

4. Zmodyfikowana inokulacja iChip

  1. Całkowicie zanurz iChips w 95% etanolu na co najmniej 15 minut.
  2. Wyjmij płytki z etanolu i połóż je na sterylnym ręczniku papierowym. Pozwalając etanolowi odparować, włącz sterylizator UV w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut, aby je dalej wysterylizować.
  3. Odpipetować 360 μl sterylnego podłoża SMS do pierwszej kolumny płytki, aby działało jako studzienki kontrolne.
  4. Dodać 45 ml SMS schłodzonego do temperatury 50 °C do zawiesiny komórek w probówce E i dokładnie wymieszać, aby połączyć zawiesinę komórek i agar.
  5. Odpipetować 360 μl mieszaniny agar-komórka z kroku 4.4 do wszystkich pozostałych studzienek płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Zalecana jest pipeta wielokanałowa, ponieważ agar szybko krzepnie. Nie zaleca się ponownego podgrzewania mieszaniny komórek agarowych po zmieszaniu ze względu na ryzyko zabicia mikroorganizmów.
  6. Po ustawieniu podłoża uszczelnij górną część płytek pokrywą płytki PCR.
  7. Powtórz kroki od 3.3 do 3.6 z probówkami F-H, aby napełnić łącznie cztery chipy iChip z dziesięciokrotnymi różnicami stężeń.
    UWAGA: W razie potrzeby media można podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund z poluzowaną nakrętką lub przechowywać w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 60 °C między płytkami, aby zapewnić, że pozostaną stopione dla każdej z nich.

5. Inkubacja

  1. Umieść płytki w pudełku zawierającym około jednego cala gleby użytej w kroku 3.2, membraną do dołu i umieść pokrywę.
  2. Inkubować płytki w przykrytym pojemniku, w ciemnym miejscu o temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Po tygodniu sprawdź zawartość zmodyfikowanych iChipsów, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia podczas instalacji. Na zanieczyszczenie wskazuje przerost jednego lub kilku mikroorganizmów we wszystkich studzienkach płytki.
  3. Po 6 tygodniach sprawdź iChips. Do izolacji kolonii należy używać płytek zawierających wzrost w mniej niż 25% studzienek.

6. Izolacja kolonii

  1. Opłucz zmodyfikowane iChipsy 3x sterylną wodą, aby usunąć wszystkie cząstki brudu.
  2. Przetrzyj górną i boki płytki 95% etanolem, omijając stronę z membraną półprzepuszczalną.
  3. Za pomocą sterylnego ostrza przeciąć pokrywę płytki wokół jednej studzienki zawierającej kolonię.
  4. Za pomocą sterylnego narzędzia do smug nakłuć kolonię i smugi na agarze SMS na płytkach 100 x 15 mm metodą czterokwadrantową.
  5. Powtórz te czynności dla wszystkich innych kolonii w iChips, które rosną po jednej kolonii na studzienkę.
    UWAGA: W przypadku kolonii, które są niewielkie, płytkę można umieścić z powrotem na glebie i inkubować, aż będą wystarczająco duże, aby można było przeprowadzić subkulturę, o ile pokrywa płytki nie została usunięta wokół studni.
  6. Inkubować płytki SMS w temperaturze 25 °C i monitorować wzrost.
  7. Zbadaj kolonie, aby upewnić się, że kultury aksoniczne zostały wyizolowane.

7. Identyfikacja mikroorganizmów

  1. Sekwencjonowanie genomów odzyskanych izolatów20.
  2. Oceń genomy za pomocą JSpeciesWS lub innej platformy identyfikacji opartej na genomie, aby określić stopień podobieństwa każdego izolatu do znanych mikroorganizmów w GenomesDB.
  3. Kategoryzować izolaty poniżej przyjętych przez społeczność progów identyfikacji gatunków jako przypuszczalnie nowe.

Wyniki

Wizualny przegląd protokołu przedstawiono w Rycina 1W przypadku pomyślnego przeprowadzenia zmodyfikowanego eksperymentu z użyciem iChip, co najmniej jedna płytka powinna wykazywać wzrost w mniej niż 25% studzienek, przy braku wzrostu w studzienkach kontrolnych. Taka liczba studzienek z wzrostem zazwyczaj zapewnia izolację pojedynczych kolonii w studzienkach. Ponadto liczba kolonii lub liczba studzienek zawierających kolonie powinna zmniejszać się dziesięciokrotnie z każdą kolejną płytką przygotowaną z serii rozcieńczeń. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 2gdzie płytki 7 i 8 są udanymi iChips, ponieważ wzrost wystąpił w mniej niż 25% studzienek, a odsetek studzienek zawierających kolonie maleje z każdą kolejną płytką, co przedstawiono w Tabela 1. Jeśli wszystkie płytki w próbie zawierają więcej niż jedną kolonię w studzience lub nie zawierają żadnych kolonii w żadnej ze studzienek, uznaje się to za wynik negatywny.

Schemat eksperymentu z mikrobiomem glebowym, zastosowanie uszczelniacza silikonowego, pobieranie próbek z mikropłytki, wyniki wzrostu kultur.
Rycina 1: Schematyczny przegląd zastosowania zmodyfikowanego urządzenia iChip do hodowli mikroorganizmów glebowych. (A,B) Konstrukcja płytki (Krok 2). (C) Przygotowanie inokulum (Krok 3). (D,E) Konfiguracja iChip (Krok 4). (F) Inkubacja iChip (Krok 5). (G-I) Przeniesienie izolatów na konwencjonalne pożywki (Krok 6). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

iChipStężenie gleby w zawiesinie agarowejDołki z koloniamiJednostki tworzące kolonie
E5,0 x 10-6 g/mlWszystkieZbyt wiele, by policzyć
F5,0 x 10-7 g/mlWszystkoZbyt wiele, by policzyć
G5,0 x 10-8 g/ml2222
H5,0 x 10-9 g/ml66

Tabela 1: Reprezentatywne dane z udanego eksperymentu iChip, w którym liczba studni zawierających kolonie maleje wraz z każdym kolejnym rozcieńczeniem w serii.

Schemat płytki ELISA przedstawiający układ próbek i studzienki kontrolne do analizy testu.
Rycina 2: Przykładowe wyniki dwóch udanych zmodyfikowanych iChips. iChips pochodziły z tego samego eksperymentu, w którym (A) płytka przygotowana z mieszaniny komórkowo-agarowej G zawiera 22 kolonie, a (B) płytka przygotowana z mieszaniny komórkowo-agarowej H zawiera sześć kolonii, co jest zgodne z 10-krotną różnicą w rozcieńczeniu między mieszaninami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kolonie można wizualizować gołym okiem lub za pomocą mikroskopu, co przedstawiono na Rysunku 3A-G. Kolonie mogą rosnąć na powierzchni agaru, jak widać na Rysunku 3B, lub być zatopione w agarze, na przykład kolonia na Rysunku 3F. W przypadku pomyślnie zmodyfikowanego iChip mogą wystąpić sytuacje, w których w jednej studzience znajdują się dwie kolonie, tak jak na Rysunku 3G. W niektórych przypadkach kolonie są oddalone od siebie na tyle, że można je osobno przebić igłą i poddać subkulturze; jednak mało prawdopodobne jest, aby te na Rysunku 3G można było łatwo wyhodować jako mikroorganizmy akseniczne. Przykłady kolonii przeniesionych z iChip na konwencjonalne podłoża SMS przedstawiono na Rysunku 4.

Eksperyment wzrostu kolonii bakteryjnych; obrazy szalek Petriego podkreślają tworzenie kolonii czerwonymi okręgami.
Rysunek 3: Reprezentatywny widok mikroskopowy kolonii rosnących w iChip po 6 tygodniach inkubacji. (A-F) Obserwuje się pojedyncze kolonie, z których należy przeprowadzić pasaż, a w (G) obserwuje się dwie kolonie w bliskim sąsiedztwie, które są trudne do uzyskania jako kultury akseniczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost kolonii bakteryjnych na płytce agarowej, eksperyment mikrobiologiczny.
Rysunek 4: Reprezentatywny wynik wzrostu bakterii wyizolowanej z zmodyfikowanego iChip na płytce z agarem SMS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zdolność do izolowania kolonii z zmodyfikowanego iChip na konwencjonalne płytki agarowe również determinuje sukces eksperymentu. Nie wszystkie kolonie rosnące w zmodyfikowanym iChip przetrwają przeniesienie na konwencjonalne płytki. W iChip kolonie są eksponowane na czynniki wzrostu i składniki odżywcze z gleby, co zwiększa ich zdolność do hodowli. W przypadku niektórych mikroorganizmów okres udomowienia nie jest wystarczający, aby stały się one hodowalne w konwencjonalnych warunkach. Stopień odzysku kolonii z iChip na płytki będzie różnić się w zależności od eksperymentu, ale niektóre z nich powinny urosnąć na płytkach, ponieważ metoda ta pozwoli również na hodowlę mikroorganizmów łatwo hodowalnych. Na przykład zmodyfikowane iChipy przedstawione na Rysunku 2 zawierały łącznie 28 kolonii, a liczba kolonii, które urosły na płytkach agarowych po pasażowaniu, wyniosła 16, podczas gdy 12 nie przetrwało przeniesienia. Izolaty mogą zostać zidentyfikowane i wykorzystane do dalszych badań po wyhodowaniu na pełnowymiarowych płytkach agarowych, jak pokazano na Rysunku 4.

Pomyślnie przeprowadzony zmodyfikowany eksperyment iChip powinien doprowadzić do izolacji mikroorganizmów, które różnią się od znanych mikroorganizmów na poziomie gatunkowym. Stopień podobieństwa każdego izolatu do znanych mikroorganizmów ustala się poprzez porównanie wyizolowanego DNA z genomami znanych mikroorganizmów. Wartości tetra Z najbliżej spokrewnionych mikroorganizmów dla każdego izolatu opisują procent podobieństwa. Rycina 5 pokazuje, że spośród dwunastu wyizolowanych bakterii, cztery stanowiły nowe gatunki lub wyższe jednostki taksonomiczne, dwie były prawdopodobnie nowymi szczepami, a sześć było znanymi mikroorganizmami. Odzyskanie kilku nowych gatunków lub szczepów jest zgodne z wcześniej opublikowanymi eksperymentami iChip, co wskazuje, że ta zmodyfikowana konstrukcja iChip nie utrudnia zwiększenia odzysku nowych gatunków11.

Wykres kołowy nowości taksonomicznej; 6 znanych gatunków, 2 potencjalne nowe, 4 nowe z analizy iChip.
Rysunek 5: Poziom klasyfikacji taksonomicznej izolatów wyizolowanych w eksperymencie z użyciem iChip. Procent podobieństwa określono na podstawie wyników tetra Z scores, które opisują podobieństwo izolatów do znanych bakterii, gdzie podobieństwo >99,9% wskazuje na zgodność gatunkową, podobieństwo 98,9%-99,9% wskazuje na możliwy nowy gatunek, a podobieństwo <98,9% wskazuje na nowy gatunek lub wyższy poziom taksonomiczny. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Liczne metody, takie jak eksploracja genomu i badanie cichych szlaków biosyntezy, ułatwiły odkrycie nowych bioaktywnych substancji chemicznych w ostatnich latach21,22. Jednak nanocząsteczki odkryte za pomocą takich metod często wykazują duże podobieństwo strukturalne do znanych związków. Uzyskanie dostępu do wcześniej niehodowanych mikroorganizmów odblokuje większą różnorodność chemiczną i nanocząsteczki dzięki nowym sposobom działania, które mogą lepiej pomóc w zwalczaniu oporności drobnoustrojów. Wykazano, że technika izolacji iChip zwiększa możliwości hodowli nowych mikroorganizmów, które można wykorzystać do budowy bibliotek mikroorganizmów w celu odkrycia nowych nanocząsteczek.

Najwcześniejsza koncepcja iChip została opublikowana w 2002 roku, która składała się z pojedynczych metalowych pierścieni zawierających mieszaninę komórek agarowych uszczelnionych półprzepuszczalnymi membranami i inkubowanych in situ23. W 2010 r. został on zmodyfikowany, aby zawierał mały chip z wieloma dołkami11, a następnie opracowano niedrogi iChip zbudowany z powszechnych materiałów laboratoryjnych we wpływowej publikacji Nature Protocols w 2017 r.9. W tej publikacji wprowadzono kilka modyfikacji do protokołu Nature, aby poprawić jego praktyczność i łatwość użycia. Protokół Nature polega na przyklejeniu półprzepuszczalnej membrany po obu stronach chipa w porównaniu z tą metodą, która wykorzystuje samoprzylepną osłonę płyty z jednej strony. Mogą wystąpić problemy podczas używania kleju silikonowego do mocowania membrany po załadowaniu iChip. Według naszej wiedzy wszystkie nietoksyczne kleje silikonowe wydzielają kwas octowy podczas wiązania, co może wpływać na żywotność komórek24. Protokół przedstawiony w tym filmie również znacznie zmniejsza ilość czynności wymaganych po inokulacji poprzez użycie pokrywy płytki PCR do uszczelnienia napełnionej płytki, co dodatkowo zapewnia sterylność i skraca czas przygotowania. Opierając się na identyfikacji wielu nowych izolatów w tym eksperymencie, użycie tylko jednej półprzepuszczalnej membrany hamuje wzrost wskaźników odkrywania nowych organizmów, który odnotowano w przypadku iChipów zbudowanych z dwóch półprzepuszczalnych membran. Konieczne byłyby jednak dalsze eksperymenty z większą próbą, aby określić ilościowo wpływ.

Inną modyfikacją metody jest subkulturowanie tylko ze zmodyfikowanych iChipsów, które zawierają wzrost w mniej niż 25% odwiertów. Jeśli kolonie rosną w większości studzienek płytki, prawdopodobnie istnieją studnie, które zawierają wiele mikroorganizmów, nawet jeśli nie są łatwo widoczne. Podczas opracowywania metody stwierdzono, że w dużej mierze niemożliwe jest uzyskanie kultur aksenicznych podczas hodowli ze studni zawierających więcej niż jedną kolonię. Izolacja kultur nieaksenicznych stwarza poważne problemy na dalszych etapach łańcucha dostaw w zakresie oznaczania bioaktywności i identyfikacji. Dlatego, dla uproszczenia, zaleca się subhodowlę tylko zmodyfikowanych iChipsów z koloniami rosnącymi w części studni.

Najważniejszym problemem, który może pojawić się w przypadku metod iChip, jest zanieczyszczenie studni lub całych iChipów innymi mikroorganizmami. Na zanieczyszczenie wskazują kolonie rosnące w studzienkach kontrolnych lub ten sam mikroorganizm rosnący w kilku studzienkach lub na całym obszarze zmodyfikowanego iChipa. Źródłem zanieczyszczenia może być nieodpowiednia sterylizacja materiałów podczas ustawiania lub niewłaściwa technika aseptyczna. W takich przypadkach należy upewnić się, że wszystkie użyte materiały są sterylizowane w autoklawie lub etanolem, jak wskazano w metodzie, i upewnić się, że nie dochodzi do kontaktu między żadnymi niesterylnymi przedmiotami a zmodyfikowanym iChipem innym niż mieszanina komórek agarowych. Jeśli zaobserwuje się przerost pojedynczego mikroorganizmu na dnie lub na górze wielu zmodyfikowanych studzienek iChip, najprawdopodobniej jest to wynik niepełnego uszczelnienia między studzienkami a membraną. W takim przypadku należy upewnić się, że użyty klej jest w 100% silikonem, który nie ulega degradacji w etanolu, oraz upewnić się, że półprzepuszczalna membrana i pokrywa płytki PCR są całkowicie uszczelnione wokół każdej studzienki podczas budowy.

Seria rozcieńczeń stosowana w obecnym protokole powinna zapewniać odpowiednie rozcieńczenie dla większości rodzajów gleb o okresie przechowywania krótszym niż jeden tydzień, ponieważ obejmuje tysiąckrotny zakres rozcieńczeń. Mogą jednak występować znaczne różnice w liczbie mikroorganizmów w zależności od rodzaju gleby. Jeśli studzienki kontrolne nie zawierają wzrostu, ale w każdym dołku ze wszystkich czterech zmodyfikowanych iChipów rośnie wiele kolonii, użyte stężenia komórek nie były wystarczająco niskie. Seria rozcieńczeń powinna zostać zmodyfikowana w celu osiągnięcia niższych stężeń komórek w mieszaninach komórek i pożywek stosowanych do tworzenia zmodyfikowanych iChips. Podobnie, jeśli nie obserwuje się wzrostu na żadnej z tych płytek, należy zwiększyć stężenia stosowane w mieszaninach pożywki komórkowej. Alternatywnie możliwe jest, że temperatura użytych pożywek była zbyt wysoka, aby mikroorganizmy mogły przetrwać. W takim przypadku pożywka powinna ostygnąć tak bardzo, jak to możliwe, bez krzepnięcia przed dodaniem do rozcieńczonej zawiesiny komórek.

Technologia ta stanowi ważny krok naprzód w kierunku przezwyciężenia anomalii związanej z liczeniem płyt. Jest on jednak nadal ograniczony przez nieprzydatność konwencjonalnych technik hodowli, na co wskazuje liczba mikroorganizmów, które nie przeżywają przeniesienia ze zmodyfikowanego iChipa na konwencjonalne płytki agarowe. Wcześniejsze publikacje informowały, że wielokrotne rundy subkultur i inkubacji w iChips dodatkowo zwiększają zdolność do uprawy mikroorganizmów. Wydłużony czas udomowienia i narażenie na czynniki wzrostu gleby podczas korzystania z agary w iChip zwiększa szanse na wzrost kolonii na samym agarze . Nie stwierdzono jednak, aby podejście to dawało większe prawdopodobieństwo wystąpienia nowych mikroorganizmów niż pojedyncza inkubacja iChip25,26.

Wiele innych taktyk jest badanych i modyfikowanych w celu zwiększenia możliwości hodowli nowych mikroorganizmów. Na przykład zaproponowano wykonanie całego urządzenia iChip z materiału półprzepuszczalnego, aby ułatwić kokulturę mikroorganizmów w sąsiednich studniach27. Biorąc to pod uwagę, zaletą konstrukcji przedstawionej w tej publikacji jest jej niski koszt, przy czym koszt zbudowania jednej płytki wynosi około 12 USD (4 USD za płytkę 96-dołkową, 8 USD za membranę, 2 USD za okładkę PCR). Co więcej, jego prosta konstrukcja sprawia, że jest to nieskomplikowane narzędzie, gdy jest używane zgodnie z opisem i zapewnia wiele możliwości personalizacji. Chociaż protokół ten wykorzystuje pożywkę selektywną dla bakterii, zestaw eksperymentalny można teoretycznie dostroić tak, aby był ukierunkowany na pożądaną populację drobnoustrojów poprzez modyfikację zastosowanej pożywki, na przykład przy użyciu pożywki tłumiącej bakterie do zwalczania grzybów lub agaru o niskiej zawartości składników odżywczych dla mikroorganizmów zarodnikujących.

Oświadczenia

Autorzy oświadczyli, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za finansowanie J-base (J-001757, J-001842) zapewnione przez Agriculture and Agri-Food Canada, które umożliwiło ten projekt. Dziękujemy Brettowi van Heyningenowi za nakręcenie materiału wideo do tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować firmie Ron Matters za pobranie próbek gleby wykorzystanych w eksperymentach opisanych w tej publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1-20 i mikro; L końcówki do pipetVWR76322-158Opakowanie 768
probówek do PCR 0,2 mlThermoFisher ScientificAB0337Opakowanie 1000
pipet jednokanałowych 0,5-5 mlVWRCA11020-004
Butelka szklana 1 LMillipore SigmaCLS13951LMusi być autoklawowalny. 
Płytki Petriego 100 x 15 mmVWR25384-342Etui 500
100% Uszczelniacz silikonowyMarineland31003
1000 µ L Wielokanałowe końcówki do pipetThermoFisher Scientific 9401113Etui 960
100-1000 µ L końcówki do pipetVWR76322-164Opakowanie 768
100-1000 µ Pipeta jednokanałowa LVWR76169-240
100-1200 µ L pipeta wielokanałowaThermoFisher Scientific46300800Musi mieć 360 i mikro; L pojemność objętościowa. 
1-10 &mikro; Pipeta jednokanałowa LVWR76169-232
Końcówki do pipet 1-5 mlVWRCA11020-008Zestaw 500
sterylnych probówek wirówkowych 15 mlVWRCA21008-918Opakowanie 500
16s startera rRNA-F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) – 10mMIntegrated DNA Technologies51-01-19-0610 µ g
16s starter rRNA-R (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) – 10mMZintegrowane technologie DNA51-01-19-0710 &mikro; g
4 mm świdr korkowyVWR470121-860
50 ml sterylne probówki wirówkoweVWRCA21008-940Opakowanie 500
95% etanoluThermo Fisher ScientificA412-500500 ml
96-dołkowa płytkaVWR10062-900Skrzynka 100
autoklawCole-ParmerUZ-01850-348 L, 115 VAC
Agar bakteriologicznyThermoFisher Scientific443570010Pojemnik 1 kg
Thomas Scientific1216H915 pojemników w opakowaniu
CasaminokwasyThermoFisher Scientific223120500 g
Digest kazeinowyThermoFisher Scientific211610500 g
Agaroza klasy elektrofluorezyThermo Fisher ScientificJ66501.30250 g
System obrazowania iBright FL1500ThermoFisher ScientificA44115
Okap z przepływem laminarnymCleanTech1000-6-A
Minion Nanopore Sequencer Oxford Nanopore TechnologiesMinIon Mk1C
NanoDrop Jeden/Jedna mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermoFisherScientific ND-ONE-W
Woda wolna od nukleazThermo Fisher ScientificAM993710 x 50 ml
Zestaw DNA Nucleobond HMWTakara740160.2
Ręcznik papierowyVWR89402-824
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo Fisher ScientificF566L500 Reactions
Skrobia ziemniaczanaThermoFisher Scientific4196900252,5 kg
Oprogramowanie QIAGEN CLC Genomics Workbench lub podobneZestaw Qiagen
Rapid Barcoding 24 OxfordNanopore TechnologiesSQK-RBK114.24
Termocykler SimpliAmpApplied BiosystemsA24811
Sterylne pętle do inokulacji z igłąVVWR76534-512Etui na 1000
Sterylne ostrze chirurgiczneVWR76457-444
SYBR Bezpieczny lub podobny ThermoFisher ScientificS33101
UltraCzysta Agaroza ThermoFisher Scientific16500-500
VortexVWR76549-928Musi pomieścić probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml Stereoskopowy
mikroskop trójokularowy VWR z zoomemVWR 89404-476
Whatman  Nuklepore  Membrany trawioneMillipore SigmaWHA113502dł. x szer. 8  w. x 10  in., wielkość porów 0,03  μ mln
stereo

Bibliografia

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Fouillaud, M., Dufosse, L. Microbial secondary metabolism and biotechnology. Microorganisms. 10 (1), 123(2022).
  3. Rizzetto, G., et al. Role of daptomycin in cutaneous wound healing: A narrative review. Antibiotics. 11 (7), 944(2022).
  4. Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nat Rev Chem. 5 (10), 726-749 (2021).
  5. Gunjal, V., Thakare, R., Chopra, S., Reddy, D. S. Teixobactin: A paving stone toward a new class of antibiotics. J Med Chem. 63, 12171-12195 (2020).
  6. Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M., Supuran, C. T. Natural products in drug discovery: Advances and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 20 (3), 200-216 (2021).
  7. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  8. Wright, G. An irresistible newcomer. Nature. 517, 422-444 (2015).
  9. Berdy, B., Spoering, A., Ling, L., Epstein, S. In situ cultivation of previously uncultivable microorganisms using the ichip. Nat Protoc. 12 (10), 2232-2242 (2017).
  10. Jung, D., et al. Triggering growth via growth initiation factors in nature: A putative mechanism for in situ cultivation of previously uncultivated microorganisms. Front Microbiol. 12, 537194(2021).
  11. Nichols, D., et al. Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2445-2450 (2010).
  12. Megaw, J., Kelly, S. A., Thompson, T. P., Skvortsov, T., Gilmore, B. F. Profiling the microbial community of a triassic halite deposit in Northern Ireland: An environment with significant potential for biodiscovery. FEMS Microbiol Lett. 366 (22), fnz242(2019).
  13. Vitorino, I., et al. Novel and conventional isolation techniques to obtain planctomycetes from marine environments. Microorganisms. 9 (10), 2078(2021).
  14. Moote, P., Polo, R. O., Uwiera, R. R. E., Inglis, G. D. Comparison of strategies for isolation anaerobic bacteria from the porcine intestine. Appl Environ Microbiol. 87 (9), e00088-e00121 (2021).
  15. Vitorino, I. R., et al. Rhodopirellula aestuarii sp. Nov., a novel member of the genus rhodopirellula isolated from brackish sediments collected in the tagus river estuary, Portugal. Syst Appl Microbiol. 45 (6), 126360(2022).
  16. Ding, H., et al. Hanstruepera marina sp. Nov. and Hanstruepera flava sp. Nov., two novel species in the family flavobacteriaceae isolated by a modified in situ cultivation technique from marine sediment. Front Microbiol. 13, 957397(2022).
  17. Ling, L. L., et al. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature. 517 (7535), 455-459 (2015).
  18. Qi, Y. K., et al. Discovery, synthesis, and optimization of teixobactin, a novel antibiotic without detectable bacterial resistance. J Pept Sci. 28 (11), e3428(2022).
  19. Piddock, L. J. Teixobactin, the first of a new class of antibiotics discovered by ichip technology. J of Antimicrob Chemother. 70 (10), 2679-2680 (2015).
  20. Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long read sequencing for whole genomic DNA analysis. J Vis Exp. (145), e58954(2019).
  21. Covington, B. C., Xu, F., Seyedsayamdost, M. R. A natural product chemist's guide to unlocking silent biosynthetic gene clusters. Annu Rev Biochem. 90, 763-788 (2021).
  22. Lee, N., et al. Mini review: Genome mining approaches for the identification of secondary metabolite biosynthetic gene clusters in Streptomyces. Comput Mol Biol. 18, 1548-1556 (2020).
  23. Kaeverlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating "uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
  24. Trcek, J., Mira, N. P., Jarboe, L. R. Adaptation and tolerance of bacteria against acetic acid. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (15), 6215-6229 (2015).
  25. Kurm, V., Van Der Putten, W. H., Hol, W. H. G. Cultivation-success of rare soil bacteria is not influenced by incubation time and growth medium. PLOS One. 14 (1), e0210073(2019).
  26. Buerger, S., et al. Microbial scout hypothesis and microbial discovery. Appl Environ Microbiol. 78 (9), 3229-3233 (2012).
  27. Lodhi, A. F., Zhang, Y., Adil, M., Deng, Y. Antibiotic discovery: Combining isolation chip (ichip) technology and co-culture technique. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (17), 7333-7341 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mikroorganizmów glebowychmikroorganizmy niehodowlanezwiązki bioaktywnemikrobiom glebowyoporność na środki przeciwdrobnoustrojoweopracowywanie biopestycydówrozcieńczenie dziesięciokrotnemembrana półprzepuszczalnaudomowienie kolonii
Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.