Artykuł metodologiczny

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki u myszy za pomocą barwienia immunologicznego

DOI:

10.3791/67436

⸱

1 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perycyty siatkówki są niezbędne dla rozwoju naczyń krwionośnych i stabilności siatkówki, odgrywając kluczową rolę w utrzymaniu integralności układu naczyniowego siatkówki. Aby zapewnić szczegółowy wgląd w charakterystykę morfologiczną perycytów, w badaniu opisano nowe podejście łączące retro-orbitalne wstrzyknięcie czynnika fluorescencyjnego, barwienie immunofluorescencyjne i leczenie oczyszczania tkanek. Po pierwsze, fluorescencyjną lektynę pomidorową wstrzyknięto do zatoki zaoczodołowej żywej myszy w celu oznaczenia unaczynienia siatkówki. Po 5 minutach mysz została złożona w ofierze, a jej nienaruszona siatkówka została ostrożnie usunięta z miseczki siatkówki i immunofluorescencyjnie wybarwiona receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β odsłonić perycyty. Dodatkowo wybarwioną siatkówkę potraktowano odczynnikiem do oczyszczania tkanek i w całości zamontowano na szkiełku mikroskopowym. Dzięki tym metodom wyraźnie obserwowano unaczynienie siatkówki i perycyty w przezroczystej siatkówce. Pod mikroskopem konfokalnym uzyskaliśmy więcej możliwości wykonywania zdjęć o wysokiej rozdzielczości w celu dalszej rekonstrukcji i analizy cech morfologicznych perycytów wzdłuż drzewa naczyniowego siatkówki w widoku trójwymiarowym. Metodologicznie protokół ten oferuje skuteczne podejście do wizualizacji perycytów w obrębie naczyń krwionośnych siatkówki, dostarczając cennych informacji na temat ich roli zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perycyty siatkówki są osadzone w błonie podstawnej wzdłuż abluminalnej strony komórek śródbłonka naczyniowego, wyświetlając podobny do siatki wzór procesów krótkiego zasięgu owiniętych wokół naczyń krwionośnych siatkówki1. Ten bliski kontakt między perycytami a unaczynieniem siatkówki przyczynia się do utrzymania homeostazy środowiskowej siatkówki2. Chociaż liczne badania dostarczyły morfologicznych dowodów na istnienie perycytów w unaczynieniu siatkówki, większość naszej wiedzy na temat cech morfologicznych perycytów siatkówki pochodzi z konwencjonalnych technik histologicznych3.

Zgodnie z tymi badaniami, zaprojektowaliśmy to badanie, aby skutecznie pokazać więcej szczegółów morfologicznych perycytów w mikrokrążeniu siatkówki, łącząc tradycyjne techniki histologiczne z nowoczesnymi, najnowocześniejszymi metodami naukowymi. Podejście to łączy w sobie trzy kluczowe techniki: retroorbitalne wstrzykiwanie fluorescencyjnej lektyny pomidorowej żywym myszom, barwienie immunofluorescencyjne za pomocą β receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFR-β) oraz strategię oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika. Retro-orbitalne wstrzykiwanie fluorescencyjnej lektyny pomidorowej okazało się skuteczne i niezawodne w obserwacji unaczynienia siatkówki myszy zarówno in vivo, jak i in vitro4,5. PDGFR-β służy jako powszechnie stosowany biomarker do barwienia immunofluorescencyjnego perycytów6. Aby uchwycić obrazy perycytów o wysokiej rozdzielczości w grubszych i pełnych siatkówkach, strategia oczyszczania tkanek zwiększa przezroczystość histologiczną2,7,8.

Chociaż każda z tych technik była stosowana indywidualnie w badaniach siatkówki, ich łączna kompatybilność do badania perycytów w unaczynieniu siatkówki myszy pozostaje niepewna. Ponieważ średnia grubość siatkówki myszy wynosi około 180-220 μm9, znakowanie przeciwciałami i obrazowanie konfokalne w tej grubej tkance bez leczenia oczyszczającego często skutkuje wysokimi sygnałami tła, komplikując obserwację relacji przestrzennej między perycytami a naczyniami krwionośnymi10. Dzięki opisanym tutaj pejściom staramy się zapewnić prostą metodę wizualizacji perycytów w obrębie naczyń krwionośnych siatkówki w trójwymiarowym (3D) widoku pod mikroskopem konfokalnym. Ta zwiększona informacja komórkowa z perycytów w unaczynieniu siatkówki może poprawić naszą wiedzę na temat homeostazy środowiskowej siatkówki i podkreślić potencjalne strategie ochrony naczyń krwionośnych, poprawiając w ten sposób wyniki funkcjonalne w zaburzeniach naczyniowych siatkówki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tego badania wykorzystano trzy młode dorosłe samce myszy C57BL/6 (w wieku 8-10 tygodni, o wadze 20-25 g). Trzymano je w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością oraz umożliwiono swobodny dostęp do pożywienia i wody. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (nr zatwierdzenia 2023-03-14-04) i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996).

1. Retroorbitalne wstrzyknięcie in vivo fluorescencyjnej lektyny pomidorowej

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 50 mg/kg pentobarbitalu w celu znieczulenia myszy. Oceń głębokość znieczulenia, oceniając brak reakcji na bodziec szczypania palca u nogi.
  2. Umieść mysz w prawej bocznej pozycji leżącej z głową skierowaną w lewo.
  3. Delikatnie przyciśnij dwa palce do obszaru okołooczodołowego, aby odsłonić lewe oko myszy i umożliwić najłatwiejsze podanie wstrzyknięcia do lewej zatoki zaoczodołowej zwierzęcia11.
  4. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 27G, aby delikatnie wbić około 2-3 mm w zatokę żylną oczodołową myszy z skosem na igle skierowanym do przodu pod kątem 45°.
  5. Wstrzyknąć 0,1 ml (1 mg/ml) fluorescencyjnej lektyny pomidorowej do oczodołowej zatoki żylnej myszy.

2. Perfuzja i enukleacja oczu

  1. Po 5 minutach od wstrzyknięcia zaoczodołowego wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór tribromoetanolu (250 mg/kg) w celu głębokiego znieczulenia myszy. Następnie poddaj zwierzę eutanazji poprzez wykrwawienie i perfuzję serca. Gdy oddech przestanie oddychać, otwórz klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi12.
  2. Gdy oddech ustanie, otwórz klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne z wyprzedzeniem i operuj w dygestorium. Użyj igły 24G i wprowadź ją 2 mm do lewej komory serca przez wierzchołek lewej komory. Przeprowadzić perfuzję z szybkością 3 ml / min z 20 ml 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 20 ml 4% formaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4).
  3. Połóż ofiarowaną mysz na boku i usuń skórę zakrywającą oczy nożyczkami. Wyłuszczeć oczy nożyczkami i kleszczami.
  4. Przeciąć nerw wzrokowy i otaczające go tkanki, a następnie wyjąć oko i przenieść na 12-dołkową płytkę w celu utrwalenia po utrwaleniu w 4% formaldehydzie w 0,1 M PB przez 2 godziny.
  5. Kriochronić tkankę w 25% sacharozie w 0,1 M PB (pH 7,4) w temperaturze 4 °C, aż opadnie na dno roztworu.
    UWAGA: Ponieważ tkanka oka dobrze odwadnia się w roztworze sacharozy, siatkówkę można łatwiej i całkowicie odłączyć, co ułatwia późniejsze kompleksowe badania.

3. Rozwarstwienie siatkówki

  1. Przenieść oczy na szalkę Petriego zawierającą 0,1 M PB (pH 7,4) za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  2. Przebij krawędź rogówki ostrymi nożyczkami, przetnij wokół rogówki i tęczówki i wyrzuć.
  3. Użyj kleszczy, aby usunąć soczewkę i ciało szkliste. Następnie odciągnij siatkówkę w kształcie miseczki od środka oka za pomocą cienkich kleszczyków. Przepłukać siatkówkę za pomocą 0,1 M PB (pH 7,4) na czystej szalce Petriego.

4. Barwienie immunofluorescencyjne i oczyszczanie tkanek siatkówki

  1. Ostrożnie usunąć siatkówkę w kształcie miseczki i inkubować ją w 2% roztworze Triton X-100 w 0,1 M PB (pH 7,4) przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Przenieść siatkówkę do roztworu blokującego (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% azydku sodu + 10% normalnej surowicy osła) i obracać z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść siatkówkę do roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała koziego anty-PDGFR-β (10 μg/ml) w buforze rozcieńczającym (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% azydek sodu + 1% normalna surowica osła) w probówce do mikrowirówki i obracać na wytrząsarce przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
  4. Przemyj siatkówkę 2x buforem do przemywania (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je przez noc w buforze do płukania w temperaturze 4 °C na shakerze.
  5. Następnego dnia przenieść siatkówkę do zmieszanego roztworu zawierającego 1 mg/ml przeciwciało drugorzędowe anty-kozy 488 i 0,2 ng/ml fluorescencyjnego jądrowego 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) o stężeniu 0,2 ng/ml w probówce do mikrowirówki i obracać z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć siatkówkę w 6-dołkowej płytce z buforem do przemywania przez 1 godzinę, 2x, w temperaturze pokojowej. Siatkówkę należy przechowywać przez noc w buforze do przemywania na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić obrazowanie i analizę zgodnie z krokiem 5, aby uzyskać widok przed oczyszczeniem tkanek.
  7. Przenieść siatkówkę do odczynnika oczyszczającego tkanki i delikatnie obracać ją z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  8. Po zabiegu oczyszczania tkanek przepłukać siatkówkę w kształcie miseczki 0,1 M PB (pH 7,4) na czystej szalce Petriego.
  9. Wykonaj 4 promieniowe nacięcia sięgające około 2/3 promienia siatkówki za pomocą nożyczek sprężynowych, aby uzyskać kształt płatka.
  10. Spłaszcz i zamontuj siatkówkę na szkiełku mikroskopowym, a następnie usuń nadmiar PB za pomocą małego kawałka chłonnego papieru. Trzymaj wewnętrzną stronę siatkówki skierowaną do góry na szkiełku.
  11. Okrąż zamontowaną siatkówkę za pomocą przekładki i wypełnij lukę świeżym odczynnikiem do oczyszczania tkanek i szkiełkiem nakrywkowym.

5. Obrazowanie i analizy

  1. Uzyskaj zewnętrzne widoki siatkówki przed (po wykonaniu kroku 4.6) i po zabiegu oczyszczania tkanek.
  2. Zeskanuj widoki montażowe oznakowanej siatkówki za pomocą panoramicznego skanera do wycinania tkanek. Użyj soczewki obiektywowej 2x o NA 0,08.
  3. Wykonuj zdjęcia w większym powiększeniu za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w następujące soczewki obiektywowe: soczewka 10x z NA 0,40 i soczewka 40x z NA 0,95. Ustaw otworek konfokalny na 152 μm (soczewka obiektywu 10x) i 105 μm (soczewka obiektywu 40x). Ustaw rozdzielczość przestrzenną przechwytywania obrazu na 1024 x 1024 pikseli (obiektyw 10x) i 640 x 640 pikseli (obiektyw 40x).
  4. Zrób 50 zdjęć (stos Z) w klatkach 2 μm z oznaczonej siatkówki. Zintegruj wszystkie obrazy w jednym ostrym trybie w trybie projekcji/topografii. Aby ustawić, kliknij Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową > Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej > Ustaw rozmiar kroku > Wybierz wzór głębi > przechwytywanie obrazu > serii Z.
  5. Rejestruj obrazy przy użyciu następujących długości fal wzbudzenia i emisji dla różnych sygnałów fluorescencyjnych: zielone sygnały fluorescencyjne przy 499 nm i 519 nm; czerwone sygnały fluorescencyjne przy 591 nm i 618 nm oraz niebieskie sygnały fluorescencyjne przy 401 nm i 421 nm.
  6. Zrekonstruuj obrazy w trójwymiarowym wzorze, importując obrazy konfokalne stosu Z do oprogramowania analitycznego, wybierając opcję Dodaj nowe powierzchnie > Wybierz ustawienia głośności > Wybierz kanał źródłowy > Dostosuj wyświetlanie > Dostosuj kąt powierzchni > migawki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patrząc z zewnątrz na całą siatkówkę, przezroczystość tkanki całej siatkówki została zwiększona za pomocą zabiegu oczyszczania tkanek w porównaniu do siatkówki bez oczyszczania tkanek (Rysunek 1).

Do badania histologicznego całej siatkówki, unaczynienie siatkówki zostało oznaczone na czerwono fluorescencyjną lektyną pomidorową poprzez wstrzyknięcie zaoczodołowe, a perycyty siatkówki są pokazane na zielono za pomocą PDGFR-β (Rysunek 2, Rysunek 3, oraz Rysunek 4). Chociaż to oznakowanie można było zaobserwować na próbce przed i po oczyszczeniu tkanki, dla porównania, szum tła próbki siatkówki został zredukowany przez zabieg oczyszczania tkanek (Ryc. 2). Zabieg sprawił również, że znakowane perycyty siatkówki i naczynia krwionośne stały się wyraźniejsze pod panoramicznym skanerem plastrów tkanek (Ryc. 2) i laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (Ryc. 3).

Stopniowy rozkład perycytów siatkówki jest również pokazany tutaj wzdłuż drzewa naczyniowego siatkówki (Rysunek 3). Od centralnej części siatkówki do jej obszaru obwodowego, perycyty znajdują się na błonie podstawnej układu naczyniowego siatkówki, w tym na pniu i gałęziach naczyniowych oraz naczyniach włosowatych (Ryc. 3).

Na podstawie powyższej obserwacji, korelacja przestrzenna perycytów i unaczynienia siatkówki została dodatkowo oceniona za pomocą bardziej powiększonych obrazów stosu Z z oczyszczonej próbki siatkówki (Rysunek 4). Za pomocą systemu przetwarzania obrazu dostarczyliśmy ponadto widoki 3D, aby pokazać, że perycyty były ściśle owinięte wokół naczynia krwionośnego siatkówki o różnych średnicach (Ryc. 4). Rysunek 4A0-D0 przedstawia hierarchiczne rozgałęzienia naczyń siatkówki od najwyższego do najniższego. Ponieważ perycyty są obficie rozmieszczone w naczyniach włosowatych, barwienie PDGFRβ w Rysunek 4D0 pokazuje większą intensywność i sygnał w porównaniu do Rysunek 4A0-C0.

W przeciwieństwie do siatkówki myszy bez leczenia oczyszczającego tkanki (Rysunek 1A, Rysunek 2A, Rysunek 3A0-D0), obecne podejście skutecznie zredukowało sygnały tła siatkówki w celu wykazania przestrzennego związku między perycytami a naczyniami krwionośnymi z całej siatkówki (Rysunek 1B, Rysunek 2B, Rysunek 3A1-D1).

figure-results-1
Rysunek 1: Porównanie przezroczystości optycznej całej siatkówki bez i z zabiegiem oczyszczania tkanek. (A, B) Widoki z zewnątrz całej siatkówki przed (A) i po (B) zabiegu oczyszczania tkanki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Porównanie cech znakowania perycytów siatkówki i układu naczyniowego z całej siatkówki bez i z leczeniem oczyszczania tkanek. (A, B) Reprezentatywne widoki montażowe całej siatkówki przed (A) i po (B) zabiegu oczyszczania tkanek zostały wykonane w ramach Systemu Wirtualnych Slajdów. Układ naczyniowy jest w kolorze czerwonym (fluorescencyjna lektyna pomidorowa), perycyty są w kolorze zielonym (PDGFR-β), a jądro komórkowe jest w kolorze niebieskim (DAPI). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie rozdzielczości obrazowania perycytów siatkówki stopniowo wzdłuż drzewa naczyniowego siatkówki przed i po zabiegu oczyszczania tkanki. (A-D) Reprezentatywne obrazy z oznakowanej siatkówki przed leczeniem oczyszczania tkanek (A0-D0) i po zabiegu oczyszczania tkanek (A1-D1) pokazują rozmieszczenie perycytów otaczających układ naczyniowy siatkówki w kolejności pnia naczyniowego (A0, A1), gałęzie pierwszego rzędu (B0, B1), gałęzie drugiego rzędu (C0, C1) i kapilarne (D0, D1). Układ naczyniowy jest w kolorze czerwonym (fluorescencyjna lektyna pomidorowa), perycyty są w kolorze zielonym (PDGFR-β), a jądro komórkowe jest w kolorze niebieskim (DAPI). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przestrzenna korelacja perycytów z unaczynieniem siatkówki o różnych średnicach. (A-D) Reprezentatywne obrazy o wysokiej rozdzielczości z oznakowanej siatkówki wzdłuż drzewa naczyniowego siatkówki pokazujące rozmieszczenie perycytów otaczających unaczynienie siatkówki o różnych średnicach, w tym pnia naczyniowego (A0, A1), gałęzi pierwszego rzędu (B0, B1), gałęzi drugiego rzędu (C0, C1) i naczyń włosowatych (D0, D1). A1-D1: Odpowiednie obrazy paneli A0-D0 zostały zrekonstruowane, aby pokazać korelację przestrzenną perycytów z unaczynieniem siatkówki o różnych średnicach w widokach trójwymiarowych i dalej zademonstrować powiększone widoki lokalnych regionów w panelach A1-D1 (strzałki) z wstawkami. Układ naczyniowy jest w kolorze czerwonym (fluorescencyjna lektyna pomidorowa), perycyty są w kolorze zielonym (PDGFR-β), a jądro komórkowe jest w kolorze niebieskim (DAPI). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu szczegółowo opisaliśmy techniczny proces demonstrowania morfologii perycytów w unaczynieniu siatkówki za pomocą retro-orbitalnego wstrzykiwania fluorescencyjnej lektyny pomidorowej, badania immunofluorescencyjnego za pomocą PDGFR-β i oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika. Wyniki pokazują, że techniki te są wysoce kompatybilne w podświetlaniu perycytów w całej siatkówce. Połączenie tych metodologii oferuje skuteczne podejście do wizualizacji cech morfologicznych perycytów w unaczynieniu siatkówki ze szczegółowej perspektywy 3D.

Udowodniono, że jedna z kluczowych technik, iniekcja zaoczodołowa u myszy, jest prostą i optymalną metodą dostarczania środków znakujących naczynia krwionośne, przewyższającą metody iniekcji żyły ogonowej i dootrzewnowej do obserwacji unaczynienia siatkówki myszy13,14. Chociaż zasada i mechanizm znakowania naczyń krwionośnych poprzez wstrzyknięcie zaoczodołowe nie jest w pełni zrozumiały, oczywiste jest, że metoda ta solidnie znakuje naczynia krwionośne siatkówki fluorescencyjną lektyną pomidorową. Znakowanie fluorescencyjne pozostaje stabilne zarówno dzięki przetwarzaniu histochemicznemu, jak i oczyszczaniu tkanek. Dlatego, poza zastosowaniem w obrazowaniu in vivo, wstrzyknięcie zaoczodołowe fluorescencyjną lektyną pomidorową skutecznie znakuje światło naczynia krwionośnego, oferując wyraźny obraz unaczynienia siatkówki do badania histologicznego in vitro i ex vivo.

Do znakowania perycytów siatkówki zastosowaliśmy barwienie immunofluorescencyjne za pomocą PDGFR-β15. Biorąc pod uwagę, że zabarwiona siatkówka została poddana dalszemu leczeniu odczynnikiem do oczyszczania tkanek w celu zmniejszenia rozpraszania światła w tkance w badaniu morfologicznym pod mikroskopem, siatkówkę inkubowano w roztworze barwiącym przez dłuższy czas, aby zwiększyć penetrację przeciwciała16,17.

Siatkówka z całym mocowaniem jest stosunkowo przezroczysta, co pozwala na przegląd unaczynienia siatkówki18. Jednak ze względu na rozpraszanie światła wraz ze swoją grubością, ogranicza przenikanie światła i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości19. Dzięki technikom oczyszczania tkanek możliwe stało się oglądanie perycytów w całej siatkówce z perspektywy wysokiej rozdzielczości19,20. Jednak metody te nie zostały jeszcze szeroko zastosowane w badaniu perycytów siatkówki myszy. W tym badaniu podejście do oczyszczania tkanek oparte na rozpuszczalniku znacznie zwiększyło naszą zdolność do wizualizacji perycytów w unaczynieniu siatkówki, umożliwiając nam uzyskanie obrazów stosu Z o wysokiej rozdzielczości za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Perycyty, rozmieszczone wzdłuż drzewa mikrokrążenia, odgrywają istotną rolę w złożonej przestrzennej i czasowej dystrybucji krwi w sieci naczyń włosowatych siatkówki22. Ich wysoce plastyczna morfologia i adaptacyjne zdolności kurczliwe sprawiają, że perycyty idealnie nadają się do regulacji przepływu krwi w naczyniach włosowatych w odpowiedzi na lokalną aktywność neuronalną w warunkach fizjologicznych i patologicznych23. Jako kluczowy gracz bariery krew-siatkówka lub sprzężenia nerwowo-naczyniowego siatkówki, perycyty siatkówki są również przyciągane w utrzymaniu neowaskularyzacji, angiogenezy i transmigracji leukocytów24.

Jako ograniczenie techniczne należy pamiętać, że oprócz PDGFR-β do identyfikacji perycytów wykorzystano również inne markery, takie jak NG-2 i CD13 22,24,25. Dlatego wybór odpowiedniego markera specyficznego dla perycytów, aby jednoznacznie wykazać perycyty, jest nadal wyzwaniem. Badanie to dostarcza dalszych dowodów na to, że PDGFR-β jest lepszym kandydatem do ujawnienia cech morfologicznych perycytów.

Podsumowując, wykazaliśmy, że połączenie retro-orbitalnego wstrzyknięcia fluorescencyjnej lektyny pomidorowej, barwienia immunofluorescencyjnego i oczyszczania tkanek umożliwiło uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających szczegółową morfologię perycytów w unaczynieniu siatkówki myszy w warunkach fizjologicznych. Odkrycia te sugerują, że metoda ta może być cenna dla przyszłych badań nad zmianami perycytów siatkówki w warunkach patologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 7244480), Fundusz Innowacji CACMS (nr . CI2021A03407), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 82004492) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Instytutów Badawczych Opieki Społecznej (nr ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Chronić przed światłem
Alexa Fluor 488 osł anty-kozi IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Chronić przed światłem
Mysz C57BL/6Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
System obrazowania konfokalnegoOlympusFV1200
Goat anty-PDGFR-βPrace badawczo-rozwojoweAF104225 µ g 
Oprogramowanie ImarisOxford Instrumentsv.9.0.1
Lektyna Lycopersicon esculentum (Pomidor), DyLight594Thermo Fisher ScientificL324711 mg
Probówka do mikrowirówekAxygenMCT-150-C1,5 ml
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-12110 ml
Panoramiczny skaner plastrów tkanekOlympusVS120-S6-W
Photoshop i  IlustracjaAdobeCS6
RapiClear 1.52 SolutionSunJin LabRC15200110 ml
Płytka sześciodołkowaCostar3335
Nożyczki sprężynowe Fine Science Tools15003-08
Szkiełko mikroskopowe Superfrost PlusThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733(2018).
  2. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546(2013).
  3. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296(2017).
  4. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  5. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
  6. Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
  7. Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807(2022).
  8. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742(2021).
  9. Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).
  10. Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).
  11. Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
  12. Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
  13. Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
  14. Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  15. Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401(2016).
  16. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
  17. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  18. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  20. Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
  21. Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).
  22. Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  23. Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Retinal PericytesRetinal VasculatureImmunofluorescent StainingTissue ClearingConfocal MicroscopyThree Dimensional ImagingTomato Lectin LabelingPDGFR Beta StainingWhole Mount RetinaMorphological Analysis

Powiązane artykuły