Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Perycyty siatkówki są niezbędne dla rozwoju naczyń krwionośnych i stabilności siatkówki, odgrywając kluczową rolę w utrzymaniu integralności układu naczyniowego siatkówki. Aby zapewnić szczegółowy wgląd w charakterystykę morfologiczną perycytów, w badaniu opisano nowe podejście łączące retro-orbitalne wstrzyknięcie czynnika fluorescencyjnego, barwienie immunofluorescencyjne i leczenie oczyszczania tkanek. Po pierwsze, fluorescencyjną lektynę pomidorową wstrzyknięto do zatoki zaoczodołowej żywej myszy w celu oznaczenia unaczynienia siatkówki. Po 5 minutach mysz została złożona w ofierze, a jej nienaruszona siatkówka została ostrożnie usunięta z miseczki siatkówki i immunofluorescencyjnie wybarwiona receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β odsłonić perycyty. Dodatkowo wybarwioną siatkówkę potraktowano odczynnikiem do oczyszczania tkanek i w całości zamontowano na szkiełku mikroskopowym. Dzięki tym metodom wyraźnie obserwowano unaczynienie siatkówki i perycyty w przezroczystej siatkówce. Pod mikroskopem konfokalnym uzyskaliśmy więcej możliwości wykonywania zdjęć o wysokiej rozdzielczości w celu dalszej rekonstrukcji i analizy cech morfologicznych perycytów wzdłuż drzewa naczyniowego siatkówki w widoku trójwymiarowym. Metodologicznie protokół ten oferuje skuteczne podejście do wizualizacji perycytów w obrębie naczyń krwionośnych siatkówki, dostarczając cennych informacji na temat ich roli zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.
Wprowadzenie
Perycyty siatkówki są osadzone w błonie podstawnej wzdłuż abluminalnej strony komórek śródbłonka naczyniowego, wyświetlając podobny do siatki wzór procesów krótkiego zasięgu owiniętych wokół naczyń krwionośnych siatkówki1. Ten bliski kontakt między perycytami a unaczynieniem siatkówki przyczynia się do utrzymania homeostazy środowiskowej siatkówki2. Chociaż liczne badania dostarczyły morfologicznych dowodów na istnienie perycytów w unaczynieniu siatkówki, większość naszej wiedzy na temat cech morfologicznych perycytów siatkówki pochodzi z konwencjonalnych technik histologicznych3.
Zgodnie z tymi badaniami, zaprojektowaliśmy to badanie, aby skutecznie pokazać więcej szczegółów morfologicznych perycytów w mikrokrążeniu siatkówki, łącząc tradycyjne techniki histologiczne z nowoczesnymi, najnowocześniejszymi metodami naukowymi. Podejście to łączy w sobie trzy kluczowe techniki: retroorbitalne wstrzykiwanie fluorescencyjnej lektyny pomidorowej żywym myszom, barwienie immunofluorescencyjne za pomocą β receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFR-β) oraz strategię oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika. Retro-orbitalne wstrzykiwanie fluorescencyjnej lektyny pomidorowej okazało się skuteczne i niezawodne w obserwacji unaczynienia siatkówki myszy zarówno in vivo, jak i in vitro4,5. PDGFR-β służy jako powszechnie stosowany biomarker do barwienia immunofluorescencyjnego perycytów6. Aby uchwycić obrazy perycytów o wysokiej rozdzielczości w grubszych i pełnych siatkówkach, strategia oczyszczania tkanek zwiększa przezroczystość histologiczną2,7,8.
Chociaż każda z tych technik była stosowana indywidualnie w badaniach siatkówki, ich łączna kompatybilność do badania perycytów w unaczynieniu siatkówki myszy pozostaje niepewna. Ponieważ średnia grubość siatkówki myszy wynosi około 180-220 μm9, znakowanie przeciwciałami i obrazowanie konfokalne w tej grubej tkance bez leczenia oczyszczającego często skutkuje wysokimi sygnałami tła, komplikując obserwację relacji przestrzennej między perycytami a naczyniami krwionośnymi10. Dzięki opisanym tutaj pejściom staramy się zapewnić prostą metodę wizualizacji perycytów w obrębie naczyń krwionośnych siatkówki w trójwymiarowym (3D) widoku pod mikroskopem konfokalnym. Ta zwiększona informacja komórkowa z perycytów w unaczynieniu siatkówki może poprawić naszą wiedzę na temat homeostazy środowiskowej siatkówki i podkreślić potencjalne strategie ochrony naczyń krwionośnych, poprawiając w ten sposób wyniki funkcjonalne w zaburzeniach naczyniowych siatkówki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Do tego badania wykorzystano trzy młode dorosłe samce myszy C57BL/6 (w wieku 8-10 tygodni, o wadze 20-25 g). Trzymano je w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością oraz umożliwiono swobodny dostęp do pożywienia i wody. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (nr zatwierdzenia 2023-03-14-04) i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996).
1. Retroorbitalne wstrzyknięcie in vivo fluorescencyjnej lektyny pomidorowej
- Wstrzyknąć dootrzewnowo 50 mg/kg pentobarbitalu w celu znieczulenia myszy. Oceń głębokość znieczulenia, oceniając brak reakcji na bodziec szczypania palca u nogi.
- Umieść mysz w prawej bocznej pozycji leżącej z głową skierowaną w lewo.
- Delikatnie przyciśnij dwa palce do obszaru okołooczodołowego, aby odsłonić lewe oko myszy i umożliwić najłatwiejsze podanie wstrzyknięcia do lewej zatoki zaoczodołowej zwierzęcia11.
- Użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 27G, aby delikatnie wbić około 2-3 mm w zatokę żylną oczodołową myszy z skosem na igle skierowanym do przodu pod kątem 45°.
- Wstrzyknąć 0,1 ml (1 mg/ml) fluorescencyjnej lektyny pomidorowej do oczodołowej zatoki żylnej myszy.
2. Perfuzja i enukleacja oczu
- Po 5 minutach od wstrzyknięcia zaoczodołowego wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór tribromoetanolu (250 mg/kg) w celu głębokiego znieczulenia myszy. Następnie poddaj zwierzę eutanazji poprzez wykrwawienie i perfuzję serca. Gdy oddech przestanie oddychać, otwórz klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi12.
- Gdy oddech ustanie, otwórz klatkę piersiową nożyczkami chirurgicznymi. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne z wyprzedzeniem i operuj w dygestorium. Użyj igły 24G i wprowadź ją 2 mm do lewej komory serca przez wierzchołek lewej komory. Przeprowadzić perfuzję z szybkością 3 ml / min z 20 ml 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 20 ml 4% formaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4).
- Połóż ofiarowaną mysz na boku i usuń skórę zakrywającą oczy nożyczkami. Wyłuszczeć oczy nożyczkami i kleszczami.
- Przeciąć nerw wzrokowy i otaczające go tkanki, a następnie wyjąć oko i przenieść na 12-dołkową płytkę w celu utrwalenia po utrwaleniu w 4% formaldehydzie w 0,1 M PB przez 2 godziny.
- Kriochronić tkankę w 25% sacharozie w 0,1 M PB (pH 7,4) w temperaturze 4 °C, aż opadnie na dno roztworu.
UWAGA: Ponieważ tkanka oka dobrze odwadnia się w roztworze sacharozy, siatkówkę można łatwiej i całkowicie odłączyć, co ułatwia późniejsze kompleksowe badania.
3. Rozwarstwienie siatkówki
- Przenieść oczy na szalkę Petriego zawierającą 0,1 M PB (pH 7,4) za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
- Przebij krawędź rogówki ostrymi nożyczkami, przetnij wokół rogówki i tęczówki i wyrzuć.
- Użyj kleszczy, aby usunąć soczewkę i ciało szkliste. Następnie odciągnij siatkówkę w kształcie miseczki od środka oka za pomocą cienkich kleszczyków. Przepłukać siatkówkę za pomocą 0,1 M PB (pH 7,4) na czystej szalce Petriego.
4. Barwienie immunofluorescencyjne i oczyszczanie tkanek siatkówki
- Ostrożnie usunąć siatkówkę w kształcie miseczki i inkubować ją w 2% roztworze Triton X-100 w 0,1 M PB (pH 7,4) przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przenieść siatkówkę do roztworu blokującego (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% azydku sodu + 10% normalnej surowicy osła) i obracać z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przenieść siatkówkę do roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała koziego anty-PDGFR-β (10 μg/ml) w buforze rozcieńczającym (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% azydek sodu + 1% normalna surowica osła) w probówce do mikrowirówki i obracać na wytrząsarce przez 2 dni w temperaturze 4 °C.
- Przemyj siatkówkę 2x buforem do przemywania (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je przez noc w buforze do płukania w temperaturze 4 °C na shakerze.
- Następnego dnia przenieść siatkówkę do zmieszanego roztworu zawierającego 1 mg/ml przeciwciało drugorzędowe anty-kozy 488 i 0,2 ng/ml fluorescencyjnego jądrowego 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) o stężeniu 0,2 ng/ml w probówce do mikrowirówki i obracać z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.
- Przemyć siatkówkę w 6-dołkowej płytce z buforem do przemywania przez 1 godzinę, 2x, w temperaturze pokojowej. Siatkówkę należy przechowywać przez noc w buforze do przemywania na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić obrazowanie i analizę zgodnie z krokiem 5, aby uzyskać widok przed oczyszczeniem tkanek.
- Przenieść siatkówkę do odczynnika oczyszczającego tkanki i delikatnie obracać ją z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Po zabiegu oczyszczania tkanek przepłukać siatkówkę w kształcie miseczki 0,1 M PB (pH 7,4) na czystej szalce Petriego.
- Wykonaj 4 promieniowe nacięcia sięgające około 2/3 promienia siatkówki za pomocą nożyczek sprężynowych, aby uzyskać kształt płatka.
- Spłaszcz i zamontuj siatkówkę na szkiełku mikroskopowym, a następnie usuń nadmiar PB za pomocą małego kawałka chłonnego papieru. Trzymaj wewnętrzną stronę siatkówki skierowaną do góry na szkiełku.
- Okrąż zamontowaną siatkówkę za pomocą przekładki i wypełnij lukę świeżym odczynnikiem do oczyszczania tkanek i szkiełkiem nakrywkowym.
5. Obrazowanie i analizy
- Uzyskaj zewnętrzne widoki siatkówki przed (po wykonaniu kroku 4.6) i po zabiegu oczyszczania tkanek.
- Zeskanuj widoki montażowe oznakowanej siatkówki za pomocą panoramicznego skanera do wycinania tkanek. Użyj soczewki obiektywowej 2x o NA 0,08.
- Wykonuj zdjęcia w większym powiększeniu za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w następujące soczewki obiektywowe: soczewka 10x z NA 0,40 i soczewka 40x z NA 0,95. Ustaw otworek konfokalny na 152 μm (soczewka obiektywu 10x) i 105 μm (soczewka obiektywu 40x). Ustaw rozdzielczość przestrzenną przechwytywania obrazu na 1024 x 1024 pikseli (obiektyw 10x) i 640 x 640 pikseli (obiektyw 40x).
- Zrób 50 zdjęć (stos Z) w klatkach 2 μm z oznaczonej siatkówki. Zintegruj wszystkie obrazy w jednym ostrym trybie w trybie projekcji/topografii. Aby ustawić, kliknij Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową > Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej > Ustaw rozmiar kroku > Wybierz wzór głębi > przechwytywanie obrazu > serii Z.
- Rejestruj obrazy przy użyciu następujących długości fal wzbudzenia i emisji dla różnych sygnałów fluorescencyjnych: zielone sygnały fluorescencyjne przy 499 nm i 519 nm; czerwone sygnały fluorescencyjne przy 591 nm i 618 nm oraz niebieskie sygnały fluorescencyjne przy 401 nm i 421 nm.
- Zrekonstruuj obrazy w trójwymiarowym wzorze, importując obrazy konfokalne stosu Z do oprogramowania analitycznego, wybierając opcję Dodaj nowe powierzchnie > Wybierz ustawienia głośności > Wybierz kanał źródłowy > Dostosuj wyświetlanie > Dostosuj kąt powierzchni > migawki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W widokach zewnętrznych całej siatkówki, przejrzystość tkanki siatkówki po zastosowaniu zabiegu klarowania była większa w porównaniu do siatkówki niepoddanej klarowaniu (Rysunek 1).
Do badania histologicznego całej siatkówki wykorzystano retroorbitalne wstrzyknięcie fluorescencyjnej lektyny pomidorowej w celu znakowania naczyń krwionośnych siatkówki na czerwono, natomiast perycyty siatkówki wybarwiono na zielono za pomocą PDGFR-β (Rysunek 2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu szczegółowo opisaliśmy techniczny proces demonstrowania morfologii perycytów w unaczynieniu siatkówki za pomocą retro-orbitalnego wstrzykiwania fluorescencyjnej lektyny pomidorowej, badania immunofluorescencyjnego za pomocą PDGFR-β i oczyszczania tkanek na bazie rozpuszczalnika. Wyniki pokazują, że techniki te są wysoce kompatybilne w podświetlaniu perycytów w całej siatkówce. Połączenie tych metodologii oferuje skuteczne podejście do wizualizacji cech morfologicznych perycytów w unaczynieniu siatkówki ze s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 7244480), Fundusz Innowacji CACMS (nr . CI2021A03407), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 82004492) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Instytutów Badawczych Opieki Społecznej (nr ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Chronić przed światłem |
| Alexa Fluor 488 osł anty-kozi IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | Chronić przed światłem |
| Mysz C57BL/6 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | SCXK (Jing) 2021-0006 | |
| System obrazowania konfokalnego | Olympus | FV1200 | |
| Goat anty-PDGFR-β | Prace badawczo-rozwojowe | AF1042 | 25 µ g |
| Oprogramowanie Imaris | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| Lektyna Lycopersicon esculentum (Pomidor), DyLight594 | Thermo Fisher Scientific | L32471 | 1 mg |
| Probówka do mikrowirówek | Axygen | MCT-150-C | 1,5 ml |
| Normalna surowica osła | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 10 ml |
| Panoramiczny skaner plastrów tkanek | Olympus | VS120-S6-W | |
| Photoshop i Ilustracja | Adobe | CS6 | |
| RapiClear 1.52 Solution | SunJin Lab | RC152001 | 10 ml |
| Płytka sześciodołkowa | Costar | 3335 | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Szkiełko mikroskopowe Superfrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 25 mm x 75 mm x 1 mm |
Bibliografia
- Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733(2018).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546(2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296(2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
- Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
- Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807(2022).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742(2021).
- Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).
- Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).
- Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401(2016).
- Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
- Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
- Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
