Artykuł metodologiczny

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

DOI:

10.3791/67439

⸱

7 lutego 2025

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to dwuwarstwowe nanocząsteczki lipidowe uwalniane przez komórki do transportu bioaktywnych ładunków, takich jak białka, RNA i DNA, do komunikacji międzykomórkowej. Badanie przesłuchów między komórkami w homeostazie i chorobach mięśni za pośrednictwem EV ma znaczący potencjał w pogłębieniu naszej wiedzy na temat rozwoju, regeneracji i atrofii mięśni. Jednak obecne protokoły izolacji EV pochodzących z mięśni szkieletowych (SkM-EVs) stoją przed wyzwaniami w osiągnięciu wysokiej czystości i wydajności, głównie ze względu na trudności w uwalnianiu EV z tkanek mięśniowych bez naruszania błon komórkowych. W artykule przedstawiono skuteczny protokół izolacji SkM-EV, obejmujący mechaniczne odłączanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie. Kroki te są zoptymalizowane w celu zwiększenia uwalniania EV z tkanek mięśniowych, dając SkM-EV o wysokiej czystości. Następnie przeprowadza się cytometrię nanoprzepływową, test BCA i test Western blot w celu scharakteryzowania ilości i jakości wyizolowanych SkM-EV. Protokół ten daje nadzieję na stworzenie niezawodnej platformy do uzyskiwania EV pochodzących z tkanek w celu przyspieszenia badań podstawowych, diagnostyki chorób i dostarczania leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nano-size, związane z błoną cząsteczki uwalniane przez komórki do środowiska zewnątrzkomórkowego. Te EV przenoszą kwasy nukleinowe, białka i lipidy, aby modulować wiele szlaków sygnałowych po wychwycie przez komórki biorcy. W szczególności EV wyizolowane z mięśni szkieletowych (SkM-EVs) są zaangażowane w degenerację, regenerację i wzrost mięśni poprzez transfer miogennych regulatorowych mikroRNA lub czynników transkrypcyjnych1,2,3,4. Ponieważ nasza wiedza na temat subpopulacji i cech SkM-EV wciąż ewoluuje, pęcherzyki te są obiecujące jako biomarkery dla wczesnej diagnostyki5,6 oraz jako cele terapeutyczne w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych. Ta rozwijająca się dziedzina oferuje ekscytujące możliwości zarówno w zakresie badań patologicznych, jak i zastosowań klinicznych.

Obecne badania nad SkM-EVs koncentrują się głównie na tych uzyskanych z supernatantów do hodowli komórkowych po hodowli ex vivo2,7,8, co budzi obawy dotyczące wierności docelowych linii komórkowych po kolejnych przejściach i podatności cech EV na zmiany w sztucznych środowiskach. Podkreśla to potrzebę izolowania SkM-EV bezpośrednio z tkanek mięśniowych, aby uniknąć wpływów hodowli ex vivo i lepiej odtworzyć warunki in vivo. Chociaż opracowano kilka podejść do izolowania EV z tkanek mięśniowych9,10, badania nadal różnią się znacznie pod względem szczegółów protokołu, co wpływa na spójność i porównywalność. Pilnie potrzebny jest ustandaryzowany protokół izolacji i charakterystyki SkM-EV, aby zapewnić wiarygodność we wszystkich powiązanych badaniach.

Biorąc pod uwagę fizjologiczne cechy mięśni szkieletowych, opracowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania SkM-EVs z próbek mięśni szkieletowych gryzoni za pomocą mechanicznego oddzielania, dysocjacji enzymatycznej, filtracji i ultrawirowania różnicowego. Dzięki kompleksowej analizie przy użyciu cytometrii nanoprzepływowej, testu BCA i testu Western blot stwierdziliśmy, że protokół ten konsekwentnie daje SkM-EV o wysokiej czystości i ilości w ograniczonym czasie. Może być stosowany do próbek mięśni szkieletowych w różnych stanach, w tym w ostrych i przewlekłych urazach mięśni. Ponadto, przy odpowiednich dostosowaniach, metoda ta może być dostosowana do tkanek mięśniowych pacjentów lub innych modeli zwierzęcych. Standaryzacja procesu izolacji SkM-EV jest niezbędna do zapewnienia spójnej jakości SkM-EV, ułatwienia porównań cech pojazdów elektrycznych – takich jak wydajność, rozmiar, skład ładunku i funkcja – oraz zwiększenia ich potencjalnych zastosowań jako biomarkerów diagnostycznych, a także zwiększenia naszej wiedzy na temat ich roli w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z tkanki mięśni szkieletowych za pomocą mechanicznego oddzielania, dysocjacji enzymatycznej, filtracji i ultrawirowania różnicowego. Pozwala na izolację EV z pojedynczych lub połączonych grup mięśni kończyn gryzoni, w tym kości piszczelowej przedniej (TA), prostownika długiego palca (EDL), płaszczkowatego (SOL), mięśnia brzuchatego łydki (GAS) i mięśnia czworogłowego uda (QUA). Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Georgii, a badanie było zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach. Zwierzęta były trzymane w obiektach dla zwierząt na Wydziale Nauk o Zwierzętach i Mleczarstwie na Uniwersytecie Georgii. W tym badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy typu dzikiego (C57BL/6J), z tkankami pobranymi od myszy uśmierconych w wieku 3 miesięcy. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Mechaniczne oderwanie grup mięśniowych od myszy

  1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Ogolić obie tylne kończyny.
  2. Zamocuj nogę myszy na sterylnej płytce z przednią stroną nogi skierowaną do góry (Rysunek 1A).
  3. Wykonaj małe nacięcie (5 mm) w skórze po bocznej stronie kostki myszy za pomocą nożyczek preparacyjnych.
  4. Ostrożnie włóż jedno ostrze nożyczek w nacięcie, umieszczając je pod skórą, ale nie w tkance mięśniowej poniżej. Następnie przetnij skórę w górę w kierunku kolana, aby przedłużyć długość nacięcia.
  5. Chwyć skórę wzdłuż nacięcia za pomocą szorstko zakończonej pęsety i rozszerz otwór, aż mięsień będzie widoczny.
  6. Zlokalizuj mięsień TA, który biegnie od kolana do kostki po bocznej stronie kości piszczelowej11, i użyj pęsety z ostrym końcem, aby chwycić i oderwać cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającej mięsień (Rysunek 1B).
  7. W pobliżu kostki zidentyfikuj dwa ścięgna na końcu TA, jedno bezpośrednio połączone z mięśniem TA, a drugie ścięgno EDL, które jest mniejsze i znajduje się obok ścięgna TA po stronie bocznej. Przeciąć oba ścięgna za pomocą nożyczek preparacyjnych.
  8. Chwyć oba ścięgna szorstko zakończonym pęsetą. Następnie użyj kolejnej pary szorstkich lub ostro zakończonych pęset, aby oddzielić ścięgna, oddzielając w ten sposób TA od EDL (Rysunek 1C).
  9. Podnieś TA za świeżo zerwane ścięgno za pomocą szorstko zakończonej pęsety. Następnie przetnij ścięgno TA w pobliżu kolana za pomocą nożyczek preparacyjnych, usuwając w ten sposób mięsień. Powtórz ten proces, aby usunąć EDL i przechowywać oba mięśnie w PBS na lodzie.
  10. Zwolnij nogę i odwróć mysz tak, aby tylna powierzchnia była skierowana do góry.
  11. Gdy skóra na nodze jest teraz częściowo usunięta, przetnij skórę w pobliżu kostki za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie użyj szorstko zakończonej pęsety, aby chwycić i oderwać skórę w górę w kierunku tylnej części kolana, odsłaniając GAZ.
  12. Przeciąć ścięgno GAS w pobliżu kostki za pomocą nożyczek preparacyjnych (Rysunek 1D).
  13. Chwyć ścięgno GAS szorstko zakończonym pęsetą i podnieś je do góry, aby odsłonić spód GAS.
  14. Zlokalizuj małe ścięgno SOL na spodzie GAS w pobliżu kolana (gdzie GAS jest nadal podłączony). Przeciąć ścięgno SOL za pomocą nożyczek preparacyjnych, powodując skurcz SOL w górę (Rysunek 1E).
  15. Chwyć zerwane ścięgno SOL pęsetą z ostrymi końcami i delikatnie je podnieś, odrywając w ten sposób SOL od spodu GAS.
  16. Przeciąć koniec SOL w miejscu, w którym przyczepia się do odciętego końca GAS, za pomocą nożyczek preparacyjnych, oddzielając w ten sposób dwa mięśnie. Przechowywać SOL w PBS na lodzie.
  17. Odetnij koniec GAS w pobliżu kolana i umieść go w PBS na lodzie.
  18. Po usunięciu czterech wymienionych mięśni poniżej kolana, odwróć mysz tak, aby przednia twarz była skierowana do góry.
  19. W razie potrzeby obierz skórę dalej szorstko zakończonym pęsetą, aby odsłonić QUA. Ustaw nogę myszy pod kątem 90°, aby zmusić QUA do zgięcia. Przetnij ścięgno najbliżej kolana za pomocą nożyczek preparacyjnych.
    1. Oddziel QUA od kości udowej, przecinając mięsień i kość, aż QUA będzie połączone tylko ścięgnem bliższym (Rysunek 1E). Następnie przeciąć ścięgno bliższe i usunąć QUA. Umieść QUA w PBS na lodzie.
  20. Upewnij się, że po odwarstwieniu mięśni kość piszczelowa i strzałkowa są wyraźnie odsłonięte (Rysunek 1F).
  21. Przepłucz mięśnie kilka razy PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak sierść i krew (Rysunek 1G). Następnie delikatnie osusz mięśnie ręcznikami papierowymi. Użyj wagi analitycznej, aby zmierzyć masę mięśniową, która zostanie później wykorzystana do obliczenia EV zebranej na gram mięśni.

2. Enzymatyczna dysocjacja oderwanych fragmentów mięśni

  1. Delikatnie usuń ścięgna mięśniowe z próbki mięśniowej za pomocą pęsety z ostrym końcem, pęsety do odłamków, skalpeli lub nożyczek (Rysunek 2A).
  2. Po usunięciu ścięgna przetnij mięsień wzdłuż włókien mięśniowych (od ścięgna do ścięgna) na kawałki mięśni o grubości 1 mm za pomocą nożyczek lub skalpela, aby zwiększyć stosunek powierzchni do objętości (Rysunek 2B,C).
    UWAGA: Staraj się ograniczyć uszkodzenia włókien mięśniowych podczas cięcia. W przypadku większych mięśni, takich jak TA, GAZ i QUA, wykonaj dodatkowe cięcia w porównaniu z mniejszymi mięśniami, takimi jak EDL i SOL, aby zapewnić mniej więcej równy stosunek powierzchni do objętości we wszystkich próbkach mięśni (Rysunek 2D).
  3. Przygotuj 10 ml świeżego buforu enzymów trawiennych (DEB) dla każdej myszy i trzymaj go na lodzie do czasu użycia.
    1. Aby przygotować DEB, należy zmieszać 2 mg enzymu kolagenazy II na 1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 1% roztworem penicyliny i streptomycyny. Po wymieszaniu przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm.
    2. Upewnij się, że DEB ma aktywność enzymatyczną ponad 250 jednostek. Wirować DEB, aż roztwór zostanie dokładnie wymieszany, a proszek enzymu kolagenazy II nie będzie już widoczny.
  4. Podziel tkankę mięśniową na podwielokrotności, z których każda zawiera 20 mg tkanki mięśniowej. Następnie dodaj 1 ml DEB do każdej podwielokrotności w celu dysocjacji enzymatycznej.
  5. Inkubować mieszaninę DEB i mięśni na wytrząsarce w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 12 godzin z prędkością wytrząsania 100 obrotów na minutę (rpm) (Rysunek 2E).

3. Filtracja i wirowanie z niską prędkością w celu wzbogacenia SkM-EV

UWAGA: Ustaw wirówkę chłodniczą na 4 °C i uruchamiaj ją, aż osiągnie ustawioną temperaturę. Wszystkie potrzebne probówki i próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będą gotowe do użycia.

  1. Postępując zgodnie z procedurami trawienia enzymatycznego, upewnij się, że nie są widoczne żadne dostrzegalne kawałki mięśni (Rysunek 3A). Przed odwirowaniem w lodówce należy wyekstrahować 10 μl roztworu z mieszaniny DEB-muscle i przenieść go do probówki o pojemności 0,2 ml w celu zbadania żywotności komórek, jeśli to konieczne.
  2. Przygotuj i oznacz nowe puste probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ustaw filtr 0,45 μm i strzykawkę 5 ml, wyjmując tłok (nie wyrzucaj) i wkręcając piastę w górny koniec filtra 0,45 μm. Ustaw filtr tak, aby dolny koniec został umieszczony w nowo oznaczonej pustej tubie ( Rysunek 3D). Przefiltruj 1x PBS przez filtr 0,2 μm.
  3. Odwirować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i 4 °C, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia (Rysunek 3B). Przenieść supernatant (około 1 ml) do strzykawki za pomocą mikropipety P200 (Rysunek 3C, E).
  4. Ponownie włożyć tłok strzykawki i powoli przepchnąć supernatant przez filtr, pozwalając mu przejść i zebrać się w nowo oznaczonej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (Rysunek 3F).
  5. Ponownie usunąć tłok i odpipetować około 200 μl 1x PBS do strzykawki.
  6. Ponownie włóż tłok i powoli przepchnij 200 μl 1x PBS przez filtr (Rysunek 3G), aby usunąć pozostały supernatant z filtra i do oznaczonej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej.
  7. Powtórz proces filtracji dla innych probówek, używając nowego filtra dla każdej próbki tkanki.
  8. Po filtracji upewnij się, że roztwór jest przezroczysty i pozbawiony resztek kawałków mięśni (Rysunek 3H).

4. Ultrawirowanie różnicowe do oczyszczania SkM-EV

UWAGA: Ustaw wirówkę chłodniczą na 4 °C i uruchamiaj ją, aż osiągnie ustawioną temperaturę. Wszystkie potrzebne probówki i próbki należy przechowywać na lodzie i są gotowe do użycia.

  1. Przefiltrowany roztwór przenieść do nowych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml (odpowiednich dla 200 000 x g). Zrównoważ wszystkie mikroprobówki dodatkowym 1x PBS, aby zapewnić równą objętość przed umieszczeniem ich w mikro-ultrawirówce.
  2. Po upewnieniu się, że objętość wszystkich probówek jest równa, zamknij probówki i umieść je w wirniku mikro-ultrawirówki, która ma być zrównoważona (Rysunek 4A).
  3. Włącz mikro-ultrawirówkę i ustaw ją tak, aby pracowała przez 1 godzinę przy 100 000 x g i 4 °C (Rysunek 4B).
  4. Umieść wirnik załadowany probówkami w mikro-ultrawirówce, zamknij pokrywę i włącz próżnię (Rysunek 4C).
  5. Gdy próżnia osiągnie poziom 2, naciśnij przycisk start i poczekaj, aż proces wirowania zostanie zakończony ( Rysunek 4D).
  6. Po zakończeniu cyklu mikro-ultrawirówki kliknij przycisk próżni, aby ponownie zwiększyć ciśnienie w komorze przed wyjęciem wirnika i rur. Trzymaj rurki na lodzie i ustaw je pionowo, aby nie naruszyć granulki.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety P200, unikając zakłócenia osadu (Rysunek 4E).
  8. Wysunąć końcówkę, a następnie dodać 50 μl 1x PBS do probówki po usunięciu supernatantu za pomocą mikropipety P200. W przypadku próbek GAS i QUA dodać do 500 μl 1x PBS, aby ułatwić rozpuszczanie (Rysunek 4F).
  9. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P20 (lub mikropipety P200, jeśli dodano 500 μl), aż zostanie całkowicie rozdrobniony i nie będzie już widoczny.
  10. Zamknąć probówkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (krócej niż tydzień), -80 °C do długotrwałego przechowywania lub umieścić probówkę z powrotem na lodzie, jeśli próbka zostanie natychmiast scharakteryzowana za pomocą cytometrii nanoprzepływowej, Western blot lub innych testów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mięśni szkieletowych (SkM-EVs) zostały pomyślnie wyekstrahowane z różnych grup mięśni, w tym piszczela przedniego (TA), prostownika długiego palca (EDL), płaszczkowatego (SOL), mięśnia brzuchatego łydki (GAS) i mięśnia czworogłowego (QUA) od myszy typu dzikiego. Późniejszą charakterystykę tych SkM-EV przeprowadzono za pomocą cytometrii nanoprzepływowej, wyjaśniając ich charakterystyczne cechy, jak podsumowano w Tabeli 1. Co ciekawe, z zaledwie 1 g tk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół rozpoczyna się od wypreparowania grup mięśni kończyn tylnych od myszy lub pozyskania pośmiertnej ludzkiej tkanki mięśniowej w oparciu o dostępne protokoły16. Następujące procedury izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) obejmują trzy podstawowe sekcje: łagodne trawienie enzymatyczne tkanki w celu uwolnienia śródmiąższowych SkM-EV, filtracja i wirowanie z niską prędkością oraz ultrawirowanie. Na koniec stosuje się różne techniki profilowania izolowanych SkM-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Departament Obrony W81XWH2210261 (do Yao Yao).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 0,6 mlThermoFisher Scientific05-408-120
Mikroprobówka 1,5 ml (C) Probówki do mikrowirówek Eppendorf5720411009
1,5 mlThermoFisher Scientific3448Przezroczysta, wyskalowana, niesterylna
strzykawka BD 5 mlBecton Dickinson14-827-52 Końcówka Luer-Lok
Szkiełka do liczenia komórek, dwukomorowe do licznika komórekBio-Rad145-0011
Wirówka 5430REppendorf22620667
Roztwór czyszczącyNanoFCM Inc.
Kolagenaza IIWorthington Biochemical CorporationLS004176
DPBS (10x) Płyn (-wapń,-magnez)CytivaSH30378.02Końcowe użyte rozcieńczenie to 1x
DPBS/Zmodyfikowane (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure Zdalny dozownik wodyMillipore Sigma ZRXSP0D01
FA-45-30-11 Wirnik mikrowirówkiEppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
NanoAnalyzerprzepływu NanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 Piekarnik z protokołem ogólnymThermoFisher Scientific51028112Konwekcja grawitacyjna, 2,3 stopy sześciennej 120 V
Sonda MemGlow-488Cytoszkielet Inc.MG01-02
Pipeta Millipak SpecialMillipore Millipore SigmaTANKMPK02
Pipeta do penicyliny-streptomycynyGibco15070063
Pipet-Lite LTS L-1000XLS+Rainin17014382
Pipeta do Pipet-Lite LTS L-200XLS+Pipeta17014391
LTS L-20XLS+Rainin17014392
Końcówki do pipet ER LTS 1000µ L F 768G/8Rainin30808038
Końcówki do pipet ER LTS 20µ L F 960G/10Rainin30807966
Końcówki do pipet ER LTS 200µ L F 960G/10Rainin30807967
Koraliki do kontroli jakościNanoFCM Inc.
S110-AT Rotor o stałym kącienachylenia ThermoFisher Scientific455391,10,000 obr./min
Koraliki S16 exo 65-155nmNanoFCM Inc.
NożyczkiSPI, USA
Sorvall mX 150+ MikroultrawirówkaThermoFisher Scientific50135641
TC 20 Automatyczny licznik komórekBio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionPęseta Corning25-900-CI
SPI, USA
Probówki wirówkowe VWR 15 mlAvantor89039-668
Whatman Puradisc 13 FiltryCytiva6782-13040,45 &mikro; m wielkość porów
Myszy C57BL/6J typu dzikiegoLaboratorystock #000664
do Rainin do pipety do pipet Jackson

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, A., et al. Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level. Elife. 12, 89512(2023).
  2. Yamaguchi, A., et al. Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages. Front Immunol. 14, 1099799(2023).
  3. Takada, Y., et al. Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells. Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).
  4. Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques. Alcohol. 108, 1-9 (2023).
  5. Kargl, C. K., et al. Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice. Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).
  6. Vann, C. G., et al. Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle. Front Physiol. 13, 937899(2022).
  7. Anakor, E., et al. The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes. Cells. 11 (5), 845(2022).
  8. Mendhe, B., et al. Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury. Cells. 12 (4), 557(2023).
  9. Madison, R. D., Robinson, G. A. Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy. Neuroscience. 419, 46-59 (2019).
  10. Hanson, B., et al. EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).
  11. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. 190, e64557(2022).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  14. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  15. Baietti, M. F., et al. Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes. Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).
  16. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique. J Vis Exp. (91), e51812(2014).
  17. Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury. Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells. Regen Ther. 7, 1-7 (2017).
  20. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. J Vis Exp. (86), e50846(2014).
  21. Mozzetta, C. Isolation and culture of muscle stem cells. Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).
  22. Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers. Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).
  23. Ma, S., et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EV z mi ni szkieletowychdysocjacja enzymatycznaultrawirowanieizolacja tkanki mi niowejnano cytometria przep ywowaWestern blottest BCAkomunikacja mi dzykom rkowabiomarkery diagnostyczne

Powiązane artykuły