Artykuł metodologiczny

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

DOI:

10.3791/67445

⸱

11 października 2024

 , 
1Department of Biochemical Science and Technology, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translacyjna kontrola różnych genów pod wpływem stresu cieplnego jest kluczowym krokiem dla adaptacji roślin do środowiska. Ocena aktywności translacyjnej różnych genów może pomóc nam zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw odporności roślin, przyczyniając się do rozwoju upraw o zwiększonej tolerancji na stres w obliczu globalnych zmian klimatycznych. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię oceny efektywności translacji poprzez profilowanie polisomów w roślinach narażonych na stres cieplny. Procedura jest podzielona na trzy części: obróbka stresowa w przypadku Arabidopsis, test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych oraz obliczenie wydajności translacji poprzez wyizolowanie niepolisomalnego i polisomalnego RNA na podstawie profilu. W pierwszej części rośliny Arabidopsis są poddawane kontrolowanym warunkom stresu cieplnego, aby naśladować wyzwania środowiskowe. Zabieg polega na wystawieniu roślin na działanie wysokich temperatur przez określony czas, zapewniając stałą i powtarzalną indukcję stresu. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla badania fizjologicznych i molekularnych reakcji rośliny na stres cieplny. Druga część to test efektywności translacji z wykorzystaniem profilowania polisomowego. Polisomy są ekstrahowane przez wirowanie w gradionym smaku sacharozy, które oddziela mRNA na podstawie obciążenia rybosomalnego. Pozwala to na badanie zajętości rybosomów na mRNA, dostarczając wglądu w mechanizmy kontroli translacyjnej w warunkach stresu. W trzeciej części RNA jest izolowane zarówno z frakcji polisomalnych, jak i niepolisomalnych. Spike in RNA służy do dokładnego pomiaru ilości RNA w każdej frakcji. Obliczanie wydajności translacji przeprowadza się poprzez porównanie rozkładu mRNA w tych frakcjach w warunkach normalnego i stresu cieplnego. Czynności translacyjne określonych genów są dalej oceniane poprzez wykonanie ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) z RNA związanym z rybosomami i całkowitym RNA. Metodologia ta koncentruje się wyłącznie na skutkach stresu cieplnego, zapewniając szczegółowy protokół analizy regulacji translacyjnej w roślinach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tłumaczenie jest kluczowe dla organizmów do syntezy funkcjonalnych białek z mRNA, wspierając podstawowe funkcje komórkowe i procesy biologiczne, takie jak metabolizm i sygnalizacja, oraz umożliwiając reakcje na stres. Bez translacji komórki nie mogą wytwarzać ważnych białek, co wpływa na ich strukturę, funkcję i regulację, wpływając w ten sposób na podtrzymanie życia i wspieranie różnorodności biologicznej1,2. Dlatego kluczowe znaczenie ma badanie wydajności translacyjnej roślin. Tłumaczenie składa się z kilku podstawowych etapów. Po pierwsze, inicjacja zachodzi, gdy mRNA wiąże się z rybosomem, co jest ułatwione przez czynniki inicjujące, takie jak eIF u eukariontów, które identyfikują kodon start, zwykle AUG. Następnie następuje elongacja, gdy cząsteczki transferu RNA (tRNA), z których każda zawiera określone aminokwasy, sekwencyjnie wiążą się z rybosomem. Wiązania peptydowe tworzą się między sąsiednimi aminokwasami, wydłużając łańcuch polipeptydowy zgodnie z sekwencją mRNA. Wreszcie, terminacja jest inicjowana po napotkaniu kodonu stop (UAA, UAG lub UGA), rozpoznawanego przez czynniki uwalniające, które skłaniają rybosom do uwolnienia nowo zsyntetyzowanego białka. Podczas translacji różne eukariotyczne czynniki inicjacji (eIF), czynniki elongacji i rybosomalne RNA współpracują ze sobą, aby zapewnić dokładność i wydajność3,4.

Poprzednie badania wykazały, że modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w regulacji interakcji między eIF, a tym samym wpływają na efektywność translacji. Badania in vitro wykazały, że kinaza KINAZY KAZEINOWEJ 2 (CK2) fosforyluje eIF3c, eIF5 i eIF2β, aby zwiększyć ich interakcje ze sobą i z eIF15,6. W ciemności ligaza E3 KONSTYTUTYWNIE FOTOMORFOGENICZNA 1 (COP1) hamuje translację poprzez hamowanie fosforylacji S6K-RPS6 za pośrednictwem TOR. Niefosforylowany RPS6 nie jest w stanie tworzyć funkcjonalnych rybosomów, zatrzymując w ten sposób translację7. I odwrotnie, w warunkach świetlnych, SUPRESOR KINAZY PHYA 105 (SPA1) fosforyluje eIF2α, aby ułatwić składanie kompleksu eIF2 i promować inicjację translacji8. Odkrycia te podkreślają złożone mechanizmy kontrolne, które regulują translację w odpowiedzi na sygnały środowiskowe.

Umiarkowane bodźce środowiskowe mogą skutecznie wspierać procesy translacyjne ułatwiające wzrost, takie jak fotomorfogeneza8,9. Jednakże, gdy czynniki środowiskowe są nadmierne, nieruchome rośliny muszą wyewoluować odpowiednie mechanizmy regulacyjne, aby złagodzić szkody spowodowane stresem środowiskowym10. W poprzednich badaniach związanych z reakcjami roślin na stres większość koncentrowała się na regulacji na poziomie metabolicznym, hormonalnym i transkrypcyjnym11,12,13,14. Jednak ostatnie badania zaczęły podkreślać wpływ regulacji translacyjnej na tolerancję roślin na stres15,16,17. Rośliny mogą zwiększyć swoją tolerancję na stres poprzez zmniejszenie wydajności translacji, minimalizując w ten sposób niepotrzebne zużycie energii. Ze względu na tworzenie się niebłoniastych granulek stresu w komórkach roślinnych, nieulegające translacji mRNA i związane z nim białka agregują się w nich w celu zmniejszenia wydajności translacji18. Jednym z powszechnych stresów środowiskowych, z którymi często spotykają się rośliny, jest stres cieplny, który, jak doniesiono, indukuje tworzenie się granulek stresu w komórkach roślinnych19,20. Globalny wzrost średnich temperatur spowodowany globalnym ociepleniem poważnie wpływa na plony21. Dlatego kluczowe znaczenie ma badanie fizjologicznej regulacji roślin pod wpływem stresu cieplnego. Poprzednie badanie wykazało, że obróbka cieplna pszenicy spowodowała zmniejszenie mRNA związanego z polisomami. Jednak mRNA przechowywane w granulkach stresu zostały uwolnione i ponownie związane z rybosomami, co ułatwiło translację po wyzdrowieniu22. Ponadto w poprzednich badaniach porównano ekspresję genów między całkowitym mRNA a mRNA związanym z polisomami w zanurzonych roślinach16. Wyniki wskazały, że poziomy mRNA w stanie stacjonarnym związane z kwasem abscysynowym i reakcjami na stres abiotyczny nieznacznie wzrosły po zanurzeniu. Co więcej, ilość mRNA związanych z polisomami znacznie wzrosła. Wyniki te sugerują, że regulacja translacji może odgrywać bardziej krytyczną rolę w kontrolowaniu tolerancji na stres u roślin. Dlatego skuteczna metoda izolacji polisomalnego RNA ma kluczowe znaczenie dla badania translatomii próbek poddanych działaniu stresu.

W tym protokole zmodyfikowaliśmy metodę izolacji RNA z ryzykownej i obszernej ekstrakcji fenolu/chloroformu metodą wytrącania LiCl na metodę ekstrakcji fenolu/tiocyjanianu guanidyny na małą skalę, która wymaga mniejszej objętości. Pierwsza metoda polega na bezpośrednim mieszaniu z frakcjami polisomalnymi, co skutkuje większą ilością odpadów eksperymentalnych9,15,23. W przeciwieństwie do tego, to zmodyfikowane podejście wykorzystuje zasady gęstości różnicowej: polisomalny RNA jest najpierw mieszany z roztworem o wysokiej zawartości soli i bez cukru, a następnie wytrącany przez ultrawirowanie. Następnie ekstrakcję RNA przeprowadza się przy użyciu niewielkiej objętości odczynnika tiocyjanianu fenolu/guanidyny. Ta metoda skutecznie ogranicza wytwarzanie odpadów organicznych, dzięki czemu nasz eksperyment jest bardziej przyjazny dla środowiska. Dodatkowo stosowane rozpuszczalniki organiczne mają niższą toksyczność. Te powody skłoniły nas do odpowiedniego dostosowania i ulepszenia procedur eksperymentalnych. Ponadto poprzednie metody nie zapewniały kompleksowego protokołu do obliczania wydajności translacji przy użyciu normalizacji skokowej, co jest niezbędne do bardziej szczegółowych analiz transatomowych.

Tutaj opisujemy profilowanie polisomów i protokół izolacji polisomalnego RNA do badania efektywności translacji i analiz transatomowych u Arabidopsis pod wpływem stresu szoku cieplnego. Protokół ten został wykorzystany do oceny wydajności translacji w dzikim typie Col-0 w warunkach normalnych, szoku cieplnego i po rekonwalescencji. Wyniki profilowania polisomów i odsetek polissomalnego RNA ujawniły zmiany w wydajności translacji po leczeniu stresem cieplnym u siewek rzodkiewnika.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki siewki rzodkiewnika poddanej obróbce cieplnej

  1. Płytka 250 nasion dla każdej kontrpróby i każdego warunku z zakraplaczem na bibule filtracyjnej umieszczonej na płytce agarowej z podłożem podstawowym Murashige i Skoog (MS) bez sacharozy (pH 5,6) uzupełnionej 1,2% fitoagarem.
    UWAGA: Aby sadzić sadzonki na płytkach MS, sterylną bibułę filtracyjną umieszcza się na płytce, aby zapobiec wnikaniu korzeni sadzonek w głąb podłoża, ułatwiając pobieranie próbek. Nasiona są następnie sadzone na bibule filtracyjnej. Aby wykluczyć wpływ cukrów na wzrost roślin i wyniki eksperymentalne, zaleca się stosowanie do uprawy pożywki MS, która nie zawiera sacharozy.
  2. Owinąć płytkę MS zawierającą posadzone nasiona folią aluminiową w celu zablokowania światła i inkubować ją w temperaturze 4 °C przez 2 dni w celu wywołania wernalizacji.
  3. Przenieś zwernalizowane nasiona do komory wzrostowej, która będzie rosła w jasno-ciemnym fotoperiodze trwającym 16 godzin: 8 godzin w temperaturze 22 °C o natężeniu światła 100 μmol/m2/s.
  4. W przypadku próbek stresu cieplnego należy uszczelnić płytki pożywki MS zawierające 5-dniowe sadzonki wodoodporną taśmą klejącą i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C na 1 godzinę.
  5. W przypadku próbek odzyskiwanych po obróbce cieplnej, należy schłodzić płytki natychmiast po obróbce cieplnej. Następnie umieścić je w komorze wzrostowej w temperaturze 22 °C na 2 godziny.
  6. Zbierz 250 sadzonek z poddanymi działaniu środka lub niepoddanymi działaniu środka do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na każdą kontrpróbę i natychmiast zamroź próbki w ciekłym azocie.
    UWAGA: Dla każdego warunku przygotowano dwie grupy próbek. Jedna służy do analiz profilowania polisomów, a druga do ekstrakcji niepolisomalnego i polisomalnego RNA.

2. Przygotowanie gradientu sacharozy

  1. Przygotować roztwór gradientowy zawierający sacharozę o następujących stężeniach: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% i 60%. Skład roztworu obejmuje 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/ml heparyny i 50 μg/ml cykloheksymidu (CHX).
  2. Załaduj roztwory gradientowe od wysokiego do niskiego stężenia, zaczynając od dołu i przesuwając się w górę. Po dodaniu każdego stężenia roztworu gradientowego, przed dodaniem następnego stężenia należy zamrozić roztwór do stanu stałego. Do każdego stężenia gradientu sacharozy dodać 2,2 ml. Proces ten spowoduje powstanie nieciągłego gradientu gęstości sacharozy.
  3. Przygotowany gradient sacharozy przechowywać tymczasowo w temperaturze -80 °C i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C przed użyciem.

3. Przygotowanie próbki do profilowania polisomów

  1. Zmielić 250 5-dniowych sadzonek Col-0, zarówno poddanych stresowi cieplnemu, jak i niepoddanych obróbce, które zostały wcześniej zamrożone na proszek, używając homogenizatora z częstotliwością 30 cykli/s przez 1 min.
    UWAGA: Gdy liczba roślin o tym samym tle jest równa, mają one taką samą wydajność ekstrakcji RNA. Jednak porównując rośliny transgeniczne lub zmutowane z nadekspresją o różnym pochodzeniu, ilość użytych roślin powinna być dostosowana do warunków panujących w roślinie.
  2. Aby otrzymać roztwór ekstrakcyjny zawierający niepolisomalny i polisomalny RNA, dodaj 500 μl buforu do ekstrakcji polisomów (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 μg/ml cykloheksymidu, 100 μg/ml heparyny, 2% PTE, 10% DOC, 400 U/ml inhibitora rybonukleazy) do każdej probówki i wymieszaj próbki przez odwrócenie i wirowanie. Zapewnić, aby próbki były utrzymywane w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania procesu.
  3. Odwirować roztwór ekstrakcyjny w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 minut. Następnie przefiltrować supernatant przez sitko do komórek o wielkości 100 μm, aby uzyskać klarowny i wolny od cząstek roztwór ekstrakcyjny.
    UWAGA: Cząstki obecne w roztworze ekstrakcyjnym mogą osadzać się podczas ultrawirowania, potencjalnie tworząc osad, który może wpłynąć na dokładność pomiarów profilowania polisomów.
  4. Załadować przefiltrowany supernatant na wcześniej przygotowany gradient sacharozy i upewnić się, że osiągnął równowagę.
    UWAGA: Ze względu na dużą prędkość obrotową ultrawirówki konieczne jest zapewnienie zarówno bezpieczeństwa, jak i prawidłowego funkcjonowania ultrawirówki. Aby to osiągnąć, konieczne jest potwierdzenie, że masy próbek są identyczne przed obróceniem. Dlatego używamy wagi precyzyjnej, aby sprawdzić, czy masy gradientów są całkowicie jednolite.
  5. Odwirować gradient sacharozy załadowany próbkami o temperaturze 4 °C, 210 000 x g przez 3,5 godziny za pomocą ultrawirówki z wirnikiem wahliwym. Ustaw maksymalne szybkości przyspieszania i zwalniania. Po ultraodwirowaniu niepolisomalne i polisomalne RNA są rozprowadzane zgodnie z ich gęstością w odpowiednim roztworze gradientu sacharozy.
    UWAGA: W gradiencie sacharozy niepolisomalny RNA o mniejszej gęstości rozprowadza się w górnej warstwie, podczas gdy polisomalny RNA, charakteryzujący się większą gęstością ze względu na obecność licznych rybosomów zaangażowanych w aktywną translację na mRNA, rozprowadza się w dolnej warstwie. Następnie profilowanie polisomów można zmierzyć za pomocą frakcjonatora gradientu gęstości.

4. Analiza profilowania polisomów

UWAGA: Do pomiaru profilowania polisomów używany jest frakcjonator gradientu gęstości z pompą strzykawkową o mikroobjętości.

  1. Przygotować roztwór chase (70% sacharozy, 10% glicerolu i 0,02% błękitu bromofenolowego) do pompy strzykawkowej do mikroobjętości.
  2. Użyj oprogramowania do sterowania frakcjonatorem gradientu gęstości. Skalibruj maszynę za pomocą wody dejonizowanej. Po kalibracji użyj go do wykonania profilowania polisomów.
    1. Aby przeprowadzić regulację linii bazowej, włącz UV/VISDetector do momentu, aż światło zmieni kolor z czerwonego na zielony. Wyreguluj pokrętło przesunięcia rejestratora, aby wyrównać linię znacznika, a następnie przekręć pokrętło regulacji linii bazowej do pozycji minimalnego otwarcia. Ustaw pokrętło Czułość na detektorze UV/VISDETECTOR na poziom 2.0 i naciśnij przycisk Auto Baseline. Na koniec użyj pokrętła Recorder Offset, aby ustawić żądaną linię bazową na 20. Skalibrowany proces będzie się różnić w zależności od marki mechanizmu i różnych próbek.
  3. Po ultraodwirowaniu umieścić probówki z próbkami na frakcjonatorze gradientu gęstości za pomocą systemu przebijania probówek, tak aby probówkę można było podłączyć do pompy strzykawkowej z roztworem do ścigania i detektorem UV.
  4. Przełącz frakcjonator gradientu gęstości w tryb sterowania programowego (REMOTE) i ustaw natężenie przepływu wtrysku pompy strzykawkowej mikroobjętości na 3 ml/min.
  5. Zainicjuj ustawienia oprogramowania, aby rozpocząć i uzyskać wykres profilu polisomów za pomocą frakcjonatora, mierząc OD254.

5. Izolacja niepolisomalnego i polisomalnego RNA

UWAGA: W tej części protokołu, po przeprowadzeniu ultrawirowania zgodnie z tymi samymi krokami, jak opisano wcześniej, użyto innej grupy próbek z tej samej partii.

  1. Na podstawie wyników pomiaru profilu polisomowego należy oddzielnie pobrać frakcje niepolisomalne i polisomalne RNA. Obliczyć objętości roztworu zarówno dla frakcji niepolisomalnej, jak i wielosomalnej, i zebrać frakcję niepolisomalną (górna część).
    UWAGA: Zgodnie z profilami frakcja z więcej niż dwoma rybosomami jest definiowana jako frakcja polisomalna, podczas gdy frakcja z pikami 40S, 60S i 80S rRNA jest definiowana jako frakcja niepolisomalna.
  2. Dokładnie wymieszaj docelowe frakcje RNA z wstępnie zimnym 2x roztworem o wysokiej zawartości soli (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl2).
  3. Dodać 8 μl rozcieńczonego wywaru eukariotycznego Poly-A RNA Control z zestawu.
    UWAGA: Dla normalizacji skoków wymaganej w siódmym kroku. Zestaw do kontroli eukariotycznego poli-A RNA zawiera geny B. subtilis, takie jak gen DAP, które nie występują w roślinach, jako geny referencyjne. Aby określić proporcję utraty genu referencyjnego podczas reakcji po ekstrakcji, przed ekstrakcją dodaj równą ilość odczynnika zawierającego próbkę RNA genu DAP do różnych probówek z niepolisomalnym lub polisomalnym RNA. Pozwala to na określenie proporcji utraty genu referencyjnego podczas reakcji po ekstrakcji i może być wykorzystane do celów normalizacji.
  4. Odwirować mieszaninę RNA w roztworze o wysokiej zawartości soli w temperaturze 4 °C, 450 000 x g, przez 5 godzin za pomocą wirnika z odchylanym wiadrem ultrawirówki.
  5. Po ultrawirowaniu RNA wytrąca się na dnie probówki wirówkowej. Ostrożnie wylej supernatant od góry, aby zachować osad RNA na dnie.
  6. Szybko umyj osad RNA 500 μl wstępnie zimnej wody uzdatnionej dietylopirowęglanem (DEPC), powtarzając ten krok 3x.
    UWAGA: Aby zapobiec ponownemu rozpuszczeniu RNA w wodzie uzdatnionej DEPC podczas procesu mycia, konieczne jest wstępne schłodzenie wody uzdatnionej DEPC przed użyciem, aby zmniejszyć jej rozpuszczalność. Dodatkowo należy zminimalizować czas kontaktu wody uzdatnionej DEPC z granulką RNA podczas mycia.

6. Ekstrakcja niepolisomalnego i polisomalnego RNA

  1. Dodać 500 μl odczynnika do ekstrakcji RNA i wymieszać z próbką RNA, która ma być ekstrahowana. Inkubować przez 10 minut.
  2. Dodać 100 μl chloroformu, dokładnie wymieszać i inkubować przez 10 minut w celu rozdzielenia faz.
  3. Odwirować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 minut. Przenieść górną, przezroczystą warstwę wodną zawierającą RNA do nowej probówki, delikatnie wymieszać z równą objętością izopropanolu i inkubować w temperaturze -20 °C przez 2 godziny w celu wytrącenia RNA.
  4. Po wytrąceniu odwirować w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant i zachować osad RNA na dnie.
  5. Umyj osad RNA 1 ml wstępnie schłodzonego 75% etanolu. Odwirować w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 minut, odrzucić supernatant i wysuszyć na powietrzu osad RNA.
  6. Po wysuszeniu osadu RNA należy ponownie zawiesić osad RNA w 30 μl wody uzdatnionej DEPC i zmierzyć stężenie RNA (OD260) za pomocą spektrofotometru o pełnym spektrum (220 nm-750 nm).

7. Normalizacja skoku

  1. Użyj 1000 ng wyekstrahowanego RNA do odwrotnej transkrypcji wykonanej za pomocą zestawu qPCR zgodnie z instrukcjami producenta. Zarówno niepolisomalne, jak i polisomalne RNA muszą zostać poddane odwrotnej transkrypcji do cDNA.
  2. Wymieszaj 1 μl cDNA ze starterami genu DAP i użyj buforu SYBR do pomiaru poziomu ekspresji docelowego genu zgodnie z instrukcją producenta. Następnie użyj PCR w czasie rzeczywistym, aby wykryć ekspresję genu DAP.
    UWAGA: Sekwencje starterów genu DAP są następujące:
    Podkład do przodu = 5'-ATA, AAA, GAA, TTC, AGC, TAA, CGC, TTC, C-3'
    Odwrócony starter = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
  3. Porównaj poziomy ekspresji genów DAP w mierzonych grupach niepolisomalnych i polisomalnych RNA i oszacuj zawartość RNA w warunkach proporcjonalnej utraty. Korzystając ze znormalizowanej zawartości RNA, oblicz stosunek RNA w polisomach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziki typ rzodkiewnika, Col-0, był uprawiany na pożywce MS pod fotoperiodem 16 h:8 h. Do zwalczania użyto 5-dniowych sadzonek bez leczenia stresem cieplnym. Grupę stresu cieplnego poddano 1 godzinnej obróbce cieplnej w temperaturze 40 °C we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej, natomiast grupę odzysku umieszczono w temperaturze 22 °C na 2 godziny bezpośrednio po obróbce cieplnej. Stosując różne warunki obróbki cieplnej i warunki odzysku, możemy wykorzystać kolejne kroki do pomiaru ich wydajności translacyjnej.

Przed ekstrakcją RNA, najpierw musi być przygotowany gradient sacharozy. Aby oddzielić niepolisomalne i polisomalne RNA na podstawie różnicy ich gęstości, przygotowaliśmy roztwór gradientowy o stężeniach sacharozy 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% i 60%. Następnie załadowaliśmy roztwory gradientu od wysokiego do niskiego stężenia, zaczynając od dołu (Rysunek 1A). Następnie możemy wykorzystać ten gradient do oddzielenia niepolisomalnego RNA o niższej gęstości w górnej warstwie, podczas gdy polisomalny RNA o większej gęstości będzie rozprowadzany w dolnej warstwie o wyższych stężeniach sacharozy. Niepolisomalny i polisomalny RNA wyekstrahowano z traktowanego lub nieleczonego Col-0. Aby zapobiec wpływowi cząstek w roztworze na wyniki analizy profilowania polisomów, roztwór zawierający RNA należy przefiltrować przez sitko komórkowe w celu uzyskania roztworu ekstrakcyjnego wolnego od cząstek. Przefiltrowany supernatant załadowano na wcześniej przygotowany gradient sacharozy i zrównoważono. Po ultraodwirowaniu próbek obciążonych gradientem sacharozy, niepolisomalne i polisomalne RNA rozprowadzono zgodnie z gęstością w gradiencie sacharozy. Następnie przeprowadzono profilowanie polisomów przy użyciu frakcjonatora gradientu gęstości (Rysunek 1B). Frakcjonator gradientu gęstości jest sterowany za pomocą oprogramowania wstępnie skalibrowanego z wodą dejonizowaną. Po kalibracji próbki są ładowane do frakcjonatora po ultrawirowaniu. Działająca w trybie sterowania programowego pompa strzykawkowa mikroobjętościowa wstrzykuje roztwór sacharozy o stężeniach wyższych niż gradient sacharozy do gradientu, popychając próbkę. Dzięki temu pomiar można rozpocząć od góry gradientu sacharozy, gdzie gęstość jest mniejsza, i przejść w kierunku dołu, gdzie gęstość jest wyższa. Następnie aktywowane są ustawienia oprogramowania, aby rozpocząć akwizycję danych, generując wykres profilu polisomu za pomocą pomiaru OD254 ( Rysunek 1B). Gdy obserwujemy wyższe natężenie sygnału we frakcji polisomalnej, oznacza to, że próbka wykazuje wyższą wydajność translacji.

Wykresy profilowania polisomów dla 5-dniowych siewek Col-0 poddanych różnym zabiegom są pokazane w Rysunek 2. Wyniki grupy kontrolnej pokazują wyraźny podział między frakcją niepolisomalną a frakcją polisomalną (Rysunek 2A). Jednak po 1 godzinie stresu cieplnego w temperaturze 40 °C intensywność sygnału frakcji polisomicznej znacznie się zmniejszyła (Rysunek 2B). Gdy sadzonki poddane obróbce cieplnej pozostawiono do odzyskania sprawności w temperaturze 22 °C przez 2 godziny, intensywność sygnału frakcji polisomicznej powróciła do poziomu podobnego do grupy kontrolnej (Rysunek 2C). Nasze wyniki wykazały, że 1-godzinna obróbka stresem cieplnym znacznie zmniejszyła wydajność translacji siewek rzodkiewnika. Jednak rośliny potrzebowały 2 godzin regeneracji, aby przywrócić wydajność translacji do poziomów porównywalnych z siewkami, które nie cierpią na stres cieplny.

Aby zebrać dalsze dowody porównujące skuteczność translacji sadzonek Col-0 w różnych warunkach leczenia, wyizolowaliśmy i wyekstrahowaliśmy niepolisomalne i polisomalne frakcje RNA. Przy pobieraniu niepolisomalnych i polisomalnych frakcji RNA kierowano się wynikami pomiarów profilu polisomowego. Do ekstrakcji niepolisomalnego i polisomalnego RNA używamy odczynnika tiocyjanianu fenolu/guanidyny do ekstrakcji izolowanych próbek niepolisomalnych i polisomalnych RNA. Dzięki zastosowanej przez nas metodzie ekstrakcji RNA możemy uzyskać stabilne i wysokiej jakości RNA do naszej dalszej analizy (Tabela 1). Następnie znormalizuj wyekstrahowany RNA za pomocą zestawu GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit, aby złagodzić błędy spowodowane różnymi stratami ekstrakcji. Następnie wykorzystano PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego określenia ekspresji genów DAP, które są zawarte w genach B. subtilis dodanych do zestawu. Przeprowadzono analizę porównawczą poziomów ekspresji genu DAP między niepolisomalnymi i polisomalnymi grupami RNA w celu oszacowania zawartości RNA w warunkach proporcjonalnej utraty (Figura 3A). Obliczyliśmy stosunek znormalizowanego polisomalnego RNA do całkowitego RNA, aby wyjaśnić wydajność translacji między nimi (Rysunek 3B). Na koniec obliczono stosunek RNA w polisomach przy użyciu znormalizowanej zawartości RNA (Rysunek 3C). Wyniki stosunku RNA w polisomach pod różnymi zabiegami Col-0 wykazywały wzór zgodny z wynikami profilu polisomów pokazanymi na Rysunek 2A. Oba wyniki wskazują, że stres cieplny znacznie zmniejsza stosunek RNA we frakcji polisomalnej, a efekt ten można odwrócić po 2 godzinach regeneracji w temperaturze 22 °C (tabela 1).

Z tej metody możemy uzyskać całą niepolisomalną lub polisomalną frakcję RNA o wysokiej jakości, zamiast rozdzielać RNA na dodatkowe frakcje23. Nasze wyniki pokazują również, że zarówno profile polisomów, jak i procent RNA w polisomach mogą skutecznie odzwierciedlać wydajność translacji u Arabidopsis z różnymi leczonymi schorzeniami.

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram przepływu pracy profilowania polisomów. (A) Schematyczna ilustracja przygotowania gradientu sacharozy w probówce wirówkowej o pojemności 13 ml. (B) Schemat blokowy ilustruje eksperymentalny proces profilowania polisomów. Po pierwsze, translatom jest ekstrahowany. Następnie niepolisomalne i polisomalne RNA są rozdzielane na podstawie różnic w ich gęstości za pomocą ultrawirowania w gradientach sacharozy o różnej gęstości. OD254 mierzy się za pomocą frakcjonatora gradientu gęstości w celu uzyskania poniższego wykresu wyników profilowania polisomów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Profilowanie polisomów Col-0 w różnych warunkach. (A, B, C) Wyniki profilowania polisomów Col-0 w warunkach (A) braku obróbki cieplnej (kontrola), (B) obróbki cieplnej w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę i (C) odzysku w temperaturze 22 °C przez 1 godzinę po obróbce cieplnej. Niepolisomalne i polisomalne RNA frakcjonowano przy użyciu gradientu sacharozy 12,5%-60%. Pozycje niepolisomalnego (NP) i polisomalnego (PL) RNA są wskazane na profilach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Diagram przepływu pracy ekstrakcji niepolisomalnego i polisomalnego RNA. (A) Ilustracja normalizacji RNA przez skok. (B) Ilustracja oddzielania niepolisomalnego i polisomalnego RNA oraz obliczanie procentowej zawartości polisomalnego RNA. (C) Procent polisomalnego RNA w Col-0 traktowanym w różnych warunkach. Słupki błędu wskazują średnią ± SD (n=3 powtórzenia biologiczne). *wartość p < 0,01, test t Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

roku mm roku pkt. roku TGL TGL pkt. roku
Zawartość (ng)260/280260/230
KontrolaRNANP758,3 pkt.Informacja o tym, że 2,19Klasa 2.16
RNAPL302.3Pytanie 2,21Pytanie 2.13
Stres cieplnyRNANP821,52.2Informacja o tym, że 2,15
RNAPL174,3Informacja o tym, że 2,19Pytanie 2,21
OdzyskiwanieRNANP797,2Informacja o tym, że 2,17Klasa 2.16
RNAPL300,9Informacja o tym, że 2,19Rozdział 2.18

Tabela 1: Zawartość i cechy niepolisomalnego i polisomalnego RNA. Ta tabela pokazała, że analizowano zawartość i jakość RNA. Zawartość RNA znormalizowano po ekstrakcji zmodyfikowanymi metodami.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia prostą i ustandaryzowaną metodę pomiaru wydajności translacji sadzonek rzodkiewnika. Krytycznymi etapami tego protokołu jest zapewnienie stabilności RNA za pomocą wtórnego wirowania i ekstrakcji odczynnikiem do ekstrakcji RNA, a także skrupulatne przygotowanie gradientu sacharozy. Ponadto zapewniamy krytyczne etapy normalizacji i kwantyfikacji niepolisomalnego i polisomalnego RNA za pomocą metody normalizacji skokowej. Bardzo ważne jest, aby wszystkie procedury były przeprowadzane na lodzie przy użyciu i narzędzi wolnych od RNaz. Ponadto należy zapewnić dokładne przygotowanie stężenia sacharozy i zminimalizować wstrząsy, aby zmniejszyć ich wpływ na gradient. W poprzednich badaniach 24,25,26 badania nad reakcjami na stres koncentrowały się głównie na analizach transkrypcyjnych i fenotypowych. Dzięki analizom profilu polisomów możemy dalej badać regulację procesów translacyjnych w roślinach pod wpływem stresu lub innych bodźców środowiskowych.

Zrozumienie procesów translacyjnych obejmuje nie tylko przeprowadzanie eksperymentów z profilowaniem polisomów, ale także uzupełnianie ich eksperymentami z znakowaniem azydohomoalaniny (AHA). Znakowanie AHA jest wykorzystywane do badania syntezy białek i aktywności translacyjnej27. Metoda polega na zastąpieniu reszt metioniny w nowo zsyntetyzowanych białkach AHA, analogiem metioniny zawierającym grupę azydkową. Komórki integrują AHA z nowo zsyntetyzowanymi białkami podczas translacji. Następnie, przy użyciu technik opartych na chemii azydku, takich jak chemia kliknięć, białka zawierające AHA mogą być selektywnie znakowane i wykrywane, umożliwiając analizę ilościową i wizualizację aktywnie translujących białek28. Łącząc znakowanie AHA z profilowaniem polisomów, naukowcy mogą uzyskać głębszy wgląd w dynamikę syntezy białek w komórkach roślinnych8.

Dzięki tej metodzie izolacji polisomalnego RNA i normalizacji skoków możemy również użyć wyekstrahowanego RNA do analizy sekwencjonowania RNA. Analizując mRNA związane z polisomami, możemy określić, które mRNA aktywnie przechodzą translację. Co więcej, porównanie mRNA w stanie stacjonarnym z mRNA związanym z polisomami pozwala nam zidentyfikować geny, które ulegają nadekspresji na poziomie translacji lub transkrypcji. Poziom ekspresji mRNA w stanie ustalonym odzwierciedla aktywność transkrypcyjną, podczas gdy mRNA związane z polisomami wskazuje na geny aktywnie ulegające translacji. Na efektywność tłumaczenia wpływają bodźce środowiskowe i modyfikacje potranslacyjne 7,8,9,16. W związku z tym metoda ta zapewnia kompleksowe zrozumienie, czy docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania jest skutecznie translowane. Jednak ograniczeniem tej metody jest to, że podczas procedury ekstrakcji nadal będzie następować utrata RNA. Względna ekspresja skokowego RNA uzyskanego za pomocą qRT-PCR może również powodować niewielkie błędy pomiaru. Konieczne są dalsze badania i walidacja przy użyciu proteomiki lub Western blot w celu zbadania funkcjonalnych aspektów białka docelowego.

Podsumowując, protokół ten reprezentuje prostą metodę, która zapewnia proste podejście z jasnymi wynikami oceny wydajności tłumaczenia. Co ważne, jego zastosowanie wykracza poza siewki poddane obróbce termicznej i obejmuje sadzonki narażone na różne inne bodźce środowiskowe.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy usługi badań technicznych ultrawirówek oferowane przez Technology Commons w College of Life Science oraz Centrum Instrumentacji sponsorowane przez Ministerstwo Nauki i Technologii, Narodowy Uniwersytet Tajwański (Tajwan). Dziękujemy również Yu-Ling Liangowi za wsparcie techniczne, a członkom laboratorium Cheng za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Young Scholar Fellowship Einstein Program z Narodowej Rady Nauki i Technologii na Tajwanie w ramach grantów nr 1. NSTC 113-2636-B-002-007 do MCC M.-C.C. dziękuje za wsparcie finansowe ze strony National Taiwan University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka eppendorfLabcon3012-870-000-9Ekstrakcja RNA
13,2 ml probówka wirówkowaBeckman Coulter331372ultrawirówka
Błękit bromofenolowyHoneywell32712Profil polisomowy
ChloroformHoneywell32211Ekstrakcja RNA
Cykloheksymid (CHX)Sigma-AldrichSI-C7698Profil polisomowy
Pirowęglan dietylu (DEPC)Sigma-AldrichD5758Ekstrakcja RNA
EtanolSigma-Aldrich32221Ekstrakcja RNA
GeneChip Eukariotyczny Poly-A Zestaw kontrolnyInvitrogen900433Normalizacja
GlicerolHoneywell15523Normalizacja
HeparynaSigma-AldrichSI-H3149Profil polisomowy
HiScript III RT SuperMix do zestawu qPCRVazymeR323-01Normalizacja
KClJ.T.Baker  3040-01Profil polisomowy
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266Profil polisomowy
MS podłoże podstawowePhytoM524kultur roślinnych
Pompa strzykawkowaBrandelSYN4007LSProfil polisomowy
Polioksyetylen-10-tridecyl-eter (PTE)Sigma-AldrichP2393Profil
polisomowyRNasinPromegaN251BProfil polisomowy
Deoksycholan sodu (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750Profil polisomowy
SacharozaSigma-AldrichS5391Profil polisomowy
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalizacja
odczynnika TRIMRCTR118Ekstrakcja RNA
Tris-HClJ.T.Baker  4109-06Profil polisomowy
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-100Kultrawirowanie
UV/VISDETECTORBrandelUA-6Profil polisomowy
Wykres pików

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. The significance of translation regulation in the stress response. BMC genomics. 14, 1-11 (2013).
  2. Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. Translation machinery: the basis of translational control. J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).
  3. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).
  4. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  5. Dennis, M. D., Browning, K. S. Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes. J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).
  6. Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components. J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).
  7. Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings. Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).
  8. Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).
  9. Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis. Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).
  10. Des Marais, D. L., Juenger, T. E. Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance. Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).
  11. Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).
  12. Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. Metabolomics for plant stress response. Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).
  13. Sun, M., et al. Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing. BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).
  14. Wasternack, C. Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects. Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).
  15. Chen, T., et al. Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein. Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).
  16. Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).
  17. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  18. Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. Plant stress granules: trends and beyond. Front Plant Sci. 12, 722643(2021).
  19. Hamada, T., et al. Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis. J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).
  20. Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants. Plants. 9 (9), 1122(2020).
  21. Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming. Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).
  22. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  23. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. J Vis Exp. (87), e51164(2014).
  24. Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).
  25. Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals. Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).
  26. Van den Broeck, L., et al. From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress. Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).
  27. Dieterich, D. C., et al. detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging. Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).
  28. Zhang, J., et al. Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging. Acad Press. 588, 41-59 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polysome ProfilingTranslation EfficiencyHeat StressArabidopsis PlantsTranslational RegulationSucrose GradientRNA IsolationSpike In NormalizationRibosome OccupancyqRT PCR

Powiązane artykuły