Ilościowa zależność struktura-aktywność, przewidywanie aktywności i dynamika molekularna nienukleotydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy

Summary

W tym badaniu wykorzystano strategie in-silico, aby zidentyfikować enumerowaną etrawirynę jako obiecujący środek terapeutyczny dla HIV. Nasze odkrycia dotyczące interakcji molekularnych i dynamiki wspierają racjonalne projektowanie nowych NNRTI jako możliwych alternatyw leczenia HIV.

Abstract

Rosnąca częstość występowania lekooporności HIV-1 stanowi wyzwanie dla skuteczności skojarzonej terapii antyretrowirusowej, szczególnie w Afryce Południowej. Rozwój oporności na nienukleotydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NNRTI) zagraża długoterminowemu powodzeniu terapii przeciwretrowirusowej. Szacuje się, że w 2019 r. oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe była bezpośrednio przyczyną 1,27 mln zgonów na całym świecie. W badaniu tym zastosowano podejście in-silico w celu zbadania leków NNTRI i ich pochodnych. Stosowane techniki obejmowały obliczenia teorii funkcjonału gęstości, dokowanie molekularne, wyliczanie, ilościową analizę zależności struktura-aktywność (QSAR), symulację dynamiki molekularnej (MDS) oraz mechanikę molekularną z uogólnionymi metodami Borna i powierzchni. Analiza koncentrowała się na różnych pochodnych pirymidyny i sześciu lekach NNRTI, badając ich interakcje z białkiem HIV-1 (kod PDB 1HQU).

Model QSAR został opracowany w celu przewidywania aktywności biologicznej sześciu badanych NNRTI. Wykorzystując 94 pochodne pirymidyny, model QSAR osiągnął R² NA poziomie 0,822 i Q² na poziomie 0,815, co wskazuje na wysoki poziom dokładności predykcyjnej.

MDS przeprowadzono w celu oceny stabilności różnych ligandów i ich nowo opracowanych alternatyw, upewniając się, że pozostają one związane z miejscem aktywnym białka przez 200-nanosekundowy okres symulacji. Etrawiryna wykazywała wahania średniego odchylenia kwadratowego (RMSD) wynoszące około 4,5 A, podczas gdy jej wyliczone pochodne wykazywały wahania RMSD wynoszące 3,5 A. Dzięki dokowaniu molekularnemu, MDS i obliczeniom energii swobodnej, enumeracyjna etrawiryna wykazała najlepszą wydajność, z wartością aktywności 7,373 i wynikiem dokowania -10,517 kcal/mol. Co więcej, obliczona energia swobodna wiązania dla enumerowanej etrawiryny wynosiła -89,684 kcal/mol, przewyższając inne badane ligandy. Znacząca poprawa sugeruje, że zmodyfikowana etrawiryna ma obiecujący potencjał jako nowy środek w terapii antyretrowirusowej.

Uzyskana niższa wartość RMSD, zwiększone interakcje aminokwasów i najwyższa wolna energia wiązania wskazują, że wymieniona etrawiryna może służyć jako realna alternatywa w leczeniu HIV/AIDS.

Introduction

Pomimo znacznych postępów w leczeniu, poważnym globalnym zagrożeniem dla zdrowia, jakim jest zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), spowodowany przez ludzki wirus niedoboru odporności-1 (HIV-1), pozostaje stałym zagrożeniem¹. Leki przeciwretrowirusowe znane jako inhibitory odwrotnej transkryptazy, RTI, są stosowane w leczeniu zakażenia wirusem HIV. Odwrotna transkryptaza, wirusowy enzym polimerazy kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) niezbędny do replikacji retrowirusa, jest hamowana przez inhibitory odwrotnej transkryptazy (RTI). Nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NRTI) i nienukleotydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NNRTI) są głównymi RTIs².

Wysoce aktywna terapia antyretrowirusowa (HAART), połączenie różnych leków przeciwwirusowych, stała się standardową terapią HIV, skutecznie kontrolując rozprzestrzenianie się AIDS i przekształcając tę niegdyś śmiertelną chorobę w możliwą do opanowania chorobę przewlekłą³. NNRTI dla HIV-1 są obecnie istotną częścią schematu HAART⁴. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) jest jednym z najpoważniejszych globalnych zagrożeń dla zdrowia, z szacunkową liczbą 1,27 miliona ofiar śmiertelnych⁵. W związku z tym istnieje pilna potrzeba rozwiązania problemu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i zidentyfikowania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe osiągnęła alarmujący poziom w wielu częściach świata.

Stanowi to poważne zagrożenie dla osiągnięcia celów zrównoważonego rozwoju, ponieważ podważa bezpieczeństwo żywnościowe, wzrost gospodarczy i bezpieczeństwo zdrowotne, a także przyczynia się do nierówności społecznych i ekonomicznych⁶. Częstość występowania wirusów lekoopornych rośnie, nawet w lekach antyretrowirusowych przeznaczonych do zwalczania wirusa HIV. Według najnowszych statystyk na koniec 2022 roku prawie 30 milionów ludzi na całym świecie przyjmowało terapię antyretrowirusową⁷.

WHO przeprowadziło 30 ankiet i odkryło, że w 21 z tych badań ponad 10% osób, które rozpoczęły terapię antyretrowirusową pierwszego rzutu, miało oporność na Newirapinę lub Efawirenz⁸. Co więcej, osoby, które wcześniej miały kontakt z lekami antyretrowirusowymi, są do trzech razy bardziej narażone na oporność na NNRTI niż osoby bez ekspozycji⁹. Badania wykazały, że znaczna liczba niemowląt w wieku poniżej 18 miesięcy, u których niedawno zdiagnozowano HIV, wykazywała wysokie wskaźniki szczepów lekoopornych^10,11. Szokujące jest to, że prawie połowa z nich miała szczep oporny na - (NNRTI) jeszcze przed rozpoczęciem leczenia. Odkrycia te podkreślają potrzebę przyspieszenia badań w celu opracowania innowacyjnej terapii HIV.

Rozwój szczepów opornych na leki i niepożądane skutki uboczne wynikające z długotrwałego stosowania nieuchronnie stanowiły wyzwanie dla klinicznego zastosowania NNRTIs¹². Rozpoczęcie skojarzonej terapii przeciwretrowirusowej (cART) wydłuża oczekiwaną długość życia osób żyjących z HIV pomimo potencjalnych działań niepożądanych. Te działania niepożądane obejmują ryzyko rozwoju chorób niezakaźnych, w tym lipodystrofii, hiperlipidemii, zmniejszonej gęstości mineralnej kości, podwyższonego poziomu glukozy we krwi prowadzącego do cukrzycy typu 2, nadciśnienia, zwiększonego ryzyka udaru mózgu i problemów związanych z otyłością¹³. Wczesna diagnoza i szybki dostęp do odpowiedniej opieki medycznej w początkowej fazie zakażenia wirusem HIV oferują znaczne korzyści zarówno z perspektywy klinicznej, jak i publicznej. Szybkie rozpoczęcie ART i profilaktyka przeciwko zakażeniom oportunistycznym prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby chorób i śmiertelności związanej z HIV.

Użycie ART może również przyczynić się do zmniejszenia możliwości dalszego przenoszenia wirusa HIV poprzez zmniejszenie poziomu krążącego kwasu rybonukleinowego HIV. Co więcej, zajęcie się leczeniem innych chorób przenoszonych drogą płciową i koinfekcji może również zmniejszyć prawdopodobieństwo dalszego zakażenia wirusem HIV¹⁴. NNRTI należą do opcjonalnych klas leczenia inhibitorów, które wchodzą w interakcje z RT poprzez wiązanie się z regionem allosterycznym lub miejscem zakażenia wirusem HIV. Ten rodzaj hamowania jest powszechnie znany jako inhibitor niekonkurencyjny, ponieważ NNRTI nie wiąże się w miejscu aktywnym substratu, ale raczej na zewnątrz. Efekt ten zmienia konformację miejsca wiązania substratu, utrudniając wiązanie standardowego podłoża i prowadząc do przedwczesnego zakończenia łańcucha. Ze względu na ich zmniejszoną toksyczność w porównaniu z NRTI, prostą strukturę, lepszą biodostępność w porównaniu z inhibitorami proteazy i doskonałą selektywność, NNRTI stały się najbardziej atrakcyjnymi inhibitorami HIV¹⁵. W związku z tym synteza i projektowanie nowych NNRTI mają kluczowe znaczenie z perspektywy farmakokinetycznej^16,17.

NNRTI są niezbędne w leczeniu HIV/AIDS ze względu na ich silną skuteczność i niską toksyczność. Jednak wczesne NNRTI, takie jak newirapina, delawirdyna i efawirenz, napotykają oporność na mutacje wirusa w miejscu wiązania NNRTI¹⁸. Leki te, należące do rodziny diarylopirymidyny (DAPY), wykazują silną aktywność przeciwko różnym szczepom NNRTIs, w tym tym opornym na wczesne NNRTIs¹⁹, prawdopodobnie ze względu na ich elastyczność molekularną i wyższą barierę odporności na HIV-1^20,21. Pomimo sukcesu, wysoki wskaźnik mutacji w HIV-1 RT i brak wewnętrznej aktywności korektorskiej doprowadziły do powstania nowych profili oporności u pacjentów stosujących etrawirynę i rylpiwirynę^22,23. Te mutacje wirusowe różnią się od siebie, podobnie jak te związane z wczesnymi lekami NNRTI²⁴. Ponad 50 strukturalnie zróżnicowanych klas związków zostało zidentyfikowanych jako NNRTI. Warto zauważyć, że sześć NNRTI uzyskało zgodę na leczenie HIV-1. Do tych zatwierdzonych leków należą: newirapina (NVP), delawirdyna (DLV), efawirenz (EFV), etrawiryna (ETR), rylpiwiryna (RPV) i dorodyryna (DOR). Rysunek 1 pokazuje struktury chemiczne tych sześciu zatwierdzonych leków NNRTI²⁵.

W niedawnym badaniu²⁶, obliczenia DFT i dokowanie molekularne sugerują, że lowastatyna i symwastatyna wykazują potencjał jako środki przeciw koronawirusowi. Wirtualne badania przesiewowe pozwoliły zidentyfikować pięć nowych zatwierdzonych przez FDA cząsteczek kandydujących podobnych do rusztowania efawirenzu, o doskonałym powinowactwie wiązania w aktywnej kieszeni głównej proteazy COVID-19.

Soltan et al.²⁷ przeprowadził podobne badanie nad identyfikacją nowych cząsteczek w celu poprawy zdolności wiązania z HIV RT, stosując strategię opartą na fragmentach z lekami zatwierdzonymi przez FDA do projektowania pochodnych chemicznych. W szczególności wykorzystali struktury delawirdyny, efawirenzu, etrawiryny i rylpiwiryny jako podstawowe rusztowania. Podobieństwo tych pochodnych do leków oceniono za pomocą Swiss-ADME, a następnie zadokowano je w powiązanych strukturach krystalicznych. Badanie zakończyło się wyborem związków wykazujących większe powinowactwo wiązania w porównaniu z ich macierzystymi rusztowaniami, w szczególności zwracając uwagę na wyraźniejszą poprawę w przypadku pochodnych zaprojektowanych z NNRTI drugiej generacji, etrawiryny i rylpiwiryny. Na przykład pochodne RPV01 i RPV15 wykazały znaczną poprawę wartości energii zadokowanej w porównaniu z rylpiwiryną, co wskazuje na potencjalną użyteczność w zwalczaniu zarówno dzikich, jak i zmutowanych form HIV RT.

Murugesan i współpracownicy²⁸ przeprowadzili badania, proponując różne podejścia chemii medycznej w celu zwiększenia skuteczności i zminimalizowania oporności w leczeniu HIV. W badaniu wykorzystano hybrydyzację molekularną, wymianę bioizosteryczną i wysokoprzepustowe badania przesiewowe. W ramach swoich badań udało im się zidentyfikować nowe rusztowania NNRTI o wysokiej sile działania zarówno przeciwko dzikim, jak i lekoopornym szczepom wirusa HIV. Opracowali pochodne DAPY, które wykazują doskonałą selektywność i niską toksyczność, a niektóre związki wykazują skuteczne hamowanie przy stężeniach nanomolowych.

Ostatnio, używanie narzędzi obliczeniowych wraz z badaniami in-silico zyskało popularność dzięki praktycznej analizie właściwości chemicznych leków kwantowych²⁹. W tym badaniu zastosowano wspomagane komputerowo projektowanie leków, teorię funkcjonału gęstości, jakościową zależność struktura-aktywność i dynamikę molekularną w celu odkrycia silnych NNRTI.

Protocol

1. Szczegóły obliczeniowe - przygotowanie białka

1. Kliknij ikonę Okno na ekranie monitora i kliknij Wszystkie aplikacje. Przewiń w dół, aby przejść do folderu Schrödinger, otwórz folder i kliknij ikonę Maestro pokazaną w Rysunek 2B, a następnie wybierz otwórz, jak pokazano w Rysunek 2B, aby uruchomić oprogramowanie.
2. Pobierz wybraną strukturę białka, przechodząc do przycisku zakładki Plik w oprogramowaniu. Z krótkiego menu, które się pojawi, wybierz Pobierz PDB, jak pokazano w Rysunek 3A, a następnie wprowadź wybrany kod PDB w polu tekstowym, jak pokazano w Rysunek 3B. Kliknij przycisk pobierania, a wybrany plik PDB zostanie wyświetlony w oknie projektu.
3. Alternatywnie można pobrać wybrane białko na komputer lokalny z banku danych o białkach, wprowadzając kod tożsamości bazy danych białek (identyfikator PDB) w polu wyszukiwania i klikając przycisk pobierz, aby pobrać plik PDB na komputer lokalny. Przejdź do zakładki Plik i wybierz opcję Importuj struktury. W interfejsie importu zlokalizuj pobrany plik PDB, jak pokazano na rysunku 3C, a następnie wybierz przycisk Importuj, jak wskazano w Rysunek 3D.
   UWAGA: Struktura białka zostanie otwarta jako struktura 3D w osobnym oknie, jak pokazano na Rysunek 4.
4. Przejdź do prawego górnego rogu oprogramowania, wybierz opcję zadania i wpisz preparat białkowy w pasku wyszukiwania. Kliknij Przepływ pracy przygotowania białka na wyświetlaczu po prawej stronie, jak pokazano na Rysunek 5A.
5. W wyskakującym oknie przepływu pracy przygotowywania białek wpisz nazwę zadania jako nazwę pliku do zapisania i kliknij zielony przycisk Uruchom w prawym dolnym rogu, jak pokazano w Rysunek 5B.
6. Monitoruj zadanie w trakcie jego uruchamiania, klikając przycisk Zadania w prawym górnym rogu, jak pokazano w Rysunek 5C.
7. Wybierz i kliknij prawym przyciskiem myszy przygotowane białko i wybierz podzielony ligand, jak pokazano na Rysunek 5D. Wybierz podział na ligandy, wodę i inne. Ma to na celu posiadanie składników białkowych jako niezależnych wpisów w nawigatorze przestrzeni roboczej

2. Przygotowanie liganda

1. Pobierz żądane związki chemiczne z bazy danych PubChem³⁰, wpisując nazwę wybranego związku w pasku wyszukiwania. Przejrzyj struktury i wybierz struktury 3-wymiarowe (3D). Kliknij przycisk Pobierz w prawym górnym oknie, aby pobrać współrzędne struktury jako plik danych strukturalnych (SDF). Jeśli struktura 3D jest niedostępna, pobierz strukturę 2D i użyj innych narzędzi, aby wygenerować strukturę 3D ze struktury 2D.
2. Kliknij kartę Plik w Schrodinger i wybierz opcję Importuj struktury, jak pokazano na rysunku 6A. Przejdź do lokalizacji pliku, w której struktury są zapisane w formacie pliku SDF, aby załadować związki, które mają być przygotowane.
3. Wybierz Zadanie w prawym górnym rogu oprogramowania Schrödinger. Wpisz LigPrep w pasku wyszukiwania i wybierz LigPrep w prawym oknie po lewej stronie, jak pokazano w Rysunek 6B.
4. Wybierz opcję Użyj struktur z, aby wybrać pliki z tabeli Obszar roboczy lub Projekt. Wybierz preferowane opcje w oknie LigPrep, zapisz plik na komputerze lokalnym i kliknij przycisk Uruchom, aby przesłać zadanie do przygotowania liganda, jak pokazano na rysunku 6C.

3. Geometria i optymalizacja ligandów

1. Otwórz plik software³¹ w celu optymalizacji geometrii pobranych konstrukcji. Przejdź do zakładki Plik (Rysunek 7A) i wybierz pozycję Otwórz, aby wybrać pobrany plik SDF z bazy danych PubChem.
   UWAGA: Plik zostanie załadowany w oknie głównym. Kliknij drugie fioletowe okno, aby wyświetlić wizualizację tych samych związków chemicznych. Każde zaimplementowane ustawienie pokaże wynik w fioletowym okienku.
2. Przejdź do karty Obliczanie i wybierz kartę Ustawienia obliczeń Gaussa. Przejdź do karty Typ zadania pokazanej na rysunku 7B i wybierz opcję Optymalizacja lub Opt+Freq.
   UWAGA: W zależności od (rozmiaru) liczby atomów lub związków, najpierw zoptymalizuj, a następnie częstotliwość. Jeśli związek jest mniejszy, wykonaj Opt+Freq. Im większa cząsteczka, tym więcej czasu zajmuje wykonanie zarówno Opt+Freq, jak i optymalizacji, a następnie częstotliwości.
3. Przejdź do zakładki Metoda i wybierz metody chemii kwantowej, a następnie wybrany funkcjonał gęstości globalnej hybrydowej korelacji wymiany-Kohna-Shama, zbiór podstawowy, ładunek i spin z wybranych strzałek w każdej sekcji.
4. Przejdź do tytułu i określ nazwę badanego związku.
5. Przejdź do zakładki Link 0 i określ wybrany limit pamięci i procesory współdzielone. Usuń zaznaczenie pól Pełna ścieżka, jak pokazano w Rysunek 7C.
6. Kliknij przycisk Edytuj na dole, aby zapisać plik wejściowy Gaussa, jak pokazano w Rysunek 3C. Zapisz plik w preferowanej lokalizacji z wybraną nazwą pliku jako plik zadania Gaussa (gjf).
   UWAGA: Po zapisaniu pliku wejściowego Gaussa pojawi się wyskakujące okienko pokazujące zawartość pliku w Notatniku. Edytuj zawartość pliku, w tym opcje, takie jak zmiana opłaty i funkcji, które były niedostępne w opcjach ustawień. Przygotowany plik zadania Gaussa zostanie użyty jako plik wejściowy do przesłania w celu uruchomienia obliczeń optymalizacji i częstotliwości za pośrednictwem komputera lokalnego.
   Następnie przeprowadzono optymalizację geometryczną tych struktur przy użyciu MN15-L functional³² i zestawu bazowego 6-31++G(d,p)³³. Jeśli jednak pojawią się problemy z prowadzeniem procesu optymalizacji i częstotliwości, można przesłać pracę za pomocą HPC.

4. Generowanie siatki receptorów

1. Przejdź do sekcji Zadania i wybierz pozycję receptor grid generation³⁴. Interfejs generowania siatki receptorów pokazany w Rysunek 8A identyfikuje aktywne miejsce białka, w którym związany jest ligand rdzeniowo-kryształowy. Kliknij Wybierz, aby zidentyfikować ligand i sprawdź, czy występuje kokrystalizowany ligand w wyskakującym powiadomieniu wyświetlanym w Rysunek 8B.
2. Wybierz ligandy i/lub reszty z obszaru roboczego, a wybrane związki będące przedmiotem zainteresowania zostaną podświetlone na niebiesko w obszarze roboczym.
3. Wybierz kartę ustawień w panelu generowania siatki receptorów, aby ustawić rozmiar pola siatki. Domyślny rozmiar pola siatki to 10 x 10 x 10 pikseli. Zmodyfikuj wymiary pola na karcie Siatka ramki, wprowadzając żądane wartości bezpośrednio lub ręcznie zmieniając rozmiar pola w obszarze roboczym.
   UWAGA: Alternatywnie, w razie potrzeby ustaw dodatkowe parametry z zakładki Zaawansowane, jak pokazano w Rysunek 8C. Przejrzyj wszystkie ustawienia, aby zapewnić dokładność.
4. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć generowanie siatki. Po zakończeniu zapisz wygenerowane pliki siatki do kolejnych symulacji dokowania. Po zakończeniu zadania pojawi się komunikat z powiadomieniem, jak pokazano w Rysunek 8D.

5. Dokowanie molekularne

1. Załaduj białko i przygotowane ligandy, przechodząc do Tasks, Docking³⁵ i Ligand Docking (dokowanie ślizgowe), jak pokazano w Rysunek 9A.
2. Załaduj plik siatki z kroku 4.1 powyżej i wybierz ligandy z obszaru roboczego, korzystając z opcji Użyj liganda z w Rysunek 9B.
3. Wybierz preferowaną metodę dokowania z zakładki ustawień pokazanej w Rysunek 9 C (domyślna precyzja dokowania to Precyzja standardowa (SP)).
4. Ustaw pole siłowe na OPLS4, aby uzyskać dokładne modelowanie oddziaływań molekularnych. Ustaw ograniczenia (np. wiązania wodorowe) na karcie Ograniczenia.
5. Przejrzyj wszystkie ustawienia i zapisz zadanie dokowania lub plik. Kliknij URUCHOM, aby rozpocząć proces dokowania.
6. Powiadomienie wskazuje, że zadanie zostało ukończone, a tabela projektu została otwarta w celu zadokowania wyników. Przyjrzyj się wiążącym pozy, partyturom i interakcjom.

6. Generowanie modelu 2D-QSAR

1. Przejdź do strony internetowej centrum społeczności KNIME i wyszukaj AutoQsar w pasku wyszukiwania. Wybierz drugi wpis AutoQsar, który pojawia się w Rysunek 10A.
2. Kliknij ikonęprzepływu pracy pobierania i wybierz przepływ pracy pobierania z menu podręcznego pokazanego w Rysunek 10B. Zapisz przepływ pracy na komputerze lokalnym.
3. Upewnij się, że KNIME³⁶ jest zainstalowany, a następnie otwórz go z komputera lokalnego. Skompiluj arkusz kalkulacyjny z uśmiechami kanonicznymi, nazwą struktury, wartościami aktywności/IC₅₀ (w mikromolach) i -log(aktywność/IC) lub dowolnym wybranym deskryptorem chemicznym. Zapisz plik w formacie wartości rozdzielanych przecinkami (CSV) na komputerze lokalnym.
4. Przejdź do Plik i zaimportuj przepływ pracy AutoQSAR³⁷. W wyskakującym oknie kliknij Importuj przepływ pracy KNIME, aby wybrać pobrany przepływ pracy AutoQSAR, jak pokazano w Rysunek 10C, a następnie wybierz Otwórz | Następny | Koniec.
5. Przepływ pracy AutoQsar zostanie wyświetlony w oknie KNIME Explorer w lewym górnym rogu. Kliknij dwukrotnie przepływ pracy, aby przenieść go do okna głównego.
6. Kliknij dwukrotnie ikonę czytnika molekularnego (do MAE), a następnie na karcie Ustawienia kliknij Dodaj plik(i), aby dodać arkusz z danymi wejściowymi lub parametrami.
7. Wybierz zakładkę Memory Policy (Zasady pamięci) i kliknij Write Tables to disc (Zapisz tabele na dysku) | Dobrze.
8. Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk Wyodrębnij właściwości i wybierz Konfiguruj, jak pokazano w Rysunek 10D.
9. Wybierz i przefiltruj wybrane właściwości molekularne lub chemiczne z okna wykluczania do okna Dołączanie. Kliknij przycisk Zastosuj.
10. Kliknij prawym przyciskiem myszy AutoQSAR Build Model i kliknij Configure. Wprowadźnazwę modelu Q SAR w wyskakującym oknie dialogowym.
11. Kliknij przyciskseparacji i wybierz właściwość do dopasowania spośród dołączonych. Wybierz losową wartość zestawu treningowego (np. 85%:15%) i kilka modeli, które chcesz zachować. Kliknij przycisk Zastosuj.
12. Kliknij prawym przyciskiem myszy dolny czytnik cząsteczek i wybierz Konfiguruj. Załaduj ligandy testowe z przygotowanego pliku CSV Excel zawierającego ligandy, które mają być badane.
13. Kliknij prawym przyciskiem myszy Wyodrębnij właściwości i ustaw ustawienia według własnego uznania.
14. Kliknij prawym przyciskiem myszy górny czytnik cząsteczek i wybierz wykonaj.
    UWAGA: Pomarańczowa kropka oznacza, że proces się rozpoczął, a zielone światło pokaże pomyślne wykonanie procesu. Następny krok będzie kontynuowany, dopóki wszystkie węzły nie zostaną pomyślnie wykonane.
15. . Uruchom drugi czytnik cząsteczek dla ligandów testowych.
16. Zapisz folder zip z wynikami z zestawu testowego i treningowego po pomyślnym wykonaniu wszystkich węzłów.
    UWAGA: Wybierz model o najlepszej wydajności na podstawie wyników walidacji krzyżowej, takich jak SD – odchylenie standardowe, R2 – korelacja zestawu treningowego między rzeczywistymi i przewidywanymi wartościami aktywności oraz Q2 – korelacja rzeczywistej i przewidywanej aktywności zestawu testowego.
17. Oceń wydajność przepływu pracy, oceniając wydajność modelu przy użyciu oceny lub węzłów statystycznych.
18. Aby zinterpretować wyniki, zidentyfikuj główne lub kluczowe deskryptory przy użyciu ważności funkcji. Wizualizuj wyniki jako wykres punktowy lub słupkowy, aby określić wydajność i relację deskryptora. Zapisz przepływ pracy i wyeksportuj dane wynikowe, prognozy i wizualizacje jako wykres punktowy i/lub pliki CSV.

7. Wyliczenie

1. Przejdź do sekcji Zadanie i wyszukaj narzędzie Ligand Designer, jak pokazano w Rysunek 11A.
2. Wybierz parę zadokowanego białka i kompleksu liganda z nawigatora przestrzeni roboczej. Kliknij opcję Analizuj przestrzeń roboczą w oknie projektanta ligand. Aby wygenerować i ocenić nowe ligandy, wybierz Skanowanie izostatyczne z listy przepływów pracy, które się pojawią, jak pokazano w Rysunek 11B sugeruje metodę hodowli, która wydłuża ligand poprzez dodawanie fragmentów do istniejących części cząsteczki.
3. Po ustawieniu opcjinumeracji e kliknij przycisk wylicz w wyświetlonym oknie powiadomienia Skanowanie izostatyczne. Powtórz krok 6.2 dla tego samego białka i innego liganda, aż wszystkie ligandy przejdą ten sam proces. Przejrzyj wyliczone ligandy z tabeli Projekty.
4. Zapisz struktury, eksportując zaprojektowane ligandy.
   UWAGA: Metoda wyliczania wygenerowała zestaw wyników dokowania po zakończeniu symulacji.
5. Indywidualnie wybierz wymienione związki z bardziej ujemnymi wynikami dokowania i ponownie je zadokuj, korzystając z procedury dokowania opisanej w sekcji 4.

8. HOMO i LUMO

1. Otwórz oprogramowanie i prześlij zoptymalizowany ligand w formacie pliku zadania Gaussa.
2. Przejdź do narzędzi i wybierz edytor MO w czerwonych i zielonych kropkach, jak pokazano w Rysunek 12A.
   UWAGA: Metoda wyliczania wygenerowała zestaw wyników dokowania po zakończeniu symulacji.
3. W panelu edytora MO w metodzie załaduj plik FChk, klikając załaduj MOS z istniejącego pliku Chk lub FChk, jak pokazano w Rysunek 12B.
4. Kliknij na zakładkę wizualizacja | aktualizacja. Poczekaj ~10 s, aż pojawi się bieżąca powierzchnia, jak pokazano na Rysunek 12D.
5. Kliknij jedno z dwóch pól wyboru obok podświetlonych żółtych cyfr, aby wybrać powierzchnię HOMO lub LUMO³⁸ do wyświetlenia w oknie obok.
6. Kliknij prawym przyciskiem myszy fioletowe tło i wybierz Plik. Kliknij Zapisz plik obrazu, aby zapisać obraz bieżącej powierzchni, jak pokazano na Rysunek 12E.
7. Kliknij prawym przyciskiem myszy fioletowe tło i wybierz Widok. Wybierz format wyświetlania, aby zmienić tło na karcie Ogólne, przezroczystość powierzchni na karcie Powierzchnia, rozmiar i kolor czcionki na karcie Tekst, jakość obrazu i preferowany układ powierzchni na karcie Cząsteczka, jak pokazano na karcie Rysunek 12F.
8. Alternatywnie wygeneruj plik modułu i przekaż plik FChk w GaussView. Przejdź do zakładki Wyniki i wybierz opcję Powierzchnie/Kontury. Kliknij akcje kostki i załaduj kostkę. Kliknij Akcje powierzchni i wybierz nową powierzchnię. Powtórz krok 8.7, aby edytować powierzchnię.
   UWAGA: Im mniejsza różnica energetyczna między HOMO i LUMO³⁹ (różnica między LUMO a HOMO), tym bardziej reaktywna powinna być cząsteczka. Oblicz przerwę energetyczną (_przerwę E) za pomocą korektora 1 dla każdej cząsteczki.
   

9. Symulacja dynamiki molekularnej — przygotowanie i minimalizacja systemu

1. Upewnij się, że pakiet Schrödinger Suite został zainstalowany na komputerze lokalnym i załaduj złożone struktury białko-ligand do workspace⁴⁰.
2. Kliknij przycisk Zadanie i wybierz Desmond System Builder⁴¹. W panelu konstruktora systemu wybierz zakładkę Solwatacja i wybierz Predefiniowany model rozpuszczalnika, jak pokazano w Rysunek 13A, Kształt pudełka, jak pokazano w Rysunek 13B, oraz metodę obliczania rozmiaru pudełka, jak pokazano w Rysunek 13C⁴², które pasują do kompleksu białko-ligand.
3. Wybierz zakładkę jony i kliknij przelicz, aby zneutralizować system, dodając liczniki jonów i ustawiając żądane stężenie soli.
4. Wybierz OPLS^43,44 jako pole siłowe.
5. Nazwij zadanie odpowiednio i zapisz plik zadania na komputerze lokalnym. Kliknij przycisk Uruchom, aby przesłać zadanie do przygotowania.
   UWAGA: Upewnij się, że nazwa zadania jest zapisana. Użyj szczegółowej nazwy.
6. Równowaga i produkcja
7. Wyświetl projekt w obszarze roboczym Po przygotowaniu systemu. Wybierz kompleks białko-ligand z Nawigatora przestrzeni roboczej, przejdź do zadania i wybierz dynamikę molekularną (Desmond).
8. Załaduj kompleks ligand-białko z obszaru roboczego w panelu dynamiki molekularnej. Wybierz żądaną oś czasu symulacji z zakładki symulacji. Wybierz NPT jako klasę ensemble⁴⁵.
9. Nazwij zadanie odpowiednio i napisz zadanie. Kliknij Zamknij, aby wyjść z okna dynamiki molekularnej.
10. Prześlij pisemne zadanie do przygotowania dynamiki molekularnej za pośrednictwem terminala lokalnego. Po zakończeniu otwórz ukończone zadanie i kontynuuj czas symulacji od początkowo ustawionej osi czasu symulacji do żądanego czasu symulacji⁴⁵, na przykład 100 ns, 200 ns.
    UWAGA: Powtórz krok 9 dla pozostałych kompleksów białko-ligand.
    1. Otwórz ukończone zadanie w oprogramowaniu Schrödinger Maestro i połącz różne ramy czasowe symulacji, jeśli uruchomiono oddzielne zadania. Przejdź do przycisku ZADANIE i wybierz diagram interakcji symulacji. Załaduj scalone pliki lub pojedynczy plik, aby zwizualizować trajektorię.
11. Wygeneruj raport zawierający wizualizacje i inne szczegółowe wyniki wyjściowe.

10. Mechanika molekularna z uogólnionym polem urodzonym i powierzchniowym (MM-GBSA)

1. Otwórz plik trajektorii i odtwórz trajektorię. Wizualizuj, gdzie kompleks białko-ligand jest zrównoważony i zanotuj liczbę ramek. Prześlij zadanie za pośrednictwem terminala do przetworzenia.
2. Powtórzyć sekcję 9 (przygotować symulację dynamiki molekularnej białka) dla drugiego kompleksu białko-ligand.
3. Catenate/wyświetl zawartość pliku wyjściowego, aby przeanalizować wygenerowane wyniki. Odczytaj średnią ΔG, aby uzyskać energię swobodną wiązania kompleksu białko-ligand.
4. Pobierz plik CSV, aby zwizualizować udział różnych cząsteczek wewnątrzcząsteczkowych.
5. Aby obliczyć swobodną energię wiązania kompleksu, należy zwrócić uwagę na różne parametry termodynamiki i desolwatacji, w tym energię wiązania (_wiązanie ΔG), model solwatacji Columbic (ΔG_wiąże Coulumb), niepolarny termin solwatacji (ΔG_wiąże Lipo), korekcję wiązań wodorowych (ΔG_wiąże Hbond), wiązanie kowalencyjne (ΔG_wiąże kowalencyjne), π-π korekcję upakowania (_wiązanie ΔG Pakowanie), uogólniona energia solwatacji elektrostatycznej Borna (ΔG_wiązania sol GB) i oddziaływanie van der Waalsa (ΔG_wiązanie vdW).
   1. Wyprowadzić końcowe wiązanie ΔG, uśredniając wartości_wiązania ΔG określone dla każdej migawki w symulacji MD, jak pokazano w równaniu 2.

Results

Generowanie siatki receptorów i dokowanie molekularne

Narzędzie do generowania siatki receptorów Maestro zostało użyte do prawidłowego scharakteryzowania miejsca wiązania do późniejszego dokowania. Do zdefiniowania siatki wykorzystano skrystalizowany ligand. Zastosowano precyzyjne ustawienie SP Glide do dokowania molekularnego. Narzędzie LigPrep w Schrödinger Maestro zostało wykorzystane do przygotowania ligandów do dokowania za pomocą pola siłowego OPLS4. Do symulacji dynamiki molekularnej w Desmondzie wykorzystano pole siłowe OPLS4. Pola siłowe mają fundamentalne znaczenie dla klasycznych symulacji molekularnych, a ich dokładność ma kluczowe znaczenie dla jakości symulacji wiązania białko-ligand w procesie odkrywania leków. W przypadku OPLS4 przypisywanie ładunków i parametrów zostało zakończone za pomocą Schrödinger Maestro. Zastosowanie parametrów OPLS4 zaowocowało istotną poprawą zarówno w porównaniach energetycznych, jak i geometrycznych w porównaniu z domyślnymi parametrami OPLS2005.

Wiązało się to z dokowaniem specyficznych ligandów, o których wiadomo, że mają powinowactwo do docelowego białka HIV-1, co pozwoliło na dokładną analizę interakcji między cząsteczkami ligandów a resztami receptora. Tabela 1 przedstawia podsumowanie klasyfikacji związków do modelowania QSAR.

Po dokowaniu HBY561, protokół dokowania został oceniony poprzez porównanie ponownie zadokowanego liganda z tym, który znajduje się w miejscu aktywnym krystalicznego białka 1HQU. Zadokowane i skrystalizowane struktury HBY561 są przedstawione w pliku uzupełniającym 1 (rysunek uzupełniający S1 i rysunek uzupełniający S2). Aby ocenić podobieństwo między zadokowanymi pozycjami a strukturami odniesienia, wartość odchylenia średniokwadratowego (RMSD) mniejsza niż 2,0 A jest powszechnie uważana za kryterium wiarygodnych wyników dokowania. Ten próg wskazuje, że przewidywana struktura jest ściśle zgodna z danymi eksperymentalnymi. W tym badaniu ligandy wykazały RMSD 1,27 A podczas porównywania struktury odniesienia z pozycją zadokowaną, jak pokazano na czerwono na rysunku uzupełniającym S3. Okazało się, że protokół dokowania był wystarczający do tej pracy, w wyniku czego wszystkie ligandy zostały zadokowane przy użyciu tych samych ustawień. Badając wyniki dokowania przedstawione w Tabeli 2, efawirenz i etrawiryna wykazały najkorzystniejsze wyniki przy -10,432 eV i -9,647 eV w stosunku do wyniku dokowania współskrystalizowanego liganda HBY561 (-9,242 eV). Rysunek uzupełniający S4 z pliku uzupełniającego 1 przedstawia diagramy interakcji ligandów między oryginalnym białkiem HIV-1 a ligandem krystalicznym, etrawiryną i efawirenzem.

Wiązania wodorowe, układanie π-π i oddziaływania hydrofobowe to główne siły przyczyniające się do wiązania. Specyficzny przypadek wiązania wodorowego pojawił się między HBY561 a oznaczonym białkiem 1HQU, wyraźnie obejmując resztę aminokwasową LYS101. Ten wzór wiązania odzwierciedlał obserwacje przeprowadzone z ligandami efawirenzem i etrawiryną, jak pokazano na Rycina 14.

Ponadto, interakcje hydrofobowe były niezbędne do wiązania w kilku lokalizacjach białek, w tym HBY561, etrawiryny i efawirenzu, oprócz sił międzycząsteczkowych, wiązań wodorowych i układania π-π. Zaobserwowano π-π układanie między TYR318 a pierścieniem aromatycznym w Efavirenz. Zarówno wiązania wodorowe, jak i układanie w stos π-π były niezbędne do utrzymania połączeń wiążących między ligandami a białkiem. Schematy interakcji ligandów HBY_561, newirapiny, doradwiryny, efawirenzu i etrawiryny przedstawiono w pliku uzupełniającym 1-Rysunek uzupełniający S5.

Te międzycząsteczkowe siły wpływają na interakcje białko-ligand i są kluczowe dla rozwoju leków, które zmniejszają oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe u HIV-1. Ich rola w zwiększaniu powinowactwa do wiązania, swoistości i mechanizmu działania pomaga w projektowaniu leków, które mogą skutecznie celować w wirusa i hamować go, rozwiązując w ten sposób rosnące obawy związane z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe w kontekście leczenia HIV-1.

przygotowanie zestawu danych 2D-QSAR

Faza treningu i testowania obejmowała 94 związki. Związki te podzielono na cztery klasy, z których każda reprezentuje ligandy związane z konkretnym badanym białkiem. W procesie szkolenia wykorzystano przepływ pracy KNIME AutoQSAR z aktywnością, HOMO i LUMO zostały wybrane jako trzy deskryptory dla tego badania.

generacja 2D-QSAR

Wszystkie 94 cząsteczki miały określone wartości aktywności na podstawie danych eksperymentalnych (Tabela uzupełniająca S1). Wyniki uzyskane z modelu QSAR znajdują się w tabeli 3. Związki klasy 1 w tabeli uzupełniającej S2 wykorzystano do modelowania QSAR, pokazując dodane grupy Ar i odpowiadające im wartości aktywności. Wyniki z czterech klas wskazują, że najwyższy wynik wynosił 0,8223, R² 0,815 i Q ² 0,8182, co odpowiada klasie 1. Jest to zgodne z poprzednimi kryteriami dążenia do R² bliskiego 1 i Q² większego niż 0,7⁴⁶. W związku z tym wybraliśmy klasę 1 do treningu naszego modelu QSAR. Podczas gdy modele dla klas 3 i 4 wykazały doskonałą wartość korelacji R² wynoszącą odpowiednio 0,8172 i 0,6673, nie pasowały one do wydajności klasy 1.

Przeprowadzono korelację krzyżową w celu dalszego sprawdzenia stabilności proponowanego modelu QSAR zgodnie z kryterium, że różnica między wynikiem Q² 0,8223 a R² powinna być mniejsza lub równa 0,3⁴⁷. Proponowany przez nas model dla klasy 1 ma różnicę 0,0038. Wykres punktowy przedstawiający obserwowaną aktywność w stosunku do przewidywanej aktywności znajduje się w Rysunek 15.

Luka energetyczna HOMO-LUMO

Określenie różnicy energetycznej między najniższym niezajętym orbitalem molekularnym a najwyższym zajętym orbitalem molekularnym, powszechnie znane jako luka energetyczna HOMO-LUMO, odgrywa kluczową rolę w charakterystyce reaktywności chemicznej i stabilności kinetycznej cząsteczki w kontekście sześciu związków NNRTI. Graniczne orbitale molekularne odgrywają kluczową rolę w ułatwianiu interakcji przenoszenia ładunku z miejscem wiązania białka HIV. Potwierdzenie minimum energetycznego zostało zapewnione poprzez zbadanie częstotliwości drgań i potwierdzenie braku częstotliwości ujemnych lub wyimaginowanych; Następnie uzyskano wartości HOMO i LUMO dla każdego minimum energetycznego. Wyższa wartość HOMO oznacza biegłość cząsteczki jako donora elektronów, podczas gdy niższa wartość sugeruje, że działa ona jako słaby akceptor elektronów. Rysunek uzupełniający S6 przedstawia HOMO_LUMO luki energetyczne dla sześciu zoptymalizowanych NNRTI. Co więcej, zmniejszona różnica energetyczna między poziomami energetycznymi HOMO i LUMO silnie wpływa na interakcje międzycząsteczkowe z przenoszeniem ładunków, które zachodzą między badanymi cząsteczkami ze względu na silną zdolność przyjmowania elektronów i bioaktywność cząsteczek⁴⁸.

Trend w wartościach luki energetycznej, przedstawiony w >Tabeli 4, jest uporządkowany malejąco: Efawirenz > Etrawiryna > HBY-561 > Newirapina > Delawirdyna > Dorawiryna > Rylpiwiryna. Znaczna luka energetyczna zaobserwowana dla efawirenzu i etrawiryny oznacza, że analizy wyników dokowania ujawniają korelację między bioaktywnością a luką HOMO-LUMO. Warto zauważyć, że potencjał przeciwwirusowy wzrasta wraz z większymi wartościami luki HOMO-LUMO. Wskazuje to nie tylko na stabilność związków, ale także na ich potencjał do tworzenia stabilnych interakcji z receptorem. Luka w projekcie HOMO-LUMO odgrywa znaczącą rolę w zrozumieniu bioaktywności cząsteczek, szczególnie w kontekście projektowania leków przeciwko HIV-1.

Wyliczenie

Stworzono różne narzędzia do wyliczania bibliotek wirtualnych. Do narzędzi używanych do wyliczania należy Schrödinger. Opiera się na metodzie przeskakiwania rdzenia, w której biblioteki są tworzone poprzez zastąpienie jednego lub kilku załączników na strukturze rdzenia fragmentami związków odczynników⁴⁹. Narzędzie do wyliczania w Maestro v13.1 zostało użyte do dodania niestandardowych grup bocznych lub atomów do każdego z sześciu NNRTI. Nowe związki wykorzystano również do przewidywania aktywności. Nastąpiła poprawa oczekiwanych wartości aktywności wyliczonych cząsteczek w porównaniu z początkowo zoptymalizowanymi cząsteczkami NNRTI, co można zobaczyć w Tabeli 5.

Poprawa wartości aktywności wyliczonych ligandów była wynikiem procesu wyliczania, który został przeprowadzony, gdy dodana niestandardowa grupa R wpłynęła na siły interakcji nowego proponowanego związku z oryginalnym białkiem. Wyliczone związki przygotowano dla mechaniki kwantowej poprzez optymalizację tych cząsteczek i obliczenie ich częstotliwości drgań. Ich luki energetyczne zostały obliczone i porównane z lukami energetycznymi NNRTI. Ogólna obserwacja, jak pokazano w tabeli 6, wskazuje, że wymienione związki są bardziej stabilne niż ich zoptymalizowane odpowiedniki.

W Tabeli 6 zaobserwowano, że różnica energetyczna między wymienionymi związkami w porównaniu do zoptymalizowanych wykazała podobny trend. Wskazuje to, że właściwości chemiczne wymienionych cząsteczek pozostały niezmienione, niezależnie od jakiejkolwiek rotacji konformacyjnej. W ten sposób byli w stanie utrzymać ważne siły międzycząsteczkowe z resztami aminokwasowymi białka.

Przed przeprowadzeniem procesu wyliczania dla NNRTI, jak opisano w sekcji 6 protokołu, obserwowane wyniki wyjściowe miały swoje początkowe wyniki dokowania z procesu wyliczania, przedstawione w Tabeli 7 pod kolumną wyliczonego wyniku dokowania. Jak wyjaśniono w sekcji 4 protokołu, proces dokowania molekularnego przeprowadzono w celu walidacji proponowanego wyniku dokowania dla wyliczonych związków. Można zaobserwować, że po ponownym dokowaniu wyliczonych związków nowe wyniki dokowania uległy poprawie, jak pokazano w kolumnie "ponownie zadokowane wyliczone ligandy". Wyniki ponownego dokowania dla wymienionych związków porównano z wynikami dokowania oryginalnych NNRTI przedstawionymi w kolumnie "oryginalny wynik dokowania" w tabeli 7. Można zaobserwować, że dla wymienionych związków wyniki dokowania dla HBY_561, etrawiryny, efawirenzu i dobawiryny były lepsze niż dla ich równoważnych zoptymalizowanych związków. Jednak delawirdyna ma taki sam wynik dokowania jak wyliczona i zoptymalizowana delawirdyna.

Dynamika molekularna

Trzy wiązania wodorowe są tworzone przez HBY 561 z LYS101, wysoce elektroujemnymi atomami N i OH. Kryształowy ligand, czyli trzecia cząsteczka, ustanawia jednocześnie dwa wiązania wodorowe z siarką i wodorem oraz trzecie wiązanie wodorowe z GLU138. Co ważne, układanie w stosy π-π i oddziaływania hydrofobowe znacząco przyczyniają się do powstawania sił międzycząsteczkowych. Co więcej, obecność dodatkowych wiązań wodorowych ma kluczowe znaczenie dla dynamiki molekularnej, co jest szczególnie odzwierciedlone w wynikowych wykresach odchylenia średniokwadratowego (RMSD). W sumie obserwuje się, że Efavirenz tworzy trzy wiązania wodorowe z bardzo elektroujemnym atomem azotu, atomem tlenu na drugim pierścieniu niearomatycznym oraz pierścieniem benzenowym i TYR318 między ligandem wysoce elektroujemnym N w pierścieniu centralnym. Widoczne jest drugie wiązanie wodorowe między N z pierścienia a OH i LY101. Etrawiryna wykazuje trzy wiązania wodorowe z LYS101. Dorawiryna tworzy wiązanie wodorowe z GLU138. Newirapina wykazuje dwa wiązania wodorowe z LY101.

W tym przypadku interakcja reszty aminokwasowej wspólna dla wszystkich ligandów to LYS101. Mimo że ich struktury różnią się, wszystkie oddziałują z tą samą resztą aminokwasową. Symulacje MD przeprowadzono z parametrami wymienionymi w sekcji 2.8 protokołu, aby ustalić, jak dobrze lub słabo każdy ligand (NNRTI i wymieniony NNRTI) wiąże się z miejscem aktywnym 1HQU. Interakcja liganda przedstawiona w Rysunek 16 wskazuje na silne wiązania wodorowe między aminokwasem LY101 białka a cząsteczkami HBY 561, newirapiny, efawirenzu i etrawiryny. Jak widać w porównaniu w tabeli 7, te silne interakcje odpowiadają za wysokie wyniki dokowania każdego związku.

Aby ocenić skuteczność wiązania każdego liganda, w tym NNRTI i wyliczonego NNRTI w miejscu aktywnym 1HQU, przeprowadzono symulacje dynamiki molekularnej (MDS). W szczególności wybrano cztery wyliczone związki, które wykazały lepsze wyniki dokowania niż oryginalne zoptymalizowane kombinacje. Te wybrane związki poddano MDS jako metodę walidacji w celu zbadania i obserwacji reakcji każdej cząsteczki z białkiem HIV-1 w określonym czasie, biorąc pod uwagę interakcje międzyatomowe w obecności liganda.

Przed rozpoczęciem MDS dla ostatnio wymienionych glikanów, konieczne było potwierdzenie przydatności protokołu symulacji dla naszego systemu. Aby to osiągnąć, pierwszym krokiem było uruchomienie MDS wolnego białka 1HQU. Żaden ligand nie był obecny w miejscu aktywnym białka (Figura 17A i Rysunek uzupełniający S7). Do ~60 ns występują znaczne wahania w strukturze białka, powodujące przesunięcia Cα RMSD do 4,5 A; po tym czasie białko wydaje się stabilizować z fluktuacją RMSD wynoszącą ~3,5 A do 200 ns. Ta stabilizacja przekonała nas, że protokół MD będzie odpowiedni dla naszych kompleksów białko-ligand, które zostaną przeanalizowane w następnej sekcji.

200 ns MDS etrawiryny i wyliczonej Etrawiryny (Rysunek 17B,C) wykazały wahania średniej kwadratowej etrawiryny (RMSD) bliskie 5,0 A i równowagę 4,5 A. Wyliczona etrawiryna wykazywała wahania RMSD wynoszące 4,5 A i równowagę 3,5 A. Ta stabilizacja wskazuje, że enumerowana etrawiryna może być potencjalnym ligandem NNRTI w leczeniu HIV/AIDS. Trajektoria o RMSD mniejszym niż 5 A oznacza silny efekt wiązania między białkiem miejsca aktywnego a ligandem. Obserwacja ta została utrzymana w odniesieniu do wszystkich wcześniej wymienionych związków, z wyjątkiem newirapiny i dobawiryny, spośród wymienionych związków (plik uzupełniający 1: rysunek uzupełniający S8, rysunek uzupełniający S9, rysunek uzupełniający S10 i rysunek uzupełniający S11).

Rysunek 18 i Rysunek 19 dalej analizuje wiązanie między etrawiryną, wyliczoną etrawiryną, a białkiem. Analizowane dane obejmują histogram interakcji interakcji, ligand-białko i białko-ligand. Histogram kontaktów interakcji dla każdego odpowiedniego liganda związanego z białkiem jest bezpośrednio związany z odpowiednimi siłami interakcji między resztą aminokwasu białka a ligandem. Wysoka obfitość LYS101 jest bardzo wyraźna dla etrawiryny i etrawiryny, a także zaobserwowano widoczny gruby pomarańczowy pasek. Zaobserwowano słabo dostrzegalny jasnopomarańczowy pas umieszczony na dolnym końcu wyliczonego wykresu etrawiryny w korelacji z TYR181. Ta zgodność wskazuje na istnienie dwóch międzycząsteczkowych sił przyciągania między GLU138. Ta pozytywna obserwacja ligandów i ich wyliczonych form została porównana w celu analizy lepszego liganda jako potencjalnego związku NNRTI. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że wymieniona etrawiryna może być stosowana w leczeniu HIV/AIDS.

Mechanika molekularna z uogólnionymi obliczeniami Born i pola powierzchni (MM-GBSA)

W tym badaniu, głównym źródłem energii wejściowej w kierunku wiązania wolnej energii,_wiązania ΔG, był wkład interakcji van der Waalsa, ΔG_VdW. Ekwitaryna ma wyższy ΔG_VdW wynoszący -66,146 kcal/mol niż jej znany odpowiednik NNRTI o ΔG_VdW wynoszącym -64,669 kcal/mol. Wyższa wartość ΔG_Hbond wynosząca -2,541 kcal/mol w wyliczeniu etrawiryny wskazuje na znaczący udział sił przyciągania wodoru między ligandem a białkiem. Udział ΔG_kulomba i ΔG_{kowalencyjnego} dla ewitawiryny wyliczonej (-17,976 i 2,807 kcal/mol) był znacznie większy niż znanego odpowiednika NNRTI, który miał odpowiednio -11,196 i 2,491.

Obserwowane wyniki podczas wiązania etrawiryny i etryminowanej etrawiryny z białkiem 1HQU są w pewnym stopniu spójne. Stwierdzono, że etrawiryna jest lepsza niż jej odpowiednik, etrawiryna, ze względu na dwa dodatkowe wiązania wodorowe. Badanie wykazało również, że ekwityna ekwityna była preferowana do wiązania się ze zidentyfikowaną kieszonką. Bardziej ujemne_wiązanie ΔG (-89,684 kcal/mol) dla ewitawiryny w porównaniu z etrawiryną (-80,551 kcal/mol) pokazuje, że etrawiryna jest dobrym inhibitorem HIV-1 RT.

Rysunek 1: Struktury chemiczne sześciu zatwierdzonych przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków nienukleotydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy dla ludzkiego wirusa niedoboru odporności-1. NVP = newirapina; DLV = delawirdyna; EFV = Efavirenz; ETV = etrawiryna; RPV = rylpiwiryna; DOR = Dorawiryna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Otwieranie aplikacji Maestro Schrödinger w systemie Windows na komputerze lokalnym. (a) Przejście do aplikacji Maestro Schrödinger na komputerze lokalnym. (B) Jak otworzyć i uruchomić Aplikację Maestro Schrödinger na komputerze lokalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Importowanie struktury pliku PDB z komputera lokalnego do okna projektu w Schrödinger. (A) Funkcja importu struktury w Maestro Schrödinger. (B) Pole tekstowe Identyfikator PDB. (C) Pobrano plik PDB na komputerze lokalnym. (D) Importuj przycisk, aby umożliwić zaimportowanie wstawionego pliku identyfikatora PDB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Struktura pliku PDB zaimportowanego do okna projektu Schrödinger. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Proces przygotowania białka. (A) Interfejs wyszukiwania przepływu pracy przygotowania białka. (B) Zapisanie nazwy pliku zadania i zainicjowanie procesu przygotowania białka. (C) Okno monitorowania dla uruchomionych zadań. (D) Rozkład liganda na poszczególne składniki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Proces przygotowania liganda. (A) Importowanie struktur z komputera lokalnego do okna projektu Przygotowanie białka Schrödinger. (B) Poszukiwanie procesu przygotowania liganda. (C) Okno przepływu pracy przygotowania ligandów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Geometria i optymalizacja przepływu pracy. (A) Okno menu GaussView do optymalizacji geometrii. (b) Dostępne typy zadań na karcie Oblicz w GaussView. (C) Opcje dostępne na karcie Link0 w GaussView. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Generowanie siatki ślizgowej i dokowanie molekularne. (A) Interfejs przepływu pracy generowania siatki receptorów. (B) Wyskakujące powiadomienie o wyborze atomu w ligandzie. (C) Zaawansowane ustawienia receptora. (D) Powiadomienie o zakończeniu zadania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Dokowanie liganda ślizgowego. (A) Interfejs do dokowania ligandów ślizgowych Szukaj. (b) Interfejs dokowania liganda. (C) Ustawienia precyzji dokowania Glide. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Proces przygotowania KNIME QSAR. (A) Wyszukiwanie węzła AutoQSAR na stronie internetowej centrum społeczności KNIME. (B) Przycisk Pobierz, aby uzyskać węzeł AutoQSAR KNIME. (C) Importowanie pobranego AutoQSAR KNIME Workflow. (D) Ustawienia konfiguracyjne dla ligandów podczas budowy modelu QSAR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Wyliczanie ligandów za pomocą Ligand Designer w Maestro Schrödinger. (A) Wyszukiwanie opcji Ligand Designer w Schrödinger. (B) Wykaz przepływów pracy do przeprowadzenia procesu wyliczania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Przepływ pracy generowania HOMO-LUMO. (A) Aby uzyskać dostęp do opcji edytora molekularnego w zakładce Narzędzia w GaussView. (B) Wczytywanie istniejącego pliku Chk lub FChk w celu wygenerowania granicznych orbitali molekularnych. (C) Ilustracja orbitali granicznych HOMO i LUMO w GaussView. (D) Wizualizacja okna do wyświetlania orbitali granicznych HOMO i LUMO. (E) Uratowanie orbitali granicznych HOMO i LUMO. (f) Interfejs formatu wyświetlania w GaussView. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Proces przygotowania, konfiguracji, przygotowania i realizacji dynamiki molekularnej. (A) Desmond System Builder: Opcje solwatacji do wyznaczania modeli wody sztywnej. (B) Opcje obwiedni Desmond System Builder do określania kształtu pudełka. (c) Desmond System Builder: Metoda obliczania rozmiaru pudełka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14: Diagramy interakcji ligandów między 1HQU a 3 górnymi ligandami. Siły oddziaływania między białkiem (1HQU) a (A) ligandem krystalicznym (HBY561), (B) efawirenzem i (C) etrawiryną. Siły te wpływają na interakcje białko-ligand i mają kluczowe znaczenie dla opracowywania leków zmniejszających oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe w HIV-1. Ich rola w zwiększaniu powinowactwa do wiązania, swoistości i mechanizmu działania pomaga w projektowaniu leków, które mogą skutecznie celować w wirusa i hamować go, rozwiązując w ten sposób rosnące obawy związane z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe w kontekście leczenia HIV-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15: Wykres punktowy pokazuje obserwowaną aktywność w porównaniu z przewidywaną aktywnością dla klasy 1 modelu QSAR. Wykres przedstawia dopasowanie między klasą 1 jako zbiorem treningowym a związkami NNRTI jako zbiorem testowym w celu uzyskania wartości aktywności predykcyjnej. Skróty: NNRTI = nienukleotydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy; QSAR = ilościowa zależność struktura-aktywność. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 16: Diagramy interakcji ligandów. Siły oddziaływań między białkiem a (A) wyliczonymi ligandami krystalicznymi HBY_561, (B) wymienionymi newirapiną, (C) wyliczonymi dobawiryną, (D) wyliczonymi efawirenzem i (E) wyliczonymi etrawirynami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 17: Diagram interakcji symulacji dynamiki molekularnej wolnego białka etrawiryny i etrygentu etrawiryny. (A) Diagram oddziaływań dynamiki molekularnej wolnego białka. (B) Diagram oddziaływania etrawiryny z dynamiką molekularną. (C) Diagram interakcji dynamiki molekularnej ewitawiryny wyliczonej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 18: Histogram interakcji między etrawiryną a białkiem. (A) Oś czasu kontaktów białko-ligand dla etrawiryny. (B) Oś czasu oddziaływań białko-ligand w czasie, w tym wiązania H, kontakty hydrofobowe, jonowe i mostki wodne. (C) Schemat przedstawiający szczegółowe interakcje między atomami ligandów a resztą białka. Wyświetlane są tylko interakcje zachodzące przez ponad 30% czasu symulacji (od 0,00 do 200 ns). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 19: Histogram interakcji kontaktowej między wyliczoną etrygowaną etrawiryną a białkiem. (A) Oś czasu kontaktów białko-ligand dla enumerowanej etrawiryny. (B) Oś czasu oddziaływań białko-ligand w czasie, w tym wiązania H, kontakty hydrofobowe, jonowe i mostki wodne. (C) Schemat przedstawiający szczegółowe interakcje między atomami ligandów a resztą białka. Wyświetlane są tylko interakcje zachodzące przez ponad 30% czasu symulacji (od 0,00 do 200 ns). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

klasa	Białko docelowe	Asortyment złożony	Łączna liczba wybranych związków
1	NL4-3 HIV-1 typu dzikiego	(8a1-8e5 – EC50 (nM)a)	25
cyfra arabska	IIIB WT WIRUS HIV-1	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
3	Szczep odporny na RES056 NNRTI	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
4	Szczep ROD HIV-2	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
Suma związków wybranych do modelowania QSAR			94 Rozdział 94

Tabela 1: Podsumowanie kryteriów klasyfikacji związków dla modelowania QSAR. Zestaw danych 94 związków pirymidyny dihydrofuro[3,4-d] został zsyntetyzowany przez Kanga i współpracowników⁵⁰ w celu celowania w różne szczepy HIV, a mianowicie NL4-3 HIV-1 typu dzikiego, IIIB WT HIV-1, RES056 szczep oporny na NNNRTI i szczep ROD HIV-2. Te pochodne pirymidyny zostały pogrupowane w cztery klasy zgodnie z ich białkiem docelowym w celu przygotowania do przeprowadzenia naszego treningu QSAR. Tabela podsumowuje, w jaki sposób cząsteczki te zostały pogrupowane w cztery klasy zgodnie z ich eksperymentalnymi wartościami EC₅₀, które reprezentują siłę działania leku, zoperacjonalizowaną jako stężenie, przy którym lek wywiera 50% swojego maksymalnego działania. Skróty: NNRTI = nienukleotydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy; QSAR = ilościowa zależność struktura-aktywność.

jedn. jedn. jedn. pkt. jedn. pkt.

Nazwa białka	Ligand	Wynik dokowania
1HQU	Efawirenz	-10,432
	Etrawiryna	-9,647
	HBY_561	-9,242
	Dorawiryna	-9.04
	Newirapina	-8,825
	Rylpiwiryna	-7,722
	Delawirdyna	-6,519

Tabela 2: Wyniki dokowania sześciu zoptymalizowanych NNRTI i białka HIV-1. Wyniki dokowania dotyczą sześciu badanych NNRTI. Bardziej ujemny wynik wskazuje na dobrą skuteczność wiązania między ligandem a białkiem. Efawirenz i etrawiryna wykazały najkorzystniejsze wyniki przy -10,432 eV i -9,647 eV w stosunku do wyniku dokowania współskrystalizowanego ligandu HBY561 (-9,242). Potencjalne ligandy to te z bardziej ujemnym wynikiem dokowania, mniejszym niż -9,242 eV.

TGL TGL pkt. r. TGL jedn. TGL jezdnego TGL jezdnego TGL pkt. jezdnego pkt.

Klasa leku	Dopasowanie aktywności na poziomie 85 procent	Kolumna 1	Kolumna 2	Kolumna 3	Kolumna 4	Kolumna 5
	wynik	Sd	Czynnik R2	RMSE (Międzynarodowa Organizacja T	Pytanie2	Q2 MW (hipoteza zerowa)
1	0,8223	0,3268	0,815	0,2479	0,8185	0,1462
cyfra arabska	0,5671	0,2996	0,5067	0,1996	0,2264	0,4736
3	0,8172	0,3692	0,8114	0,1536	0,9065	-1,1532
4	0,6673	0,367	0,6436	0,1709	0,8852	0,1445
*SD –odchylenie standardowe,
R2 – korelacja zbioru treningowego między rzeczywistymi a przewidywanymi wartościami aktywności,
Q2 – korelacja rzeczywistej i przewidywanej aktywności zestawu testowego.
RMSE - Błąd średniokwadratowy

Tabela 3: Parametry statystyczne modelu 2D-QSAR. W tabeli przedstawiono odchylenie standardowe, korelację zbioru treningowego między rzeczywistymi a przewidywanymi wartościami aktywności (R²) oraz wysoki wynik korelacji aktywności rzeczywistej i przewidywanej zestawu testowego dla każdej klasy (Q²). Wyższy wynik (R²) reprezentuje klasę.

pkt. TGL pkt. jezdnego jezdnego pkt. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt.

Ligand	homo	LUMO	Odstęp E
Efawirenz	-0,2242	-0,06943	0,15477
Etrawiryna	-0,21408	-0,08141	Numer katalogowy: 0,13267
Newirapina	-0,20602	-0,07759	Numer katalogowy: 0,12843
HBY_561	-0,19687	-0,0748	0,12207
Delawirdyna	-0,19651	-0,07958	Numer katalogowy: 0,11693
Dorawiryna	-0,22413	-0,10916	Numer katalogowy: 0,11497
Rylpiwiryna	-0,21343	-0,11216	0,10127

Tabela 4: Luka energetyczna HOMO-LUMO zoptymalizowanych NNRTI. Tabela przedstawia wyniki luk energetycznych HOMO-LUMO uzyskane po optymalizacji sześciu NNRTI.

TGL TGL pkt. pkt. TGL TGL TGL pkt. pkt. pkt. TGL TGL TGL pkt.

Ligand	Zoptymalizowane ligandy	Enumerowane ligandy
Dorawiryna	7,229	7,374
Rylpiwiryna	7,302	7,279
Etrawiryna	7,229	7,374
Efawirenz	7,229	7,323
Delawirdyna	7,302	7,302
Newirapina	7,229	6,988
HBY_561	7,229	7,323

Tabela 5: Przewidywane wyniki aktywności zoptymalizowanych NNRTI w porównaniu z odpowiadającymi im wyliczonymi NNRTI. W tabeli porównano wyniki aktywności predykcyjnej między zoptymalizowanymi i zliczonymi ligandami. Im wyższe wyniki aktywności, tym lepszy związek jako potencjalny ołów leku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Ligand	Luka energetyczna po optymalizacji	Luka energetyczna po wyliczeniu	Różnica w odstępach między związkami zoptymalizowanymi i wyliczonymi
Dorawiryna	0,115	0,126	0,011
Rylpiwiryna	0,101	0,127	0,030
Etrawiryna	0,133	0,126	0,010
Efawirenz	0,155	0,126	0,030
Delawirdyna	0,117	0,126	0,010
Newirapina	0,128	0,126	0,002
HBY_561	0,122	0,126	0,004

Tabela 6: Porównanie przewidywanych przerw energetycznych wyliczonych NNRTI i pierwotnej luki energetycznej zoptymalizowanych NNRTI. W tabeli przedstawiono porównanie luki energetycznej HOMO-LUMO pomiędzy ligandami zoptymalizowanymi i zliczonymi oraz różnic w różnicach energii między nimi.

) pkt. pkt. jezdnych jedn. pkt. pkt. jedn. jedn. jezdnych pkt. pkt. jedn. jedn. jedni pkt. pkt. pkt. jezdnych pkt. jedn. pkt. pkt. pkt. jedn. jedn. pkt.

Ligand wyliczony	Zasada 5 właściwości	Kolumna 1	Kolumna 2	Kolumna 3	Kolumna 4	Kolumna 5	Dodano grupę boczną	Wyliczony wynik dokowania	Oryginalny wynik dokowania	Ponownie zadokowane ligandy wyliczone
	AlogP	PSA (PSA	Wirus HBD (HBD	Hba	Mw	Mpo
Dorawiryna	2.4	125,9	cyfra arabska	8	441,8 pkt.	0,49	Hydroksylowe	-8,894	-9.04	-9,739
Etrawiryna	4.4	140,9	3	8	451,3 pkt.	0,37	Hydroksylowe	-10,258	-9,647	-10,517
Efawirenz	3.7	64,3	cyfra arabska	3	330,7 pkt.	0,75	Aminy	-10,284	-10,432	-11.025
Newirapina	2.6	58,1	1	4	284,3	0,73	Fluorek	-9,112	-8,825	-9,445
HBY_561	2.4	93,9	cyfra arabska	6	358,5	0,66	amid	-9,596	-9,242	-10,1
AlogP - (Obliczony logarytm współczynnika podziału oktanol-woda).
PSA - (Powierzchnia biegunowa)
HBD - (Dawcy Wiązań Wodorowych)
HBA - (Akceptory wiązań wodorowych)
MW - (Masa cząsteczkowa)
MPO - (Optymalizacja wieloparametrowa)

Tabela 7: Porównanie wyników dokowania między oryginalnymi i wyliczonymi NNRTI. W tabeli przedstawiono porównanie wyliczeniowych wyników dokowania, które są wynikami dokowania po wyliczeniu. Oryginalne wyniki dokowania to wyniki dokowania zoptymalizowanych NNRTI. Ponownie zadokowane wyliczone wyniki są wynikami dokowania ligandów, które zostały wyliczone. Ponieważ proces wyliczania daje predykcyjny wynik dokowania, ligandy musiały zostać ponownie zadokowane przy użyciu tej samej metody, co zoptymalizowane ligandy. Dodane grupy to te, które zostały dodane do ligandów podczas procesu wyliczania.

jezdnych jezdnych TGL szt. jedni pkt. TGL jedn. jedn. jedn. TGL jedn. jedn. jedn. zł jedn. jedyny jezdnych jedn. jedni pkt. TGL jedn. TGLI jedn. pkt. pkt. TGLI jedn. TGL jezdnych jezdnych jedn. pkt. pkt. jezdnego Rozdział pkt. jedn. jedn. TGL pkt. jezdnych jedn. TGL jezdnych

Ligand	Wiązanie ΔG	ΔGKulomb	ΔGkowalencyjny	ΔGHbond	ΔGLipo	Pakiet ΔG	ΔGSolv	ΔGVdW
Etrawiryna	-80.551	-11.196	2,491	-1,509	-27.447	-4,826	Klasa 26 605	-64.669
Wyliczona etrawiryna	-89,684	-17,976	Z drugiej strony, 807	-2,541	-27.652	-4,211	Z dnia 26 034	-66.146
Zobacz materiał HBY561	-79.664	-12,261	0,994	-0,521	-26.052	-1,278	18.624	-59.169
Wyliczone HBY561	-82.719	-13,443	1,534	-0,603	-27.053	-1,210	20.600	-62.544
Efawirenz	-71.372	-12,984	1,151	-0,834	-25.353 jedyniec	-1,379	14.472	-46,44
Wyliczone Efavirenz	-79,125	-18,602	1,753	-2,159	-25.409	-1,198	16.619	-50.129

Tabela 8: MMGBSA reXts wybranych ligandów na 1HQU. Tabela przedstawia mechanikę molekularną z uogólnionymi obliczeniami Borna i pola powierzchni, które pokazują średnią energię swobodną wiązania (ΔGbind) kompleksu białko-ligand. Tabela przedstawia porównanie oryginalnie zoptymalizowanych ligandów, które wykazują dobre wyniki dokowania w stosunku do ligandów krystalicznych i ich wyliczonych odpowiedników. Wybrany związek z wyższym wynikiem dokowania i dobrą symulacją dynamiki molekularnej fluktuacji RMSD przy równowadze powinien również spełniać obliczenia MMGBSA, wykazując najbardziej ujemnąenergię swobodną wiązania (_wiązanie ΔG). W tym przypadku wyliczona etrawiryna spełnia oba parametry obliczeniowe.

Plik uzupełniający 1: Inne rXts uzyskane w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Metodę DFT²⁶ wykorzystano do analizy właściwości elektronowych i stabilności różnych pochodnych pirymidyny, co nie ma miejsca w podobnych badaniach. Zastosowanie DFT pozwala na głębsze zrozumienie oddziaływań molekularnych na poziomie kwantowym, usprawniając proces projektowania NNRTI. W tym badaniu wybraliśmy sześć NNRTI o nieznanych wartościach aktywności. Pobraliśmy ich struktury molekularne z bazy danych PubChem i przeprowadziliśmy optymalizację geometryczną przy użyciu funkcjonalnego zestawu Minnesota 15 Local (MN15-L)³² i zestawu podstawowego 6-31++G (d,p)² w pakiecie oprogramowania mechaniki kwantowej Gaussian 16 revision C01³³ . Aby skonfigurować pliki wejściowe symulacji, użyliśmy GaussView 6.0²⁶. Struktury kwantowe zostały następnie zadokowane w miejscu aktywnym białka HIV-1.

W badaniu wykorzystano podejście QSAR⁵¹, które jest dostosowane do przewidywania aktywności biologicznej NNRTI na podstawie ich struktury chemicznej. Model ten został wygenerowany przy użyciu zestawu danych 94 pochodnych dihydrofuro[3,4-d] pirymidyny, co umożliwia identyfikację kluczowych grup funkcyjnych, które wpływają na aktywność przeciwwirusową. Włączenie solidnego modelu QSAR jest kluczowym postępem, ponieważ pomaga filtrować związki na wczesnym etapie procesu projektowania, zwiększając skuteczność odkrywania leków.

Wzięto pod uwagę przewidywaną aktywność nowych związków, a wyniki dokowania zostały zweryfikowane. Zaawansowana technika dokowania molekularnego pozwoliła na zbadanie interakcji wiążących między NNRTI a enzymem odwrotnej transkryptazy HIV-1. Uzupełnieniem były symulacje dynamiki molekularnej prowadzone przez dłuższy okres czasu (200 ns), które dostarczyły informacji na temat stabilności i zachowania kompleksów lek-białko w warunkach fizjologicznych. W ramach projektu Molecular Dynamics⁵² potwierdzono wyniki badań dokowania. Symulując zachowanie kompleksów lek-enzym w czasie, możemy ocenić dynamiczną stabilność i interakcje, które mogą nie zostać uchwycone w badaniach statycznego dokowania⁵³. Podejście to zapewnia bardziej realistyczną ocenę tego, jak NNRTI mogą działać w systemach biologicznych. Symulacje wykazały, że etrawiryna powodowała wahania RMSD o około 4,5 A, podczas gdy wyliczana etrawiryna powodowała wahania RMSD o 3,5 A. Stwierdzono różne podobieństwa między etrawiryną a etryminowaną etrawiryną, przy czym wymieniony związek posiadał wzmocnione interakcje aminokwasowe w miejscu aktywnym białka. Niższy RMSD, ulepszone interakcje aminokwasowe i najwyższa wiązanie wolnej energii sugerują, że wymieniona etrawiryna może służyć jako realna alternatywa w leczeniu HIV/AIDS.

Na uwagę zasługuje wykorzystanie technik enumeracyjnych⁵⁴ do generowania stereoizomerów i wykonywania skanowania izosterowego. Metoda ta pozwala naukowcom na zbadanie szerszej przestrzeni chemicznej dla potencjalnych NNRTI poprzez systematyczne modyfikowanie istniejących struktur, co może prowadzić do odkrycia związków o zwiększonej skuteczności i zmniejszonej oporności.

Badania łączą analizę HOMO-LUMO pochodzącą z obliczeń mechaniki kwantowej w celu oceny reaktywności i stabilności związków. Ten aspekt jest często pomijany w podobnych^badaniach55, a jednak dostarcza cennych informacji na temat właściwości elektronicznych, które mogą wpływać na aktywność biologiczną

Zastosowanie metody MMGBSA w tym badaniu do oszacowania wolnych energii wiązania wyliczonych NNRTI jako potencjalnych inhibitorów odwrotnej transkryptazy HIV-1 (RT) przedstawia nowy aspekt, który zwiększa znaczenie i potencjalny wpływ tej pracy na rozwój leczenia HIV.

Zastosowanie MMGBSA w tym badaniu zapewnia dokładniejsze oszacowanie wolnych energii wiązania dla wyliczonej etrawiryny w porównaniu z jej odpowiednikiem. Obliczając wartości wolnej energii wiązania, w badaniu ilościowo oceniano powinowactwo wiązania etrygowanej etrawiryny, które było znacznie wyższe (9,133 kcal/mol) niż w przypadku standardowej etrawiryny. Ten poziom szczegółowości wiążących obliczeń energetycznych pozwala na bardziej zniuansowane zrozumienie, w jaki sposób modyfikacje strukturalne mogą wpływać na skuteczność NNRTI, czego często brakuje w podobnych badaniach, które mogą opierać się wyłącznie na ocenach jakościowych.

Podana wartość_kowalencyjna ΔG wynosząca 1,477 kcal/mol dodatkowo wskazuje na siłę oddziaływania dla wymienionego związku. Podejście porównawcze jest innowacyjne, ponieważ nie tylko identyfikuje obiecującego kandydata, ale także sytuuje go w szerszym kontekście istniejących terapii, stanowiąc punkt odniesienia dla przyszłego rozwoju NNRTI.

Porównanie przedstawione w Tabeli 8 wskazuje również, że etrywata etrawiryna może być potencjalnym związkiem do zastosowania jako alternatywna ART, ponieważ jej swobodna energia wiązania (_wiązanie ΔG) jest najwyższa w porównaniu z etrawiryną, HBY56, etrawiryną i ich wyliczonymi odpowiednikami.

Wyniki naszego badania mogą znacząco wpłynąć na opracowanie nowych środków terapeutycznych w leczeniu zakażenia wirusem HIV. Dodatkowo, takie podejście może pozwolić na zidentyfikowanie najbardziej obiecującego kandydata na anty-HIV. Odkrycia te mogą utorować drogę do racjonalnego projektowania nowych NNRTI HIV-1.

Włączenie MMGBSA w połączeniu z innymi metodami obliczeniowymi (takimi jak dokowanie molekularne, modelowanie QSAR i symulacje dynamiki molekularnej) zwiększa solidność wyników. To zintegrowane podejście pozwala na kompleksową ocenę związków, od optymalizacji strukturalnej po dynamiczne zachowanie w kontekście biologicznym. Taka metodologia jest stosunkowo nowa w badaniach NNRTI, gdzie badania często koncentrują się na wyizolowanych metodach bez holistycznego spojrzenia na proces projektowania leków. Badania wskazują na kilka obiecujących wyników i lepsze zrozumienie interakcji molekularnych między NNRTI a enzymem odwrotnej transkryptazy, co może stanowić podstawę przyszłych prac nad projektowaniem leków.

Podczas gdy inne badania w dziedzinie rozwoju NNRTI często koncentrują się na pojedynczych metodach obliczeniowych lub podstawowych analizach dokowania, badania te wyróżniają się połączeniem obliczeń chemii kwantowej z dynamiką molekularną i modelowaniem QSAR, zastosowaniem systematycznego podejścia do wyliczania, które rozszerza potencjalną przestrzeń chemiczną dla NNRTI, oraz wykorzystaniem kompleksowego in-silico ramy, które nie tylko przewidują powinowactwo wiązania, ale także oceniają stabilność i dynamikę interakcji lek-enzym.

Ogólnie rzecz biorąc, nowatorstwo tych badań polega na ich wieloaspektowym podejściu, wykorzystującym zaawansowane techniki obliczeniowe w celu sprostania wyzwaniom związanym z lekoopornością w leczeniu HIV, torując w ten sposób drogę do opracowania skuteczniejszych NNRTI. Odkrycia podkreślają potencjał opracowania skuteczniejszych NNRTI, które mogą przezwyciężyć ograniczenia obecnych terapii.

Niektóre przyszłe zastosowania podejścia opisanego w tym protokole obejmują następujące elementy.

Integracja z uczeniem maszynowym

Przyszłe badania mogą zintegrować MMGBSA z algorytmami uczenia maszynowego w celu poprawy mocy predykcyjnej wiązania szacunków energii swobodnej. Trenując modele na dużych zbiorach danych, naukowcy mogą zwiększyć dokładność i wiarygodność prognoz, umożliwiając lepszą identyfikację obiecujących kandydatów na NNRTI.

Zastosowanie w projektowaniu leków opartych na fragmentach

MMGBSA może być skutecznie wykorzystywana w projektowaniu leków opartych na fragmentach, gdzie małe fragmenty molekularne są optymalizowane w celu poprawy powinowactwa wiązania. Takie podejście może doprowadzić do identyfikacji nowych NNRTI o zwiększonej sile działania i selektywności wobec HIV-1.

Badanie mechanizmów oporności na leki

Technika ta może być zastosowana do badania interakcji wiązania NNRTI ze zmutowanymi szczepami HIV-1. Porównując wolne energie wiązania NNRTI zarówno z wariantami typu dzikiego, jak i opornymi, naukowcy mogą uzyskać wgląd w mechanizmy oporności na leki i pomóc w projektowaniu inhibitorów nowej generacji.

Ocena właściwości farmakokinetycznych

MMGBSA może być również stosowana do oceny właściwości farmakokinetycznych NNRTI, takich jak rozpuszczalność i przepuszczalność. Dzięki zrozumieniu, w jaki sposób te właściwości korelują z powinowactwem wiązania, naukowcy mogą zoptymalizować kandydatów na leki w celu uzyskania lepszych profili terapeutycznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GaussView	GaussView		V6.1.1
KNIME	KNIME		V4.7.1
Schrödinger Maestro V13.6	SCHRODINGER INC.		Rok wydania licencji 2023-2