Artykuł metodologiczny

Stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego

DOI:

10.3791/67462

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje rozwój modelu myszy z nadwrażliwością na kaszel, który może służyć jako idealny model do badania mechanizmów przewlekłego kaszlu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaszel jest jednym z najczęstszych objawów wielu chorób układu oddechowego. Przewlekły kaszel znacząco wpływa na jakość życia i stanowi znaczne obciążenie ekonomiczne. Zwiększona wrażliwość na kaszel jest patofizjologiczną cechą charakterystyczną przewlekłego kaszlu. Zaobserwowano, że nadwrażliwość na kaszel jest związana z zapaleniem dróg oddechowych, przebudową nerwów czuciowych dróg oddechowych i zmianami w ośrodkowym układzie nerwowym. Jednak dokładne mechanizmy molekularne pozostają niejasne i wymagają dalszych wyjaśnień przy użyciu odpowiednich modeli zwierzęcych. Poprzednie badania wykorzystywały świnki morskie jako modele do badania kaszlu, ale modele te mają kilka ograniczeń eksperymentalnych, w tym wysokie koszty, brak narzędzi transgenicznych i niedobór komercyjnych odczynników. Ponadto świnki morskie zazwyczaj wykazują słabą tolerancję środowiskową i wysoką śmiertelność pod wpływem bodźców. W przeciwieństwie do tego, myszy są mniejsze, łatwiejsze w utrzymaniu, bardziej opłacalne i podatne na manipulacje genetyczne, co czyni je bardziej odpowiednimi do badań mechanistycznych. W tym badaniu ustaliliśmy model myszy z nadwrażliwością na kaszel via ciągłym wdychaniu kwasu cytrynowego (CA). Model ten jest prosty w obsłudze i daje powtarzalne wyniki, co czyni go cennym narzędziem do dalszych badań nad mechanizmami i potencjalnymi nowymi metodami leczenia przewlekłego kaszlu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaszel jest kluczowym odruchem obronnym, który pomaga usunąć wydzieliny z dróg oddechowych lub ciała obce z dróg oddechowych. Jest to jednak również jeden z najczęstszych objawów wielu chorób układu oddechowego, często skłaniający pacjentów do szukania pomocy medycznej1. Przewlekły kaszel, definiowany jako uporczywy kaszel trwający dłużej niż 8 tygodni u dorosłych, znacząco wpływa na jakość życia, powodując problemy, takie jak nietrzymanie moczu, bezsenność, refluks i inne nieprzyjemne doświadczenia, a także znaczne obciążenie ekonomiczne2,3,4. Powszechnie uważa się, że zwiększona wrażliwość na kaszel jest patofizjologiczną cechą charakterystyczną przewlekłego kaszlu, gdzie niski poziom termicznych, mechanicznych i chemicznych czynników drażniących może wywołać kaszel5. Nadwrażliwość na kaszel jest związana z zapaleniem dróg oddechowych6, przebudową nerwów czuciowych dróg oddechowych7 oraz zmianami w ośrodkowym układzie nerwowym8, chociaż dokładne mechanizmy molekularne pozostają niejasne i wymagają dalszego wyjaśnienia za pomocą odpowiednich modeli zwierzęcych.

Różne zwierzęta, w tym świnki morskie, koty, króliki, psy i świnie, zostały wykorzystane do badania mechanizmów kaszlu9. Świnki morskie są tradycyjnie uznawane za najbardziej odpowiedni model do badania mechanizmów kaszlu i skuteczności leków przeciwkaszlowych9,10,11,12. Modele te mają jednak kilka ograniczeń eksperymentalnych, w tym wysokie koszty, brak narzędzi transgenicznych i niedobór komercyjnych odczynników. Ponadto świnki morskie często wykazują słabą tolerancję środowiskową i wysoką śmiertelność pod wpływem bodźców. W przeciwieństwie do tego, myszy są mniejsze, łatwiejsze w utrzymaniu, bardziej opłacalne i podatne na manipulacje genetyczne, co czyni je bardziej odpowiednimi do badań mechanistycznych. Wcześniejsze badania nad modelami kaszlu koncentrowały się przede wszystkim na kaszlu wywołanym zapaleniem dróg oddechowych, używanym głównie do oceny skuteczności leków przeciwkaszlowych i mechanizmów obwodowych13,14. Obecnie brakuje modeli zwierzęcych nadwrażliwości na kaszel.

W odpowiedzi wprowadzamy metodę tworzenia mysiego modelu nadwrażliwości na kaszel poprzez ciągłe wdychanie kwasu cytrynowego (CA). Ten model jest prostszy, łatwiejszy do skonstruowania i bardziej wykonalny w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (20230656). W badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6 wolne od specyficznych patogenów w wieku 8-10 tygodni i o wadze 20-25 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynnika chemicznego

  1. Przygotowanie roztworu kwasu cytrynowego (CA)
    1. W celu oceny kaszlu należy przygotować 0,4 M roztwór, rozpuszczając 3,84 g kwasu cytrynowego w proszku w zwykłej soli fizjologicznej do końcowej objętości 50 ml.
    2. Do leczenia zwierząt należy przygotować 0,1 M roztwór, rozpuszczając 9,6 g proszku kwasu cytrynowego w roztworze soli fizjologicznej do końcowej objętości 500 ml.
  2. Przygotowanie roztworu kapsaicyny
    1. Rozpuścić 30,5 mg kapsaicyny w proszku w PBS zawierającym 10% etanolu i 10% Tween-80, aby uzyskać 10 mM roztwór podstawowy.
    2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1:100 w roztworze soli fizjologicznej, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 100 μM.
  3. Przygotowanie roztworu metacholiny
    1. Rozpuścić 100 mg proszku metacholiny w PBS do końcowej objętości 2 ml w celu uzyskania roztworu o stężeniu 50 mg/ml.
    2. Rozcieńczyć ten roztwór PBS, aby uzyskać stężenia 25 mg/ml, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/ml i 3,125 mg/ml.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Warunki mieszkaniowe
    1. Myszy domowe w klatkach ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody, utrzymywane w temperaturze 22 ± 1 °C ze standardowym 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Manipulacje eksperymentalne przeprowadzono po 1 tygodniu od aklimatyzacji do środowiska żywieniowego.
  2. Aklimatyzacja
    1. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w środowisku żywieniowym przez 1 tydzień przed przeprowadzeniem eksperymentalnych manipulacji.

3. Rozwój modelu

  1. Przypisanie do grupy
    1. Losowo podziel myszy na grupę modelową i grupę kontrolną, po 8 myszy w każdej grupie.
  2. Ustawienie ekspozycji
    1. Umieść myszy w dwóch niezależnych komorach (jak pokazano na Rysunek 1), każda podłączona do nebulizatora ultradźwiękowego.
    2. Wystaw grupę modelową na działanie 0,1 M aerozolu kwasu cytrynowego (CA), a grupę kontrolną na 0,9% aerozolu soli fizjologicznej (NS) z szybkością rozpylania 3 ml / min przez 2 godziny dziennie przez 2 tygodnie (jak pokazano na Rysunek 2). Wróć myszy do klatek po każdej ekspozycji.
  3. Ocena wrażliwości na kaszel
    1. Po ostatniej ekspozycji oceń wrażliwość na kaszel, oceniając kaszel odruchowy (prowokowany NS, CA (0,4 M) i kapsaicyną (100 μM)) oraz kaszel spontaniczny (bez żadnej prowokacji).
      UWAGA: Aby monitorować dynamiczne zmiany wrażliwości na kaszel podczas opracowywania modelu, oceń wrażliwość na kaszel w dniach 0, 3, 7 i 10 za pomocą prowokacji CA (0,4 M).

4. Ocena wrażliwości na kaszel

  1. Przygotowanie instrumentu
    1. Użyj nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) do pomiaru wrażliwości na kaszel. Podłączyć komory, przetworniki przepływu, przepływ polaryzacyjny i inne elementy zgodnie z instrukcją aplikacji (patrz tabela materiałów).
    2. Przeprowadź proces kalibracji, aby zapewnić dokładne pomiary, klikając przycisk Kalibruj. Na ekranie stanu zostanie wyświetlony postęp, a gdy pasek stanu osiągnie 100%, kalibracja zostanie zakończona.
  2. Wykrywanie kaszlu
    1. Utwórz badanie kaszlu dla myszy i skonfiguruj parametry dla 1 minuty aklimatyzacji, 10 minut czasu odpowiedzi i 10 minut dostarczania roztworu chemicznego.
    2. Umieść przytomne myszy w osobnych komorach, upewniając się, że w każdej komorze jest tylko jedna mysz.
      UWAGA: Upewnij się, że mysz jest całkowicie w komorze przed zamknięciem pokrywy, aby uniknąć uszkodzenia jej ogona i palców.
    3. Dodać 1 ml roztworów chemicznych (NS, CA lub kapsaicyny) do nebulizatora.
      UWAGA: Liczba przypadków kaszlu - z których każda składa się z trzech faz: wdechowej, uciskowej i wydalającej15 (jak pokazano w Rysunek 3)- zostanie zarejestrowana po rozpoczęciu badania. Po 10 minutach nagrywania wykrywanie kaszlu zostanie zakończone. Wyczyść komorę po wykryciu każdego zwierzęcia, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

5. Pomiar nadreaktywności dróg oddechowych (AHR)

  1. Przygotowanie instrumentu
    1. Przygotuj instrumenty zgodnie z opisem w kroku 4.1.
  2. Pomiar AHR
    1. Utwórz badanie dawka-odpowiedź dla myszy, konfigurując typy pomiarów, parametry i sekwencję zadań: 1 minuta na aklimatyzację, 30 s na dostarczenie roztworu metacholiny, 3 minuty na czas odpowiedzi i 1 minuta na powrót do zdrowia.
    2. Umieść przytomne myszy w indywidualnych komorach, upewniając się, że w każdej komorze jest tylko jedna mysz.
    3. Dodać 50 μl roztworów chemicznych (PBS lub metacholiny) do nebulizatora i rozpocząć badanie.
    4. Zapisz wartość Penh, wskaźnika zwężenia oskrzeli, w odpowiedzi na różne stężenia metacholiny (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/ml).

6. Kolekcja płukania oskrzelowo-pęcherzykowego

  1. poświęcenie
    1. Uśmierc myszy za pomocą znieczulenia z pentobarbitalem sodowym (50 mg / kg) podawanym we wstrzyknięciu dootrzewnowym (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  2. Pobieranie próbek
    1. Zbierz krew z zatoki oczodołowej myszy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie umieść probówkę na lodzie. Odwirować krew o stężeniu 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Za pomocą pipety zebrać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Zebrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), otwierając klatkę piersiową w celu odsłonięcia tchawicy, wprowadzając igłę o sile 22 G do tchawicy, a następnie trzykrotnie przepłukując 0,5 ml wstępnie schłodzonego PBS i zbierając płyn.
    3. Po zebraniu należy odwirować BALF przy stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zawiesić osad w 100 μl PBS i przygotować rozmazy komórek do dalszej analizy.
    4. Zbierz tkanki płucne, otwierając klatkę piersiową, aby odsłonić płuca, usuwając tkanki płucne i umieszczając je w fiolkach kriogenicznych. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C do przyszłych badań.

7. Ilościowy RT-PCR

  1. Ekstrahuj całkowite RNA z tkanki płucnej za pomocą odczynnika TRIzol. Przeprowadź syntezę cDNA przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  2. Przeprowadzanie PCR w ilościowym systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zielonej fluorescencji SYBR. Znormalizuj kwantyfikację względnej ekspresji mRNA SP i CGRP do wyrażenia β-Actin9.

8. Analiza statystyczna

  1. Przedstaw dane jako średnią ± SEM. Użyj testu t, aby porównać dane między dwiema grupami, uznając P < 0,05 za statystycznie istotne. Przeprowadzaj wszystkie analizy statystyczne za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w Rysunek 4A, wrażliwość na kaszel w grupie modelowej (grupa CA) znacznie wzrosła po 1 tygodniu ekspozycji w porównaniu z grupą kontrolną (grupa NS), a ta podwyższona wrażliwość utrzymywała się przez cały okres ekspozycji. Ani grupa kontrolna, ani grupa modelowa myszy nie doświadczyły śmiertelności podczas procesu modelowania (Rysunek 4B). Rysunek 4C i rysunek 4D pokazują, że liczba spontanicznych epizodów kaszlu znacznie wzr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu udało się ustalić model mysi z nadwrażliwością na kaszel poprzez ciągłe wdychanie kwasu cytrynowego (CA). Model ten wykazał wiarygodny wzrost wrażliwości na kaszel zarówno w przypadku kaszlu spontanicznego, jak i odruchowego wywołanego przez kwas cytrynowy i kapsaicynę. Kwas cytrynowy i kapsaicyna są szeroko stosowane do oceny wrażliwości odruchu kaszlowego16.

Kilka krytycznych kroków w tym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 82100034), Guangzhou Science and Technology Planning Project (202102010168).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologicznaBiosharpBL158A
KapsaicynaKajman chemiczna92350
Kwas cytrynowySigma-AldrichC2404
EtanolFabryka odczynników chemicznych w KantonieGSHB15-AR-0,5L
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNATransGen BiotechAT341
MetacholinaSigma-AldrichA2251
Nieinwazyjny system pletyzmografii całego ciała (WBP)DSI601-1400-001
Pentobarbital sodowyMerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)MeilunbioMA0015
W czasie rzeczywistym  ilościowe  PCR  Wykrywanie  systemBio-rad Sterownik CFX  Connect
TRIzol odczynnikInvitrogen15596026CN
Tween-80SolarbioT8360-100
Nebulizator ultradźwiękowyYuwell402AI

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  5. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  6. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).
  7. Shapiro, C. O., et al. Airway sensory nerve density is increased in chronic cough. Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).
  8. Ando, A., et al. Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control. Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).
  9. Plevkova, J., et al. Animal models of cough. Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656(2021).
  10. Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. Antitussive effects of memantine in guinea pigs. Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).
  11. Hewitt, M. M., et al. Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).
  12. Zhong, S., et al. Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models. J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).
  13. Zhong, S., et al. Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure. J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).
  14. Wei, L., et al. Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).
  15. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263(2013).
  16. Gibson, P., et al. Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report. Chest. 149 (1), 27-44 (2016).
  17. Nakaji, H., et al. Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study. Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).
  18. Xu, X., et al. Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough. J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).
  19. Iwata, T., et al. Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough. PLoS One. 10 (11), e0141823(2015).
  20. Chen, L., et al. Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis. Sci Rep. 10 (1), 10557(2020).
  21. Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).
  22. Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. Citric acid bioproduction: The technological innovation change. Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).
  23. Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).
  24. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhalacja kwasu cytrynowegoprzewlek y kaszelstan zapalny dr g oddechowychsensoryczne nerwy dr g oddechowychpletyzmografia ca ego cia ap ukanie wewn trzbronchialnenadreaktywno dr g oddechowychpr ba z metacholim

Powiązane artykuły