Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Podsumowanie

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Streszczenie

Ludzka linia komórkowa THP-1 ludzkiej ostrej białaczki monocytowej (AML) jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów, w tym ich interakcji z istotnymi ludzkimi patogenami, takimi jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV). W porównaniu z innymi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi pochodzenia szpikowego, komórki THP-1 zachowują wiele nienaruszonych szlaków sygnalizacji zapalnej i wykazują cechy fenotypowe, które bardziej przypominają cechy pierwotnych monocytów, w tym zdolność do różnicowania się w makrofagi po potraktowaniu octanem forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA). Zastosowanie technologii CRISPR-Cas9 do inżynierii komórek THP-1 poprzez celowany nokaut genów (KO) zapewnia potężne podejście do lepszego scharakteryzowania mechanizmów związanych z odpornością, w tym interakcji wirus-gospodarz. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 wykorzystującej elektroporację do dostarczania wstępnie zmontowanych rybonukleoprotein Cas9:sgRNA do jądra komórkowego. Użycie wielu sgRNA celujących w ten sam locus w nieco różnych pozycjach powoduje delecję dużych fragmentów DNA, zwiększając w ten sposób wydajność edycji, jak oceniono za pomocą testu endonukleazy T7 I. Edycja za pośrednictwem CRISPR-Cas9 na poziomie genetycznym została zwalidowana przez sekwencjonowanie Sangera, a następnie analizę wnioskowania o edycjach CRISPR (ICE). Niedobór białka potwierdzono za pomocą immunoblottingu połączonego z testem czynnościowym. Korzystając z tego protokołu, osiągnięto do 100% indeli w docelowym locus i spadek ekspresji białka o ponad 95%. Wysoka wydajność edycji sprawia, że izolowanie klonów jednokomórkowych jest wygodne poprzez ograniczenie rozcieńczenia.

Wprowadzenie

THP-1 to ludzka linia komórkowa pochodząca z monocytów wyizolowana od pacjenta cierpiącego na ostrą białaczkę (AML), która wykazuje cechy fenotypowe bardzo podobne do cech pierwotnych monocytów¹. W porównaniu z pierwotnymi makrofagami pochodzącymi z monocytów, które nie dzielą się i wykazują zarówno ograniczoną długość życia, jak i zmienność między / wewnątrz dawcy w fenotypie, komórki THP-1 mogą być hodowane praktycznie w nieskończoność i mają bardziej jednorodne zachowanie, które sprzyja odtwarzalności wyników^2,3,4,....

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Projekt przewodnika z CRISPOR (Rysunek 1.1)

UWAGA: Oprogramowanie SnapGene Viewer może być użyte w krokach 4, 7 i 10 do opisania miejsca docelowego edycji i lokalizacji hybrydyzacji startera PCR w obrębie interesującego genu.

1. Wejdź na stronę internetową Ensembl (www.ensembl.org). W polu wyszukiwania wybierz gatunek i wprowadź nazwę interesującego go genu. Kliknij Przejdź. Wybierz wynik, kt....

Wyniki

Linia komórkowa THP-1 została wygenerowana ze stabilną ekspresją białka reporterowego GFP (THP-1_GFP) (Rysunek 2A) i użyta jako narzędzie do ustanowienia protokołu dla wydajnej edycji genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9. W tym celu zaprojektowano 3 sgRNA ukierunkowane na gen EGFP za pomocą narzędzia internetowego CRISPOR²⁹ (Figura 2B), które zostały jednocześnie skompleksowane z Cas9 w stosunku molowym 9:1, aby utworzyć RNP przed dostarczeniem do komó.......

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół mający na celu uzyskanie udanej edycji linii komórkowej THP-1 za pośrednictwem CRISPR. Podejście to opiera się na przenoszeniu wstępnie zmontowanych RNP sgRNA/Cas9 za pomocą elektroporacji/nukleofekcji. Strategia ta została wybrana w celu ograniczenia efektów off-target, które potencjalnie powstają po integracji kasety sgRNA/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa, co prowadzi do trwałej ekspresji nukleazy. Wybrano wiele sgRNA ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania, aby osiągną.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy	ClearLine	146560	_
0,4 % trypan niebieski	Beckman Coulter	383200	_
1,5 mL probówka	Eppendorf	3810X	_
24-dołkowa	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA Loading Dye	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² Kolba hodowlana z wentylowaną nasadką	Corning	353136	_
8-paskowe probówki do PCR z nakrętkami	Technologie życia	AM12230	_
Płytki 96-dołkowe Płytki płaskie Corning		353072	_
96-dołkowe Okrągłe dno	Corning	353077	_
Agaroza	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc System obrazowania	BIO-RAD	12003153	_
Szkiełko zliczające	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_	_http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
Bydło płodowe Serum	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo scientific	SM0323	_
Przeglądarka danych genomu	NCBI_		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	Version 9.3.1
Polimerazy DNA z fuzji Herculase II	Agilent	600679	_
ICE Narzędzie do analizy CRISPR	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD_		Wersja 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	W zestawie z zestawem T7EI M0302S
Neon, 10 i mikro; L	Invitrogen	MPK1025K	Zestaw do elektroporacji zawierający końcówki, probówki, bufor R i E
System transfekcji neonowej	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_	_	https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
		Starter do PCR bez nukleaz (
EGFP)	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
Starter PCR (SAMHD1)	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Wersja : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicylina-streptomycyna (10 000 U / mL)	Gibco	15140122	_
PFA	Mikroskopia elektronowa Nauki	15714	_
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104	_
Rozwiązanie do ekstrakcji DNA QuickExtract	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640, GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	Version 7
SpCas9 2NLS Nukleaza	Synthego	_	_
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA	Invitrogen	S33102	_
Syntetyczne sgRNA (EGFP)	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Syntetyczne sgRNA (SAMHD1)	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Strzykawka Plastipak Luer Lock	BD	301229
_T100 Termocykler	BIO-RAD	1861096	_
T7 endonukleaza I	Nowość Anglia Biolabs	M0302S	_
TAE bufor UltraPure, 10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
Komórki THP-1	ATCC	TIB-202	_
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco		25300054
_ZE5 Analizator komórek	BIO-RAD	12014135	_