Artykuł metodologiczny

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67469

⸱

28 lutego 2025

 , 
1INSERM, CEA, Center for Immunology of Viral, Auto-immune, Hematological and Bacterial diseases (IMVA-HB/IDMIT), Université Paris-Saclay

W tym artykule

Podsumowanie

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Streszczenie

Ludzka linia komórkowa THP-1 ludzkiej ostrej białaczki monocytowej (AML) jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów, w tym ich interakcji z istotnymi ludzkimi patogenami, takimi jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV). W porównaniu z innymi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi pochodzenia szpikowego, komórki THP-1 zachowują wiele nienaruszonych szlaków sygnalizacji zapalnej i wykazują cechy fenotypowe, które bardziej przypominają cechy pierwotnych monocytów, w tym zdolność do różnicowania się w makrofagi po potraktowaniu octanem forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA). Zastosowanie technologii CRISPR-Cas9 do inżynierii komórek THP-1 poprzez celowany nokaut genów (KO) zapewnia potężne podejście do lepszego scharakteryzowania mechanizmów związanych z odpornością, w tym interakcji wirus-gospodarz. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 wykorzystującej elektroporację do dostarczania wstępnie zmontowanych rybonukleoprotein Cas9:sgRNA do jądra komórkowego. Użycie wielu sgRNA celujących w ten sam locus w nieco różnych pozycjach powoduje delecję dużych fragmentów DNA, zwiększając w ten sposób wydajność edycji, jak oceniono za pomocą testu endonukleazy T7 I. Edycja za pośrednictwem CRISPR-Cas9 na poziomie genetycznym została zwalidowana przez sekwencjonowanie Sangera, a następnie analizę wnioskowania o edycjach CRISPR (ICE). Niedobór białka potwierdzono za pomocą immunoblottingu połączonego z testem czynnościowym. Korzystając z tego protokołu, osiągnięto do 100% indeli w docelowym locus i spadek ekspresji białka o ponad 95%. Wysoka wydajność edycji sprawia, że izolowanie klonów jednokomórkowych jest wygodne poprzez ograniczenie rozcieńczenia.

Wprowadzenie

THP-1 to ludzka linia komórkowa pochodząca z monocytów wyizolowana od pacjenta cierpiącego na ostrą białaczkę (AML), która wykazuje cechy fenotypowe bardzo podobne do cech pierwotnych monocytów1. W porównaniu z pierwotnymi makrofagami pochodzącymi z monocytów, które nie dzielą się i wykazują zarówno ograniczoną długość życia, jak i zmienność między / wewnątrz dawcy w fenotypie, komórki THP-1 mogą być hodowane praktycznie w nieskończoność i mają bardziej jednorodne zachowanie, które sprzyja odtwarzalności wyników2,3,4,5,6. Warto zauważyć, że komórki THP-1 mogą być różnicowane w kierunku fenotypu podobnego do makrofagów z 13-octanem forbolu-12-mirystynianu (PMA), co czyni je szeroko stosowanym modelem in vitro do badania odpowiedzi monocytów/makrofagów na sygnały zapalne7,8,9,10,11,12,13 lub zakażenie klinicznie istotnymi ludzkimi patogenami, w tym HIV14,15,16. Możliwość inżynierii genetycznej komórek THP-1 jest przedmiotem zainteresowania w wielu obszarach badań związanych z biologią.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9 (CRISPR-Cas9) to prokariotyczny adaptacyjny układ odpornościowy wykorzystujący nukleazę sterowaną przez RNA w celu degradacji atakujących genomów wirusowych, który został przeprogramowany jako narzędzie inżynierii genetycznej17. Proces edycji genomu przebiega w trzech etapach: rozpoznanie, rozszczepienie i naprawa. RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA) rekrutuje nukleazę Cas9 do określonego locus genomowego poprzez parowanie zasad z sekwencją prowadzącą 20 pz. Obecność sekwencji Protospacer Adjacent Motif (PAM) bezpośrednio 3' genomowej sekwencji docelowej 20-bp wyzwala rozwijanie i rozszczepianie za pośrednictwem Cas9 na obu niciach DNA między pozycjami 17 i 18 (3-bp 5' PAM). Powstałe w ten sposób pęknięcie dwuniciowe (DSB) jest przetwarzane przez dwie główne ścieżki naprawy. W przypadku braku matrycy naprawczej posiadającej homologię z uszkodzonym locus, podatny na błędy szlak niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) wprowadzi losowe inserpcje nukleotydów i / lub delecje (indele), potencjalnie prowadząc do mutacji przesunięcia ramki i / lub wprowadzenia kodonów przedwczesnej terminacji (PTC). Z kolei mRNA zawierające PTC są ukierunkowane na degradację przez nonsensowny szlak rozpadu mRNA (NMD), ostatecznie zakłócając ekspresję/funkcję białka18,19,20. Alternatywnie, zależna od szablonu ścieżka naprawy kierowanej homologią (HDR) może działać i wiernie naprawiać DSB. Mechanizm ten został wykorzystany do osiągnięcia precyzyjnej edycji genów, w tym knock-inów i podstawień zasad. Warto zauważyć, że stan cyklu komórkowego jest ważnym czynnikiem wpływającym na wybór ścieżki naprawy DSB. Rzeczywiście, NHEJ jest aktywny na wszystkich etapach cyklu komórkowego, podczas gdy HDR jest głównie ograniczony do faz S/G221.

Komórki THP-1 rosną w zawiesinie i są niezwykle trudne do transfekcji plazmidowym DNA, co prawdopodobnie również zmienia ich żywotność i/lub zdolność różnicowania22,23. Transdukcja za pomocą wektorów lentiwirusowych opartych na HIV-1, kodujących zarówno Cas9, jak i sgRNA, jest często stosowana do nokautowania (KO) genu będącego przedmiotem zainteresowania24. Integracja kasety Cas9/sgRNA z genomem komórkowym zapewnia przedłużoną ekspresję i wydajny KO, ale jest również stałym źródłem efektów off-target25. Alternatywnie, wstępnie zmontowane rybonukleoproteiny Cas9:sgRNA (RNP) są dostarczane przez elektroporację, metodę polegającą na tymczasowym tworzeniu porów zarówno w plazmie, jak i błonach jądrowych po zastosowaniu impulsów elektrycznych. Zachowanie żywotności komórek jest ważnym wyzwaniem przy wdrażaniu tego podejścia.

Tutaj stworzono linię komórkową THP-1 stabilnie wyrażającą GFP (THP-1_GFP), która służy jako narzędzie do ustanowienia protokołu umożliwiającego efektywną edycję opartą na CRISPR-Cas9. Po zaprojektowaniu strategii inaktywacji genu EGFP przy użyciu trzech sgRNA jednocześnie (podejście wielokierunkowe), określono wydajność KO w kilku warunkach elektroporacji przy użyciu ekspresji GFP jako odczytu. Równolegle monitorowano proliferację komórek. Edycja genów została potwierdzona zarówno testem endonukleazy T7 I (T7EI), jak i sekwencjonowaniem Sangera, a następnie analizą za pomocą algorytmu wnioskowania o edycjach CRISPR (ICE)26. Parametry, które spowodowały zmniejszenie ekspresji GFP nawet o 95%, przy czym komórki THP-1 odzyskuwały normalne tempo wzrostu po elektroporacji, zostały z powodzeniem wykorzystane do inaktywacji endogennego genu (SAMHD1) i wytworzenia jednokomórkowych klonów THP-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Projekt przewodnika z CRISPOR (Rysunek 1.1)

UWAGA: Oprogramowanie SnapGene Viewer może być użyte w krokach 4, 7 i 10 do opisania miejsca docelowego edycji i lokalizacji hybrydyzacji startera PCR w obrębie interesującego genu.

  1. Wejdź na stronę internetową Ensembl (www.ensembl.org). W polu wyszukiwania wybierz gatunek i wprowadź nazwę interesującego go genu. Kliknij Przejdź. Wybierz wynik, który odpowiada genowi (nie transkrypcji).
  2. Kliknij Pokaż tabelę transkrypcji, a następnie wybierz identyfikator transkrypcji, który odpowiada kodowaniu białka oznaczonego na złoto w kolumnie Biotyp. Po wejściu na stronę transkrypcji kliknij Eksony w menu po lewej stronie.
  3. Przewiń w dół i kliknij Pobierz sekwencję. Upewnij się, że format pliku to FASTA. W obszarze Ustawienia - Dołączone sekwencje usuń zaznaczenie wszystkiego oprócz Sekwencja genomowa.
    Wprowadź liczbę "500" w sekwencji flankującej na obu końcach pola transkrypcji. Kliknij Podgląd, zaznacz całą sekwencję (tylko nukleotydy bez nagłówka) i skopiuj ją (Ctrl+C).
  4. Otwórz przeglądarkę SnapGene i kliknij Nowy plik > DNA. Wklej sekwencję (Ctrl+V) w polu Utwórz sekwencję. Usuń zaznaczenie opcji Wykryj wspólne cechy i wybierz opcję Liniowy w topologii.
    Zmień nazwę pliku i kliknij Utwórz. W menu po lewej stronie usuń zaznaczenie opcji Pokaż enzymy (pierwsza ikona). W dolnej części okna wybierz kartę Sekwencja.
    UWAGA: Ten krok umożliwia pobranie pełnej sekwencji genu, w tym eksonów, intronów i sekwencji flankujących 500 pz (opcjonalnie). Ta ostatnia informacja jest przydatna do projektowania starterów PCR do amplifikacji miejsca docelowego znajdującego się w pierwszym eksonie.
  5. Wróć na stronę Ensembl, przewiń w górę podgląd pliku i kliknij Wstecz. Teraz zmień format pliku na RTF. W obszarze Ustawienia - Dołączone sekwencje usuń zaznaczenie wszystkiego oprócz eksonów. W obszarze Pokaż warianty wybierz opcję Nie. Kliknij Pobierz u góry strony.
  6. Otwórz pobrany plik (z programem Word), który zawiera sekwencję eksonów i pokazuje sekwencję kodowania na niebiesko, zaczynając od początkowego ATG. Wybierz ekson, który ma być celem edycji kierowanej przez CRISPR-Cas9 (zalecenia znajdują się poniżej), zaznacz go i skopiuj (Ctrl+C).
    1. Docelowy ekson jest albo wczesnym eksonem, albo eksonem kodującym funkcjonalnie ważną domenę białka. Warto zauważyć, że ustanowienie PTC w późnym eksonie w pobliżu 3' UTR prawdopodobnie nie wywoła NMD, prowadząc do ekspresji C-końcowego białka skróconego. I odwrotnie, wprowadzenie PTC we wczesnym eksonie proksymalnym do natywnego miejsca inicjacji wiąże się z ryzykiem nielegalnej translacji (ITL, aka alternatywnej inicjacji translacji (ATI)), co daje nieoczekiwaną ekspresję N-końcowego białka, które rozpoczyna się w miejscach inicjacji translacji w ramce (TIS) poniżej pierwszego kodonu ATG. Aby zminimalizować to ostatnie ryzyko, zaleca się ocenę występowania alternatywnego TIS za pomocą ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) i/lub NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
    2. Upewnij się, że docelowy ekson zawiera sekwencję kodującą. Jednak przydatne może okazać się wygrzewanie sgRNA z regionem 5'UTR przed początkowym ATG, aby włączyć go do usuniętego fragmentu.
    3. Idealnie byłoby, gdyby docelowy ekson był wspólny dla wszystkich wariantów transkryptu kodującego białko genu. Sprawdź, czy tak jest w przypadku przeglądarki danych genomu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/), wyszukując interesujący Cię gen.
      Kliknięcie na nazwę genu (na zielono) w oknie wyświetlacza pokaże warianty transkrypcji (na fioletowo). Egzony są reprezentowane przez prostokąt.
  7. W przeglądarce SnapGene Viewer naciśnij Ctrl+F, Ctrl+V, a następnie Enter, aby wyszukać sekwencję eksonu. Naciśnij Ctrl + T, aby dodać nową funkcję, nazwij ją, zmień typ na "exon" i kliknij OK.
  8. Wejdź na stronę CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) i wklej sekwencję eksonów w kroku 1. Najpierw wybierz genom referencyjny w kroku 2, a następnie typ PAM, który ma być docelowy w kroku 3, zwykle 20bp-NGG dla SpCas9. Kliknij PRZEŚLIJ.
  9. Wybierz dwa sgRNA tak, aby były oddzielone od siebie o maksymalnie 150 pz, a następnie wybierz trzeci sgRNA pomiędzy. Oto kilka wskazówek dotyczących wyboru sgRNA:
    1. Wynik swoistości MIT jest związany z efektami off-target. Wyższy wynik oznacza mniej potencjalnych niecelności. Prawa kolumna wyświetla trzy przewidywane miejsca poza celem, uszeregowane od najbardziej do najmniej prawdopodobnych, wraz z ich lokalizacjami (w egzonie, intronie lub regionie międzygenowym). Dostęp do pełnej listy przewidywanych witryn niedocelowych można uzyskać, klikając przycisk pokaż wszystko. Jeśli to możliwe, wybierz sgRNA z wynikiem MIT >80, priorytetowo traktując te bez niezgodności 0, 1 lub 2. Ponadto należy unikać sgRNA z off-targets w eksonie, które mają największy potencjał do wpływania na fenotyp.
    2. Aby uzyskać informacje na temat przewidywanej skuteczności, zapoznaj się z wynikiem Doench '16. Należy zauważyć, że wysoki wynik Doench '16 wskazuje po prostu, że sgRNA jest bardziej prawdopodobne, że będzie skuteczne. Rzeczywista skuteczność musi być określona doświadczalnie. Z tego powodu zawsze warto wybrać kilka sgRNA, nawet jeśli nie są one przeznaczone do stosowania razem.
    3. Zbyt wysoka lub zbyt niska zawartość GC, a także niektóre motywy mogą być szkodliwe dla wydajności sgRNA i należy ich unikać. Parametry te są wyróżniane przez CRISPOR.
  10. Powtórz krok 1.7, aby dodać sekwencję sgRNA i powiązaną sekwencję PAM do sekwencji genu w przeglądarce SnapGene Viewer. W tym samym czasie wklej sekwencję sgRNA (bez PAM) do pliku tekstowego lub Excel, aby zachować orientację 5'-3' wymaganą przy zamawianiu oligonukleotydu.
  11. Aby amplifikować miejsce docelowe na podstawie PCR, zaprojektuj kilka otaczających go starterów. Wielkość amplikonu powinna wynosić od 800 do 1000 pz. PrimerQuest został wykorzystany do zaprojektowania starterów dla tego protokołu (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Alternatywnie, CRISPOR dostarcza listę starterów do amplifikacji docelowego regionu genomu, a także miejsc poza celem. Po wyświetleniu pełnej listy potencjalnych miejsc niedocelowych (krok 1.9.1) kliknij na Startery niedocelowe w prawym dolnym rogu.

2. Przygotowanie odczynnika i ogniwa do elektroporacji (Rysunek 1.2)

  1. Przygotuj 24-dołkową płytkę hodowlaną, aby odzyskać komórki po elektroporacji, wypełniając studzienki 500 μl pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 20% inaktywowaną termicznie (56 °C, 30 min), przefiltrowaną (0,20 μm) płodową surowicę bydlęcą (FBS). Nie dodawaj antybiotyków. Przechowywać płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny do momentu elektroporacji.
  2. Jeśli sgRNA są wysyłane w stanie suchym, należy je ponownie uwodnić buforem TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) do końcowego stężenia 100 μM (tj. 10 μL buforu TE na 1 nmol sgRNA). Wirować przez 30 s, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić całkowite nawodnienie, a następnie, po krótkiej homogenizacji pipetą, przechowywać roztwór podstawowy sgRNA w temperaturze -20 °C. W zależności od końcowej objętości należy przygotować porcje, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
  3. Przygotować roboczy roztwór sgRNA o końcowym stężeniu 30 μM, rozcieńczając roztwór podstawowy 100 μM w wodzie wolnej od nukleaz. Wirować przez 30 s i inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zebrać RNP Cas9:sgRNA w stosunku molowym 1:9, jednocześnie rozcieńczając 1 μL każdego z trzech 30 μM sgRNA i 0,5 μL 20 μM roztworów Cas9 w 3,5 μL buforu do respensji R, zawartego w zestawie do elektroporacji (końcowa objętość 7 μL, dla jednego warunku doświadczalnego; odpowiednio skaluj). Krótko wirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. W międzyczasie przygotować nieedytowaną kontrolę, dodając 0,5 μl 20 μM Cas9 do 6,5 μl buforu do reskrypcji R. Krótko wirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 5 μl buforu do respensji R do wszystkich próbek, aby uzyskać końcową objętość 12 μl na warunki elektroporacji.
  7. Przygotuj ogniwa THP-1 do elektroporacji.
    1. Ocena stężenia i żywotności za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:2 w 0,4% roztworze barwiącym błękit trypanowy. Po 30 s inkubacji dobrze homogenizować i dodać 10 μl do ściany komory liczącej z ulepszonym przez Neubauera stylem siatki. Policz trzy duże kwadraty i podziel liczbę przez 100, aby uzyskać stężenie komórek (x106 komórek/ml).
      UWAGA: Zdrowie ogniw wpływa na ich wrażliwość na elektroporację. Należy zadbać o to, aby hodowla komórkowa przebiegała w optymalnych warunkach. Czas spędzany poza inkubatorem musi być ograniczony, a wszystkie odczynniki i roztwory powinny być wcześniej przygotowane i podgrzane.
    2. Dla każdego warunku zebrać objętość odpowiadającą 0,2 x 106 komórek i odwirować (336 x g, 5 min, 20 °C).
    3. Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 500 μl PBS. Ponownie odwirować (336 x g, 5 min, 20 °C).
    4. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórek THP-1 z 12 μl roztworu RNP (krok 2.6).

3. Konfiguracja systemu elektroporacji i nukleofekcja (Rysunek 1.3)

  1. Umieść stację pipetową pod szafką bezpieczeństwa biologicznego, umieść rurkę do elektroporacji we wsporniku i dodaj 3 ml buforu E, dołączonego do zestawu do elektroporacji.
  2. Po włączeniu urządzenia do elektroporacji za pomocą ekranu dotykowego należy ustawić następujące parametry elektroporacji: Napięcie = 1 500 V, Czas trwania = 10 ms, Liczba = 3.
  3. Wyposażyć pipetę elektroporacyjną w końcówkę i odessać 10 μl roztworu RNP/THP-1 (krok 2.7.4). Włóż pipetę do rurki do elektroporacji i naciśnij Start na ekranie urządzenia do elektroporacji. Poczekaj, aż pojawi się komunikat Zakończono i wyjmij pipetę z probówki.
  4. Przenieść komórki do dołka na wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytce i delikatnie homogenizować. Umieść płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze i pozwól jej odpoczywać w spokoju przez 72 godziny
    UWAGA: Należy uważać, aby podczas pipetowania zawiesiny RNP/THP-1 nie tworzyć pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one zakłócać procedurę elektroporacji. Jeśli komunikat o błędzie pojawi się przy braku widocznego łuku elektrycznego, wyjmij pipetę do elektroporacji z rurki i ponownie naciśnij Start. Jeśli jednak zaobserwuje się łuk elektryczny w postaci krótkiej, jasnej iskry, może to wskazywać na obecność pęcherzyków. Procedura elektroporacji prawdopodobnie zakończy się niepowodzeniem, nawet w przypadku braku komunikatu o błędzie.

4. Odzysk THP-1 72 h po elektroporacji (Rysunek 1.4)

  1. Policz komórki, aby ocenić stężenie (krok 2.7.1) 72 godziny po elektroporacji.
  2. Jeśli jest wystarczająca liczba komórek (tj. ≥0,6 x 106 komórek/ml), rozcieńczyć je co najmniej czynnikiem 2 z RPMI uzupełnionym 20% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny i doprowadzić stężenie między 0,3-0,5 x 106 komórek na ml. W przeciwnym razie pozwól komórce odzyskać sprawność przez kolejne 72 godziny.
  3. Przejdź i amplifikuj komórki, aż będzie wystarczająco dużo do walidacji KO. W międzyczasie można rozpocząć izolację klonów jednokomórkowych (krok 7).

5. Walidacja edycji genów za pomocą testu niedopasowania T7EI (Rysunek 1.5)

UWAGA: Test może zaniżać efektywność edycji, biorąc pod uwagę, że T7EI rozpoznaje niezgodności większe niż 1 pz. W związku z tym test T7EI nie jest przydatny do badań przesiewowych homozygotycznych populacji komórek (tj. klonów pojedynczych komórek), chyba że zostanie odpowiednio zmodyfikowany (krok 5.7).

  1. Ocenić stężenie komórek (krok 2.7.1) i pobrać objętość odpowiadającą 0,1 x 106 komórek w probówce o pojemności 1,5 ml. Odwirować (336 x g, 5 min, 20 °C), odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl PBS. Ponownie odwirować i za pomocą pipety odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu. Natychmiast zamrozić próbkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Wyodrębnij genomowe DNA, aby posłużyło jako matryca do amplifikacji PCR.
    1. Zawiesić osad z 50 μl roztworu do ekstrakcji DNA, homogenizować i przenieść całą objętość do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Wirować i krótko wirować (impuls przez 3 s).
    2. Umieścić probówkę w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 10 minut.
    3. Rozcieńczyć wyekstrahowane DNA 90 μl ultraczystej wody. Wirować i wirować krótko (5 000 x g, 3 s).
  3. Rozcieńczyć starter PCR (patrz tabela materiałów) w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 10 μM (tj. 10 pmol/μL).
  4. Przygotuj mieszaninę PCR (zgodnie z PONIŻSZĄ UWAGA) w probówce PCR o pojemności 0,2 ml (końcowa objętość = 50 μl dla jednego warunku). Zazwyczaj będą istniały co najmniej dwa warunki: KO i nieedytowana kontrolka tylko z Cas9.
    UWAGA: Oczyszczone genomowe DNA: 10 μL; Starter do przodu i do tyłu (10 μM): po 2,5 μL, stężenie końcowe 500 nM; Bufor reakcyjny (5x): 10 μL. Dobrze zawirować przed dodaniem. Wymieszać dNTP (po 25 mM każdy): 0,6 μL, końcowe stężenie 0,3 mM dla każdego dNTP. Polimeraza DNA: 0,5 μL; Woda ultraczysta: 23,9 μL. Krótko odwirować i odwirować (impuls przez 3 s).
  5. Umieść probówki w termocyklerze i uruchom program PCR z następującymi ustawieniami:
    UWAGA: Jeden cykl w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie 30 cykli [98 °C przez 20 s (etap denaturacji), X °C przez 15 s (etap wyżarzania), 72 °C przez 45 s (etap wydłużania)], a następnie jeden końcowy cykl w temperaturze 72 °C przez 2 minuty. Pod koniec amplifikacji wyjmij probówki, odwiruj i krótko odwiruj (impuls przez 3 s). Temperatura wyżarzania (X) jest temperaturą topnienia (Tm) starterów minus 5 °C.
  6. Dla populacji edytowanej poliklonalnie: w nowej probówce o pojemności 0,2 ml dodać 17,5 μl amplikonu PCR i 2 μl NEBuffer 2 (10x), aby uzyskać końcową objętość 19,5 μl. Wirować i krótko wirować (impuls przez 3 s). Alternatywnie, aby przesiewać klony pojedynczych komórek, wymieszaj 1:1 produktów PCR zarówno z edytowanych, jak i nieedytowanych komórek kontrolnych (krok 5.6) (Rysunek uzupełniający 1).
  7. W celu utworzenia heterodupleksu należy umieścić probówki w termocyklerze i uruchomić następujący program: jeden cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut, jeden z rampą -2 °C/s od 95 do 85 °C, jeden z rampą -0,3 °C/s od 85 do 25 °C i jeden końcowy cykl chłodzenia w temperaturze 10 °C w trybie HOLD.
  8. Po utworzeniu heterodupleksu dodać 0,5 μl roztworu T7EI do probówki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  9. Przygotuj żel agarozowy 1,2%:
    1. Zważ agarozę w szklanej butelce i dodaj odpowiednią objętość 1x buforu TAE (40 mM tris-acetat, 1 mM EDTA, pH 8,3). Umieść go w kuchence mikrofalowej, uważając, aby nie zakręcić mocno nakrętki. Podgrzej kilka razy, aż kryształy agarozy całkowicie się rozpuszczą.
      UWAGA: W razie potrzeby wymieszaj roztwór. Nie pozwól, aby się zagotował, w przeciwnym razie objętość zmniejszy się, zmieniając stężenie agarozy.
    2. Dodaj barwnik z żelu DNA rozcieńczony w stosunku 1/20 000 i dobrze wymieszaj.
    3. Wlej roztwór agarozy do formy, dodaj grzebień i pozwól zastygnąć w temperaturze pokojowej.
  10. Przygotować próbki do elektroforezy żelowej, mieszając 5 μl produktów trawienia T7EI (etap 5.9) lub niestrawiony produkt PCR z 5 μl wody i 2 μl barwnika 6x obciążającego DNA. Załaduj drabinkę próbek i rozmiaru i migruj pod napięciem 80 V przez 45 minut (czas można dostosować w zależności od oczekiwanej wielkości fragmentów DNA). Po zakończeniu migracji należy uzyskać obraz żelu za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania.

6. Walidacja edycji genów za pomocą analizy sekwencjonowania Sangera (Rysunek 1.6)

  1. Aby scharakteryzować modyfikację genetyczną, należy oczyścić produkty PCR (krok 5.4) i po sekwencjonowaniu Sangera przeanalizować wyniki za pomocą narzędzia ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
  2. Kontroluj, czy białko może być wytwarzane pomimo modyfikacji.
    1. Pobierz wyniki ICE i otwórz plik contribs.txt.
    2. Porównaj edytowane sekwencje z ich odpowiednikiem WT. Zmapuj indele i sprawdź, czy powstały w docelowym regionie genomu. Oceń ich rozmiar. Jeśli długość indela nie jest wielokrotnością trzech, nastąpi przesunięcie ramki i prawdopodobnie zostanie wprowadzony PTC. Oczekuje się, że zmutowane mRNA ulegnie degradacji za pośrednictwem NMD.

7. Izolacja klonów pojedynczych komórek poprzez ograniczenie rozcieńczenia (Rysunek 1.7)

UWAGA: Izolacja klonów jednokomórkowych nie jest obowiązkowa. Jeśli jednak zdecydujesz się to zrobić, ważne jest, aby scharakteryzować wiele klonów i porównać ich fenotyp z pierwotną populacją poliklonalną.

  1. Pobrać próbkę zawiesiny komórkowej, rozcieńczyć ją w stosunku 1:2 pożywką hodowlaną i ocenić stężenie (etap 2.7.1). Rozcieńczenie zwiększa dokładność liczenia.
  2. Wykonaj od 2 do 3 etapów seryjnego rozcieńczania, aby osiągnąć stężenie 7 komórek/ml. Dozować 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę na okrągłodenną 96-dołkową płytkę (tj. 0,7 komórki na studzienkę). Pozwól komórce zdekantować przez kilka godzin przed obserwacją płytek pod mikroskopem, aby zidentyfikować studzienki zawierające jedną komórkę.
  3. Regularnie monitoruj tworzenie i wzrost kolonii, a w razie potrzeby przenieś komórki na większą płytkę hodowlaną lub kolbę.

8. Charakterystyka funkcjonalna komórek THP-1 KO SAMHD1 za pomocą testu restrykcyjnego HIV-1

  1. Wysiewaj THP-1 na 24-dołkowej płytce hodowlanej z 0,25 x 106 komórek na studzienkę w 300 μl RPMI uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny (pełne RPMI) i zawierającej 300 ng / ml PMA do różnicowania. Przechowywać płytkę w wilgotnym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez 24 godziny.
  2. Zastąp pożywkę kompletną pożywką RPMI wolną od PMA i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne 24 godziny.
  3. Za pomocą pompy próżniowej odessać całą pożywkę hodowlaną. Dodać 250 μl roztworu zawierającego wirusa HIV-1-GFP z pseudotypem VSVg (MOI = 0,5 IFU/komórkę). Dołącz niezainfekowaną kontrolkę. Umieścić płytkę w temperaturze 4 °C na 2 godziny, aby zsynchronizować infekcję.
  4. Umyj ogniwa raz za pomocą RPMI. Dodaj 500 μl pełnego RPMI do każdego dołka i inkubuj przez 48 godzin w standardowych warunkach (czas można dostosować).
  5. Po usunięciu pożywki hodowlanej, przemyj komórki raz zimnym 1x PBS. Następnie dodaj 100 μl 0,05% trypsyny-EDTA do każdej studzienki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu całkowitego odłączenia komórek (5 minut powinno wystarczyć) przed dodaniem 200 μl pełnego RPMI w celu inaktywacji enzymu. Przenieść 250 μl z każdej studzienki do 96-dołkowej płytki okrągłodennej (upewnić się, że cytometr przepływowy akceptuje płytki hodowlane).
  6. Odwirować płytkę (757 x g, 3 min, opóźnienie = 6,20 °C) i odessać supernatant za pomocą pipety wielokanałowej. Zawiesić osad w 100 μl 4% PFA i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Dodaj 100 μL zimnego 1X PBS.
  7. Przeanalizuj wskaźnik infekcji, reprezentowany przez komórki GFP-dodatnie, za pomocą cytometrii przepływowej (patrz rysunek uzupełniający 2, aby zapoznać się z sugerowaną strategią bramkowania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Linia komórkowa THP-1 została wygenerowana ze stabilną ekspresją białka reporterowego GFP (THP-1_GFP) (Rysunek 2A) i użyta jako narzędzie do ustanowienia protokołu dla wydajnej edycji genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9. W tym celu zaprojektowano 3 sgRNA ukierunkowane na gen EGFP za pomocą narzędzia internetowego CRISPOR29 (Figura 2B), które zostały jednocześnie skompleksowane z Cas9 w stosunku molowym 9:1, aby utworzyć RNP przed dostarczeniem do komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół mający na celu uzyskanie udanej edycji linii komórkowej THP-1 za pośrednictwem CRISPR. Podejście to opiera się na przenoszeniu wstępnie zmontowanych RNP sgRNA/Cas9 za pomocą elektroporacji/nukleofekcji. Strategia ta została wybrana w celu ograniczenia efektów off-target, które potencjalnie powstają po integracji kasety sgRNA/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa, co prowadzi do trwałej ekspresji nukleazy. Wybrano wiele sgRNA ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania, aby osiągną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszystkich autorów nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, Paryż), G. Bossisowi (IGMM, Montpellier) i D. Schlüterowi (Hannover Medical School, Niemcy) za udostępnienie protokołów i dyskusję. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant nr 101017572 dla AZ) oraz ANRS (grant ECTZ162721 dla AZ). Infrastruktura badawcza Modelu Chorób Zakaźnych i Terapii Innowacyjnych (IDMIT) jest wspierana przez "programme investissement d'avenir (PIA)" pod numerem ANR_11_INSB_0008.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowyClearLine146560_
0,4 % trypan niebieskiBeckman Coulter383200_
1,5 mL probówkaEppendorf3810X_
24-dołkowaCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Kolba hodowlana z wentylowaną nasadkąCorning353136_
8-paskowe probówki do PCR z nakrętkamiTechnologie życiaAM12230_
Płytki 96-dołkowe Płytki płaskie Corning353072_
96-dołkowe Okrągłe dnoCorning353077_
AgarozaEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc System obrazowaniaBIO-RAD12003153_
Szkiełko zliczająceNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Bydło płodowe SerumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Przeglądarka danych genomuNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Version 9.3.1
Polimerazy DNA z fuzji Herculase IIAgilent600679_
ICE Narzędzie do analizy CRISPRSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Wersja 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SW zestawie z zestawem T7EI M0302S
Neon, 10 i mikro; LInvitrogenMPK1025KZestaw do elektroporacji zawierający końcówki, probówki, bufor R i E
System transfekcji neonowejInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Starter do PCR bez nukleaz (
EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
Starter PCR (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Wersja : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicylina-streptomycyna (10 000 U / mL)Gibco15140122_
PFAMikroskopia elektronowa Nauki15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104_
Rozwiązanie do ekstrakcji DNA QuickExtractBiosearch TechnologiesQE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Version 7
SpCas9 2NLS NukleazaSynthego__
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAInvitrogenS33102_
Syntetyczne sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Syntetyczne sgRNA (SAMHD1)Synthego_#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Strzykawka Plastipak Luer LockBD301229
_T100 TermocyklerBIO-RAD1861096_
T7 endonukleaza INowość Anglia BiolabsM0302S_
TAE bufor UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
Komórki THP-1ATCCTIB-202_
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300054
_ZE5 Analizator komórekBIO-RAD12014135_

Bibliografia

  1. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  2. Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism. Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).
  3. Bol, S. M., et al. Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages. Virology. 390 (2), 205-211 (2009).
  4. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).
  5. O'Neill, M. B., et al. Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans. Front Immunol. 12, 768189(2021).
  6. Wen, Y., et al. Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses. J Immunol Methods. 498, 113147(2021).
  7. Inagaki, Y., et al. Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages. Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).
  8. Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).
  9. Chanput, W., et al. β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages. Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).
  10. Cui, J., et al. USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors. Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).
  11. Chen, S., et al. SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).
  12. Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes. Cell Immunol. 355, 104148(2020).
  13. Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells. Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).
  14. Martinat, C., et al. SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells. Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).
  15. Rensen, E., et al. Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages. EMBO J. 40 (1), e105247(2021).
  16. Ikeda, T., et al. APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1. mBio. 14 (4), e0078223(2023).
  17. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  18. Kurosaki, T., Maquat, L. E. Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance. J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).
  19. Tuladhar, R., et al. CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation. Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).
  20. Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).
  21. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  22. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
  23. Tang, X., et al. A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment. Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).
  24. Ji, W., Zhang, L., Liu, X. Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy. STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).
  25. Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).
  26. Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. https://www.synthego.com/help/citing-ice (2019).
  27. Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects. Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).
  28. Pedersen, A. G., Nielsen, H. Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).
  29. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  30. Laguette, N., et al. SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx. Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).
  31. Hrecka, K., et al. Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein. Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).
  32. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  33. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  34. Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies. Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).
  35. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  36. Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9. Sci Rep. 6, 39608(2016).
  37. Bowling, A., et al. Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination. J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).
  38. Inácios, Â, et al. Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).
  39. Li, J., et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).
  40. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162 (4), 900-910 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok elektroporacjiklonowanie pojedynczych kom rekdostarczanie rybonukleoproteintest endonukleazy T7sekwencjonowanie metod Sangeraanaliza immunoblottingowar nicowanie monocyt w

Powiązane artykuły