Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stworzenie modeli szczurów naśladujących terapie hormonalne afirmujące płeć

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67470

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gender-Specific Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 2Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”, 3Centre Animal Research and Walfare, Istituto Superiore di Sanità

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje rozwój dwóch modeli gryzoni naśladujących terapie hormonalne afirmujące płeć poprzez podskórne podawanie testosteronu lub estradiolu z octanem cyproteronu (stosowanych w terapiach dla ludzi transpłciowych): ustalanie dawek, identyfikacja odpowiednich biomarkerów i ocena efektów.

Streszczenie

Osoby transpłciowe (TG) to osoby, których tożsamość płciowa i płeć przypisana przy urodzeniu nie są zgodne. Często przechodzą one hormonalną terapię afirmującą płeć (GAHT), interwencję medyczną, która pozwala na nabycie drugorzędowych cech płciowych bardziej zgodnych z ich indywidualną tożsamością płciową, zapewniając spójne wyniki w poprawie wielu zmiennych społeczno-psychologicznych. Jednak, GAHT jest ukierunkowany na różne układy organizmu, i niektóre działania niepożądane są rejestrowane, Chociaż nie są jeszcze w pełni zidentyfikowane i scharakteryzowane. W związku z tym osoby z TG poddawane GAHT mogą być uważane za podatną podgrupę populacji i należy zwrócić szczególną uwagę w ramach oceny ryzyka, np. poprzez wykorzystanie ukierunkowanych modeli zwierzęcych. W niniejszej pracy opisano procedury mające na celu wdrożenie dwóch modeli szczurzych naśladujących GAHT: model demaskulinizująco-feminizujący (dMF) naśladujący GAHT dla kobiet TG oraz model defeminizyzująco-maskulinizujący (dFM) naśladujący GAHT dla mężczyzn TG. Modele te zostały wdrożone poprzez podawanie tych samych hormonów, które są stosowane w ludzkim GAHT, a mianowicie β-estradiolu w połączeniu z octanem cyproteronu w przypadku dMF i testosteronu w przypadku dFM, tymi samymi drogami ekspozycji przez okres 2 tygodni. Szczury są codziennie sprawdzane podczas leczenia w celu oceny stanu zdrowia i potencjalnie agresywnych zachowań. W momencie uśmiercenia pobrano próbki krwi i tkanek docelowych i przechowywano je do analizy biochemicznej, molekularnej i histopatologicznej. Oceniono również parametry specyficzne dla płci, a mianowicie liczbę plemników i wymiary łechtaczki. Ponadto izoformy CYP450, ulegające wyłącznej i/lub preferencyjnej ekspresji w wątrobie samców i samic szczurów, zostały zidentyfikowane i scharakteryzowane jako nowe biomarkery w celu zweryfikowania skuteczności GAHT i ustalenia modelu. Zbadano również zajęcie tarczycy jako kluczowy cel w układzie hormonalnym.

Wprowadzenie

Psychologiczne postrzeganie przez jednostkę bycia mężczyzną, kobietą, żadnym, ani jednym, drugim, lub gdzieś pomiędzy1 nazywa się tożsamością płciową. Może być dopasowany do płci biologicznej (cisgender) lub może być różny (transgender - TG). Mężczyzna TG to osoba urodzona jako kobieta, ale identyfikująca się jako mężczyzna. Kobieta TG rodzi się jako mężczyzna, ale identyfikuje się jako kobieta2. Szacuje się, że obecnie na całym świecie jest 25 milionów osób z TG3, większość z nich cierpi na dysforię płciową, stan psychiczny charakteryzujący się niezgodnością między ich płcią a tą, którą przypisano im przy urodzeniu4, co może skutkować dyskryminacją społeczną i trudnościami w pracy i rodzinie, często prowadząc do depresji, niepokój i stres5. Z tych powodów osoby z TG często przechodzą hormonalną terapię afirmującą płeć (GAHT) i/lub operację afirmującą płeć. GAHT dla mężczyzn TG charakteryzuje się podawaniem testosteronu (T) (Tabela 1), a dla kobiet TG estrogenów (E2) plus antyandrogeny (Tabela 2)6.

GAHT zwykle trwa przez całe życie jednostki, działając nieprzerwanie na układ hormonalny7,8. Dlatego ważne jest, aby przeanalizować wpływ GAHT na zdrowie osób z TG i jego potencjalne długotrwałe skutki. Co więcej, osoby z TG są narażone, podobnie jak ogół populacji, na zanieczyszczenia chemiczne - w szczególności na substancje zaburzające gospodarkę hormonalną (ED) - które atakują układ hormonalny jako GAHT, co skutkuje nadmierną stymulacją9.

ED to grupa substancji chemicznych wpływających na organizmy i/lub ich potomstwo poprzez zmianę różnych procesów hormonalnych i metabolicznych, takich jak wydzielanie, aktywacja, synteza, uwalnianie i wiązanie naturalnych hormonów. Ponieważ zaburzenia erekcji są szeroko rozpowszechnione w środowisku, żywność i produkty codziennego użytku (np. plastikowe butelki i pojemniki, wkładki do metalowych puszek na żywność, detergenty, środki zmniejszające palność, żywność, zabawki, kosmetyki i pestycydy itp.), ogólna populacja jest stale narażona przez całe życie10. Ponadto, nawet niskie dawki ekspozycji na zaburzenia erekcji mogą prowadzić do uszkodzenia tkanek i narządów, a powszechnym zjawiskiem związanym z narażeniem na zaburzenia erekcji jest występowanie efektów specyficznych dla płci zarówno u zwierząt laboratoryjnych, jak i u ludzi11. Na przykład narażenie na materiał mający kontakt z żywnością, bisfenol A (BPA), wiąże się z zagrożeniami dla zdrowia, takimi jak endometrioza i zespół policystycznych jajników u kobiet, a także ze zmniejszoną płodnością ze względu na jego działanie estrogenowe12. U mężczyzn BPA może obniżać poziom i obniżać jakość nasienia13. Ponadto pestycydy wiążą się z wyższym ryzykiem raka piersi u kobiet i znacznymi problemami z płodnością u mężczyzn13. Do tej pory nie są dostępne żadne konkretne narzędzia do badania toksykologicznych skutków zanieczyszczeń środowiska, w tym zaburzeń erekcji, w TG people9.

Niniejsze badanie ma na celu opisanie metod i parametrów wybranych do rozwoju dwóch modeli zwierzęcych TG: modelu demaskulinizująco-feminizującego (dMF) i modelu demaskulinizująco-maskulinizującego (dFM). W szczególności oceniany jest dobór odpowiednich poziomów dawek, czasu i sposobu podawania hormonów na podstawie aktualnych terapii stosowanych u ludzi14. Ponadto identyfikowane i charakteryzowane są biomarkery tkankowe i funkcjonalne, które jednoznacznie definiują modele. Ponadto szczegółowo opisano skuteczność i tolerancję terapii u zwierząt, a także dobór najodpowiedniejszych markerów do stosowania w badaniach długoterminowych wraz z technikami stosowanymi do tych celów.

W celu scharakteryzowania modeli, analizowane są następujące punkty końcowe: poziom testosteronu (T) w surowicy (najlepszy biomarker do oceny sukcesu GAHT w obu modelach9,15); poziom estradiolu (E2) w surowicy (oba modele); hormon tyreotropowy (TSH) i tyroksyna (T4) (model dMF); liczba plemników (model dMF); wymiar łechtaczki (model dFM); analiza histopatologiczna narządów rodnych, wątroba i tarczyca (dla obu modeli). Ponadto analizowana jest również ekspresja następujących izoform cytochromu P450 wątroby specyficznych dla płci (CYP450s, dla obu modeli)16,17: CYP2C11 (specyficznie wyrażony w wątrobie mężczyzny), CYP3A18 (wyrażony 25 razy bardziej w wątrobie męskiej niż żeńskiej), CYP2C12 (specyficznie wyrażony w wątrobie żeńskiej) i CYP2C6 (wyrażony głównie w wątrobie kobiety, ale występujący w niższych stężeniach, również u samca).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania są przeprowadzane zgodnie z Dyrektywą 2010/63/UE, włoskim dekretem ustawodawczym nr 26 z dnia 4 marca 2014 r. oraz Zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP) OECD. Protokół badania został zatwierdzony przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (autoryzacja nr 806/2021-PR). Tutaj 16 młodych, dojrzałych płciowo szczurów Sprague-Dawley obu płci (304 ± samców szczurów o wadze 13 g i 190 ± samic szczurów o wadze 7 g w wieku 8-9 tygodni) jest kupowanych i trzymanych w dwóch klatkach w standardowych warunkach laboratoryjnych (22 ± 0,5 °C, 50%-60% wilgotności względnej, 12 godzin naprzemiennego ciemnego światła z 12-14 wymianami powietrza na godzinę) z wodą i pokarmem dostępnym ad libitum. We wszystkich klatkach, w celu wzbogacenia środowiska każdego zwierzęcia, włóż drewniane klocki do gryzienia i wymieniaj je co tydzień.

UWAGA: Zwierzęta w wieku 8-9 tygodni zostały wybrane, ponieważ GAHT może rozpocząć się w okresie dojrzewania (etapy Tannera od 2 do 3), co odpowiada 8-9 tygodniom u gryzoni, i trwa długo, potencjalnie przez całe życie osób TG9.

1. Wielkość grupy i opieka nad zwierzętami

  1. Jako model należy wykorzystać młode dorosłe samce i samice szczurów Sprague-Dawley (w wieku 8-9 tygodni), ponieważ szczur jest preferowanym gatunkiem wskazanym przez OECD (np. Wytyczna 421 Badanie przesiewowe toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej) i jedynym gatunkiem gryzoni zaproponowanym i uwzględnionym w wytycznej OECD 407 (28-dniowe badanie toksyczności pokarmowej po podaniu dawki powtórzonej u gryzoni, zaktualizowane o parametry wykrywania EI).
  2. Użyj oprogramowania G*Power do wymiarowania grupy. Zarówno dla modelu dFM, jak i dMF należy wybrać cztery grupy testowe: jedną grupę kontrolną (C) i trzy grupy zwierząt leczonych różnymi dawkami GAHT. Dokonać wymiarowania w odniesieniu do porównania między dwiema grupami (dawka terapeutyczna w porównaniu z C) za pomocą testu Manna-Whitneya, dwustronny poziom istotności alfa = 0,0167 (odpowiadający alfa = 0,05 z poprawką Bonferroniego zastosowaną do 3 porównań między każdą dawką leczenia a C), a moc 1-beta = 0,80.
    1. Obliczona liczba szczurów/grup jest następująca:
      dla modelu dFM, zwierzęta/grupa n=4, według Kinnear i wsp.18 wskazujące po 2 tygodniach leczenia następujące poziomy: w grupie kontrolnej: 0,2 ± 0,3 ng/ml, w grupie terapii hormonalnej: 16 ± 5 ng/ml (średnia ± odchylenie standardowe), odpowiadające wymiarowi efektu mierzonemu za pomocą d = 4,46 Cohena (bardzo duży efekt).
      dla modelu dMF: zwierzęta/grupa n=3, według Gómeza i wsp.19 wskazując po 2 tygodniach leczenia, następujące poziomy: grupa kontrolna: 1,901 ± 0,413 ng/ml oraz grupa terapii hormonalnej: 0,043 ± 0,023 ng/ml (średnia ± błąd standardowy) odpowiadający wymiarowi efektu mierzonemu za pomocą d Cohena = 6,35 (bardzo duży efekt).
    2. Aby wyrównać oba modele, wybierz n = 4 zwierzęta na płeć/grupę, co daje w sumie N = 32 zwierzęta.
  3. Po 1 tygodniu aklimatyzacji podziel szczury według płci na dwie grupy eksperymentalne (dMF i dFM, 4 szczury/grupę), z których każda składa się z jednego C (samiec kontrolny, CM i kontrolna samica, CF) oraz trzy grupy leczone wybranego GAHT.
  4. Monitoruj wszystkie szczury 2 razy dziennie (o 8:30 i 16:00), aby sprawdzić ogólny stan zdrowia i potencjalną agresywność spowodowaną podawaniem GAHT. Rejestruj masę ciała (mc) i zużycie paszy 2x w tygodniu, używając wagi analitycznej z funkcją dynamicznego ważenia optymalnego dla masy ciała zwierząt laboratoryjnych.
    UWAGA: Aby ocenić potencjalną agresywność, weterynarz wyznaczony do spraw dobrostanu zwierząt sprawdzał szczury dwa razy dziennie (rano i późnym popołudniem).
  5. W modelu eksperymentalnym dFM należy zmierzyć średnicę łechtaczki wszystkich szczurów bezpośrednio przed rozpoczęciem leczenia (punkt 0) i na końcu leczenia (punkt 13), używając cyfrowego miernika do precyzyjnych odczytów.
  6. Zważyć wszystkie zwierzęta przed złożeniem w ofierze i natychmiast po uśmierceniu usunąć najądrze w celu przeprowadzenia liczenia plemników.

2. Dobór i przygotowanie dawki

  1. Należy stosować następujące trzy dawki hormonów do podawania szczurom z dFM: 5, 10,5 i 22,5 mg/kg tygodniowo, w przypadku modelu dMF należy stosować następujące trzy wybrane poziomy dawek (DL): DL1 E2 0,045 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg, DL2 E2 0,09 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg i DL3 E2 0,18 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg.
    UWAGA: Wszystkie dawki są dobierane z uwzględnieniem głównych wytycznych klinicznych stosowanych u ludzi z TG people15 oraz ograniczonych danych dostępnych w literaturze.
  2. Przygotuj wszystkie roztwory podstawowe co tydzień, używając kaptura bezpieczeństwa chemicznego. Prawidłowo wymieszaj wszystkie substancje z olejem sezamowym jako nośnikiem, zapewniając ich całkowite rozpuszczenie.
    UWAGA: W przypadku obu modeli należy skorzystać z kalkulatora konwersji dawki (https://dosecal.cftri.res.in/), aby wprowadzić dawkę do przeliczenia, gatunki, dla których ustalono dawkę, gatunki zwierząt oraz wagę, dla której należy przeliczyć dawkę. Dla modelu dFM (Tabela 3), ludzka terapia hormonalna, maksymalna dawka 100 mg T na tydzień20. Dawka obliczona u szczurów wynosi 10,5 mg/kg T na tydzień. Druga dawka wynosi 22,5 mg/kg mc. tygodniowo u szczurów18. Trzecia dawka wynosi 5 mg/kg mc. na tydzień, identyfikowana przez utrzymanie współczynnika 2,1 między dwiema obliczonymi dawkami. W przypadku modelu dMF patrz Tabela 4, dawki są oparte na zalecanych schematach dla ludzi21 i danych dostępnych w badaniach in vivo14,19,22.

3. Traktowanie zwierząt

  1. Wykonaj podskórne podanie T (dla modelu dFM) i E2 plus CPA (dla modelu dMF), ściskając i unosząc skórę w miejscu wstrzyknięcia, tworząc rodzaj kurtyny. Następnie należy wprowadzić igłę strzykawki o pojemności 1 ml równolegle do grzbietu zwierzęcia. Po wejściu do środka powoli wstrzyknij wymaganą objętość (100 μL dla T; 200 μL dla E2+CPA)23.
    1. Traktuj zwierzęta w następujący sposób: dla modelu dFM podawaj T enanthate rozpuszczony w oleju sezamowym (nośnik) 2 razy w tygodniu przez 2 tygodnie (100 μL na każde podskórne wstrzyknięcie T). W przypadku modelu dMF należy podawać E2 plus octan CPA rozpuszczony w oleju sezamowym (nośniku) 5 razy w tygodniu przez 2 tygodnie (200 μl na każde wstrzyknięcie podskórne). Szczury z grupy C należy traktować w ten sam sposób tylko z nośnikiem (olej sezamowy).

4. Pobieranie krwi, ofiarowanie i pobieranie próbek tkanek

  1. Po 2 tygodniach leczenia, tuż przed złożeniem ofiary, należy zastosować system znieczulenia gazowego i znieczulić wszystkie zwierzęta. Indukować znieczulenie dawką od 2% do 3,5% izofluranu w 100% tlenu z szybkością 1,5 l/min aż do utraty odruchów w przezroczystej, polistyrenowej komorze indukcyjnej. Umieścić szczura w pozycji leżącej na poduszce grzewczej i regulować dawkę izofluranu w dawce podtrzymującej od 1,5% do 3,5% podawanej przez standardową maskę na nos szczura przez cały czas trwania procedury wewnątrzsercowego pobierania krwi.
  2. Przygotuj strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 21G, eliminując podciśnienie. Sondując serce palcami, ostrożnie włóż igłę w boczną ścianę klatki piersiowej prostopadłą do ciała w przybliżeniu w miejscu zgiętych łokci, między żebrami 5 i 6. Po wejściu do komory serca krew dostaje się do strzykawki przez naczynia włosowate. Powoli i w sposób ciągły cofać tłok strzykawki, aż do pobrania krwi.
  3. Po pobraniu próbki krwi należy umieścić szczury w komorze CO2 w celu przeprowadzenia eutanazji za pomocą uduszenia CO2 z szybkością wypełnienia 30%-70% objętości komory na minutę. Po 2-3 minutach zweryfikuj śmierć zwierząt, monitorując oddech i bicie serca24.
  4. Po złożeniu ofiary połóż każde zwierzę na stole sekcyjnym w pozycji leżącej, z przednimi nogami skierowanymi do góry, a tylnymi nogami skierowanymi w dół, i przymocuj je szpilkami. Spryskaj brzuszną powierzchnię zwierzęcia roztworem dezynfekującym.
  5. Wytnij następujące narządy: jądra, najądrza, macicę, jajniki, wątrobę i tarczycę. Zważyć i przechowywać je w probówkach o pojemności 50 ml z 35 ml 10% buforowanej formaliny (wszystkie narządy) lub roztworu Bouina (tylko jądra) lub zebrać je w probówkach kriogenicznych (organ/probówka) i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie (do przechowywania w temperaturze -80 °C).
    1. Najpierw przetnij skórę nożyczkami na linii środkowej, od łona do górnej części brzucha. Wykonaj dwa boczne nacięcia wzdłuż przyśrodkowych powierzchni każdej kończyny tylnej od środkowego nacięcia brzusznego brzucha i odsłoń wnętrzności brzucha .
    2. Najpierw usuń narządy rozrodcze; u samców szczurów usuń jądra, owalne parzyste narządy znajdujące się w jamie brzusznej, w pozycji wewnątrz brzucha (worek mosznowy). Przetnij i dociśnij worek mosznowy, aby upewnić się, że jądra wystają, a następnie delikatnie je chwyć. Przytrzymaj tłuszcz trzewny szczypcami, a następnie odetnij jądra od wnętrzności. Po wycięciu zważyć i przechowywać jądra w roztworze Bouina do analizy histopatologicznej.
    3. U samic szczurów najpierw delikatnie chwyć macicę, a następnie odetnij jajniki (które znajdują się na końcu obu rogów macicy) z trzewnej tkanki tłuszczowej. Po wycięciu zważ jajniki.
    4. Zarówno u samic, jak i samców szczurów przejdź na prawą stronę jamy brzusznej, gdzie znajduje się wątroba. Wątroba jest narządem wielopłatkowym i można zidentyfikować wiele części: lewą przyśrodkową (mniejszą), lewą boczną (główną), prawą przyśrodkową (mniejszą), prawą boczną (główną), ogoniastą i płatem kwadratowym25. Chwyć wątrobę kleszczami, uważając, aby jej nie złamać. Chwyć wyrostek mieczykowaty szczypcami i całkowicie przetnij membranę nożyczkami.
    5. Użyj kleszczy, aby podnieść wyrostek mieczykowaty i pobrać wątrobę z jamy brzusznej. Oddziel wątrobę od przepony nożyczkami. Następnie zważ wątrobę i przechowuj.
    6. W celu ekstrakcji tarczycy za pomocą nożyczek przetnij prostopadle wzdłuż szyi zwierzęcia, usuń skórę i mięśnie, a następnie delikatnie przytnij końce tchawicy, w której znajduje się tarczyca. Przechowuj tarczycę do dalszej analizy26.
  6. Wykonaj liczenie plemników zgodnie z poniższym opisem.
    1. Po usunięciu jądra chwyć najądrza, które jest przymocowane do tylnego brzegu odpowiedniego jądra i zawarte w mosznie.
    2. W tym eksperymencie próbki nasienia pobiera się z ogona prawego najądrza. W momencie pobierania oczyść ogon z tłuszczu i tkanki łącznej za pomocą nożyczek, oddziel go od pozostałej części i umieść na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) zawierającej 1 ml DMEM. Przeciąć nożyczkami i przelać pipetą Pasteura, aby ułatwić uwolnienie zawartości.
    3. Przenieść cały otrzymany płyn do probówki o pojemności 15 ml i doprowadzić objętość do 10 ml za pomocą DMEM (współczynnik rozcieńczenia 1:10 = 0,1). Odpipetować zawartość do homogenizacji i utworzyć zawiesinę. Po lekkim wstrząśnięciu pobrać 10 μl zawiesiny, aby załadować komorę Neubauera. Załaduj kamerę i po 3 minutach ładowania kamery rozpocznij liczenie.

5. Test immunoenzymatyczny (ELISA)

  1. Pobrać próbki krwi (około 2-5 ml na zwierzę) do probówek o pojemności 2 ml i pozostawić do koagulacji w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Odwirować wszystkie próbki krwi w wirówce 2x przez 15 minut w temperaturze 4 °C i 3000 x g.
  2. Odwirowana krew ma wielowarstwowy wygląd z trzema warstwami o różnych kolorach. Górna warstwa składa się z osocza (zwykle żółtego lub przezroczystego), płynnej części krwi; warstwa poniżej plazmy może mieć białawe lub szare zabarwienie i jest sierścią Buffy. Najniższa warstwa zawiera czerwone krwinki, a kolor może wydawać się ciemnoczerwony lub jaskrawoczerwony. Aby określić poziom hormonów płciowych, należy pobrać surowicę wszystkich próbek za pomocą pipety (bez dotykania kożucha lub warstw erytrocytów), podzielić je na podwielokrotności (500 μl) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. W obu modelach należy wykonać test ELISA w celu wykrycia i/lub zmierzenia obecności białek, przeciwciał lub antygenów w próbce w celu oznaczenia hormonów płciowych. Użyj metody bezpośredniej i postępuj zgodnie z instrukcjami każdego zestawu ELISA. W tym badaniu u szczurów oznaczono poziomy następujących hormonów w surowicy: E2, Rat Estradiol ELISA; T, mysz / szczur testosteron Elisa; TSH, zestaw ELISA dla szczurów i T4, zestaw ELISA dla szczurów.

6. Analiza histopatologiczna

  1. Przygotować preparaty histologiczne tkanek zgodnie z poniższymi procedurami.
  2. Próbki macicy, jajnika, tarczycy i wątroby należy umieścić w 10% buforowanej formalinie przez co najmniej 48 godzin
    UWAGA: Pracuj pod maską chemiczną. Nie wdychać substancji/mieszaniny. Unikaj wytwarzania pary/aerozoli.
  3. Próbki myć pod bieżącą wodą przez 1 godzinę, a następnie przechowywać w 80% alkoholu etylowym (C2H5OH) do czasu przetworzenia, aby zachować strukturę protoplazmatyczną przed zmianami wynikającymi ze śmierci komórki.
  4. Utrwalić jądro w roztworze Bouina składającym się z 15 ml nasyconego roztworu kwasu pikrynowego, 5 ml stężonej formaliny (33%-40%) i 1 ml lodowatego kwasu octowego przez 48 godzin. Próbki przemywać 80% alkoholem etylowym.
    UWAGA: Pracuj pod maską chemiczną.
  5. Przeprowadzić włączenie do stałej parafiny za pomocą automatycznego procesora tkanek. Pod koniec procesu włączania umieścić próbki w małych metalowych pojemnikach, do których wlano stopioną parafinę i ostudzić na zamrożonej płycie, tworząc bloki do cięcia. Ustaw je w zależności od żądanej sekcji cięcia.
  6. Następnie pokrój próbki za pomocą obracającego się mikrotomu. Za pomocą małych szczoteczek należy zebrać skrawki o wielkości 5-6 μm, rozprowadzić je na kilka sekund w wodzie o temperaturze 37 °C i umieścić na szkiełkach mikroskopowych. Pozostaw szkiełka do prostopadłego odsączenia na kilka minut i wysusz je w piekarniku w temperaturze 36 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  7. Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną, jak opisano poniżej.
    1. Odparafinować szkiełka, zanurzając je w środku czyszczącym pochodzenia terpenowego (substytut ksylenu) na 5 minut.
    2. Ponownie nawodnij szkiełka, zanurzając je w następującej serii stopniowanego etanolu. Dla każdego roztworu 2 minuty na zanurzenie: 100% etanolu, 95% etanolu, 80% etanolu, 50% etanolu i wody destylowanej.
      UWAGA: Może to być punkt zatrzymania protokołu, a zjeżdżalnie można pozostawić w RT w wodzie na kilka godzin. Opcjonalnie szkiełka można również przechowywać w wodzie w temperaturze 4 °C.
    3. Umieść szkiełka w hematoksylinie Mayera na 5 minut. Natychmiast przenieś je z powrotem do pojemnika z wodą z kranu na 5 minut. Wlej wodę z kranu do tylnego rogu pojemnika najbardziej oddalonego od sekcji. Okresowo opróżniaj pojemnik, aż fioletowe zabarwienie w wodzie zniknie.
      UWAGA: Aby zapobiec odklejaniu się odcinków od szkiełek, nie należy wylewać wody bezpośrednio na szkiełka.
    4. Umieść szkiełka w 1% roztworze wodnym eozyny Y na 2 minuty. Przenieś szkiełka do wody destylowanej na 15 s. Odwodnij szkiełka, zanurzając je w następującej serii klasyfikowanego etanolu. Dla każdego roztworu 15 s na zanurzenie: 50% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu.
    5. Umieść szkiełka w 100% etanolu na 1 minutę i zmień go na świeży 100% etanol na kolejne 1 minutę. Umieść szkiełka w środku czyszczącym pochodzenia terpenowego (substytut ksylenu) na 2 minuty i zmień go na świeży środek czyszczący pochodzenia terpenowego (substytut ksylenu) na kolejne 2 minuty. Usuwaj po jednym szkiełku na raz i umieść szkiełko nakrywkowe.
    6. Przykryj sekcje medium montażowym i umieść szkiełko nakrywkowe na spodzie szkiełka.
      UWAGA: Upewnij się, że medium montażowe wciąga suwak na miejsce. Jeśli szkiełko nakrywkowe nie jest płaskie, delikatnie wciśnij je na miejsce. Zetrzyj nadmiar podłoża montażowego za pomocą ręcznika papierowego.
    7. Zanurz chusteczkę czyszczącą w środku czyszczącym pochodzenia terpenowego (substytut ksylenu) i wytrzyj tylną część szkiełka, aby usunąć wszelkie skapane medium. Umieść szkiełko płasko na ruchomej, solidnej powierzchni, takiej jak kawałek kartonu. Dodaj szkiełko nakrywkowe do wszystkich pozostałych szkiełek zgodnie z opisem w kroku 6.7.6. Poczekaj, aż szkiełka wyschną, a medium montażowe stwardnieje w temperaturze pokojowej w masie.
      UWAGA: Pracuj pod maską chemiczną.
  8. Po barwieniu przykryć próbki szkiełkiem nakrywkowym i ocenić je za pomocą mikroskopu optycznego. Zmiany histopatologiczne opisano na podstawie rozmieszczenia, nasilenia i cech morfologicznych.
  9. Przeprowadź ocenę urazów półilościowo, używając 5-punktowej skali oceny (od 0 do 4), biorąc pod uwagę dotkliwość zmian w oparciu o kryteria wyjaśnione przez Shackelforda i wsp.27 i podsumowane w następujący sposób:
    Stopień 0: bez zmian
    Stopień 1: minimalna zmiana. Efekt jest ledwo widoczny na tkance; małe i rzadkie. Wpływa na część tkanki mniejszą lub równą 10%.
    Stopień 2: zmiana światła. Reprezentuje niewielką zmianę histologiczną. Gatunek ten stosuje się, gdy tkanka lub jej struktura wykazała zmianę objętości między 11% a 20%.
    Stopień 3: umiarkowana zmiana. Zmiana jest widoczna w tkance. Stopień wskazuje na obecność różnic między 21%-40% tkanki lub jej struktury
    Stopień 4: zaznaczona zmiana. Przytłaczająca zmiana histologiczna tkanki lub jej struktury. Zmiany dotyczą 41%-100% tkanki.
  10. Wykonaj ilościową analizę histomorfometryczną macicy, jajnika, jądra i tarczycy. Zbadaj skrawki tkanek za pomocą systemu analizy obrazu zastosowanego w mikroskopie optycznym i postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Macica: Za pomocą obiektywu 2x zmierz całkowitą powierzchnię każdego poprzecznego odcinka prawego rogu macicy, zewnętrznego i wewnętrznego mięśniówki macicy oraz światła macicy. Oblicz powierzchnię endometrium i mięśniówki macicy oraz stosunek powierzchni endometrium do mięśniówki macicy28.
    2. Jajnik: Użyj jednego z całych odcinków w centralnej pozycji jajnika, aby odsłonić pęcherzyki w różnych stadiach rozwoju; policz pęcherzyki pierwotne, wtórne, ciałko żółte, Graafa i pęcherzyki akretyczne za pomocą obiektywu 4x. Wykonaj klasyfikację mieszków włosowych według Fortune29. Ponadto zmierz powierzchnię jajnika dla każdej próbki i jej gęstość pęcherzykową (liczba pęcherzyków/powierzchnia jajnika x 100)30.
    3. Jądro: Korzystając z obiektywu 10x, zmierz 20 kanalików na próbkę; dodatkowo zmierz całkowitą powierzchnię światła, całkowitą powierzchnię, średnicę podłużną i średnicę poprzeczną28.
    4. Tarczyca: Zmierz następujące parametry: gęstość pęcherzyków (stosunek liczby pęcherzyków do danego obszaru, 10x obiektyw); pośrednia wysokość komórek pęcherzykowych (średni stosunek powierzchni pęcherzyka do powierzchni koloidu w pięciu losowo wybranych pęcherzykach/próbkę 40x obiektyw); średni stosunek powierzchni nabłonka mieszków włosowych do liczby jąder (w tym samym pęcherzyku w celu ustalenia dojrzewania pęcherzykowego); wysokość komórek pęcherzykowych (średnia wysokość pięciu komórek w pięciu losowo wybranych pęcherzykach/próbkę, 64x obiektyw)31.

7. Ekspresja genów

  1. W przypadku obu modeli należy przeprowadzić analizę ekspresji genów przy użyciu próbek wątroby przechowywanych w temperaturze -80 °C. Postępuj zgodnie z protokołem całkowitego oczyszczania RNA za pomocą zestawu, zaczynając od lizatu tkanki zwierzęcej.
    1. Aby uzyskać lizat wątroby, zmielić próbkę tkanki (10 mg) za pomocą minipinnera, dodać 600 μl RL BUFFER (dostarczonego z zestawem) do próbki tkanki i kontynuować mielenie, aż próbka zostanie zhomogenizowana.
  2. Natychmiast po ekstrakcji należy określić ilościowo otrzymane RNA i ocenić jego jakość (pod kątem denaturacji lub obecności jakichkolwiek reszt białkowych) za pomocą fluorospektrometru. Wykonać spektrofotometryczne odczyty absorbancji przy długościach fal 260 nm i 280 nm, gdzie odpowiednio absorbują kwasy nukleinowe i białka.
  3. Po ocenie całkowitego stężenia RNA, przy użyciu zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta, należy dokonać odwrotnej transkrypcji odpowiedniej objętości zawierającej 1 μg całkowitego RNA z każdej próbki do cDNA.
  4. Przeanalizuj uzyskane cDNA metodą RT-PCR.
    1. Aby przeanalizować ekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania, zaprojektowano specyficzne startery do przodu i do tyłu dla każdego genu docelowego, a także dla genu referencyjnego z konstytutywną ekspresją dehydrogenazy fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH). Za pomocą aplikacji internetowej Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) wybierz najlepsze startery, które zagwarantują specyficzność parowania tylko do interesującego nas genu i uzyskaj oligonukleotydy zsyntetyzowane przez komercyjnego dostawcę. Sekwencje zastosowanych par starterów przedstawiono w tabeli 5.
    2. Zawiesić liofilizowane startery w wodzie destylowanej wolnej od RNAzy o końcowym stężeniu 100 mM. Użyj dedykowanego zestawu do wykonania analizy qPCR. Przeprowadzić reakcje w końcowej objętości 20 μl, rozcieńczając wyżarzony cDNA w stosunku 1:40. Załaduj każdą próbkę podwójnie do 96-dołkowych płytek PCR.
    3. Wykonaj przebiegi qPCR na termocyklerze zgodnie z tym programem: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut; 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę. Na koniec wykonaj cykl dysocjacji od 55°C do 95°C (30 s/°C), aby zweryfikować specyficzność amplifikowanego produktu. Korzystając z dedykowanego oprogramowania maszyny, uzyskaj wartości progowe cyklu (Cycle Threshold, Ct) dla każdej próbki. Wyraż wyniki jako ΔΔ Ct (delta delta Ct) zgodnie ze wzorem Pfaffla32:
      ΔCt Gen docelowy = Kontrola Ct - Traktowany Ct
      Gen referencyjny ΔCt = Kontrola Ct - Traktowany Ct
      ΔCt = ΔCt Gen docelowy - ΔCt Gen referencyjny

8. Analiza danych

  1. Zarządzanie danymi za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Wykonuj analizy za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Projektuj grafikę za pomocą specjalnego oprogramowania.
  2. Reprezentują przyrost masy ciała, spożycie paszy, bezwzględną i względną masę narządów, poziomy hormonów w surowicy, dane morfometryczne tkanek i dane dotyczące ekspresji genów jako średnie odchylenie standardowe ±. Wykonaj nieparametryczną analizę Kruskala-Wallisa, a następnie porównania parami post-hoc (test Manna-Whitneya).
  3. Analizuj dane histologiczne za pomocą dwukierunkowego dokładnego testu Fishera, aby zidentyfikować znaczące różnice w stosunku do grupy kontrolnej, w tym próbek, które są przypisane do kategorii bez odniesienia do gradacji ciężkości (całkowita częstość występowania). Należy użyć testu Cochran-Armitage Trend Test, aby określić trend dawka-odpowiedź. Uważa się, że różnice między grupami są istotne, jeśli wartość p wynosi < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak wykazali Tassinari i wsp.14 oraz Tammaro i wsp.33, następujące wyniki potwierdziły skuteczność GAHT u szczurów oraz zasadność zastosowania tych modeli.

Nie odnotowano śmiertelności ani nieprawidłowych zachowań, takich jak agresja, i nie zaobserwowano klinicznych objawów toksyczności lub cierpienia (np. zmniejszonej aktywności, piloerekcji oraz zaniedbanego wyglądu)14.

Stężenia T w osoczu u d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wdrożenie modeli gryzoni naśladujących GAHT ma kluczowe znaczenie dla zbadania potencjalnej specyficznej podatności i wrażliwości osób z TG oraz długoterminowych wyników terapii, zwykle trwających przez całe życie.

Biorąc pod uwagę niewielką liczbę podobnych badań w literaturze, krytycznym punktem tego eksperymentu jest dobór dawek do ustawienia modeli; Dawki takie powinny być wystarczająco małe, aby można je było zastosować do długotrwałego podawania zwierzętom, nie powodując przy tym działań...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone bez jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby potencjalnie powodować konflikt interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Waga analityczna ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Wirówka 5415 REppendorfDo eppendorf
Octan cyproteronuSigma-AldrichC3412
D-MEM podłożeGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Roztwór formaliny, buforowany neutralnie, 10%Oprogramowanie Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism w wersji 5.0  dla systemu WindowsOprogramowanie
HematoxylinBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Oprogramowanie do obrazowaniaNikonNIS-BR
Oprogramowanie statystyczne JMP 10SAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MikroskopiaNikon Microphot FX
Mysz / szczur Testosteron ELISABiovendorRTC001R96T
Spektrofotometr NanoDrop 1000Thermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Wagi przenośne SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesZaprojektowane przez PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH (hormon tyreotropowy) Zestaw ELISAELK BiotechnologyELK228396T
Szczur TSH (hormon tyreotropowy) Zestaw ELISAELK BiotechnologyELK228396T
Zestaw do syntezy SensiFASTcDNA BiolineBIO-6505350 reaction
Sesam OilACROSAC241000010
Sprague Dawley szczury  piesek i suczkaEnvigo8/9  tygodni
Diety standardoweMucedola4RF18
T4 (tyroksyna) Zestaw ELISAELK BiotechnologyELK871696T
Testosteron enanthateSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Procesor tkanekShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Zestaw do całkowitego oczyszczania RNANorgen1720050 kolumn
Victor 3 Czytnik Multilabel Perkin Elmer
β-Estradiol 17-walerianianSigma-AldrichE1631
GraphPad

Bibliografia

  1. Rokach, A., Patel, K. Human sexuality: Function, dysfunction, paraphilias, and relationships. , Academic Press. (2021).
  2. American Psychological Association. Guidelines for psychological practice with transgender and gender nonconforming people. Am Psychol. 70 (9), 832-864 (2015).
  3. Ammari, T., Sluiter, E. C., Gast, K., Kuzon, W. M. Female-to-male gender-affirming chest reconstruction surgery. Aesthet Surg J. 39 (2), 150-163 (2019).
  4. Garg, G., Elshimy, G., Marwaha, R. Gender Dysphoria. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  5. Chan, A. S. W., Wu, D., Lo, I. P. Y., Ho, J. M. C., Yan, E. Diversity and inclusion: Impacts on psychological wellbeing among lesbian, gay, bisexual, transgender, and queer communities. Front Psychol. 13, 726343(2022).
  6. Unger, C. A. Hormone therapy for transgender patients. Transla Androl Urol. 5 (6), 877(2016).
  7. Sofer, Y., et al. Gender‐affirming hormone therapy effect on cortisol levels in trans males and trans females. Clin Endocrinol. 100 (2), 164-169 (2024).
  8. Pirtea, P., Ayoubi, J. M., Desmedt, S. T. ’, Sjoen, G. Ovarian, breast, and metabolic changes induced by androgen treatment in transgender men. Fertil Steril. 116 (4), 936-942 (2021).
  9. Tassinari, R., Maranghi, F. Rodent model of gender-affirming hormone therapies as specific tool for identifying susceptibility and vulnerability of transgender people and future applications for risk assessment. Int J Environ Res Public Health. 18 (23), 12640(2021).
  10. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (3-5), 204-215 (2011).
  11. van Larebeke, N., Fucic, A. Challenges in endocrine disruptor toxicology and risk assessment. , The Royal Society of Chemistry. (2020).
  12. You, H. H., Song, G. Review of endocrine disruptors on male and female reproductive systems. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 244, 109002(2021).
  13. Sifakis, S., Androutsopoulos, V. P., Tsatsakis, A. M., Spandidos, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environ Toxicol Pharmacol. 51, 56-70 (2017).
  14. Tassinari, R., et al. Risk assessment of transgender people: Development of rodent models mimicking gender-affirming hormone therapies and identification of sex-dimorphic liver genes as novel biomarkers of sex transition. Cells. 12 (3), 474(2023).
  15. T’Sjoen, G., Arcelus, J., Gooren, L., Klink, D. T., Tangpricha, V. Endocrinology of transgender medicine. Endo Rev. 40 (1), 97-117 (2019).
  16. Dhir, R. N., Shapiro, B. H. Interpulse growth hormone secretion in the episodic plasma profile causes the sex reversal of cytochrome P450s in senescent male rats. Proc Natl Acad Sci. 100 (25), 15224-15228 (2003).
  17. Robertson, G. R., Farrell, G. C., Liddle, C. Sexually dimorphic expression of rat CYP3A9 and CYP3A18 genes is regulated by growth hormone. Biochem Biophys Res Comm. 242 (1), 57-60 (1998).
  18. Kinnear, H., et al. A mouse model to investigate the impact of testosterone therapy on reproduction in transgender men. Human Reprod. 34 (10), 2009-2017 (2019).
  19. Gómez, Á, et al. Effects of adult male rat feminization treatments on brain morphology and metabolomic profile. Hormones Behav. 125, 104839(2020).
  20. T'Sjoen, G., et al. European society for sexual medicine position statement "Assessment and hormonal management in adolescent and adult trans people, with attention for sexual function and satisfaction". J Sex Med. 17 (4), 570-584 (2020).
  21. Coleman, E., et al. Standards of care for the health of transgender and gender diverse people, version 8. Int J Transgender Health. 23 (sup 1), S1-S259 (2022).
  22. Sudhakar, D., Huang, Z., Zietkowski, M., Powell, N., Fisher, A. R. Feminizing gender‐affirming hormone therapy for the transgender and gender diverse population: An overview of treatment modality, monitoring, and risks. Neurourol Urodynamics. 42 (5), 903-920 (2023).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Hickman, D. L. Minimal exposure times for irreversible euthanasia with carbon dioxide in mice and rats. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  25. Vdoviaková, K., et al. Importance rat liver morphology and vasculature in surgical research. Med Sci Monit. 22, 4716(2016).
  26. Fiette, L., Slaoui, M. Necropsy and sampling procedures in rodents. Methods Mol Biol. 691, 39-67 (2011).
  27. Shackelford, C., Long, G., Wolf, J., Okerberg, C., Herbert, R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicol Pathol. 30 (1), 93-96 (2002).
  28. Tassinari, R., et al. short-term exposure to titanium dioxide nanoparticles in Sprague-Dawley rat: focus on reproductive and endocrine systems and spleen. Nanotoxicology. 8 (6), 654-662 (2014).
  29. Fortune, J. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal Reprod Sci. 78 (3-4), 135-163 (2003).
  30. Maranghi, F., et al. Effects of the food contaminant semicarbazide following oral administration in juvenile Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 47 (2), 472-479 (2009).
  31. Rasinger, J., et al. Low dose exposure to HBCD, CB-153 or TCDD induces histopathological and hormonal effects and changes in brain protein and gene expression in juvenile female BALB/c mice. Reprod Toxicol. 80, 105-116 (2018).
  32. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).
  33. Tammaro, A., et al. Risk assessment of transgender people: implementation of a demasculinizing–feminizing rodent model including the evaluation of thyroid homeostasis. Biology Direct. 19 (1), 5(2024).
  34. Falvo, R. E., Kaltenbach, C. C., Pancoe, W. L. Determination of testosterone concentration in the plasma of normal and androgen-sterilized female rats, using a competitive protein binding technique. Neuroendocrinology. 10 (4), 229-234 (1972).
  35. Gibbs, R. B. Testosterone and estradiol produce different effects on cognitive performance in male rats. Horm Behav. 48 (3), 268-277 (2005).
  36. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. J Vis Exp. (64), e4013(2012).
  37. Cooke, P. S., Nanjappa, M. K., Ko, C., Prins, G. S., Hess, R. A. Estrogens in male physiology. Physiol Rev. 97 (3), 995-1043 (2017).
  38. Raja, N. S., Rubin, E. S., Moravek, M. B. A Review of animal models investigating the reproductive effects of gender-affirming hormone therapy. J Clin Med. 13 (4), 1183(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hormonalna terapia potwierdzaj ca p ezdrowie os b transp ciowychpodawanie testosteronuestradiolcyproterony octanbiomarkery specyficzne dla p cipodatno na zwi zki chemiczne ze rodowiskaanaliza histopatologicznaliczba plemnik wtarczyca
Stworzenie modeli szczurów naśladujących terapie hormonalne afirmujące płeć
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.