Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67475

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine, Autonomous University of the State of Mexico, 2Experimental Chemistry Lab, Faculty of Chemistry, Autonomous University of the State of Mexico, 3National Laboratory for Research and Development of Radiopharmaceuticals, National Institute for Nuclear Research

W tym artykule

Podsumowanie

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Streszczenie

Przewlekłe rany, ze względu na ich częstość, stanowią poważny globalny problem zdrowotny. Skuteczne strategie terapeutyczne mogą znacznie przyspieszyć gojenie, zmniejszając w ten sposób ryzyko powikłań i zmniejszając obciążenie ekonomiczne systemów opieki zdrowotnej. Chociaż liczne badania eksperymentalne dotyczyły gojenia się ran, większość z nich opiera się na obserwacjach jakościowych lub bezpośrednich pomiarach ilościowych. Celem pracy była standaryzacja metody pośredniego pomiaru ran z wykorzystaniem planimetrii cyfrowej, obejmującej cyfrowe skalowanie i segmentację. Podejście to rozwiązuje problem braku szczegółowych, krok po kroku metodologii dokładnej oceny rany. Zaprojektowano i wykonano kabinę do dokumentacji fotograficznej, a także zastosowano wspomagane komputerowo cyfrowe narzędzia planimetryczne w celu zminimalizowania zmienności w pomiarach obszaru rany, obwodu i odległości od środka rany do jej krawędzi. Na grzbietowej linii środkowej na poziomie łopatki samców myszy CD1 (n = 4, 10 tygodni, 30-35 g) powstała okrężna rana pourazowa (o średnicy 5 mm). Ewolucję rany dokumentowano fotografować przez 14 dni za pomocą specjalnie zaprojektowanej kabiny fotograficznej, która kontrolowała warunki oświetleniowe, odległość ogniskową i położenie obiektu. Skaling i pomiary ran wykonano za pomocą segmentacji w oprogramowaniu ImageJ, a analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Kinetyka zamykania rany wykazała niewielki wzrost wielkości i obwodu rany między dniem 0 a dniem 2, po którym następował stopniowy spadek, aż do całkowitego zamknięcia do dnia 14. Kabina do dokumentacji fotograficznej i planimetria cyfrowa wspomagana komputerowo umożliwiły pomiary ilościowe przy minimalnej zmienności. Podsumowując, narzędzia te zapewniają wiarygodną i powtarzalną metodę oceny kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Gojenie ran pourazowych trwa około 21 dni i ma dobrze zdefiniowaną sekwencję czterech odrębnych faz: (1) hemostaza, (2) stan zapalny, (3) proliferacja i (4) przebudowa1. Jeśli którakolwiek faza gojenia się ran jest przedłużona, może to prowadzić do rozwoju ran przewlekłych1. Ze względu na ich wysokie rozpowszechnienie, potencjalne powikłania2 i znaczne obciążenie ekonomiczne, są one uważane za globalny problem zdrowotny.

Badania przedkliniczne mają na celu osiągnięcie szybszego gojenia poprzez promowanie kompleksowej reepitelializacji ran3,4,5, zapobiegając powikłaniom i zmniejszając koszty leczenia. Badania te oceniają różne strategie, w tym rozwój biomateriałów, interwencje farmakologiczne i inne procedury medycyny regeneracyjnej6,7,8,9.

Wiele eksperymentalnych modeli zostało opracowanych do badania ran pourazowych. Niektórzy koncentrują się na makroskopowo widocznych cechach jakościowych, takich jak wielkość, wskaźniki stanu zapalnego, obecność ziarniny, wydzieliny i tworzenie się strupów5. Inni analizują dane ilościowe, w tym powierzchnię, obwód, promień, średnicę, kolor, głębokość i odległości od środka do krawędzi ran

.

W związku z tym, większość badań in vivo bezpośrednio mierzy promień i głębokość rany. Jednak ręczne wyznaczanie krawędzi rany na obrazie makroskopowym może powodować błędy systematyczne w measurement10. W innych badaniach stosuje się planimetrię mechaniczną, przy użyciu przezroczystych arkuszy z tworzywa sztucznego w siatkę, w których krawędzie rany są wcześniej wytyczone; W obu przypadkach uzyskanie obszaru lub obwodu wymaga ręcznych instrumentów, takich jak linijki lub planimetry cyfrowe. Obecnie planimetria cyfrowa wspomagana komputerowo umożliwia komputerową analizę makroskopowych obrazów ran lub arkuszy z tworzywa sztucznego. Manipulacja in situ i jakość obrazu makroskopowego są ograniczeniem, jednak to narzędzie11,12,13,14 znacznie zmniejsza zmienność między pomiarami obszaru i obwodu.

Ta proponowana metodologia oferuje znaczące korzyści w porównaniu z istniejącymi technikami oceny zamykania ran u myszy15,16,17,18,19,20. Podczas gdy dokumentacja fotograficzna została uznana za dokładne i spójne narzędzie do oceny kinetyki zamykania ran, poprzednie badania21,22 podkreślały ograniczenia ręcznego pomiaru rany, takie jak stronniczość obserwatora i zmienność spowodowana niespójnym oświetleniem i ustawieniem kamery. Obecne podejście rozwiązuje te problemy poprzez standaryzację warunków obrazowania za pomocą specjalnie zbudowanej kabiny, poprawiając odtwarzalność i precyzję. Co więcej, skomputeryzowana planimetria cyfrowa umożliwia dokładniejsze oceny ilościowe, poprawiając ocenę interwencji terapeutycznych i minimalizując błędy pomiaru, jak wykazano w innych badaniach porównujących techniki manualne i cyfrowe12,22, co czyni ją szczególnie przydatną do badań kinetyki zamykania ran w modelach mysich, umożliwiając precyzyjną ocenę leczenia poprzez utrzymanie ścisłej kontroli nad akwizycją obrazu Warunki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem myszy laboratoryjnych zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi i regulacjami określonymi w Oficjalnej Normie Meksykańskiej (NOM-062-ZOO-1999) dotyczącą postępowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Protokół został przeanalizowany i zatwierdzony przez Wewnętrzny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych (CICUAL) Narodowego Instytutu Badań Jądrowych (ININ) pod numerem referencyjnym CICUAL-01-23. W badaniu wykorzystano samce myszy CD1 (n = 4) w wieku 10 tygodni, o masie ciała w przedziale od 28-32 g. Wszystkie zwierzęta zostały wybrane w celu zapewnienia jednorodności szczepu, wieku, płci i masy ciała, aby zminimalizować zmienność wyników eksperymentalnych. Szczegółowe informacje na temat użytych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Konstrukcja namiotu bezcieniowego do pozyskiwania obrazów makroskopowych

UWAGA: Do zaprojektowania kabiny fotograficznej w celu wyeliminowania zewnętrznych źródeł światła wykorzystano licencjonowane oprogramowanie SolidWorks (wersja 2015). Sześcian o wymiarach 40 cm × 40 cm zbudowano z białego profilu aluminiowego o grubości jednej cala. Sześcian składał się z trzech sekcji montowanych sekwencyjnie: dachu, ścian bocznych i podłogi (Rysunek 1A).

  1. Konstrukcja dachu
    UWAGA: Dach podzielono na krawędź przednią (A), krawędź tylną (B) oraz krawędzie boczne (C i D) w celu orientacji (Rysunek 1B).
    1. Na wewnętrznym obszarze bocznej krawędzi dachu (C i D) zamocować nacięty profil aluminiowy (przeznaczony do trzymania szkła) o szerokości 1,5 cm, grubości 2,51 cm i długości 34,9 cm (Rysunek 1B).
    2. W rowku każdego profilu dachowego umieścić dwie prostokątne płyty aluminiowe o wymiarach 34,5 cm długości x 13 cm szerokości z polietylenem w centrum (Płyta 1 i 2 na Rysunku 1C), aby umożliwić ich przesuwanie w rowkach obu profili.
    3. Za pomocą taśmy dwustronnej zainstalować 20 cm rurkową lampę LED RGB o zakresie temperatury barwowej 2500-9000 K (Rysunek 1C) pod kątem 45° na dolnej krawędzi panelu 1.
    4. Na panelach dachowych 1 i 2 zamontować prostokątny panel z pianki o wymiarach 32 cm x 12 cm z centralnym okrągłym wycięciem o średnicy 7,82 cm, aby umożliwić instalację obiektywu kamery (Rysunek 1C).
  2. Konstrukcja podłogi
    1. Umieścić kwadratowy kawałek białej pianki o wymiarach 40 cm x 40 cm na profilach obszaru podłogi. Z każdego narożnika płyty z pianki wyciąć kwadraty o długości boku 2,54 cm (Rysunek 1E).
  3. Konstrukcja ścian bocznych
    1. Wyciąć cztery czworoboczne panele z pianki o wymiarach 40 cm x 40 cm.
    2. Przykleić dwa panele silikonem po stronach C i D, aby utworzyć lewą i prawą ścianę boczną (Rysunek 1F).
    3. Do profili aluminiowych A i B przymocować paski rzepów, aby ułatwić manipulację wewnętrznymi elementami kabiny fotograficznej. Dodatkowo, 1 cm od krawędzi przykleić rządek samozapinanych mocowań do dwóch kwadratów z pianki po jednej stronie i umieścić je na ścianach przedniej i tylnej (Rysunek 1F).
  4. Konstrukcja podstawy referencyjnej
    UWAGA: Podstawa referencyjna była niezbędna do utrzymania myszy w pozycji brzusznej podczas znieczulenia oraz w trakcie dokumentowania ewolucji rany. Komponenty 3D zostały zaprojektowane i wykonane techniką modelowania przez nakładanie warstw (FDM) z materiału PLA przy użyciu drukarki 3D23,24.
    1. Wydrukować w 3D maskę o podstawie 2 cm szerokości, długości i wysokości i umieścić ją 11,5 cm od krawędzi wcześniej wyciętego białego prostokąta z pianki o wymiarach 40 cm x 28 cm, aby utrzymać myszy pod znieczuleniem inhalacyjnym (Rysunek 1D, kolor czerwony).
    2. Wydrukować w 3D prostokątną platformę (9 cm długości, 5 cm szerokości, 2,5 cm wysokości) z czterema obszarami wypukłymi w celu wyrównania grzbietu myszy podczas akwizycji obrazu. Obszary te podtrzymywały głowę, kończyny i region brzuszny, aby utrzymać pozycję brzuszną. Przykleić tę platformę do centrum podstawy referencyjnej (Rysunek 1D, kolor zielony).
    3. Wydrukować w 3D blok linijki (2 cm szerokości, 8 cm długości, 2,5 cm wysokości) i przymocować go 1 cm od lewej strony podstawy myszy, aby umieścić element referencyjny pomiaru niezbędny do cyfrowego przetwarzania obrazu (Rysunek 1D, kolor niebieski).
    4. Do bloku linijki przymocować 15 cm stalową linijkę z podziałką i zainstalować całą podstawę referencyjną wewnątrz kabiny w celu skalowania obrazu (Rysunek 1D).

Koncepcja równowagi statycznej; opisany zestaw sześcianów; schemat przedstawiający etapy konstrukcji A-F.
Rysunek 1: Schemat konstrukcji obudowy do makroskopowego pozyskiwania obrazów. (A) Sekcje obudowy (dach, ściany boczne, podłoga).(B) Orientacja profili tworzących dach; przedni (A), tylny (B) i boczne (wewnętrzna strona profili zaznaczona na czerwono „C,D”). (C) Panele dachowe 1 i 2, montaż tuby świetlnej LED, płyty pod obiektyw kamery oraz montaż podłogi. (D) Montaż maski anestezjologicznej (CZERWONA), platformy dla myszy (ZIELONA) oraz prostokątnej platformy do pozycjonowania linijki pomiarowej (NIEBIESKA) na podstawie referencyjnej. (E) Ostateczne położenie podstawy referencyjnej. (F) Montaż ścian bocznych, przedniej i tylnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Utrzymanie zwierząt

  1. Uzyskać zgodę komisji bioetycznej instytucji na przeprowadzanie badań na zwierzętach. Wykorzystać myszy CD1 (n = 4) w wieku 10 tygodni o masie ciała 28-32 g.
  2. Utrzymywać myszy w standardowych warunkach: temperatura 21 °C, cykl światła i ciemności 12/12 h, wilgotność 45%, z dostępem ad libitum do wody i pokarmu, z wyjątkiem okresów sesji fotodokumentacji.

3. Generowanie rany urazowej

  1. Zanestezuj mysz, stosując inhalacyjny sewofluran o stężeniu 5%, podawany przy przepływie tlenu 1,5 L/min za pomocą skalibrowanego waporyzatora25 (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
    1. Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchu wycofania podczas ucisku między palcami. Nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu podczas anestezji. Utrzymuj myszy w stabilnej temperaturze 37 °C podczas operacji i rekonwalescencji (20 min).
  2. Umieść mysz w pozycji brzusznej i wydepiluj obszar o wymiarach 2,5 cm x 3 cm w regionie szyjnym w kierunku ogonowym, używając ostrzy chirurgicznych. Rozciągnij skórę, aby uniknąć rozdarć. Przeprowadź asepsję i antyseptykę, stosując kilka rund naprzemiennych płukań powidonem jodowym i sterylną wodą.
  3. Użyj sterylnego trepana do biopsji o średnicy 5 mm i wywieraj nacisk kolistymi ruchami, aby wykonać nacięcie skórno-epidermalne na poziomie łopatki. Usuń płat za pomocą pęsety ząbkowanej i przetnij nożyczkami irydowymi (Rycina 2A).
  4. W przypadku wystąpienia punktów krwawienia w ranie, przeprowadź hemostazę za pomocą urządzenia do elektrokoagulacji.
  5. Za pomocą pęsety jubilerskiej umieść nad raną okrągłą błonę skórną o średnicy 1 cm, aby zapobiec kontaminacji i skurczowi rany.
  6. Wszystkie operacje przeżyciowe wykonuj w warunkach sterylnych. Przygotuj miejsce operacyjne środkami dezynfekcyjnymi, takimi jak powidon jodowy. Załóż sterylne rękawiczki i maskę oraz zachowaj sterylność przez cały czas trwania procedury, używając sterylnych narzędzi i minimalizując kontakt z powierzchniami niesterylnymi.
    1. Po operacji umieść myszy w oddzielnych klatkach w temperaturze 24 °C i monitoruj je, aż odzyskają normalną zdolność poruszania się. Zapewnij kontrolę temperatury ciała podczas i po operacji, aby zapobiec hipotermii, stosując zewnętrzne źródła ciepła.
  7. Podawaj leki przeciwbólowe, rozpuszczając ketorolak (w formie tabletki, 10 mg) w wodzie pitnej w stężeniu 0,025 mg/mL. Odpowiada to dawce dziennej 5 mg/kg dla myszy o masie 30 g pijacej około 6 mL wody na dobę. Rozpocznij podawanie 48 h przed operacją i kontynuuj do 4. dnia po powstaniu rany, aby zapewnić wyprzedzającą i trwałą analgezję26.
  8. Po operacji monitoruj zwierzęta codziennie przez co najmniej pięć kolejnych dni. Oceniaj każdą mysz pod kątem wskaźnika kondycji ciała, wyglądu sierści, behawioralnych oznak bólu lub stresu (np. zmniejszona aktywność, nieprawidłowa postawa) oraz stanu rany (np. obecność wydzieliny, zaczerwienienie, obrzęk lub oznaki infekcji). Zapisuj obserwacje w instytucjonalnym dzienniku opieki nad zwierzętami. Kontynuuj regularne monitorowanie do 14. dnia, kiedy rany u zdrowych gryzoni zazwyczaj osiągają zaawansowane stadia gojenia. Eutanatyzuj myszy poprzez zastąpienie O2 w komorze z CO2 zgodnie ze standardami międzynarodowymi. Stanowi to punkt końcowy badania.

4. Pozyskiwanie obrazów makroskopowych

  1. Przez 14 kolejnych dni codziennie wykonuj zdjęcia ran, aby monitorować ciągłą kinetykę ich gojenia. Użyj aparatu półprofesjonalnego lub profesjonalnego; ustaw obiektyw w okrągłym otworze w dachu kabiny fotograficznej.
    UWAGA: Dostosuj harmonogram w razie potrzeby, w zależności od warunków eksperymentalnych.
  2. Do oświetlenia użyj rurki LED RGB w trybie skorelowanej temperatury barwowej (CCT), ustawiając ją na 9000 K i 100% jasności.
  3. Umieść podstawę referencyjną w centrum dna kabiny fotograficznej.
  4. Umieść mysz w komorze do anestezji wziewnej na 3 min (Rysunek 2B).
  5. Po wprowadzeniu w stan znieczulenia ułóż mysz na platformie dla myszy w pozycji brzusznej. Zabezpiecz pysk w masce do anestezji sewofluranem, podając 5% sewofluranu przy przepływie tlenu 1,5 L/min (Rysunek 2C).
  6. Przed wykonaniem zdjęć usuń folię dermalną z rany za pomocą pęsety jubilerskiej i wyrównaj podstawę referencyjną z obiektywem aparatu.
  7. Zamontuj przednią ściankę kabiny fotograficznej i wykonaj zdjęcia makroskopowe z następującymi ustawieniami: przysłona f/3.2, czas naświetlania 1/200s, czułość ISO 80, ogniskowa 4mm.
  8. Za pomocą pęsety jubilerskiej nałóż na ranę folię dermalną o średnicy 1 cm przed zdjęciem maski do anestezji. Przenieś myszy do oddzielnych klatek i obserwuj do czasu odzyskania sprawności ruchowej.

5. Przetwarzanie obrazu

  1. Utwórz kopię zapasową obrazów makroskopowych. Przetwórz obrazy przy użyciu oprogramowania ImageJ.
  2. Otwórz kopię zapasową obrazu w ImageJ, przechodząc przez ścieżkę: File > Open > Search w folderach z obrazami, a następnie kliknij Open.
  3. Skaluj obraz na podstawie punktu odniesienia: Powiększ obraz do maksymalnego rozmiaru, wybierz narzędzie straight-line, powiększ widok linijki obok myszy za pomocą klawisza +, narysuj na obrazie linijki linię prostą o długości 10 mm, następnie przejdź do Analyze > Set Scale > Wpisz „10” w polu Known distance > ustaw Unit of length na mm, a następnie kliknij Ok. Pozwala to wyznaczyć stosunek liczby pikseli do odległości dla obrazu makroskopowego (Rycina 2D).
  4. Wyodrębnij obszar rany z obrazu: Użyj narzędzia prostokąta, aby zaznaczyć obszar wokół rany (w = 150, h = 150). Zapisz wartości X i Y, kliknij prawym przyciskiem myszy na prostokąt > Duplicate > Nazwij obiekt > Naciśnij Enter. W nowym obrazie naciśnij dwukrotnie klawisz +, aby powiększyć widok (Rycina 2E).
  5. Zapisz przycięty obraz, przechodząc przez ścieżkę: File > Save As > Tiff > Wpisz nazwę > Save.
  6. Utwórz duplikat przyciętego obrazu, aby uniknąć jego modyfikacji podczas segmentacji: Kliknij prawym przyciskiem myszy na przycięty obraz > Duplicate > Nazwij go, dodając słowo „Segmentation” na końcu. Następnie naciśnij Enter. W nowym obrazie naciśnij dwukrotnie klawisz +, aby powiększyć widok.
  7. Rozdziel obraz na kanały kolorystyczne, przechodząc przez ścieżkę: Image > Type > RGB Stack. W obrazie z kanałem czerwonym (1/3 Red) kliknij prawym przyciskiem myszy Duplicate i naciśnij OK w oknie Duplicate.
  8. Przeprowadź segmentację obrazu z kanału czerwonego. Kliknij obraz z kanału czerwonego, Image > Adjust > Threshold. Następnie wybierz Default > Apply (Rycina 2F).
  9. Skoryguj obszar zainteresowania (ROI), aby zapewnić pełne pokrycie rany i uniknąć zniekszaceń segmentacji.
    UWAGA: Jeśli obszary wokół rany nie zostały uwzględnione w segmentacji, przejdź do Process > Binary > Fill Holes. Aby usunąć czarne punkty poza raną, przejdź do Process > Binary > Erode. Jeśli komenda Erode zmniejszy rozmiar rany, skoryguj to za pomocą Process > Binary > Dilate.
  10. Zaznacz obrys ROI: Edit > Selection > Create Selection. ROI zostanie obrysowane na żółto. Dodaj je do menedżera ROI, przechodząc przez Edit > Selection > Add to Manager (Rycina 2G).
  11. Zweryfikuj segmentację: Otwórz okno ROI Manager i wybierz ROI do przeglądu: More > Translate. Wpisz wartości X i Y zapisane w kroku 4 i naciśnij OK.
    1. Powiększ oryginalny obraz do maksymalnego rozmiaru, a następnie wybierz ROI w ROI Manager. Dostosuj ROI za pomocą klawiszy strzałek, aż pokryje się z raną (Rycina 2H). Jeśli ROI pasuje do rany, segmentacja przebiegła pomyślnie. W przeciwnym razie powtórz kroki od punktu 2.
  12. Po potwierdzeniu segmentacji uzyskaj pomiary rany: Analyze > Measure. Tabela wyników wyświetli wartości pola powierzchni, obwodu oraz pozycji X/Y. Skopiuj te wartości do oprogramowania SPSS w celu udokumentowania i analizy statystycznej (Rycina 2I).

Proces gojenia ran u myszy, schemat przedstawiający pobieranie wycinków, znieczulenie, dokumentację fotograficzną i analizę obrazu.
Rysunek 2: Przebieg pomiaru rany z wykorzystaniem cyfrowej planimetrii i technik segmentacji. (A) Nacięcie skóry i naskórka za pomocą sterylnego trepana do biopsji o średnicy 5 mm. (B) Umieszczenie myszy w komorze do znieczulenia inhalacyjnego na 3 min. (C) Dokumentacja fotograficzna poprzez umieszczenie znieczulonej myszy w kabinie fotograficznej i zabezpieczenie jej nosa w masce do podawania sewofluranu. (D) Otwarcie uzyskanego obrazu w programie ImageJ i przeskalowanie go z wykorzystaniem linijki jako referencji. (E) Wyodrębnienie obszaru rany za pomocą narzędzia prostokąta. (F) Rozdzielenie obrazu na kanały RGB i przetwarzanie kanału czerwonego. (G) Obrysowanie i zarządzanie obszarem zainteresowania (ROI). (H) Walidacja segmentacji poprzez dopasowanie ROI do rany. (I) Pomiar parametrów rany i zapisanie wyników do analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Eutanazja po zabiegu

UWAGA: Badanie kończy się po 14 dniach, kiedy to rany u zdrowych gryzoni zazwyczaj osiągają zaawansowane stadia gojenia. Na tym etapie myszy zostały humanitarnie uśpione zgodnie z zatwierdzoną przez instytucję procedurą eutanazji.

  1. Przygotować sprzęt. Upewnić się, że komora do eutanazji jest czysta, sucha i ma odpowiednią wielkość, aby pomieścić myszy bez nadmiernego zagęszczenia. Podłączyć komorę do medycznego źródła CO2 z regulatorem przepływu.
  2. Ostrożnie przenieść myszy do komory, aby zminimalizować stres. Zapewnić im spokojne środowisko z minimalną liczbą zakłóceń zewnętrznych.
  3. Ustawić szybkość przepływu CO2 na 30%-70% objętości komory na minutę, zgodnie z zaleceniami AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. Stopniowo zwiększać stężenie CO2, aby uniknąć wywołania u myszy stresu lub dyskomfortu.
  4. Uważnie obserwować myszy podczas procedury. Monitorować oznaki stopniowej utraty przytomności, w tym zmniejszoną aktywność i spowolnienie oddechu, a następnie bezdech i zatrzymanie akcji serca.
  5. Potwierdzić zgon, gdy myszy przestaną oddychać i nie będą wykazywać żadnych oznak ruchu; odczekać dodatkowe 1-2 min, aby upewnić się, że funkcje życiowe całkowicie ustały. Zweryfikować zgon poprzez potwierdzenie braku odruchów (np. odruchu rogówkowego) oraz braku aktywności serca.
  6. Przenieść zwłoki do wyznaczonych pojemników na odpady biologiczne niebezpieczne. Postępować zgodnie z protokołami instytucjonalnymi oraz krajowymi wytycznymi dotyczącymi bezpiecznej utylizacji szczątków zwierząt.
  7. Odnotować liczbę uśmierconych zwierząt, datę oraz wszelkie istotne obserwacje, aby zapewnić zgodność ze standardami etycznymi i instytucjonalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po skalowaniu obrazów w oprogramowaniu ImageJ, za pomocą segmentacji cyfrowej wyznaczono średni obwód (Tabela 1) oraz powierzchnię (Tabela 2) ran, wraz z odpowiadającymi im odchyleniami standardowymi. Wartości te rejestrowano od dnia zerowego do czternastego (D0-D14).

DzieńObwód (mm)
022.75 ± 0.8900

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W modelach przedklinicznych ilościowa analiza ewolucji ran pourazowych w modelach przedklinicznych napotyka wyzwania związane z takimi czynnikami, jak rozmiar rany, zlokalizowana reakcja zapalna34, lokalizacja i/lub manipulacja. Dla tych pomiarów istnieją bezpośrednie ręczne36 i pośrednie cyfrowe metody planimetryczne 11,16,37,38. W przeciwieństwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów związanego z tymi badaniami.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600) poprzez dotację za zapewnienie finansowania, oraz Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) za ich wsparcie. Dodatkowo, Rysunek 2 został przygotowany przy pomocy oprogramowania BioRender (2020), dostępnego pod adresem BioRender.com/p67z056.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dziurkacz do biopsji 5 mmMILTEX, USA33-35Do oznaczania krawędzi rany
Aluminium z rdzeniem polietylenowymAlucobond, USABright Silver 119Do budowy makroskopowego obiektywu do kabiny akwizycji obrazu
 Sony, JaponiaSEL2470ZAby ustawić ostrość obrazów do fotografowania
ElektrokoagulacjaBonart, USAART-E1Aby wyeliminować krwawiące punkty w ranie, jeśli są obecne.
Paski mocujące na rzep VELCRO
IBM SPSS Statistics Version 22IBM Corporation, USAhttps://www.ibm.com/analytics/spss-statisticsSłuży do analizy statystycznej pomiarów ran, w tym danych powierzchniowych i obwodowych.
ImageJ Version 1.53tNational Institutes of Health, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/Służy do przetwarzania obrazów makroskopowych, w tym skalowania, segmentacji i pomiaru parametrów rany.
KetorolacSIEGFRIED RHEIN, Meksyk493977Do leczenia bólu pooperacyjnego
Miltex Iris Scissors, 4-1 / 8" ZakrzywioneMILTEX, USAV95-306Aby przeciąć płat rany wygenerowany za pomocą stempla biopsyjnego
Świetlówka LEDRGB ANDOER, Chiny‎ B09F8RLMSYDo oświetlenia kabiny akwizycji obrazu makroskopowego
Półprofesjonalna kameraSony, Japonia  DSC-HX300Do robienia zdjęć
Kleszcze ząbkowaneMILTEX, USAV96-118Do przytrzymania klapki podczas cięcia
SevofluraneBaxter, USAAMX2L9117PRDo znieczulenia wziewnego
Pentobarbital soduAranda, Meksyk734.448.001.212Do znieczulenia dootrzewnowego
SolidWorks Version 2015Dassault Systè mes, Francja  https://www.solidworks.com/Służy do projektowania i tworzenia modeli 3D do budowy  akcesoriów do kabiny do dokumentacji fotograficznej.
Ostrza chirurgiczne HERGOM, MeksykH10Aby ogolić włosy w obszarze, w którym zostanie utworzona rana
Przezroczysty opatrunek samoprzylepny3M, USAF51CA07Aby zakryć ranę pourazową

Bibliografia

  1. Martinengo, L., et al. Prevalence of chronic wounds in the general population: systematic review and meta-analysis of observational studies. Ann Epidemiol. 29, 8-15 (2019).
  2. Chen, X., Shi, X., Xiao, H., Xiao, D., Xu, X. Research hotspot and trend of chronic wounds: A bibliometric analysis from. 31 (5), to 2022. Wound Repair 597-612 (2013).
  3. Gould, L., Li, W. W. Defining complete wound closure: Closing the gap in clinical trials and practice. Wound Repair. 27 (3), 201-224 (2019).
  4. Baron, J. M., Glatz, M., Proksch, E. Optimal support of wound healing: New insights. Dermatology. 236 (6), 593-600 (2020).
  5. Tiwari, R., Pathak, K. Local drug delivery strategies towards wound healing. Pharmaceutics. 15 (2), (2023).
  6. Gupta, B., Agarwal, R., Alam, M. S. Hydrogels for wound healing applications. Biomed Hydrogels. , 184-227 (2011).
  7. Pastar, I., et al. Pre-clinical models for wound-healing studies. Skin Tissue Models Regen Med. , 223-253 (2018).
  8. Shen, Z., Zhang, C., Wang, T., Xu, J. Advances in functional hydrogel wound dressings. A Review. Polymers (Basel. 15 (9), (2000).
  9. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing). J Biomed Biotechnol. 2011, 1-8 (2011).
  10. Peterson, N., Stevenson, H., Sahni, V. Size matters: How accurate is clinical estimation of traumatic wound size. Injury. 45 (1), 232-236 (2014).
  11. Öien, R. F., Håkansson, A., Hansen, B. U., Bjellerup, M. Measuring the size of ulcers by planimetry: a useful method in the clinical setting. J Wound Care. 11 (5), 165-168 (2002).
  12. Rogers, L. C., Bevilacqua, N. J., Armstrong, D. G., Andros, G. Digital planimetry results in more accurate wound measurements: a comparison to standard ruler measurements. J Diabetes Sci Technol. 4 (4), 799-802 (2010).
  13. Shamata, A., Thompson, T. Documentation and analysis of traumatic injuries in clinical forensic medicine involving structured light three-dimensional surface scanning versus photography. J Forensic Leg Med. 58, 93-100 (2018).
  14. Foltynski, P., Ladyzynski, P., Ciechanowska, A., Migalska-Musial, K., Judzewicz, G., Sabalinska, S. Wound area measurement with digital planimetry: Improved accuracy and precision with calibration based on 2 rulers. PLoS One. 10 (8), (2015).
  15. Frank, S., Kämpfer, H. Excisional wound healing. Wound Healing: Methods Protoc. , 3-15 (2003).
  16. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. 75, (2013).
  17. Barakat, M., DiPietro, L. A., Chen, L. Limited Treatment options for diabetic wounds: Barriers to clinical translation despite therapeutic success in murine models. Adv Wound Care (New Rochelle. 10 (8), 436-460 (2021).
  18. Goh, C. C., et al. Inducing ischemia-reperfusion injury in the mouse ear skin for intravital multiphoton imaging of immune responses). J Vis Exp. 118, (2016).
  19. Wang, Y., et al. Autologous fat grafting promotes macrophage infiltration to increase secretion of growth factors and revascularization, thereby treating diabetic rat skin defect. Diabetes, Metab Syndr Obes: Targets and Therapy. 13, 4897-4908 (2020).
  20. Notodihardjo, S. C., et al. A comparison of the wound healing process after the application of three dermal substitutes with or without basic fibroblast growth factor impregnation in diabetic mice. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 73 (8), 1547-1555 (2020).
  21. Thawer, H. A., Houghton, P. E., Woodbury, M. G., Keast, D., Campbell, K. A comparison of computer-assisted and manual wound size measurement. Ostomy Wound Manage. 48 (10), 46-53 (2002).
  22. Huang, C. X., et al. Comparison of digital and traditional skin wound closure assessment methods in mice. Lab Anim Res. 39 (1), (2023).
  23. Subramaniam, S. R., et al. 3D printing: Overview of PLA progress. AIP Conf Proc. 020015. , (2019).
  24. Oleksy, M., Dynarowicz, K., Aebisher, D. Rapid prototyping technologies: 3D printing applied in medicine. Pharmaceutics. 15 (8), (2023).
  25. Césarovic, N., Nicholls, F., Rettich, A., Kronenberg, S., Häussler, A. K., Boillat, C. S., Spahn, D. R., Arras, M. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Anim. 44 (4), 329(2010).
  26. Domer, F. Characterization of the analgesic activity of ketorolac in mice. Eur. J. Pharmacol. 177, 127(1990).
  27. Cukjati, D., Reberšek, S., Miklavčič, D. A reliable method of determining wound healing rate. Med Biol Eng Comput. 39 (2), 263-271 (2001).
  28. Payne, W. G., Bhalla, R., Hill, D. P., Pierpont, Y. N., Robson, M. C. Wound healing trajectories to determine pressure ulcer treatment efficacy. Wound Repair. 11, 1(2011).
  29. Cardinal, M., Eisenbud, D. E., Phillips, T., Harding, K. Early healing rates and wound area measurements are reliable predictors of later complete wound closure. Wound Repair. 16 (1), 19-22 (2008).
  30. Tallman, P. Initial rate of healing predicts complete healing of venous ulcers. Arch Dermatol. 133 (10), 1231(1997).
  31. Hopkins, N. F. G., Jamieson, C. W. Antibiotic concentration in the exudate of venous ulcers: The prediction of ulcer healing rate. Br J Surg. 70 (9), 532-534 (2005).
  32. Robson, M. C. Wound healing trajectories as predictors of effectiveness of therapeutic agents. Arch Surg. 135 (7), (2000).
  33. Jessup, R. L. What is the best method for assessing the rate of wound healing? A comparison of 3 mathematical formulas. Wounds. 19 (3), 138-147 (2006).
  34. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: A critical step during wound healing. Cell Mol Life Sci. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  35. Szpaderska, A. M., DiPietro, L. A . Inflammation in surgical wound healing: Friend or foe. Surgery. 137 (5), 571-573 (2005).
  36. Hamed, E., Al Balah,, A, O. F., Refaat, M., Badr, A. M., Afifi, A. Photodynamic therapy mediated by methylene blue-loaded PEG accelerates skin mouse wound healing: An immune response. Lasers in Med Sci. 39 (1), 141(2024).
  37. Ibraheem, W. I., et al. Comparison of digital planimetry and ruler methods for the measurement of extraction socket wounds. 59 (1), Medicina (Kaunas. 135(2023).
  38. Mayrovitz, H. N., Soontupe, L. B. Wound areas by computerized planimetry of digital images: accuracy and reliability). Wounds. 22 (5), 222-229 (2009).
  39. Galiano, R. D., Michaels, J., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12 (4), 485-495 (2004).
  40. Price, A., Grey, J. E., Patel, G. K., Cbe, K. G. H. ABC of wound healing. , John Wiley & Sons. 0470658975(2022).
  41. Eming, S. A., Krieg, T., Davidson, J. M. Inflammation in wound repair: Molecular and cellular mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (3), 514-525 (2007).
  42. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  43. López, N., Cervero, S., Mj Jiménez,, Sanchez, J. F. Cellular characterization of wound exudate as a predictor of wound healing phases. Wounds. 26 (4), 101-107 (2014).
  44. Liu, N. T., et al. Quantifying the effects of wound healing risk and potential on clinical measurements and outcomes of severely burned patients: A data-driven approach. Burns. 46 (2), 303-313 (2020).
  45. Han, C., Barakat, M., DiPietro, L. A. Angiogenesis in wound repair: Too much of a good thing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 14 (10), (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model rany u myszypomiar ranysegmentacja w programie ImageJkabina do dokumentacji fotograficznejanaliza powierzchni ranyprzedkliniczne gojenie ranpomiar wspomagany komputerowoobwód rany
Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.