Artykuł metodologiczny

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

DOI:

10.3791/67475

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine, Autonomous University of the State of Mexico, 2Experimental Chemistry Lab, Faculty of Chemistry, Autonomous University of the State of Mexico, 3National Laboratory for Research and Development of Radiopharmaceuticals, National Institute for Nuclear Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekłe rany, ze względu na ich częstość, stanowią poważny globalny problem zdrowotny. Skuteczne strategie terapeutyczne mogą znacznie przyspieszyć gojenie, zmniejszając w ten sposób ryzyko powikłań i zmniejszając obciążenie ekonomiczne systemów opieki zdrowotnej. Chociaż liczne badania eksperymentalne dotyczyły gojenia się ran, większość z nich opiera się na obserwacjach jakościowych lub bezpośrednich pomiarach ilościowych. Celem pracy była standaryzacja metody pośredniego pomiaru ran z wykorzystaniem planimetrii cyfrowej, obejmującej cyfrowe skalowanie i segmentację. Podejście to rozwiązuje problem braku szczegółowych, krok po kroku metodologii dokładnej oceny rany. Zaprojektowano i wykonano kabinę do dokumentacji fotograficznej, a także zastosowano wspomagane komputerowo cyfrowe narzędzia planimetryczne w celu zminimalizowania zmienności w pomiarach obszaru rany, obwodu i odległości od środka rany do jej krawędzi. Na grzbietowej linii środkowej na poziomie łopatki samców myszy CD1 (n = 4, 10 tygodni, 30-35 g) powstała okrężna rana pourazowa (o średnicy 5 mm). Ewolucję rany dokumentowano fotografować przez 14 dni za pomocą specjalnie zaprojektowanej kabiny fotograficznej, która kontrolowała warunki oświetleniowe, odległość ogniskową i położenie obiektu. Skaling i pomiary ran wykonano za pomocą segmentacji w oprogramowaniu ImageJ, a analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Kinetyka zamykania rany wykazała niewielki wzrost wielkości i obwodu rany między dniem 0 a dniem 2, po którym następował stopniowy spadek, aż do całkowitego zamknięcia do dnia 14. Kabina do dokumentacji fotograficznej i planimetria cyfrowa wspomagana komputerowo umożliwiły pomiary ilościowe przy minimalnej zmienności. Podsumowując, narzędzia te zapewniają wiarygodną i powtarzalną metodę oceny kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gojenie ran pourazowych trwa około 21 dni i ma dobrze zdefiniowaną sekwencję czterech odrębnych faz: (1) hemostaza, (2) stan zapalny, (3) proliferacja i (4) przebudowa1. Jeśli którakolwiek faza gojenia się ran jest przedłużona, może to prowadzić do rozwoju ran przewlekłych1. Ze względu na ich wysokie rozpowszechnienie, potencjalne powikłania2 i znaczne obciążenie ekonomiczne, są one uważane za globalny problem zdrowotny.

Badania przedkliniczne mają na celu osiągnięcie szybszego gojenia poprzez promowanie kompleksowej reepitelializacji ran3,4,5, zapobiegając powikłaniom i zmniejszając koszty leczenia. Badania te oceniają różne strategie, w tym rozwój biomateriałów, interwencje farmakologiczne i inne procedury medycyny regeneracyjnej6,7,8,9.

Wiele eksperymentalnych modeli zostało opracowanych do badania ran pourazowych. Niektórzy koncentrują się na makroskopowo widocznych cechach jakościowych, takich jak wielkość, wskaźniki stanu zapalnego, obecność ziarniny, wydzieliny i tworzenie się strupów5. Inni analizują dane ilościowe, w tym powierzchnię, obwód, promień, średnicę, kolor, głębokość i odległości od środka do krawędzi ran

.

W związku z tym, większość badań in vivo bezpośrednio mierzy promień i głębokość rany. Jednak ręczne wyznaczanie krawędzi rany na obrazie makroskopowym może powodować błędy systematyczne w measurement10. W innych badaniach stosuje się planimetrię mechaniczną, przy użyciu przezroczystych arkuszy z tworzywa sztucznego w siatkę, w których krawędzie rany są wcześniej wytyczone; W obu przypadkach uzyskanie obszaru lub obwodu wymaga ręcznych instrumentów, takich jak linijki lub planimetry cyfrowe. Obecnie planimetria cyfrowa wspomagana komputerowo umożliwia komputerową analizę makroskopowych obrazów ran lub arkuszy z tworzywa sztucznego. Manipulacja in situ i jakość obrazu makroskopowego są ograniczeniem, jednak to narzędzie11,12,13,14 znacznie zmniejsza zmienność między pomiarami obszaru i obwodu.

Ta proponowana metodologia oferuje znaczące korzyści w porównaniu z istniejącymi technikami oceny zamykania ran u myszy15,16,17,18,19,20. Podczas gdy dokumentacja fotograficzna została uznana za dokładne i spójne narzędzie do oceny kinetyki zamykania ran, poprzednie badania21,22 podkreślały ograniczenia ręcznego pomiaru rany, takie jak stronniczość obserwatora i zmienność spowodowana niespójnym oświetleniem i ustawieniem kamery. Obecne podejście rozwiązuje te problemy poprzez standaryzację warunków obrazowania za pomocą specjalnie zbudowanej kabiny, poprawiając odtwarzalność i precyzję. Co więcej, skomputeryzowana planimetria cyfrowa umożliwia dokładniejsze oceny ilościowe, poprawiając ocenę interwencji terapeutycznych i minimalizując błędy pomiaru, jak wykazano w innych badaniach porównujących techniki manualne i cyfrowe12,22, co czyni ją szczególnie przydatną do badań kinetyki zamykania ran w modelach mysich, umożliwiając precyzyjną ocenę leczenia poprzez utrzymanie ścisłej kontroli nad akwizycją obrazu Warunki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem myszy laboratoryjnych zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi i przepisami ustanowionymi w Oficjalnym Meksykańskim Standardzie (NOM-062-ZOO-1999) dotyczącym obchodzenia się i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Protokół został poddany przeglądowi i zatwierdzony przez Wewnętrzny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych (CICUAL) Narodowego Instytutu Badań Jądrowych (ININ) pod numerem referencyjnym CICUAL-01-23. W badaniu wykorzystano samce myszy CD1 (n = 4) w wieku 10 tygodni, o masie ciała w zakresie 28-32 g. Wszystkie zwierzęta zostały wybrane tak, aby zapewnić jednolitość szczepu, wieku, płci i masy ciała, minimalizując zmienność wyników eksperymentu. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Budowa fotobudki do pozyskiwania obrazów makroskopowych

UWAGA: Licencjonowane oprogramowanie SolidWorks (wersja 2015) zostało użyte do zaprojektowania fotobudki w celu wyeliminowania zewnętrznych źródeł światła. Sześcian o wymiarach 40 cm × 40 cm został zbudowany z białego profilu aluminiowego o grubości jednego cala. Sześcian składał się z trzech sekcji, składanych kolejno: dachu, ścian bocznych i podłogi (Rysunek 1A).

  1. Konstrukcja dachu
    UWAGA: Dach został zregionalizowany jako przednia krawędź (A), tylna krawędź (B) i boczne krawędzie (C i D) w celu orientacji (Rysunek 1B).
    1. Zamocuj na wewnętrznej powierzchni bocznej krawędzi dachu (C i D) szczelinowy profil aluminiowy (przeznaczony do utrzymywania szkła) o szerokości 1,5 cm, grubości 2,51 cm i długości 34,9 cm (Rysunek 1B).
    2. Umieść dwie prostokątne płyty aluminiowe o długości 34,5 cm i szerokości 13 cm z polietylenem pośrodku w rowku każdego profilu dachowego (płyta 1 i 2 w Rysunek 1C), aby umożliwić przesuwanie się przez rowek obu profili.
    3. Zainstaluj świetlówkę LED RGB o średnicy 20 cm i zakresie temperatury barwowej 2500-9000 K (Rysunek 1C) pod kątem 45° na dolnej krawędzi panelu 1 za pomocą taśmy dwustronnej.
    4. Zamontuj na panelach dachowych 1 i 2 prostokątny panel z płyty piankowej o wymiarach 32 cm x 12 cm z centralnym okrągłym wycięciem o średnicy 7,82 cm, aby umożliwić montaż obiektywu kamery (Rysunek 1C).
  2. Konstrukcja posadzki
    1. Umieść kwadratowy kawałek białej płyty piankowej o wymiarach 40 cm x 40 cm na profilach podłogi. Wytnij kwadraty o boku długości 2,54 cm z każdego rogu płyty piankowej (Rysunek 1E).
  3. Budowa ścian bocznych
    1. Wytnij cztery czworokątne panele z płyty piankowej o wymiarach 40 cm x 40 cm.
    2. Przyklej dwa panele silikonem po bokach C i D, aby utworzyć lewą i prawą ścianę boczną (Rysunek 1F).
    3. Przymocuj listwy mocujące na rzep do profili aluminiowych A i B, aby ułatwić manipulowanie wewnętrznymi elementami fotobudki. Dodatkowo przymocuj 1 cm od krawędzi linii samoprzylepnych łączników do dwóch kwadratów z tektury piankowej po jednej stronie i umieść je na przedniej i tylnej ścianie (Rysunek 1F).
  4. Budowa bazy referencyjnej
    UWAGA: Baza referencyjna była niezbędna do utrzymania myszy w pozycji leżącej podczas znieczulenia i przez cały czas dokumentowania ewolucji rany. Komponenty 3D zostały zaprojektowane i wyprodukowane przy użyciu techniki Fused Deposition Modeling (FDM) z materiałem PLA i drukarką 3D23,24.
    1. Wydrukuj maskę 3D z podstawą o szerokości, długości i wysokości 2 cm i umieść ją 11,5 cm od krawędzi wstępnie wyciętego prostokąta z białej płyty piankowej o wymiarach 40 cm x 28 cm, aby utrzymać myszy w znieczuleniu wziewnym (Rysunek 1D, kolor czerwony).
    2. Wydrukuj w 3D prostokątną platformę (9 cm długości, 5 cm szerokości, 2,5 cm wysokości) z czterema wytłaczanymi obszarami, aby wyrównać grzbiet myszy podczas akwizycji obrazu. Obszary te wspierały głowę, kończyny i okolice brzucha, aby utrzymać pozycję leżącą. Przyklej tę platformę do środka bazy referencyjnej (Rysunek 1D, kolor zielony).
    3. Wydrukuj w 3D blok linijki (2 cm szerokości, 8 cm długości, 2,5 cm wysokości) i zamocuj go 1 cm od lewej strony podstawy myszy, aby umieścić element odniesienia pomiaru potrzebny do cyfrowego przetwarzania obrazu (Rysunek 1D, kolor niebieski).
    4. Przymocuj linijkę z podziałką 15 cm ze stali nierdzewnej do bloku linijki i zainstaluj całą podstawę referencyjną wewnątrz kabiny w celu skalowania obrazu (Rysunek 1D).

Proces montażu kostki modułowej; oznaczony schemat dachu, podłogi, ścian, elementów; Projektowanie 3D.
Rysunek 1: Schemat budowy szafy do akwizycji obrazów makroskopowych. (A) Sekcje kabiny (dach, ściany boczne, podłoga). orazOrientacja profili tworzących dach; przód (A), tył (B) i boki (wewnętrzna strona profili w kolorze czerwonym "C,D"). (C) Panele dachowe 1 i 2, montaż świetlówki LED, płyty obiektywu kamery i montaż podłogi. (D) Montaż maski anestezjologicznej (CZERWONA), platformy myszy (ZIELONA) i prostokątnej platformy do pozycjonowania linijki pomiarowej (NIEBIESKA) na podstawie odniesienia. E) Ostateczna lokalizacja bazy odniesienia. (F) Montaż ścian bocznych, przednich i tylnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Opieka nad zwierzętami

  1. Uzyskaj zezwolenie od komisji bioetycznej instytucji na przeprowadzanie testów na zwierzętach. Użyj myszy CD1 (n = 4), w wieku 10 tygodni, o wadze 28-32 g.
  2. Trzymaj myszy w standardowych warunkach: utrzymuj temperaturę 21 °C, 12/12 h cykli światło/ciemność, 45% wilgotności i zapewnij ad libitum dostęp do wody i jedzenia, z wyjątkiem sesji fotograficznych.

3. Powstawanie ran pourazowych

  1. Znieczulić mysz za pomocą wziewnego sewofluranu o stężeniu 5%, dostarczanego z natężeniem przepływu tlenu 1,5 l/min, przy użyciu skalibrowanego parownika25 (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    1. Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając, czy nie ma odruchu odstawienia podczas szczypania międzypalcowego. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Utrzymuj myszy w stabilnej temperaturze 37 °C podczas operacji i rekonwalescencji (20 min).
  2. Umieść mysz w brzusznej pozycji odleżynowej i wypiluj obszar o wymiarach 2,5 cm x 3 cm od okolicy szyjnej doogonowo za pomocą ostrzy chirurgicznych. Rozciągnij skórę, aby uniknąć skaleczeń. Wykonaj aseptykę i antyseptykę za pomocą kilku rund naprzemiennego płukania jodonem powidonu i sterylnej wody.
  3. Użyj sterylnego stempla do biopsji o średnicy 5 mm i uciskaj okrężnymi ruchami, aby wykonać nacięcie skórno-naskórkowe na poziomie łopatki. Zdejmij klapkę ząbkowanymi kleszczami i przetnij nożyczkami z końcówką tęczówki (Rysunek 2A).
  4. Jeśli w ranie znajdują się punkty krwawienia, osiągnij hemostazę za pomocą urządzenia do elektrokoagulacji.
  5. Umieść okrągły film skórny o średnicy 1 cm na ranie za pomocą kleszczyków jubilerskich, aby zapobiec zanieczyszczeniu i skurczom.
  6. Wszystkie operacje przetrwania należy wykonywać w sterylnych warunkach. Przygotować miejsce operacji środkami dezynfekującymi, takimi jak powidon-jod. Nosić sterylne rękawiczki i maskę oraz utrzymywać sterylność przez cały czas trwania zabiegu, używając sterylnych narzędzi i minimalizując kontakt z niesterylnymi powierzchniami.
    1. Po zabiegu należy umieścić myszy w oddzielnych klatkach w temperaturze 24 °C i monitorować je do momentu odzyskania normalnego sposobu poruszania się. Upewnij się, że temperatura ciała jest kontrolowana podczas i po operacji, aby zapobiec hipotermii przy użyciu zewnętrznych źródeł ciepła.
  7. Środek przeciwbólowy należy podawać przez rozpuszczenie ketorolaku (w postaci tabletek, 10 mg) w wodzie pitnej o stężeniu 0,025 mg/ml. Odpowiada to dziennej dawce 5 mg/kg mc. dla myszy o wadze 30 g spożywającej około 6 ml wody dziennie. Rozpocznij podawanie 48 godzin przed zabiegiem i kontynuuj do 4 dnia po zranieniu, aby zapewnić prewencyjną i trwałą analgezję26.
  8. Po zabiegu należy monitorować zwierzęta codziennie przez co najmniej pięć kolejnych dni. Oceń każdą mysz pod kątem oceny kondycji ciała, wyglądu sierści, behawioralnych objawów bólu lub niepokoju (np. zmniejszona aktywność, nieprawidłowa postawa) i stanu rany (np. obecność wydzieliny, zaczerwienienie, obrzęk lub oznaki infekcji). Zapisuj obserwacje w dzienniku opieki nad zwierzętami w instytucji. Kontynuuj regularne monitorowanie do 14 dnia, kiedy rany u zdrowych gryzoni zwykle osiągają zaawansowane stadium gojenia. Myszy należy poddać eutanazji przez wymianę O2 w komorze CO2 zgodnie z międzynarodowymi standardami. To oznacza punkt końcowy badania.

4. Akwizycja obrazów makroskopowych

  1. Rób zdjęcia ran codziennie przez 14 kolejnych dni, aby monitorować ciągłą kinetykę zamykania rany. Użyj półprofesjonalnego lub profesjonalnego aparatu; Umieść obiektyw przez okrągły otwór w dachu kabiny fotograficznej.
    UWAGA: Dostosuj harmonogram w razie potrzeby w oparciu o warunki eksperymentalne.
  2. Użyj świetlówki LED RGB w trybie skorelowanej temperatury barwowej (CCT), ustawionej na 9000 K i 100% jasności do oświetlenia.
  3. Umieść bazę referencyjną na środku podłogi kabiny fotograficznej.
  4. Umieść mysz w komorze do znieczulenia wziewnego na 3 minuty (Rysunek 2B).
  5. Po wywołaniu znieczulenia umieść mysz w pozycji leżącej na platformie myszy. Zabezpiecz pysk w masce anestezjologicznej sewofluranu, dostarczając 5% sewofluranu przy natężeniu przepływu tlenu 1,5 l/min (Rysunek 2C).
  6. Przed wykonaniem zdjęć usuń film skórny z rany za pomocą kleszczy Jeweller i wyrównaj podstawę referencyjną z obiektywem aparatu.
  7. Zamontuj przednią ścianę kabiny fotograficznej i rób zdjęcia makroskopowe z następującymi ustawieniami: przysłona f/3.2, czas naświetlania 1/200s, czułość ISO 80, ogniskowa 4mm.
  8. Za pomocą kleszczyków Jeweller umieść film skórny o średnicy 1 cm na ranie przed zdjęciem maski znieczulającej. Przenieś myszy do indywidualnych klatek i obserwuj, aż odzyskasz sprawność motoryczną.

5. Przetwarzanie obrazu

  1. Wygeneruj kopię zapasową obrazów makroskopowych. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ.
  2. Otwórz obraz kopii zapasowej w ImageJ, postępując zgodnie ze ścieżką: File > Open > Search in the images, a następnie kliknij Otwórz.
  3. Przeskaluj obraz przez odniesienie: Zmaksymalizuj obraz, wybierz narzędzie do linii prostej, powiększ linijkę obok myszy za pomocą +, narysuj linię prostą 10 mm na obrazie linijki, a następnie przejdź do Analizuj > Ustaw skalę > wprowadź " 10" dla znanej odległości > Ustaw jednostkę długości na mm, a następnie kliknij OK. Określa to stosunek pikseli do odległości dla obrazu makroskopowego (Rysunek 2D).
  4. Oddziel obszar rany od obrazu: Użyj narzędzia prostokąt, aby zaznaczyć obszar wokół rany (w = 150, h = 150). Zapisz wartości X i Y, kliknij prawym przyciskiem myszy prostokąt > Duplikuj > Nazwij temat > Naciśnij Enter. Na nowym obrazie naciśnij dwukrotnie +, aby powiększyć (Rysunek 2E).
  5. Zapisz przycięty obraz, postępując zgodnie ze ścieżką: Plik > Zapisz jako > Tiff > Wprowadź nazwę > Zapisz.
  6. Utwórz duplikat przyciętego obrazu, aby uniknąć modyfikacji podczas segmentacji: Kliknij prawym przyciskiem myszy przycięty obraz > Zduplikuj > Nazwij go, dodając "Segmentacja" na końcu. Następnie naciśnij Enter. Na nowym obrazie naciśnij dwukrotnie przycisk +, aby powiększyć.
  7. Rozdziel obraz na kanały kolorów, postępując zgodnie z następującą ścieżką: Typ obrazu > > Stos RGB. Na czerwonym obrazie kanału (1/3 czerwonego) kliknij prawym przyciskiem myszy Duplikuj i naciśnij OK w oknie Duplikuj.
  8. Podziel obraz kanału na segmenty na czerwono. Kliknij czerwony obraz kanału, Obraz > Dostosuj próg >. Następnie wybierz opcję Domyślne > Zastosuj (Rysunek 2F).
  9. Popraw obszar zainteresowania (ROI), aby zapewnić pełne pokrycie rany i uniknąć zniekształceń segmentacji.
    UWAGA: Jeśli obszary wokół rany nie są objęte segmentacją, przejdź do opcji Process > Binary > Fill Holes. Aby usunąć czarne kropki na zewnątrz rany, przejdź do sekcji Process > Binary > Erode. Jeśli polecenie Erozja zmniejsza rozmiar rany, popraw go, używając opcji Process > Binary > Dilate.
  10. Zaznacz obwód ROI: Edytuj > zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie. Zwrot z inwestycji zostanie zaznaczony na żółto. Dodaj go do Menedżera ROI, postępując zgodnie z Edytuj > Wybór > Dodaj do menedżera (Rysunek 2G).
  11. Sprawdź poprawność segmentacji: Otwórz okno Menedżer zwrotu z inwestycji i wybierz zwrot z inwestycji do przejrzenia: Więcej > tłumaczenia. Wprowadź wartości X i Y zapisane w kroku 4 i naciśnij przycisk OK.
    1. Zmaksymalizuj oryginalny obraz, a następnie wybierz ROI w Menedżerze ROI. Dostosuj ROI za pomocą strzałek, aż zrówna się z raną (Rysunek 2H). Jeśli zwrot z inwestycji pasuje do rany, segmentacja zakończyła się sukcesem. W przeciwnym razie powtórz od kroku 2.
  12. Po potwierdzeniu segmentacji uzyskaj pomiary rany: Analizuj > Mierz. W tabeli wyników zostaną wyświetlone wartości powierzchni, obwodu i pozycji X/Y. Skopiuj te wartości do oprogramowania SPSS w celu dokumentacji i analizy statystycznej (Rysunek 2I).

Schemat procesu gojenia się ran myszy z dziurkaczem biopsyjnym i analizą RGB; Gromadzenie danych.
Rysunek 2: Przebieg pomiaru ran za pomocą cyfrowej planimetrii i technik segmentacji. (A) Nacięcie skórno-naskórkowe za pomocą sterylnego stempla do biopsji 5 mm. (B) Umieszczenie myszy w wziewnej komorze anestezjologicznej na 3 min. (C) Dokumentacja fotograficzna poprzez ustawienie znieczulonej myszy w kabinie fotograficznej i zabezpieczenie jej pyska w masce sewofluranu. (D) Otwarcie uzyskanego obrazu w ImageJ i przeskalowanie go za pomocą linijki jako odniesienia. (E) Ekstrakcja obszaru rany za pomocą narzędzia prostokątnego. (F) Rozdzielanie obrazu na kanały RGB i przetwarzanie kanału czerwonego. (G) Określenie obszaru zainteresowania (ROI) i zarządzanie nim. (H) Walidacja segmentacji poprzez dopasowanie zwrotu z inwestycji do rany. (I) Pomiar parametrów rany i zapisywanie wyników do analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Eutanazja pozabiegowa

UWAGA: Badanie kończy się po 14 dniach, kiedy to rany u zdrowych gryzoni zazwyczaj osiągają zaawansowane stadium gojenia. Na tym etapie myszy zostały humanitarnie poddane eutanazji zgodnie z ustaloną instytucjonalnie zatwierdzoną procedurą eutanazji.

  1. Przygotuj sprzęt. Upewnij się, że komora eutanazji jest czysta, sucha i odpowiedniej wielkości, aby pomieścić myszy bez przepełnienia. Podłączyć komorę do źródła CO2 klasy medycznej z regulatorem przepływu.
  2. Delikatnie przenieś myszy do komory, aby zminimalizować stres. Upewnij się, że znajdują się w spokojnym otoczeniu z minimalnymi zakłóceniami zewnętrznymi.
  3. Ustaw natężenie przepływu CO2 na 30%-70% objętości komory na minutę, zgodnie z zaleceniami wytycznych AVMA dotyczących eutanazji zwierząt. Stopniowo zwiększaj stężenie CO2, aby uniknąć wywoływania niepokoju lub dyskomfortu u myszy.
  4. Uważnie obserwuj myszy podczas zabiegu. Szukaj oznak stopniowej utraty przytomności, w tym zmniejszonej aktywności i oddychania, a następnie bezdechu i zatrzymania akcji serca.
  5. Potwierdź śmierć, gdy myszy przestaną oddychać i nie będą wykazywać żadnych oznak ruchu; odczekaj dodatkowe 1-2 minuty, aby zapewnić całkowite ustanie funkcji życiowych. Zweryfikuj zgon, potwierdzając brak odruchów (np. odruchu rogówkowego) i czynności serca.
  6. Przenieść tusze do wyznaczonych pojemników na biologiczne odpady niebezpieczne. Postępuj zgodnie z protokołami instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi bezpiecznego usuwania szczątków zwierzęcych.
  7. Zapisuj liczbę zwierząt poddanych eutanazji, datę i wszelkie istotne obserwacje, aby zapewnić zgodność z normami etycznymi i instytucjonalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po przeskalowaniu obrazów w oprogramowaniu ImageJ, średni obwód (Tabela 1) i obszar (Tabela 2) ran, wraz z ich odpowiednimi odchyleniami standardowymi, zostały uzyskane poprzez cyfrową segmentację. Wartości te rejestrowano od dnia zerowego do dnia czternastego (D0-D14).

dzieńObwód (mm)
022,75 ± 0,8900

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W modelach przedklinicznych ilościowa analiza ewolucji ran pourazowych w modelach przedklinicznych napotyka wyzwania związane z takimi czynnikami, jak rozmiar rany, zlokalizowana reakcja zapalna34, lokalizacja i/lub manipulacja. Dla tych pomiarów istnieją bezpośrednie ręczne36 i pośrednie cyfrowe metody planimetryczne 11,16,37,38. W przeciwieństwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów związanego z tymi badaniami.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600) poprzez dotację za zapewnienie finansowania, oraz Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) za ich wsparcie. Dodatkowo, Rysunek 2 został przygotowany przy pomocy oprogramowania BioRender (2020), dostępnego pod adresem BioRender.com/p67z056.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dziurkacz do biopsji 5 mmMILTEX, USA33-35Do oznaczania krawędzi rany
Aluminium z rdzeniem polietylenowymAlucobond, USABright Silver 119Do budowy makroskopowego obiektywu do kabiny akwizycji obrazu
 Sony, JaponiaSEL2470ZAby ustawić ostrość obrazów do fotografowania
ElektrokoagulacjaBonart, USAART-E1Aby wyeliminować krwawiące punkty w ranie, jeśli są obecne.
Paski mocujące na rzep VELCRO
IBM SPSS Statistics Version 22IBM Corporation, USAhttps://www.ibm.com/analytics/spss-statisticsSłuży do analizy statystycznej pomiarów ran, w tym danych powierzchniowych i obwodowych.
ImageJ Version 1.53tNational Institutes of Health, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/Służy do przetwarzania obrazów makroskopowych, w tym skalowania, segmentacji i pomiaru parametrów rany.
KetorolacSIEGFRIED RHEIN, Meksyk493977Do leczenia bólu pooperacyjnego
Miltex Iris Scissors, 4-1 / 8" ZakrzywioneMILTEX, USAV95-306Aby przeciąć płat rany wygenerowany za pomocą stempla biopsyjnego
Świetlówka LEDRGB ANDOER, Chiny‎ B09F8RLMSYDo oświetlenia kabiny akwizycji obrazu makroskopowego
Półprofesjonalna kameraSony, Japonia  DSC-HX300Do robienia zdjęć
Kleszcze ząbkowaneMILTEX, USAV96-118Do przytrzymania klapki podczas cięcia
SevofluraneBaxter, USAAMX2L9117PRDo znieczulenia wziewnego
Pentobarbital soduAranda, Meksyk734.448.001.212Do znieczulenia dootrzewnowego
SolidWorks Version 2015Dassault Systè mes, Francja  https://www.solidworks.com/Służy do projektowania i tworzenia modeli 3D do budowy  akcesoriów do kabiny do dokumentacji fotograficznej.
Ostrza chirurgiczne HERGOM, MeksykH10Aby ogolić włosy w obszarze, w którym zostanie utworzona rana
Przezroczysty opatrunek samoprzylepny3M, USAF51CA07Aby zakryć ranę pourazową

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martinengo, L., et al. Prevalence of chronic wounds in the general population: systematic review and meta-analysis of observational studies. Ann Epidemiol. 29, 8-15 (2019).
  2. Chen, X., Shi, X., Xiao, H., Xiao, D., Xu, X. Research hotspot and trend of chronic wounds: A bibliometric analysis from 2013 to 2022. Wound Repair Regen. 31 (5), 597-612 (2013).
  3. Gould, L., Li, W. W. Defining complete wound closure: Closing the gap in clinical trials and practice. Wound Repair Regen. 27 (3), 201-224 (2019).
  4. Baron, J. M., Glatz, M., Proksch, E. Optimal support of wound healing: New insights. Dermatology. 236 (6), 593-600 (2020).
  5. Tiwari, R., Pathak, K. Local drug delivery strategies towards wound healing. Pharmaceutics. 15 (2), 634(2023).
  6. Gupta, B., Agarwal, R., Alam, M. S. Hydrogels for wound healing applications. Biomed Hydrogels. , 184-227 (2011).
  7. Pastar, I., et al. Pre-clinical models for wound-healing studies. Skin Tissue Models Regen Med. , 223-253 (2018).
  8. Shen, Z., Zhang, C., Wang, T., Xu, J. Advances in functional hydrogel wound dressings: A Review. Polymers (Basel). 15 (9), 2000(2000).
  9. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 1-8 (2011).
  10. Peterson, N., Stevenson, H., Sahni, V. Size matters: How accurate is clinical estimation of traumatic wound size. Injury. 45 (1), 232-236 (2014).
  11. Öien, R. F., Håkansson, A., Hansen, B. U., Bjellerup, M. Measuring the size of ulcers by planimetry: a useful method in the clinical setting. J Wound Care. 11 (5), 165-168 (2002).
  12. Rogers, L. C., Bevilacqua, N. J., Armstrong, D. G., Andros, G. Digital planimetry results in more accurate wound measurements: a comparison to standard ruler measurements. J Diabetes Sci Technol. 4 (4), 799-802 (2010).
  13. Shamata, A., Thompson, T. Documentation and analysis of traumatic injuries in clinical forensic medicine involving structured light three-dimensional surface scanning versus photography. J Forensic Leg Med. 58, 93-100 (2018).
  14. Foltynski, P., Ladyzynski, P., Ciechanowska, A., Migalska-Musial, K., Judzewicz, G., Sabalinska, S. Wound area measurement with digital planimetry: Improved accuracy and precision with calibration based on 2 rulers. PLoS One. 10 (8), e0134622(2015).
  15. Frank, S., Kämpfer, H. Excisional wound healing. Wound Healing: Methods Protoc. , 3-15 (2003).
  16. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
  17. Barakat, M., DiPietro, L. A., Chen, L. Limited Treatment options for diabetic wounds: Barriers to clinical translation despite therapeutic success in murine models. Adv Wound Care (New Rochelle). 10 (8), 436-460 (2021).
  18. Goh, C. C., et al. Inducing ischemia-reperfusion injury in the mouse ear skin for intravital multiphoton imaging of immune responses. J Vis Exp. (118), e54956(2016).
  19. Wang, Y., et al. Autologous fat grafting promotes macrophage infiltration to increase secretion of growth factors and revascularization, thereby treating diabetic rat skin defect. Diabetes, Metab Syndr Obes: Targets and Therapy. 13, 4897-4908 (2020).
  20. Notodihardjo, S. C., et al. A comparison of the wound healing process after the application of three dermal substitutes with or without basic fibroblast growth factor impregnation in diabetic mice. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 73 (8), 1547-1555 (2020).
  21. Thawer, H. A., Houghton, P. E., Woodbury, M. G., Keast, D., Campbell, K. A comparison of computer-assisted and manual wound size measurement. Ostomy Wound Manage. 48 (10), 46-53 (2002).
  22. Huang, C. X., et al. Comparison of digital and traditional skin wound closure assessment methods in mice. Lab Anim Res. 39 (1), 25(2023).
  23. Subramaniam, S. R., et al. 3D printing: Overview of PLA progress. AIP Conf Proc. , 020015(2019).
  24. Oleksy, M., Dynarowicz, K., Aebisher, D. Rapid prototyping technologies: 3D printing applied in medicine. Pharmaceutics. 15 (8), 2169(2023).
  25. Césarovic, N., Nicholls, F., Rettich, A., Kronenberg, S., Häussler, A. K., Boillat, C. S., Spahn, D. R., Arras, M. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Anim. 44 (4), 329-336 (2010).
  26. Domer, F., et al. Characterization of the analgesic activity of ketorolac in mice. Eur. J. Pharmacol. 177, 127-135 (2016).
  27. Cukjati, D., Reberšek, S., Miklavčič, D. A reliable method of determining wound healing rate. Med Biol Eng Comput. 39 (2), 263-271 (2001).
  28. Payne, W. G., Bhalla, R., Hill, D. P., Pierpont, Y. N., Robson, M. C. Wound healing trajectories to determine pressure ulcer treatment efficacy. Wound Repair Regen. 11, e1(2011).
  29. Cardinal, M., Eisenbud, D. E., Phillips, T., Harding, K. Early healing rates and wound area measurements are reliable predictors of later complete wound closure. Wound Repair Regen. 16 (1), 19-22 (2008).
  30. Tallman, P. Initial rate of healing predicts complete healing of venous ulcers. Arch Dermatol. 133 (10), 1231(1997).
  31. Hopkins, N. F. G., Jamieson, C. W. Antibiotic concentration in the exudate of venous ulcers: The prediction of ulcer healing rate. Br J Surg. 70 (9), 532-534 (2005).
  32. Robson, M. C. Wound healing trajectories as predictors of effectiveness of therapeutic agents. Arch Surg. 135 (7), 773(2000).
  33. Jessup, R. L. What is the best method for assessing the rate of wound healing? A comparison of 3 mathematical formulas. Wounds. 19 (3), 138-147 (2006).
  34. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: A critical step during wound healing. Cell Mol Life Sci. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  35. Szpaderska, A. M., DiPietro, L. A. Inflammation in surgical wound healing: Friend or foe. Surgery. 137 (5), 571-573 (2005).
  36. Hamed, E., Al Balah, O. F. A., Refaat, M., Badr, A. M., Afifi, A. Photodynamic therapy mediated by methylene blue-loaded PEG accelerates skin mouse wound healing: An immune response. Lasers in Med Sci. 39 (1), 141(2024).
  37. Ibraheem, W. I., et al. Comparison of digital planimetry and ruler methods for the measurement of extraction socket wounds. Medicina (Kaunas). 59 (1), 135(2023).
  38. Mayrovitz, H. N., Soontupe, L. B. Wound areas by computerized planimetry of digital images: accuracy and reliability. Wounds. 22 (5), 222-229 (2009).
  39. Galiano, R. D., Michaels, J., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-495 (2004).
  40. Price, A., Grey, J. E., Patel, G. K., Cbe, K. G. H. ABC of wound healing. , John Wiley & Sons, ISBN. 0470658975(2022).
  41. Eming, S. A., Krieg, T., Davidson, J. M. Inflammation in wound repair: Molecular and cellular mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (3), 514-525 (2007).
  42. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  43. López, N., Cervero, S., Jiménez, M. J., Sanchez, J. F. Cellular characterization of wound exudate as a predictor of wound healing phases. Wounds. 26 (4), 101-107 (2014).
  44. Liu, N. T., et al. Quantifying the effects of wound healing risk and potential on clinical measurements and outcomes of severely burned patients: A data-driven approach. Burns. 46 (2), 303-313 (2020).
  45. Han, C., Barakat, M., DiPietro, L. A. Angiogenesis in wound repair: Too much of a good thing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 14 (10), a041225(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model rany u myszypomiar ranysegmentacja w programie ImageJkabina do dokumentacji fotograficznejanaliza powierzchni ranyprzedkliniczne gojenie ranpomiar wspomagany komputerowoobw d rany

Powiązane artykuły