Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67479

⸱

7 lutego 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Streszczenie

Techniki znakowania metabolicznego pozwalają na włączenie bioortogonalnych reporterów do glikanów, umożliwiając ukierunkowaną biokoniugację barwników molekularnych w komórkach poprzez kliknięcie i chemię bioortogonalną. Metaboliczna inżynieria oligosacharydowa (MOE) cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na istotną rolę glikozylacji w wielu procesach biologicznych, które obejmują rozpoznawanie molekularne, oraz jej wpływ na patologie, od raka, przez zaburzenia genetyczne, po infekcje wirusowe i bakteryjne.

Chociaż MOE jest bardziej znany z wykrywania glikokoniugatów na powierzchni komórek, jest również bardzo ważną metodologią do badania wewnątrzkomórkowych glikanów w kontekstach fizjologicznych i patologicznych. Takie badania bardzo korzystnie korzystają z wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Jednak mikroskopia superrozdzielcza nie jest łatwo dostępna w większości laboratoriów i stanowi wyzwanie dla codziennego wdrażania. Mikroskopia ekspansywacyjna jest najnowszą alternatywą, która zwiększa rozdzielczość mikroskopii poprzez fizyczne powiększanie próbek biologicznych znakowanych markerami fluorescencyjnymi. Poprzez zatopienie próbki w pęczniejącym żelu i spowodowanie jej izotropowej ekspansji poprzez obróbkę chemiczną, struktury subkomórkowe mogą być wizualizowane ze zwiększoną precyzją i rozdzielczością bez potrzeby stosowania technik superrozdzielczości.

W tej pracy ilustrujemy zdolność mikroskopii ekspansywnej do wizualizacji wewnątrzkomórkowych glikanów sjalowanych poprzez połączone użycie MOE i chemii kliknięć. W szczególności proponujemy procedurę bioortogonalnego znakowania i mikroskopii ekspansyjnej, która wykorzystuje reporter ukierunkowany na sialilację, co może być związane z immunofluorescencją w badaniach kolokalizacyjnych. Protokół ten umożliwia badania lokalizacyjne biosyntezy koniugatu sjalokonatycznego, transportu wewnątrzkomórkowego i recyklingu.

Wprowadzenie

Mikroskopia fluorescencyjna, choć jest powszechnie stosowana do znakowania i wizualizacji specyficznych cząsteczek wewnątrz komórek, jest z natury ograniczona w rozdzielczości przez limit dyfrakcyjny Abbe1, który ogranicza możliwość rozróżnienia obiektów oddalonych od siebie o mniej niż około 200-250 nm. Ograniczenie to wynika z falowej natury światła oraz apertury numerycznej obiektywu mikroskopu, co stanowi wyzwanie podczas obrazowania struktur podkomórkowych. Przełamanie tych ograniczeń pozwala na lepsze zrozumienie określonych procesów biologicznych w skali nanometrycznej.

Aby przekroczyć limit dyfrakcyjny światła, opracowano techniki mikroskopii super-rozdzielczej, takie jak STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) oraz STED (Stimulated Emission Depletion)2,3. Metoda STORM opiera się na stochastycznej aktywacji fluoroforów, co pozwala na obrazowanie jedynie rzadkiego podzbioru z nich w danym czasie. Umożliwia to precyzyjną lokalizację poszczególnych fluoroforów, co pozwala na rekonstrukcję obrazu o wysokiej rozdzielczości. Z kolei metoda STED poprawia rozdzielczość poprzez zastosowanie lasera wygaszającego, który selektywnie tłumi fluorescencję na obrzeżach plamki wzbudzenia, skutecznie zwężając funkcję rozproszenia punktu.

Podejścia te kontrastują z mikroskopią szerokopolową lub konfokalną, w której wszystkie fluorofory są wykrywane jednocześnie, co skutkuje obrazem łączącym wszystkie wzory dyfrakcyjne i uniemożliwia rozróżnienie blisko położonych pojedynczych fluoroforów, prowadząc do utraty rozdzielczości. Jednak metody superrozdzielcze wymagają bardzo specyficznych źródeł światła, sprzętu, przygotowania próbek i/lub fluoroforów, co sprawia, że technologie te są kosztowne, trudno dostępne w większości laboratoriów i wymagające w implementacji w rutynowych eksperymentach. Ograniczenia te skłoniły społeczność naukową do poszukiwania alternatywnych rozwiązań pozwalających na osiągnięcie wyższej rozdzielczości, które byłyby kompatybilne z powszechnie dostępnym sprzętem mikroskopowym i rutynowymi protokołami barwienia. W 2015 roku Boyden i współpracownicy opracowali metodę obejścia ograniczeń mikroskopii optycznej poprzez fizyczne powiększenie próbki, nazwaną mikroskopią ekspansyjną (Expansion Microscopy, ExM)4.

ExM to trzystopniowa metoda, która pozwala na uzyskanie szczegółów próbek biologicznych w skali nanometrycznej bez przekraczania granicy dyfrakcyjnej światła (Rysunek 1). Zamiast tego wykorzystuje ona konwencjonalne mikroskopy ograniczone dyfrakcją do obrazowania próbek, które zostały fizycznie powiększone w sposób izotropowy. Pierwszy krok, nazywany żelowaniem, polega na zatopieniu próbki biologicznej, zazwyczaj utrwalonych komórek lub tkanek, w pęczniejącym polielektrolitowym hydrożelu na bazie akrylanu sodu i akryloamidu. Następnie próbka biologiczna poddawana jest działaniu enzymów w celu częściowej degradacji niektórych składników, takich jak białka lub membrany, oraz rozbicia gęstych struktur komórkowych, aby zapewnić równomierne rozszerzanie się komórek. Krok ten, nazywany trawieniem, pomaga osiągnąć ten cel poprzez homogenizację komponentów strukturalnych próbki pod względem właściwości mechanicznych, co zapobiega różnicowemu rozszerzaniu, które mogłoby prowadzić do zniekształcenia próbki. W ostatnim kroku, zwanym ekspansją, zatopiona w hydrożelu i poddana trawieniu próbka jest umieszczana w wodzie dejonizowanej, co powoduje jej pęcznienie. Dzięki tej technologii próbka powiększa się o liniowy współczynnik powiększenia wynoszący około 4-5x w każdym wymiarze, co umożliwia wizualizację drobnych szczegółów komórkowych przy użyciu standardowych technik mikroskopowych. Ze względu na izotropowy charakter ekspansji, próbka biologiczna powiększona wewnątrz macierzy żelowej zachowuje swoje trójwymiarowe szczegóły geometryczne oraz relacje przestrzenne między różnymi komponentami strukturalnymi. Informacje przestrzenne są zatem zachowane podczas pęcznienia, podczas gdy odległość między zakotwiczonymi w żelu znacznikami fluorescencyjnymi lub biomolekułami zwiększa się równomiernie we wszystkich kierunkach. Pozwala to na lepszą separację sygnałów, co skutkuje zwiększoną rozdzielczością.

Schemat mikroskopii ekspansyjnej: żelowanie, trawienie, ekspansja; matryca polimerowa, wizualizacja biomolekuł.
Rycina 1: Przegląd protokołu ExM. (a) Żelowanie: Próbka biologiczna zostaje zakotwiczona i zatopiona w pęczniejącym hydrożelu polielektrolitowym. (b) Trawienie: Właściwości mechaniczne próbki zostają ujednolicone przy użyciu enzymów i detergentów, co prowadzi do rozkładu białek i błon lipidowych, które w przeciwnym razie ograniczałyby ekspansję i powodowały zniekształcenia. (c) Ekspansja: Hydrożel zostaje zanurzony w wodzie dejonizowanej, co powoduje jego izotropową ekspansję. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Od 2015 roku w metodzie ExM wprowadzono znaczące ulepszenia technologiczne w zakresie zachowania informacji przestrzennych. W szczególności zaprojektowano różne kotwice molekularne, które pozwalają na kowalencyjne przytwierdzenie biomolekuł bezpośrednio do pęczniejącego hydrożelu5,6. W niniejszym protokole zastosowano N-akryloylosukcynimid (NAS), który reaguje z wolnymi grupami aminowymi biomolekuł (zazwyczaj resztami lizyny lub pozycjami N-końcowymi białek), aby biokoniugować grupę akryloylową do białek komórkowych, w tym glikoprotein. Grupa akryloylowa ta reaguje następnie z innymi monomerami poprzez reakcje sieciowania podczas żelowania, kotwicząc te biomolekuły bezpośrednio w polimerze.

ExM jest kompatybilna z szeroką gamą metod znakowania, w tym z metaboliczną inżynierią oligosacharydów (MOE). MOE to potężne narzędzie umożliwiające znakowanie glikanów poprzez włączanie analogów prekursorów metabolicznych wyposażonych w bioortogonalny uchwyt chemiczny7. Analogi te, znane jako reportery chemiczne, wbudowują się w szlaki metaboliczne, nie wywołując toksyczności. W podejściu MOE monosacharydy reporterowe są przetwarzane metabolicznie w aktywowane cukry nukleotydowe, a następnie przenoszone na powstające glikokonjugaty. Naszym głównym celem jest badanie sjalilacji, w szczególności wewnątrzkomórkowej dynamiki i transportu sjalilowanych N-glikoprotein, co jest kluczowe w kontekście zdrowia i chorób ze względu na ich rolę w interakcjach międzykomórkowych, regulacji odporności oraz rozwoju. Nieprawidłowa sjalilacja jest zaangażowana w choroby takie jak nowotwory8,9,10,11, choroby zakaźne12 oraz zaburzenia genetyczne13,14,15, co czyni ją kluczowym celem dla rozwoju terapii i odkrywania biomarkerów. Zrozumienie sjalilacji pogłębia wiedzę na temat glikobiologii i mechanizmów chorobowych.

Sjalilację można badać za pomocą MOE, wykorzystując analogi kwasu N-acetylneuraminowego (Neu5Ac), najliczniejszego kwasu sjalowego u ludzi, lub analogi N-acetylmannozaminy (ManNAc), metabolicznego prekursora Neu5Ac, posiadające uchwyt bioortogonalny8,16. ManNAc jest przekształcany w Neu5Ac w cytozolu, a następnie aktywowany do cytydyno-5′-monofosfo-N-kwasu neuraminowego (CMP-Neu5Ac) w jądrze komórkowym. Po aktywacji do cukru nukleotydowego, sjalilotransferazy w aparacie Golgiego przenoszą jednostki Neu5Ac na pozycje terminalne rosnących łańcuchów glikanów (Rysunek 2). Po metabolicznej inkorporacji nienaturalnych pochodnych ManNAc, znakowane sjalilowane glikany mogą zostać kowalencyjnie połączone z fluorophorem posiadającym grupę reaktywną komplementarną do uchwytu reporterowego za pomocą bioortogonalnej chemii klik. Umożliwia to bezpośrednią obserwację glikokonjugatów in vivo lub ex vivo.

W przypadku większości reporterów monosacharydowych, do przenikania przez błonę plazmatyczną drogą dyfuzji biernej wymagana jest forma peracetylowana. Wykazano jednak, że zarówno reportery peracetylowane, jak i niechronione, skutecznie badają sialylację16. Niechronione reportery sialylacji są w stanie wnikać do komórek poprzez mechanizmy transportu aktywnego, a mianowicie pinocytozę w przypadku analogów Neu5Ac oraz za pomocą nieznanego jeszcze transportera dla ManNAc. Choć cukry niechronione wymagają wyższego stężenia (zazwyczaj 100-500 µM), aby osiągnąć porównywalne efekty, po dostaniu się do wnętrza komórki mogą one bezpośrednio wejść na szlak metaboliczny kwasu sialowego. Z kolei cukry peracetylowane muszą zostać całkowicie deacetylowane przez wewnątrzkomórkowe nieswoiste esterazy, zanim staną się metabolicznie aktywne. Mimo że można je stosować w niższych stężeniach (zazwyczaj 10-50 µM), niepełna deacetylacja może zakłócać aktywność enzymów lub prowadzić do wbudowania częściowo acetylowanych analogów kwasu sialowego, co potencjalnie może zafałszować analizę końcową. Dodatkowo uwalnianie kwasu octowego może lokalnie wpływać na pH, co potencjalnie oddziałuje na funkcje komórkowe. Chen i współpracownicy wykazali również, że cukry per-O-acetylowane reagują z wolnymi resztami cysteiny w białkach poprzez mechanizm nieenzymatyczny, co prowadzi do nieswoistego wbudowania i zwiększenia sygnału tła17,18. W niniejszym protokole stosujemy zatem niechronione reportery ManNAc.

Schemat szlaku metabolicznego; biosynteza glikanów, reakcja CuAAC, aparat Golgiego, szlak wydzielniczy, komórka.
Rysunek 2Metaboliczna inżynieria oligosacharydów i znakowanie kwasów sialowych. UDP-GlcNAc jest przekształcany w ManNAc przez domenę 2-epimerazy UDP-GlcNAc białka GNE/MNK w cytozolu. Następnie ManNAc jest fosforylowany w cytozolu przez domenę 6-kinazy ManNAc białka GNE/MNK, w wyniku czego powstaje ManNAc-6-fosforan. N-Syntaza acetylneuraminianu katalizuje kondensację ManNAc-6-P z fosfoenolopirogronianem w celu otrzymania Neu5Ac-9-fosforanu, który jest następnie defosforylowany przez fosfatazę kwasu sialowego, prowadząc do powstania Neu5Ac. Neu5Ac może być również dostarczany poprzez szlak odzyskiwania w procesie endocytozy i recyklingu lizosomalnego.8Po transporcie do jądra komórkowego jest ono przekształcane w CMP-Neu5Ac przez syntetazę kwasu sjalowego CMP. W aparacie Golgiego CMP-NeuAc stanowi substrat dla sjalilotransferaz, które wprowadzają resztę Neu5Ac w pozycjach końcowych glikanów w dojrzewających glikokonjugatach, które ostatecznie są ekspresjonowane w błonie komórkowej lub wydzielane. Chemiczne reportery ManNAz posiadające uchwyt bioortogonalny mogą przenikać do komórki poprzez nieoznaczony transporter aktywny i wchodzić w szlak metaboliczny. Znakowane jednostki Neu5Az włączone w glikany po biosyntezie są następnie znakowane poprzez konjugację sondy fluorescencyjnej za pośrednictwem reakcji CuAAC. Skróty: NAc = N-acetylowy; UDP-GlcNAc = urydynodifosforan N-acetyloglukozamina; ManNAc = N-acetylmannozamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimeraza; MNK = ManNAc 6-kinaza; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosforan; NANS = N-syntaza acetylneuraminianu; PEP = fosfoenolopirogronian; Neu5Ac = N-kwas N-acetylneuraminowy; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosforan; NANP = fosfataza kwasu sialowego; CMP = cytydyna-5′-monofosforan; CMAS = syntetaza CMP-kwasu sialowego; STs = sialylotransferazy; ManNAz = N-azydoacetylmannozamina; Neu5Az = kwas N-azydoacetyloneuraminowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Spośród możliwych reakcji bioortogonalnych skupiliśmy naszą uwagę na miedziowo katalizowanej cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC)16,19. Z naszego doświadczenia wynika, że CuAAC jest najlepszą opcją do znakowania glikanów wewnątrzkomórkowych w utrwalonych komórkach. Reakcja ta jest dobrze ugruntowana, gruntownie zbadana w chemii bioortogonalnej i została zestandaryzowana do stosowania w złożonych środowiskach biologicznych, co zapewnia solidną podstawę wiedzy oraz zoptymalizowane protokoły. Jej szybka kinetyka zapewnia wysoką wydajność i specyficzność reakcji; wykorzystuje ona grupy azydowe i alkinowe, które są łatwe w syntezie, stabilne, nie występują w układach żywych i są obojętne wobec rodzimych biomolekuł, co czyni ją idealną do zastosowań w utrwalonych komórkach, gdzie toksyczność miedzi nie stanowi problemu. Cykloaddycja alkinowo-azydkowa sterowana naprężeniem pierścienia (SPAAC)20,21, choć pozwala uniknąć toksyczności miedzi, charakteryzuje się wolniejszą kinetyką i bardziej rozbudowanymi sondami, co w zastosowaniach wewnątrzkomórkowych ma tendencję do prowadzenia do wyższego sygnału tła i zmniejszonego stosunku sygnału do szumu z powodu pułapkowania hydrofobowego. Z kolei reakcja Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronowym (IEDDA)22,23, mimo że jest szybka i nie wymaga miedzi, wiąże się z bardziej złożoną syntezą sond i wymaga większych grup raportujących, które nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane w zastosowaniach MOE. Ponieważ ExM wymaga wyłącznie utrwalonych komórek, CuAAC oferuje niezawodne i wydajne rozwiązanie do znakowania bioortogonalnego.

Niniejsza praca przedstawia protokół wizualizacji wewnątrzkomórkowych glikoprotein sialilowanych w komórkach, łączący znakowanie metaboliczne, bioortogonalną chemię klik oraz mikroskopię ekspansyjną. W opisanych w pracy procedurach eksperymentalnych wykorzystano N-azyd acetylmannozaminę (ManNAz) jako reporter chemiczny, a ligację małych organicznych fluoroforów metodą CuAAC przeprowadzono przed procedurą ekspansji. Glikoproteiny są kotwiczone do hydrożelu za pomocą NAS przed żelacją, trawieniem i ekspansją. Znakowanie kwasów sialowych metodą MOE może być powiązane z podejściem immunofluorescencyjnym w celu oceny kolokalizacji, co zilustrowano tutaj za pomocą mysiego przeciwciała pierwszorzędowego anty-GM130 zlokalizowanego w aparacie Golgiego w części cis. Protokół ten można stosować do komórek w stanie fizjologicznym lub do komórek poddanych działaniu czynników chemicznych. W tym celu wykorzystano chlorochinę do zahamowania funkcji lizosomalnych, co wpływa na procesy przetwarzania i transportu glikoprotein wewnątrz komórek. Barwienie jąder komórkowych służy jako punkt odniesienia, nie tylko do lokalizacji komórek, ale także jako wskaźnik jakości procesu ExM. Współczynnik ekspansji można w rzeczywistości zmierzyć, porównując wielkość jądra przed ekspansją (preExM) i po ekspansji (postExM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiew komórek

UWAGA: Kolejne kroki należy przeprowadzić w warunkach sterylnych pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Metodę tę można zastosować do dowolnej z linii komórkowych wykorzystanych w niniejszej pracy (HeLa, MCF7, pierwotne fibroblasty) lub do większości modeli linii komórek adherentnych powszechnie stosowanych w badaniach20,24,25.

  1. Hodywnie komórki w medium DMEM z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionym o 10% płatkowej surowicy bydlęcej (FBS), w kolbie T75 w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  2. Po osiągnięciu pełnej konfluencji usunąć medium hodowlane i przemyć komórki 4 mL PBS.
    UWAGA: Roztwory PBS stosowane w tym kroku oraz we wszystkich kolejnych krokach płukania muszą zostać wysterylizowane poprzez filtrację przez membranę PTFE 0,2 µm przed użyciem.
  3. Inkubować komórki przez 5 min w temperaturze 37 °C w 2 mL 1x roztworu trypsyny-EDTA zawierającego 0,5 g/L trypsyny, aby odczepić je od dna kolby.
  4. Dodać 8 mL medium DMEM z wysoką zawartością glukozy zawierającego 10% FBS i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że każda pojedyncza komórka została odczepiona od dna kolby.
  5. Przenieść komórki do probówki stożkowej 15 mL i odwirować przez 5 min przy 200 × g. W międzyczasie do każdego dołka płytki 12-dołkowej włożyć jedno szkiełko nakrywkowe (średnica 12 mm, grubość 130-160 µm).
    UWAGA: Grubość szkiełka nakrywkowego powinna być dostosowana do wymagań mikroskopu używanego w kolejnych etapach obrazowania.
  6. Usunąć nadsącz po wirowaniu i resuspender osad w 1 mL medium hodowlanego.
  7. Wyznaczyć średnią liczbę komórek/mL za pomocą hemocytometru na podstawie co najmniej dwóch pomiarów.
  8. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do stężenia 300 000 komórek na mL w medium hodowlanym i nanieść 1 mL zawiesiny do każdego dołka.
  9. Pozostawić komórki do osiadania przez 24 h w medium DMEM z wysoką zawartością glukozy zawierającym 10% FBS w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przed przejściem do kolejnych etapów.

2. Leczenie chlorochiną (opcjonalnie)

UWAGA: Kroki 2.1-2.8 ilustrują sposób zastosowania protokołu w przypadku komórek traktowanych zewnętrznym odczynnikiem (inhibitorem, efektorem, lekiem), na przykładzie chlorochiny. Pomiń te kroki w przypadku komórek nietraktowanych zewnętrznymi odczynnikami.

  1. Odważyć odpowiednią ilość soli difosforanu chlorochiny (CQ), aby przygotować wystarczającą objętość 10 mM roztworu zapasowego.
    UWAGA: Kolejne kroki należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Rozpuścić stałą CQ w odpowiedniej ilości wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM.
  3. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 µm.
  4. Przenieść 1 mL 10 mM roztworu zapasowego do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przemyć próbkę komórek przygotowaną w kroku 1.9 za pomocą 1 mL PBS.
  6. Dodać 100 µL 10 mM CQ do 9,9 mL pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy zawierającej 10% FBS, aby uzyskać stężenie końcowe CQ wynoszące 100 µM.
  7. Inkubować komórki przez 8 h w 1 mL pożywki uzupełnionej o 100 µM CQ w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  8. Przemyć komórki 3x za pomocą 1 mL PBS.

3. Metaboliczne projektowanie oligosacharydów

  1. Przygotować 5 mM roztwór zapasu ManNAz (lub ManNAc dla warunku kontrolnego negatywnego) w pożywce DMEM high glucose zawierającej 10% FBS.
    UWAGA: Objętość roztworu zapasu powinna być wystarczająca, aby każda studzienka mogła zostać potraktowana 1 mL roztworu analogu cukru. Kolejne kroki należy przeprowadzić w warunkach sterylnych pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 µm i przechowywać w alikwotach po 1 mL w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  3. Przygotować pożywkę uzupełnioną o 500 µM ManNAz lub ManNAc poprzez rozcieńczenie 1 mL alikwotu roztworu zapasu przygotowanego w kroku 3.2 w 9 mL pożywki DMEM high glucose zawierającej 10% FBS.
  4. Inkubować komórki przygotowane w kroku 1.9 (dla eksperymentów na komórkach niepoddanych działaniu leku) lub w kroku 2.8 (dla eksperymentów na komórkach traktowanych CQ) w 1 mL pożywki uzupełnionej o 500 µM ManNAz (lub 500 µM ManNAc dla grupy kontrolnej) przez 24 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .

4. Fixacja i permeabilizacja

UWAGA: Wszystkie te etapy należy przeprowadzać pod wyciągiem laboratoryjnym.

  1. Przemyć próbki 1 mL PBS.
  2. Utrwalić komórki na każdym szkiełku podstawnym, dodając 500 µL 5% paraformaldehydu. Pozostawić na 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyć 3x 1 mL PBS.
  4. Przygotować specjalną komorę wilgotnościową, używając wystarczająco dużego nieprzezroczystego pudełka (np. pudełka polistyrenowego) z pokrywką. Na dnie pudełka umieścić zwilżony kawałek papieru filtracyjnego, a na nim położyć warstwę parafilmu.
    UWAGA: Po zamknięciu komora wilgotnościowa powinna całkowicie chronić próbkę przed zewnętrznymi źródłami światła.
  5. Umieścić szkiełka podstawne na parafilmie, komórkami do góry.
    UWAGA: Należy wcześniej opisać parafilm nazwą lub numerem referencyjnym próbek.
  6. Przeprowadzić permeabilizację komórek, używając 200 µL 0,5% (v/v) Triton X-100 w PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć 3x 200 µL PBS.

5. Znakowanie fluorescencyjne

  1. Znakowanie CuAAC znakowanych glikanów sialilowanych
    UWAGA: Bufor do reakcji CuAAC musi zostać świeżo przygotowany przed użyciem, a odczynniki należy dodawać w określonej kolejności, przy czym ostatnim dodawanym składnikiem jest askorbinian sodu. W natlenionych roztworach wodnych jony Cu(I) powstałe w wyniku redukcji Cu(II) askorbinianem będą stopniowo utleniać się z powrotem do Cu(II), co prowadzi do spadku stężenia askorbinianu w czasie. Aby zapewnić powtarzalność wyników, bufor nie powinien być przechowywany dłużej niż kilka dni w temperaturze 4 °C i najlepiej należy go zużyć w dniu przygotowania.
    1. Aby oznakować modyfikowane azydą glikany sialylowane przygotowane w sekcji 3, należy przygotować bufor do reakcji CuAAC składający się z 5 µM alkini AlexaFluor 488 (AF488Alk), 150 µM CuSO4, 300 µM kwasu 2-(4-((bis((1-(tert-butyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo)amino)metylo)-1H-1,2,3-triazol-1-ylo)octowego (BTTAA), 0,1 M K2HPO4 oraz 2,5 mM askorbinianu sodu w wodzie dejonizowanej. Należy przygotować ilość roztworu wystarczającą do naniesienia 200 µL na każde szkiełko podstawowe.
    2. Nanieś 200 µL buforu CuAAC na każde szkiełko podstawowe, aby zainicjować reakcję. Upewnij się, że próbka jest jednorodnie pokryta kroplą, i pozostaw do reakcji na 45 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    3. Przemyj 3x 200 µL PBS, aby zatrzymać reakcję i usunąć nadmiar sondy oraz odczynników.
  2. Barwienie jąder komórkowych
    1. W celu znakowania jąder Hoechst 33342, rozcieńcz roztwór stokowy o stężeniu 10 mg/mL w stosunku 1:2000 w PBS.
      UWAGA: Jako równoważne barwniki przeciwjądrowe można zastosować 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), uzyskując ten sam efekt.
    2. Przykryj komórki 200 µL tego roztworu i inkubuj przez 5-10 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    3. Przemyj 3x 200 µL PBS.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Przygotuj bufor blokujący z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) zawierający 0,1 g żelatyny, 1 g BSA, 1 mL FBS i 49 mL PBS na 50 mL buforu.
    2. Inkubuj próbki przez 1 h w temperaturze 4 °C w 200 µL buforu blokującego BSA. Chroń próbkę przed światłem.
    3. W celu barwienia immunofluorescencyjnego aparatu Golgiego przy użyciu oczyszczonego przeciwciała przeciw-GM130 mysiego (rozpoznawany epitop: szczur GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), rozcieńcz przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:100 w przygotowanym buforze blokującym BSA.
      UWAGA: Ten etap można dostosować do barwienia immunofluorescencyjnego innych organelli, stosując odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe; w takim przypadku czynnik rozcieńczenia należy dostosować zgodnie z wytycznymi producenta.
    4. Dodaj 70 µL roztworu zawierającego przeciwciało do szkiełek podstawowych i inkubuj przez 1 h w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
    5. Przemyj 3x 200 µL PBS.
    6. Rozcieńcz fluorescencyjne przeciwciało wtórne (Alexa Fluor 546 przeciw-mysie IgG) w stosunku 1:600 w buforze blokującym BSA i nanieś 100 µL na każde szkiełko podstawowe.
    7. Inkubuj próbki przez 1 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    8. Przemyj 3x 200 µL PBS.
    9. Przenieś szkiełka podstawowe do płytki 6-dołkowej. Przechowuj próbki w 2 mL PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Zaleca się zawsze przygotowanie replikatu przeznaczonego wyłącznie do wizualizacji preExM jako referencji do porównania przed i po ekspansji oraz w celu upewnienia się, że wzór znakowania nie uległ zniekształceniu po ekspansji.

6. Obrazowanie próbek przed ekspansją

UWAGA: Następujące kroki zależą od użytego sprzętu do obrazowania biologicznego i mogą wymagać dostosowania do wymagań urządzenia. Należy przestrzegać zasad lokalnego laboratorium lub platformy obrazowania biologicznego. Kroki 6.1-6.13 opisane tutaj są wykonywane na konfokalnym mikroskopie skaningowym.

  1. Włącz mikroskop i upewnij się, że źródła światła (lasery) są rozgrzane. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazowania biologicznego.
  2. Wybierz długości fal wzbudzenia laserowego odpowiadające fluoroforom w celu utworzenia kanałów (np. 405 nm dla barwienia jąder komórkowych, 488 nm dla glikanów sjalilowanych znakowanych AF488Alk oraz 546 nm dla znakowania immunofluorescencyjnego). Aktywuj lasery w odpowiedni sposób.
  3. Umieść i zabezpiecz szkiełko nakrywkowe o średnicy 32 mm (130-170 µm grubość) w uchwycie dostosowanym do mikroskopu.
  4. Umieść próbkę przygotowaną w kroku 5.3.9 na szkiełku nakrywnym o średnicy 32 mm, stroną z komórkami skierowaną w dół. Dodaj kroplę wody dejonizowanej, aby zapobiec wysychaniu próbki.
  5. Należy wybrać odpowiedni obiektyw; w tym przypadku obiektyw imersyjny 63x z aperturą numeryczną 1,4 lub ekwiwalentny.
    UWAGA: Najwyższa apertura numeryczna zapewnia najlepszą rozdzielczość. Podczas korzystania z obiektywu immersyjnego należy pamiętać o dodaniu kropli olejku pomiędzy obiektyw a szkiełko nakrywką.
  6. Umieść uchwyt na stole mikroskopu powyżej obiektywu.
  7. Należy użyć trybu jasnego pola lub fluorescencji o niskiej intensywności lasera, aby zlokalizować obszar zainteresowania w próbce.
  8. Ustaw ostrość.
  9. Wizualizuj komórki w oprogramowaniu w fluorescencja w czasie rzeczywistym tryb. Ustaw intensywność lasera dla każdego kanału. Rozpocznij od niskiej mocy lasera, aby uniknąć fotoblaknięcia. Powoli zwiększaj moc lasera i dostosuj wzmocnienie (gain) oraz przesunięcie (offset) detektora, aby wzmocnić sygnał bez wprowadzania nadmiernego szumu, w stopniu umożliwiającym wyraźną wizualizację fluorescencji bez prześwietlenia.
    UWAGA: Parametry należy dostosować tak, aby zminimalizować szum tła oraz uniknąć nasycenia sygnału. Kluczowe jest zachowanie spójnych ustawień dla wszystkich próbek w serii eksperymentów, w tym dla kontroli negatywnych.
  10. Ustaw parametry obrazu, takie jak wielkość otworu przypływowego (np. 1 jednostka Airy’ego), prędkość skanowania (np. 8), stopień powiększenia (np. 1), zakres jasności wartości (np. 16 bitów) oraz liczba uśrednień (np.., 2), tryb (np. linia) oraz metoda (np. średnia) w zależności od potrzeb, aby uzyskać pożądaną obserwację.
    UWAGA: Wartości te zależą od systemu i próbki i powinny zostać zoptymalizowane przed akwizycją. Wielkość otworu blendy (pinhole) zależy od apertury numerycznej, powiększenia i długości fali: jego zmniejszenie może poprawić rozdzielczość kosztem stosunku sygnału do szumu. Zaleca się ustawienie dużej prędkości skanowania (odpowiadającej krótkiemu czasowi przebywania wiązki na pikselu), aby uniknąć fotobielenia.
  11. Przeprowadzić akwizycję i zapisać dane w żądanym formacie wraz z odpowiednimi metadanymi w celu późniejszego odniesienia.
  12. Po zakończeniu akwizycji umieścić próbkę z powrotem w płytce 6-dołkowej, dodając niewielką ilość wody dejonizowanej, aby ułatwić transfer za pomocą pęsety.
    UWAGA: Krok 6.12 wykonuje się tylko wtedy, gdy konieczna jest amplifikacja tej konkretnej próbki. W przeciwnym razie należy zutylizować próbkę i wykorzystać pozostałe powtórzenia w kolejnych krokach.

7. Protokół mikroskopii ekspansyjnej

UWAGA: Próbki są chronione przed światłem w maksymalnym możliwym stopniu, aby uniknąć fotoblaknięcia. Etapy kotwiczenia i żelowania są przeprowadzane pod dygestorium.

  1. Kotwiczenie
    1. Próbki inkubować z N-akryloilosuccinnimidem (NAS) o stężeniu 3,2 mg/mL w PBS na wytrząsarku mechanicznym przez 1 h w temperaturze pokojowej. Przygotować odpowiednią ilość roztworu, aby dodać 500 µL roztworu na każdą studnię (roztwór zapasowy: 16 mg/mL NAS w DMSO).
      UWAGA: NAS reaguje z resztami lizyny i końcami N-terminalnymi białek, szczepiąc grupę akryloilową, co umożliwia zakotwiczenie białek w hydrożelu w kolejnych etapach.
    2. Przemyć 3x 1 mL PBS.
  2. Żelowanie
    1. Przygotować roztwór monomeru o następującym składzie: do 50 mL 1x PBS (pH 7,4) dodać 5,843 g NaCl, 1,25 g akryloamidu, 0,075 g bis-akryloamidu oraz 4,313 g akrylanu sodu. Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby nanieść 70 µL na każde szkiełko nakrywki. Alikwoty 1 mL zamrozić co najmniej 24 h przed żelowaniem.
      OSTRZEŻENIE: Monomery są toksyczne; należy z nimi obchodzić się ostrożnie, stosując odpowiedni sprzęt ochronny i odważając je pod dygestorium.
    2. Na kawałku parafilmu umieścić kroplę 70 µL roztworu monomeru, a następnie dodać 1,4 µL 10% (v/v) N,N,N′,N′-tetrametylenediaminy (TMEDA), a następnie 1,4 µL 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), które należy wymieszać w kropli.
      UWAGA: Odczynniki sieciujące muszą być dodawane w tej konkretnej kolejności: najpierw TMEDA, potem APS.
    3. Szybko i ostrożnie położyć szkiełko nakrywki na roztworze stroną z komórkami do dołu.
    4. Pozostawić roztwór do polimeryzacji na 1 h w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnej.
  3. Trawienie
    1. Przygotować roztwór buforu do trawienia składający się z buforu 1x TAE, 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,8 M guanidyny HCl i 8 U/mL proteinazy K.
      UWAGA: Bufor do trawienia musi być świeżo przygotowany i preinkubowany przez 30 min w 37 °C przed użyciem.
    2. Dodać 1 mL buforu do trawienia do hydrożelu utworzonego w kroku 7.2. Trawienie przeprowadzać przez 3 h w 37 °C na wytrząsarce mechanicznej.
    3. Usunąć bufor do trawienia i delikatnie przemyć żel 3x 2 mL wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Hydrożel lekko zwiększy swoją objętość i oddzieli się od szkiełka nakrywki.
  4. Ekspansja
    1. Pozostawić hydrożel do ekspansji w 3 mL wody dejonizowanej przez 2 h. Wymieniać wodę co 30 min.

8. Obrazowanie próbek po ekspansji

  1. Umieścić szkiełko podstawowe o średnicy 32 mm (grubość 130-170 µm) i zabezpieczyć je w uchwycie.
  2. Wyciąć fragment hydrożelu i umieścić go na szkiełku, tak aby komórki znajdowały się na spodzie żelu.
    UWAGA: Wycięte fragmenty powinny być wystarczająco duże, aby zapewnić odpowiednią powierzchnię do obserwacji, ale nie zbyt duże, ponieważ mogłoby to utrudnić manipulację żelem i zwiększyć ryzyko jego uszkodzenia (zalecany rozmiar: 5 do 8 mm). Umieścić tyle fragmentów hydrożelu, aby pokryły całą powierzchnię szkiełka; pomoże to ustabilizować fragmenty w miejscu i zapobiegnie ich przesuwaniu się podczas obrazowania. W przypadku problemów z dryftem korzystne może okazać się uprzednie pokrycie szkiełek poli-D-lizyną6.
  3. Umieścić uchwyt na stoliku mikroskopu nad obiektywem.
  4. Przeprowadzić akwizycję obrazów przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z obiektywem imersyjnym olejowym, zgodnie z opisem w kroku 6.

9. Obliczanie współczynnika ekspansji (EF) w programie ImageJ

  1. Otwórz dane obrazowania w bezpłatnym programie ImageJ lub programie równoważnym.
  2. W przypadku pracy z obrazem wielokanałowym należy rozdzielić kanały i pracować wyłącznie na kanale jądra komórkowego, przechodząc do Wybierz obraz | Kolor | Rozdziel kanały.
  3. Aby zmierzyć średnica jądra komórkowegonależy zaznaczyć sygnał odpowiadający jądru komórkowemu poprzez ustalenie progu, klikając w Wybierz obraz | Dostosuj | Próg…Wybierz metodę w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. menu rozwijane, które najlepiej pasuje do obrazu (np.., Otsu), a następnie dostosować próg aż do momentu, gdy kształt jądra zostanie wyraźnie odcięty od tła.
    UWAGA: Ustawienie progu wymaga dostosowania dla każdego obrazu, ponieważ jedno ustawienie może nie być odpowiednie dla wszystkich obrazów lub każdej próbki.
  4. Ustaw pomiar w celu określenia Średnica Fereta poprzez kliknięcie w Wybierz Analiza | Ustaw pomiary…Z menu należy wybrać Średnica Fereta i dostosuj dziesiętny jeśli jest to konieczne.
  5. Aby rozpocząć analizę obrazu, kliknij w Wybierz Analyze | Analyze particles w celu ustalenia wielkości cząsteczek; dla jądro komórkowewybierz 5-nieskończoność µm² | Wyświetl wyniki | Dodaj do menedżera | Wyklucz na krawędziach & NałożenieRozpocząć analizę.
  6. Wraz z rozpoczęciem analizy pojawi się kilka okien. W oknie wyników (results) należy odnaleźć maksymalna średnica Fereta z każdego jądro komórkowe w kolumnie FeretSkopiuj surowe dane do arkusza kalkulacyjnego i oblicz przeciętna wielkość jądra komórkowego dla wstępnie namnożone i rozszerzony próbki
    UWAGA: Należy upewnić się, że obszary zainteresowania (ROI) odpowiadające każdemu jądru obejmują cały obwód jądra.
  7. Obliczyć współczynnik rozszerzenia (EF) w następujący sposób:
    EF = Wzór na rozszerzenie rozmiaru jądra; wykres stosunków; koncepcja z zakresu fizyki edukacyjnej; analiza ilościowa.
    UWAGA: Współczynnik EF określa stopień rozcieńczenia próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniżej przedstawiono zastosowanie protokołu do wizualizacji glikoprotein sjalilowanych w komórkach HeLa (Rysunek 3A) oraz komórkach MCF7 (Rysunek 3B), z pominięciem traktowania CQ (sekcja 2 protokołu) oraz barwienia współlokalizacji immunofluorescencyjnej (krok 5.3 protokołu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół znakowania CuAAC nie zawiera aminoguanidyny w buforze reakcyjnym. Ponieważ jest on nakierowany na wizualizację wewnątrzkomórkowych glikokonjugatów, przeprowadza się go na komórkach utrwalonych po etapie metabolicznej inkorporacji, aby uniknąć problemów związanych z cytotoksycznością i poprawić pobieranie układu katalitycznego. Stosowanie aminoguanidyny jest zazwyczaj zalecane przy znakowaniu powierzchni komórek żywych, aby zapobiec reakcjom bocznym między dehydroaskorbinianem a resztami argininy, histydyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy obiektom TisBio i platformie PLBS za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tej pracy. Prace te były wspierane przez granty CNRS i Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Chcielibyśmy podziękować dr François Foulquierowi, dr Zoé Durin, pani Dorothée Vicogne i pani Céline Schulz za inspirację do dyskusji i dostarczenie nam linii komórkowej Fibroblast 533T i podstawowego przeciwciała GM130.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(+) L-askorbinian soduSigma Aldrich11140
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCorning3513
AkrylamidSigma AldrichA8887
Ester N-hydroksysukcynimidu kwasu akrylowego Sigma AldrichA8060
Alexa Fluor 488 alkin Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 kozi anty-mysi IgGInvitrogenA11003
Nadsiarczan amonuSigma Aldrich9913
Bis-akrylamidSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
Probówka wirówkowa 2 mlEPPENDORF30120094
Sól difosforanu chlorochinySigma AldrichC6628
Probówka stożkowa 15 mlFalcon352097
szkiełka nakrywkowe 12 mm #1eprediaCB00120RA120MNZ0
szkiełka nakrywkowe 32 mm #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM o wysokim poziomie glukozy średni DutscherL0104-500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (PBS) DutscherL0615-500
Płodowa surowica bydlęcabiowestS1810-500
Fibroblast 533T-Pobrane od zdrowej osoby
FIJI ImageJ 2.9.0-
ŻelatynaBio-RAD170-6537
Guanidyna HClSigma Aldrich50950
Komórki HeLaATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-BBezwodna
mikroskopia konfokalna LSM 780 Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-acetylmannosamine (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azydoacetylomannosamina (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27Zeiss420782-9900-799 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinaza KSigma AldrichP2308z  Tritirachium album
oczyszczone mysie przeciwciało GM130BD Bioscience61082250 & mikro; g
Akrylan sodu Kolba Sigma Aldrich408220
T75Corning430641
TEMEDSigma AldrichT9281
tris Octan EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BlueDutscher702630
Trypsina-EDTA 1xDutscherL0930-100

Bibliografia

  1. De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
  2. Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
  3. Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
  5. Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
  6. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
  7. Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
  8. Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
  9. Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
  10. Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  14. Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
  16. Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
  17. Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
  18. Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
  19. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
  20. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  21. Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
  22. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
  23. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
  24. Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
  25. Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
  26. Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
  27. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
  28. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  29. Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
  30. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
  31. Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
  32. Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
  33. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  34. Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
  35. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

znakowanie metaboliczneznakowanie bioortogonalneglikany syjlowanewizualizacja glikan wmikroskopia immunofluorescencyjnabiosynteza sialokonjugat wrozdzielczo subkom rkowa
Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.