Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Podsumowanie

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Streszczenie

Naprawa chrząstki w przewlekłych chorobach stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby skutecznie zregenerować uszkodzone tkanki. Protokół ten zapewnia krok po kroku metodę różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Proces różnicowania jest starannie zorganizowany, aby promować zaangażowanie linii chondrogennej, zaczynając od iPSC hodowanych w określonych pożywkach, które sekwencyjnie prowadzą komórki przez krytyczne etapy różnicowania. Początkowo iPSC są ekspandowane w celu osiągnięcia optymalnej konfluencji przed indukcją w kierunku linii chondrogennej przy użyciu serii zdefiniowanych zmian pożywki. Do 10 dnia komórki są przenoszone do pożywki promującej chondrogenezę, która zwiększa tworzenie komórek podobnych do chondrocytów, wyrażających kluczowe markery dojrzałych chondrocytów. Dalsza agregacja w 96-dołkowych płytkach pokrytych agarozą prowadzi do powstania trójwymiarowych sferoid, które są następnie hodowane w niestandardowych mini-bioreaktorach zaprojektowanych do symulacji mikrośrodowiska, które sprzyja odkładaniu się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Umożliwiając skalowalną produkcję sferoid chondrocytów, które naśladują natywne cechy chrząstki, podejście to oferuje obiecujące, powtarzalne rozwiązanie do opracowywania komórkowych metod leczenia wad chrząstki, zapewniając szerokie zastosowanie w zastosowaniach klinicznych i badawczych w medycynie regeneracyjnej układu mięśniowo-szkieletowego.

Wprowadzenie

Rozpowszechnienie chorób stawów prowadzi do znacznych obciążeń ekonomicznych ze względu na rosnącą liczbę niepełnosprawnych pacjentów i koszty związane z ich opieką. Chrząstka szklista to bezczynna tkanka łączna o ograniczonym potencjale regeneracyjnym¹. Długotrwałe stosowanie niektórych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), glikokortykosteroidów oraz chemioterapii lub radioterapii może jeszcze bardziej zmniejszyć zdolność regeneracyjną chrząstki, prawie eliminując jej zdolność do gojenia². To sprawia, że uzyskanie autologicznych komórek chrząstki do terapii komórkowej jest trudne.

Technologia trójwymiarowej (3D) hodowli komórek, w tym chondrocytów, od dawna jest uznawana za rozwijający się obszar badań o dużym potencjale. Te struktury 3D są badane pod kątem zastosowań zarówno w podstawowych badaniach biologicznych, jak i medycynie regeneracyjnej. Sferoidy pochodzące z autologicznych chondrocytów są obiecujące terapeutycznie w leczeniu zwyrodnienia tkanki chrzęstnej, schorzenia, które obecnie cieszy się dużym zainteresowaniem na całym świecie³.

sferoidy pochodzące z chondrocytów różniących się od iPSC stanowią obiecującą alternatywę dla pierwotnych chondrocytów, oferując znaczące korzyści dla naprawy chrząstki. iPSC zapewniają prawie nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się i posiadają szeroki potencjał różnicowania, co pozwala na produkcję chondrocytów w ilościach wystarczających do zastosowań klinicznych bez inwazyjnych procedur pobierania komórek⁴. Co więcej, przejście z tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kultur chondrocytów do systemów hodowli 3D, takich jak chondrosfery, dodatkowo zwiększa żywotność i funkcjonalność tych komórek, tworząc bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko. Badania pokazują, że chondrocyty hodowane w sferoidach 3D lepiej utrzymują swój fenotyp, wykazując niższe wskaźniki odróżnicowania i wyższe poziomy ekspresji kluczowych markerów chrząstki szklistej II, takich jak kolagen typu II i agrekan⁵.

Pomimo potencjału chondrosfer pochodzących z iPSC, standardowe protokoły generowania wysokiej jakości chondrosfer pozostają ograniczone. Zmienność protokołów w różnych badaniach często prowadzi do niespójności w jakości chondrocytów i składzie macierzy zewnątrzkomórkowej, wpływając na ich skuteczność w zastosowaniu terapeutycznym⁶. W tym miejscu przedstawiono udoskonalony protokół, który standaryzuje wytwarzanie sferoid z chondrocytów pochodzących z iPSC przy użyciu niedrogich, niestandardowych mini-bioreaktorów. Faza hodowli w mini-bioreaktorze jest niezbędna, ponieważ zapewnia kontrolowane ustawienie o niskiej przyczepności, które optymalizuje dystrybucję składników odżywczych, dojrzewanie ECM i zagęszczenie sferoidalne⁷. Ta faza sprzyja silnej ekspresji niezbędnych markerów chondrocytów, w tym kolagenu typu II, agrekanu i SOX9, wraz z kompozycją ECM, która bardzo przypomina natywną chrząstkę. Regularna wymiana pożywek i staranna kontrola warunków środowiskowych - temperatury, CO₂ i prędkości obrotowej - dodatkowo zapewniają żywotność i dojrzewanie sferoid chondrocytów. Protokół ten został zoptymalizowany w celu stworzenia wysokiej jakości chondrosfer z silną ekspresją markerów chrząstki szklistej w opłacalny i skalowalny sposób, odpowiedni do zastosowań badawczych i klinicznych w naprawie chrząstki.

Protokół

Badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Komisję Etyki LOPUKHIN FRCC PCM (protokół nr 2019/02 z 9 kwietnia 2019 r.). Wszystkie próbki od dawców zostały pobrane zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników i/lub ich opiekunów prawnych.

UWAGA: Utrzymuj sterylną technikę przez cały czas trwania protokołu. Podgrzać wszystkie pożywki i roztwory hodowlane do temperatury 37 °C przed nałożeniem ich na komórki lub sferoidy. Hodować komórki w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ przy wilgotności 80%. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

Rysunek 1: Protokół produkcji chondrosfer z linii iPSC IPSRG4S. (A) Początkowo iPSC są hodowane w pluripotencjalnych pożywkach z komórek macierzystych, aż do osiągnięcia 80% zbieżności. (B) Aby wywołać różnicowanie w kierunku linii chondrocytowej, iPSC są następnie hodowane w pożywce A przez 2 dni. Pożywkę zastępuje się następnie preparatem pozbawionym Chir 99021 i inhibitora kinazy Rho, a komórki są hodowane przez dodatkowe 6 dni ze zmianami pożywki co 2 dni. (C) Komórki są następnie przenoszone na pożywkę B, aby promować chondrogenezę przez następne 10 dni. (D) Po osiągnięciu wystarczającej liczby komórek proces przechodzi do etapu produkcji sferoid. (E) Komórki są agregowane w sferoidy w warunkach niskiej przyczepności pod wpływem grawitacji. (F) Powstałe sferoidy są hodowane w mini-bioreaktorach z pożywką B. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przekształcenie szalek Petriego w mini-bioreaktory

UWAGA: Szczegóły w poprzednim artykule⁵.

1. Pokrój probówki wirówkowe na pierścienie o wysokości 7-8 mm za pomocą sterylnych nożyczek do autoklawu (ustawienia autoklawu: 121 °C (250 °F) przy 15 psi, 30 min i suszenie po autoklawie przez 20 min).
2. Zmiażdż szalki Petriego o niskiej przyczepności, niepoddane obróbce lub mikrobiologiczne na małe kawałki. Rozpuść około 1 g cząstek plastiku w 10 ml chloroformu przez noc, aby uzyskać płynny roztwór tworzywa sztucznego. Przeprowadź tę procedurę w dygestorium.
3. Sprawdź, czy płynny plastik jest wystarczająco lepki do pipetowania. Upewnij się, że kropelki zachowują kulisty kształt, a nie rozchodzą się po powierzchni. Jeśli roztwór jest zbyt rzadki, dodaj więcej cząstek plastiku, zwykle wymagających 1-3 g. Jeśli jest zbyt gęsty, dodaj dodatkowy chloroform, zwykle wymagając do 5 ml.
4. Uformuj plastikową gałkę na środku sterylnej szalki Petriego o bardzo niskiej przyczepności 60 mm, używając jednej z dwóch skutecznych metod opisanych poniżej.
   1. Opcja 1: Umieść autoklawowany plastikowy pierścień na środku szalki Petriego, a następnie nałóż płynny plastik do wnętrza pierścienia; jedna kropla będzie wymagała około 100-200 μl kropli płynnego plastiku.
   2. Opcja 2: Nałóż taką samą liczbę kropli płynnego plastiku bezpośrednio na środek szalki Petriego bez użycia plastikowego pierścienia.
5. Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia przez 2-3 godziny w okapie z przepływem laminarnym. Po wysuszeniu naczynia należy wystawić na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 20-30 min.

2. Traktowanie potraw kulturowych żelatyną

1. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, rozpuszczając sproszkowaną żelatynę w wodzie destylowanej o temperaturze 95 °C. Przepuścić roztwór kolejno przez filtry membranowe 0,45 μm i 0,25 μm, a następnie przechowywać filtrat w temperaturze 4 °C.
2. Bezpośrednio przed ponownym wysiewem chondrocytów nanieść 3 ml roztworu żelatyny do kolby o średnicy 25^cm2 (zaleca się do 15 g tkanki chrzęstnej na kolbę T25). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut, usunąć żelatynę, dwukrotnie spłukać PBS i przystąpić do wysiewu komórek.

3. Izolacja i hodowla chondrocytów

UWAGA: Chondrocyty są izolowane z obszarów chrząstki nieobciążających od pacjentów poddawanych całkowitej wymianie stawu kolanowego. Zebrać wszystkie próbki w sterylnych warunkach i przechowywać je w sterylnych probówkach wypełnionych DMEM zawierającym 200 U/ml roztworu penicyliny/streptomycyny. Chrząstkę należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2-8 °C.

1. Leczenie enzymatyczne należy rozpocząć w ciągu 2 dni od pobrania chrząstki. Umyj kawałki chrząstki w roztworze Hanksa za pomocą szalek Petriego o średnicy 60 mm, a następnie pokrój chrząstkę na fragmenty o średnicy około 1-2 mm za pomocą autoklawowanych nożyczek.
2. Przenieść kawałki chrząstki do probówek o pojemności 15 ml i wytrawić je w 0,01% roztworze kolagenazy typu II w DMEM, około 1 ml na 1 g chrząstki, w ciągu 8-12 godzin w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 °C przy 5% CO₂, 100% wilgotności, pod ciągłym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej przy 150-200 obr./min.
3. Po roztrawieniu umyć fragmenty chrząstki, dodając DMEM do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 300 × g przez 10 minut. Ponownie zawiesić fragmenty w pożywce do hodowli chondrocytów (tabela uzupełniająca 1) i umieścić je w adhezyjnej kolbie T25 wstępnie pokrytej 0,1% roztworem żelatyny.
4. Przejście chondrocytów po osiągnięciu gęstości zlewania 80%.
   1. W celu pasażowania przemyj chondrocyty roztworem Hanksa, a następnie inkubuj komórki w 0,25% roztworze trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   2. Aby dezaktywować trypsynę, dodaj równą objętość DMEM + 10% FBS. Ponownie zawieś chondrocyty w świeżej pożywce hodowlanej, a następnie rozprowadź je w stosunku 1:3, wysiewając 20 000-30 000 komórek na 1 cm².
   3. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ i wilgotności 100%.

4. Hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych

UWAGA: We współpracy z Laboratorium Komórek Macierzystych Molekularnej Grupy Badawczej Mózgu, Wydział Neubiologii, Instytut A.I. Virtanen, Uniwersytet Wschodniej Finlandii, Kuopio, Finlandia, IPSRG4S linii iPSCs, został pomyślnie wygenerowany w poprzednim badaniu⁸.

1. Hoduj iPSC na 6-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych matrycą zawierającą białka zewnątrzkomórkowe ( Rysunek 1A). Użyj pożywki dla pluripotencjalnych komórek macierzystych (Tabela uzupełniająca 1).
2. Komórki pasażują przy 80% konfluencji, zachowując stosunek 1:4 (50 000-75 000 komórek na 1 cm²). Na około 2-3 godziny przed oderwaniem należy przenieść iPSC do pożywki dla pluripotencjalnych komórek macierzystych zawierających inhibitor kinazy Rho Y27632 w końcowym stężeniu 1 μM przez 1 dzień.
3. Przemyć iPSC roztworem Hanksa i inkubować w temperaturze 37 °C z 0,05% roztworem trypsyny. Aby dezaktywować trypsynę, dodaj równą objętość DMEM + 10% FBS. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut w probówkach o pojemności 15 ml.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w nowym podłożu dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby zwiększyć żywotność komórek, dodaj inhibitor kinazy Rho Y27632 do pożywki w końcowym stężeniu 1 μM przez 1 dzień. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 °C przy 5% CO₂ i wilgotności 100%.

5. Chondrogenne różnicowanie iPSC

1. Zainicjuj różnicowanie w kierunku linii chondrocytarnej poprzez hodowlę komórek w pożywce A (Tabela uzupełniająca 1) przez pierwsze 2 dni. W dniu 3 zastąp pożywkę A roztworem, który wyklucza Chir 99021 i inhibitor kinazy Rho, pozostawiając wszystkie inne składniki bez zmian. Zmieniaj podłoże co 2 dni od 3 do 9 dnia (Rysunek 1B).
2. W 10 dniu przenieś komórki podobne do chondrocytów do pożywki B (Tabela uzupełniająca 1), sformułowanej w celu ułatwienia chondrogenezy. Zmieniaj podłoże co 2 dni przez 10 dni (Rysunek 1C).
3. Przygotuj wcześniej 96-dołkową płytkę do hodowli zawiesiny komórek, pokrywając każdą studzienkę 1,5% agarozą w wodzie destylowanej. Rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej do wrzenia (około 60-90 s przy 700 W). Po upłynnieniu agarozy dodaj 75 μl agarozy do każdej studzienki i pozwól jej stwardnieć w temperaturze pokojowej (około 15 minut).
4. Dodać 150 μl pożywki DMEM do każdej studzienki i inkubować płytkę w inkubatorze CO₂ przez co najmniej 12 godzin
   UWAGA: Przygotowane płytki można przechowywać do 1 miesiąca w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C, jeśli podłoże w każdej studzience jest uzupełniane w celu skompensowania parowania.
5. W 12 dniu, po zaobserwowaniu zmian fenotypowych związanych z chondrogenezą, zainicjuj tworzenie sferoid za pomocą wygenerowanych komórek podobnych do chondrocytów.
   UWAGA: Na tym etapie wskazane jest przeanalizowanie ekspresji kluczowych markerów chondrocytarnych za pomocą immunocytochemii (ICC) i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) przy użyciu metody ^{2-ΔΔCT 9} w celu potwierdzenia pomyślnego różnicowania chondrogennego iPSC. Podczas pasażowania z płytki 6-dołkowej do kolby do hodowli^{komórkowej o} średnicy 75 cm2, niewielką część komórek można wysiać na płytkę 48-dołkową, dopasowując liczbę markerów do analizy. Przeprowadź analizę ICC na tych próbkach, aby zweryfikować ekspresję genów.

6. Powstawanie sferoid z komórek pochodzących z iPSC podobnych do chondrocytów

1. Po uzyskaniu pochodnych podobnych do chondrocytów, komórki pasażują przy 80% zbiegu. Odłącz komórki od płytek 6-dołkowych za pomocą 0,05% roztworu trypsyny. Aby dezaktywować trypsynę, dodaj równą objętość DMEM + 10% FBS, a następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 200 x g przez 5 minut.
Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki B i przenieść do kolby hodowlanej o średnicy 75 cm2 wstępnie pokrytej 0,1% roztworem żelatyny (Rysunek 1D).
2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji jako monowarstwa, odłącz komórki ponownie za pomocą trypsyny i ponownie zawieś w podłożu B, jak opisano.
3. Przenieś komórki na 96-dołkową płytkę pokrytą 1,5% agarozą o gęstości 100 000 komórek na dołek. Uprawiaj w podłożu B, dodając 150 μl kompletnego podłoża na studzienkę (Rysunek 1D, 3A).
4. Utrzymuj komórki w 96-dołkowej płytce pokrytej 1,5% agarozą przez co najmniej 1 dzień i maksymalnie 3 dni, aż utworzą się sferoidy (Rysunek 2B). Przenieś sferoidy z dołków za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml z przyciętym końcem, a następnie przenieś do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól sferoidom osiąść na 2-3 minuty i usuń supernatant.
5. Zanurzyć sferoidy w świeżo rozmrożonym, nierozcieńczonym roztworze matrycy membrany podstawnej utrzymywanym w temperaturze 4 °C. Po 30 minutach zebrać sferoidy przez bierną sedymentację w probówce o pojemności 15 ml lub przez delikatne odwirowanie przy 100 x g przez 1 min.
   UWAGA: Matrix należy rozmrażać przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze 2-8 °C. Po pierwszym rozmrożeniu wytwarza się jednorazowe podwielokrotności matrycy, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Probówki polipropylenowe lub inne kompatybilne z zamrażarkami są używane i przechowywane w temperaturze -70 °C lub -20 °C. Należy zwrócić uwagę na datę ważności partii/partii, która wynosi 2 lata od daty produkcji.
6. Przenieś sferoidy do mini-bioreaktorów i dodaj 6 ml pożywki B. Umieść mini-bioreaktor na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 °C przy 5% CO₂ i wilgotności 100% oraz prędkości mieszania 70-75 obr./min (Rysunek 1F).
7. Zmieniaj pożywkę co tydzień lub zgodnie z wymaganiami dotyczącymi zubożenia pożywki lub zmiany koloru wskaźnika kwasowo-zasadowego. Aby to zrobić, pozwól sferoidom osiąść grawitacyjnie w probówce o pojemności 15 ml, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Dodaj świeżą pożywkę B do probówki i przenieś sferoidy z powrotem do mini-bioreaktorów.

Wyniki

Opisany protokół jest zilustrowany w Rysunek 1. Metodologia ta wykorzystuje dwie odrębne pożywki hodowlane do różnicowania iPSC w sferoidy chondrocytów przez minimalny okres 1 miesiąca (Rysunek 2). Proces różnicowania rozpoczyna się, gdy iPSC osiągają zbieżność 75%-90% (Rysunek 1B). Wczesne oznaki różnicowania chondrogennego pojawiają się około 9-10 dnia hodowli w pożywce A, charakteryzujące się przyjęciem przez komórki...

Dyskusja

Komórki iPS stanowią przełomowe narzędzie w medycynie regeneracyjnej, oferujące potencjał do generowania specyficznych dla pacjenta chondrocytów do naprawy chrząstki. Obecne protokoły wykorzystują ukierunkowane różnicowanie poprzez szlaki mezodermalne, a kluczowe cząsteczki sygnałowe, takie jak TGF-β i BMP-2, promują zaangażowanie linii chondrocytarnej. Metody te mają na celu odtworzenie rozwoju chrząstki embrionalnej, umożliwiając produkcję składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen typu II i aggrekan, n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% roztwór trypsyny	Thermo Fisher Scientific	25300-062
0,25% roztwór trypsyny	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Podłoże Eagle's	Thermo Fisher Scientific	12634028
Przeciwciało monoklonalne Aggrecan	Invitrogen	AHP0022	Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie: 1/500
Kwas askorbinowy	Sigma	A4544	50 μ g/ml
B-27 suplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x lub 2%
Beta-merkaptoetanol	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μ M
COL1A1 (E6A8E) Przeciwciało monoklonalne	CellSignalling	39952	Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie: 1/800
COL2A1 (M2139) Przeciwciało monoklonalne	Santa Cruz	sc-52658	Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie: 1/50
Roztwór kolagenazy typu II	PanEco	P011-2	0,01%
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μ g/ml
pożywki DMEM bez glutaminy	PanEco	?420?
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
roztwór Hanksa	PanEco	?020?
Hybris 8 medium	PanEco	?780?/?780
Roztwór insuliny-transferyny-selenu	PanEco	?065	1x roztwór ma następujące stężenia: Insulina: 10 &mikro; g/ml; Transferyna: 5,5 i mikro; g/ml; Selen 5 ng/ml
L-alanylo-L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	35050038	2 mM
Matrigel Matrix	BD	354277	300 μ g/ml
roztworu penicyliny-streptomycyny	PanEco	?063?	100 j./ml
Kwas retinowy	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Inhibitor kinazy Rho Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
Przeciwciało drugorzędowe Kozioł anty-mysie IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Gospodarz: Koza; Rozcieńczenie: 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Kozioł anty-królicze IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	?32732	Gospodarz: Koza; Rozcieńczenie: 1/500
Sox9 (D8G8H) Przeciwciało monoklonalne	CellSignalling	82630	Gospodarz: Rb; Rozcieńczenie: 1/400
TeSR-1 medium	STEMCELL technologies	85850
TGF-β 1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/ml