Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Podsumowanie

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Streszczenie

Naprawa chrząstki w przewlekłych chorobach stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby skutecznie zregenerować uszkodzone tkanki. Protokół ten zapewnia krok po kroku metodę różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Proces różnicowania jest starannie zorganizowany, aby promować zaangażowanie linii chondrogennej, zaczynając od iPSC hodowanych w określonych pożywkach, które sekwencyjnie prowadzą komórki przez krytyczne etapy różnicowania. Początkowo iPSC są ekspandowane w celu osiągnięcia optymalnej konfluencji przed indukcją w kierunku linii chondrogennej przy użyciu serii zdefiniowanych zmian pożywki. Do 10 dnia komórki są przenoszone do pożywki promującej chondrogenezę, która zwiększa tworzenie komórek podobnych do chondrocytów, wyrażających kluczowe markery dojrzałych chondrocytów. Dalsza agregacja w 96-dołkowych płytkach pokrytych agarozą prowadzi do powstania trójwymiarowych sferoid, które są następnie hodowane w niestandardowych mini-bioreaktorach zaprojektowanych do symulacji mikrośrodowiska, które sprzyja odkładaniu się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Umożliwiając skalowalną produkcję sferoid chondrocytów, które naśladują natywne cechy chrząstki, podejście to oferuje obiecujące, powtarzalne rozwiązanie do opracowywania komórkowych metod leczenia wad chrząstki, zapewniając szerokie zastosowanie w zastosowaniach klinicznych i badawczych w medycynie regeneracyjnej układu mięśniowo-szkieletowego.

Wprowadzenie

Rozpowszechnienie chorób stawów prowadzi do znacznych obciążeń ekonomicznych ze względu na rosnącą liczbę niepełnosprawnych pacjentów i koszty związane z ich opieką. Chrząstka szklista to bezczynna tkanka łączna o ograniczonym potencjale regeneracyjnym¹. Długotrwałe stosowanie niektórych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), glikokortykosteroidów oraz chemioterapii lub radioterapii może jeszcze bardziej zmniejszyć zdolność regeneracyjną chrząstki, prawie eliminując jej zdolność do gojenia². To sprawia, że uzyskanie autologicznych komórek chrząstki do terapii komórkowej jest trudne.

Technologia trójwymiarowej (3D) hodowli komórek, w tym chondrocytów, od dawna jest uznawana za rozwijający się obszar badań o dużym potencjale. Te struktury 3D są badane pod kątem zastosowań zarówno w podstawowych badaniach biologicznych, jak i medycynie regeneracyjnej. Sferoidy pochodzące z autologicznych chondrocytów są obiecujące terapeutycznie w leczeniu zwyrodnienia tkanki chrzęstnej, schorzenia, które obecnie cieszy się dużym zainteresowaniem na całym świecie³.

sferoidy pochodzące z chondrocytów różniących się od iPSC stanowią obiecującą alternatywę dla pierwotnych chondrocytów, oferując znaczące korzyści dla naprawy chrząstki. iPSC zapewniają prawie nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się i posiadają szeroki potencjał różnicowania, co pozwala na produkcję chondrocytów w ilościach wystarczających do zastosowań klinicznych bez inwazyjnych procedur pobierania komórek⁴. Co więcej, przejście z tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kultur chondrocytów do systemów hodowli 3D, takich jak chondrosfery, dodatkowo zwiększa żywotność i funkcjonalność tych komórek, tworząc bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko. Badania pokazują, że chondrocyty hodowane w sferoidach 3D lepiej utrzymują swój fenotyp, wykazując niższe wskaźniki odróżnicowania i wyższe poziomy ekspresji kluczowych markerów chrząstki szklistej II, takich jak kolagen typu II i agrekan⁵.

Pomimo potencjału chondrosfer pochodzących z iPSC, standardowe protokoły generowania wysokiej jakości chondrosfer pozostają ograniczone. Zmienność protokołów w różnych badaniach często prowadzi do niespójności w jakości chondrocytów i składzie macierzy zewnątrzkomórkowej, wpływając na ich skuteczność w zastosowaniu terapeutycznym⁶. W tym miejscu przedstawiono udoskonalony protokół, który standaryzuje wytwarzanie sferoid z chondrocytów pochodzących z iPSC przy użyciu niedrogich, niestandardowych mini-bioreaktorów. Faza hodowli w mini-bioreaktorze jest niezbędna, ponieważ zapewnia kontrolowane ustawienie o niskiej przyczepności, które optymalizuje dystrybucję składników odżywczych, dojrzewanie ECM i zagęszczenie sferoidalne⁷. Ta faza sprzyja silnej ekspresji niezbędnych markerów chondrocytów, w tym kolagenu typu II, agrekanu i SOX9, wraz z kompozycją ECM, która bardzo przypomina natywną chrząstkę. Regularna wymiana pożywek i staranna kontrola warunków środowiskowych - temperatury, CO₂ i prędkości obrotowej - dodatkowo zapewniają żywotność i dojrzewanie sferoid chondrocytów. Protokół ten został zoptymalizowany w celu stworzenia wysokiej jakości chondrosfer z silną ekspresją markerów chrząstki szklistej w opłacalny i skalowalny sposób, odpowiedni do zastosowań badawczych i klinicznych w naprawie chrząstki.

Protokół

​Badanie zostało przeanalizowane i zatwierdzone przez Komisję Etyczną LOPUKHIN FRCC PCM (protokół nr 2019/02 z dnia 9 kwietnia 2019 r.). Wszystkie próbki od dawców pobrano zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Od wszystkich uczestników i/lub ich opiekunów prawnych uzyskano świadomą zgodę.

UWAGA: Przez cały czas trwania protokołu należy zachować technikę sterylną. Wszystkie pożywki i roztwory należy podgrzać do 37 °C przed podaniem ich komórkom lub sferoidom. Komórki należy hodować w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂ i 80% wilgotności. Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1: Protokół wytwarzania chondrosfer z linii iPSC IPSRG4S. (A) Początkowo iPSC są hodowane w pośrodku dla pluripotencjalnych komórek macierzystych do momentu osiągnięcia 80% konfluencji. (B) Aby indukować różnicowanie w kierunku linii chondrocytycznej, iPSC są następnie hodowane w pośrodku A przez 2 dni. Następnie pośrodki zastępuje się formulacją pozbawioną Chir 99021 oraz inhibitora kinazy Rho, a komórki hoduje się przez kolejne 6 dni, zmieniając pośrodki co 2 dni. (C) Następnie komórki przenosi się do pośrodka B, aby promować chondrogenezę przez kolejne 10 dni. (D) Po osiągnięciu odpowiedniej liczby komórek proces przechodzi do etapu produkcji sferoidów. (E) Komórki są agregowane w sferoidy w warunkach niskiej adhezji pod wpływem grawitacji. (F) Powstałe sferoidy są hodowane w mini-bioreaktorach z pośrodkiem B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Przekształcenie szalek Petriego w minibioreaktory

UWAGA: Szczegóły znajdują się w poprzednim artykule⁵.

1. Za pomocą sterylnych nożyczek do autoklawowania potnij probówki wirówkowe na pierścienie o wysokości 7-8 mm (parametry autoklawowania: 121 °C (250 °F), 15 psi, 30 min, a następnie suszenie po autoklawowaniu przez 20 min).
2. Rozdrobnij naczynia Petri o niskiej adhezji, nieobrobione lub mikrobiologiczne na małe kawałki. Rozpuść około 1 g cząsteczek plastiku w 10 mL chloroformu przez noc, aby przygotować ciekły roztwór plastiku. Procedurę tę należy przeprowadzić w dygestorium.
3. Sprawdź, czy ciekły plastik jest wystarczająco lepki do pipetowania. Upewnij się, że krople zachowują kształt sferyczny, a nie rozprzestrzeniają się po powierzchni. Jeśli roztwór jest zbyt rzadki, dodaj więcej cząsteczek plastiku (zazwyczaj wymagane jest 1-3 g). Jeśli jest zbyt gęsty, dodaj dodatkowy chloroform (zazwyczaj do 5 mL).
4. Uformuj plastikowy wypustek w centrum sterylnego naczynia Petri o średnicy 60 mm i ultra-niskiej adhezji, korzystając z jednej z dwóch opisanych poniżej skutecznych metod.
   1. Opcja 1: Umieść autoklawowany plastikowy pierścień w centrum naczynia Petri, a następnie nanieś do wnętrza pierścienia ciekły plastik; jedna kropla będzie wymagała około 100-200 µL ciekłego plastiku.
   2. Opcja 2: Nanieś taką samą liczbę kropli ciekłego plastiku bezpośrednio do centrum naczynia Petri, nie używając plastikowego pierścienia.
5. Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia przez 2-3 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Po wysuszeniu naświetlaj naczynia promieniowaniem ultrafioletowym przez 20-30 min.

2. Powlekanie szalek hodowlanych żelatyną

1. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, rozpuszczając żelatynę w proszku w wodzie destylowanej w temperaturze 95 °C. Przeprowadzić roztwór kolejno przez filtry membranowe 0,45 µm i 0,25 µm, a następnie przechowywać filtrat w temperaturze 4 °C.
2. Bezpośrednio przed ponownym wysianiem chondrocytów, nanieść 3 mL roztworu żelatyny do kolby 25 cm² (zaleca się użycie do 15 g tkanki chrzestnej na jedną kolbę T25). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min, usunąć żelatynę, przemyć dwukrotnie PBS i przystąpić do wysiewania komórek.

3. Izolacja i hodowla chondrocytów

UWAGA: Chondrocyty są izolowane z obszarów chrząstki niepodlegającej obciążeniom u pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego. Wszystkie próbki należy pobrać w warunkach sterylnych i przechowywać w sterylnych probówkach wypełnionych DMEM zawierającym 200 U/mL roztworu penicyliny/streptomycyny. Tkankę chrzęstną należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2-8 °C.

1. Obróbkę enzymatyczną należy rozpocząć w ciągu 2 dni od pobrania chrząstki. Kawałki chrząstki należy przemyć w roztworze Hanksa w szalkach Petriego o średnicy 60 mm, a następnie pociąć na fragmenty o średnicy około 1-2 mm za pomocą autoklawowanych nożyczek.
2. Kawałki chrząstki należy przenieść do probówek o pojemności 15 mL i poddać trawieniu w 0,01% roztworze kolagenazy typu II w DMEM (około 1 mL na 1 g chrząstki) przez 8-12 h w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 °C z 5% CO₂ i 100% wilgotnością, przy ciągłym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150-200 rpm.
3. Po trawieniu fragmenty chrząstki należy przemyć, dodając DMEM do probówki 15 mL, a następnie odwirować przy 300 × g przez 10 min. Fragmenty należy resuspendować w pożywce do hodowli chondrocytów (Supplementary Table 1) i wysiać do przylegającej kolby T25 uprzednio pokrytej 0,1% roztworem żelatyny.
4. Pasażowanie chondrocytów należy przeprowadzić po osiągnięciu 80% konfluencji.
   1. W celu pasażowania chondrocyty należy przemyć roztworem Hanksa, a następnie inkubować komórki z 0,25% roztworem trypsyny w 37 °C przez 5 min.
   2. Aby dezaktywować trypsynę, należy dodać równą objętość DMEM + 10% FBS. Chondrocyty należy resuspendować w świeżej pożywce hodowlanej, a następnie rozdzielić w stosunku 1:3, wysiewając 20 000-30 000 komórek na 1 cm².
   3. Kolbę z hodowlą należy umieścić w inkubatorze w 37 °C z 5% CO₂ i 100% wilgotnością.

4. Hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych

UWAGA: We współpracy z Laboratorium Komórek Macierzystych Grupy Badań nad Cząsteczkową Budową Mózgu, Katedry Neurobiologii, Instytutu A.I. Virtanena, Uniwersytetu Finlandii Wschodniej w Kuopio w Finlandii, w poprzednim badaniu⁸ pomyślnie wygenerowano linię iPSCs IPSRG4S.

1. Hodować iPSC w płytkach 6-dołkowych uprzednio pokrytych matrycą zawierającą białka zewnątrzkomórkowe (Rysunek 1A). Stosować pożywkę dla pluripotencjalnych komórek macierzystych (Tabela uzupełniająca 1).
2. Przesiewać komórki przy 80% konfluencji, zachowując stosunek 1:4 (50 000-75 000 komórek na 1 cm²). Około 2-3 h przed odszczepieniem przenieść iPSC do pożywki dla pluripotencjalnych komórek macierzystych zawierającej inhibitor kinazy Rho Y27632 w stężeniu końcowym 1 µM na 1 dzień.
3. Przemyć iPSC roztworem Hanksa i inkubować w 37 °C z 0,05% roztworem trypsyny. Aby dezaktywować trypsynę, dodać równą objętość DMEM + 10% FBS. Odwirować zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 5 min w probówkach 15 mL.
4. Odlać nadsącz i resuspendować komórki w świeżej pożywce dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby zwiększyć żywotność komórek, dodać do pożywki inhibitor kinazy Rho Y27632 w stężeniu końcowym 1 µM na 1 dzień. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 °C z 5% CO₂ i 100% wilgotnością.

5. Różnicowanie chondrogeniczne iPSC

1. Rozpocząć różnicowanie w kierunku linii chondrocytów poprzez hodowlę komórek w Medium A (Supplementary Table 1) przez pierwsze 2 dni. W dniu 3. zastąpić Medium A roztworem bez zawartości Chir 99021 i inhibitora Rho kinazy, pozostawiając wszystkie pozostałe składniki bez zmian. Wymieniać medium co 2 dni od dnia 3. do dnia 9. (Figure 1B).
2. W dniu 10. przenieść komórki chondrocytopodobne do Medium B (Supplementary Table 1), sformułowanego w celu usprawnienia chondrogenezy. Wymieniać medium co 2 dni przez 10 dni (Figure 1C).
3. Przygotować wcześniej 96-dołkową płytkę do hodowli zawiesiny komórek, pokrywając każdy dołek 1,5% agarozą w wodzie destylowanej. Roztopić agarozę w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia (około 60-90 s przy 700 W). Po upłynnieniu agarozy dodać 75 µL agarozy do każdego dołka i pozostawić do stwardnienia w RT (około 15 min).
4. Dodać 150 µL medium DMEM do każdego dołka i inkubować płytkę w inkubatorze CO₂ przez co najmniej 12 h.
   UWAGA: Przygotowane płytki można przechowywać do 1 miesiąca w inkubatorze CO₂ w 37 °C, pod warunkiem uzupełniania medium w każdym dołku w celu zrekompensowania odparowania.
5. W dniu 12., po zaobserwowaniu zmian fenotypowych związanych z chondrogenezą, rozpocząć formowanie sferoidów z wykorzystaniem wygenerowanych komórek chondrocytopodobnych.
   UWAGA: Na tym etapie zaleca się analizę ekspresji kluczowych markerów chondrocytarnych za pomocą immunocytochemii (ICC) i ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej (qPCR) z zastosowaniem metody 2^-ΔΔCT9, aby potwierdzić pomyślne różnicowanie chondrogenne iPSC. Podczas pasażowania z płytki 6-dołkowej do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm², niewielką część komórek można wysiać do płytki 48-dołkowej, dostosowując liczbę dołków do liczby analizowanych markerów. Przeprowadzić analizę ICC tych próbek w celu weryfikacji ekspresji genów.

6. Tworzenie sferoidów z komórek pochodnych iPSC o fenotypie chondrocytarnym

1. Po uzyskaniu pochodnych przypominających chondrocyty, pasażuj komórki przy 80% konfluencji. Odklej komórki z płytek 6-dołkowych, używając 0,05% roztworu trypsyny. Aby inaktywować trypsynę, dodaj równą objętość DMEM + 10% FBS, a następnie przenieś komórki do probówki 15 mL i wiruj przy 200 x g przez 5 min.
2. Usuń nadosad, resuspenduj komórki w 1 mL Medium B i przenieś do kolby hodowlanej 75 cm² uprzednio pokrytej 0,1% roztworem żelatyny (Rysunek 1D). Gdy komórki osiągną 80% konfluencji jako monowarstwa, ponownie odklej je za pomocą trypsyny i resuspenduj w Medium B w opisany sposób.
3. Przenieś komórki na płytkę 96-dołkową pokrytą 1,5% agaroza z gęstością 100 000 komórek na dołek. Hoduj w Medium B, dodając 150 µL pełnej pożywki na dołek (Rysunek 1D, 3A).
4. Utrzymuj komórki na płytce 96-dołkowej pokrytej 1,5% agarozą przez minimum 1 dzień i maksymalnie 3 dni, aż do czasu utworzenia sferoidów (Rysunek 2B). Przenieś sferoidy z dołków za pomocą końcówki pipety 1 mL z przyciętym końcem, a następnie przenieś je do probówki 15 mL. Pozostaw sferoidy do osadzenia na 2-3 min i usuń nadosad.
5. Zanurz sferoidy w świeżo rozmrożonym, nierozcieńczonym roztworze matrycy błony podstawnej utrzymywanym w temperaturze 4 °C. Po 30 min zbierz sferoidy poprzez sedymentację pasywną w probówce 15 mL lub przez delikatne wirowanie przy 100 x g przez 1 min.
   UWAGA: Matrycę należy rozmrażać przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze 2-8 °C. Po pierwszym rozmrożeniu przygotowuje się jednorazowe alikwoty matrycy, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Należy używać probówek z polipropylenu lub innych probówek odpornych na zamrażanie i przechowywać je w temperaturze -70 °C lub -20 °C. Należy zwracać uwagę na datę ważności partii, która wynosi 2 lata od daty produkcji.
6. Przenieś sferoidy do mini-bioreaktorów i dodaj 6 mL Medium B. Umieść mini-bioreaktor na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze CO₂ ustawionym na 37 °C z 5% CO₂, 100% wilgotnością i prędkością wytrząsania 70-75 rpm (Rysunek 1F).
7. Wymieniaj pożywkę co tydzień lub w zależności od zużycia pożywki bądź zmiany barwy wskaźnika kwasowo-zasadowego. Aby to zrobić, pozwól sferoidom osadzić się grawitacyjnie w probówce 15 mL, a następnie ostrożnie usuń nadosad. Dodaj do probówki świeże Medium B i przenieś sferoidy z powrotem do mini-bioreaktorów.

Wyniki

Opisany protokół został przedstawiony na Rysunku 1. Metodologia ta wykorzystuje dwa odrębne media hodowlane w celu indukowania różnicowania iPSC w sferoidy chondrocytów przez okres co najmniej 1 miesiąca (Rysunek 2). Proces różnicowania rozpoczyna się, gdy iPSC osiągną 75%-90% konfluencji (Rysunek 1B). Wczesne oznaki różnicowania chondrogennego pojawiają się około 9-10 dnia hodowli w medium A, co obj...

Dyskusja

Komórki iPS stanowią przełomowe narzędzie w medycynie regeneracyjnej, oferujące potencjał do generowania specyficznych dla pacjenta chondrocytów do naprawy chrząstki. Obecne protokoły wykorzystują ukierunkowane różnicowanie poprzez szlaki mezodermalne, a kluczowe cząsteczki sygnałowe, takie jak TGF-β i BMP-2, promują zaangażowanie linii chondrocytarnej. Metody te mają na celu odtworzenie rozwoju chrząstki embrionalnej, umożliwiając produkcję składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen typu II i aggrekan, n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% roztwór trypsyny	Thermo Fisher Scientific	25300-062
0,25% roztwór trypsyny	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Podłoże Eagle's	Thermo Fisher Scientific	12634028
Przeciwciało monoklonalne Aggrecan	Invitrogen	AHP0022	Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie: 1/500
Kwas askorbinowy	Sigma	A4544	50 μ g/ml
B-27 suplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x lub 2%
Beta-merkaptoetanol	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μ M
COL1A1 (E6A8E) Przeciwciało monoklonalne	CellSignalling	39952	Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie: 1/800
COL2A1 (M2139) Przeciwciało monoklonalne	Santa Cruz	sc-52658	Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie: 1/50
Roztwór kolagenazy typu II	PanEco	P011-2	0,01%
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μ g/ml
pożywki DMEM bez glutaminy	PanEco	?420?
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
roztwór Hanksa	PanEco	?020?
Hybris 8 medium	PanEco	?780?/?780
Roztwór insuliny-transferyny-selenu	PanEco	?065	1x roztwór ma następujące stężenia: Insulina: 10 &mikro; g/ml; Transferyna: 5,5 i mikro; g/ml; Selen 5 ng/ml
L-alanylo-L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	35050038	2 mM
Matrigel Matrix	BD	354277	300 μ g/ml
roztworu penicyliny-streptomycyny	PanEco	?063?	100 j./ml
Kwas retinowy	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Inhibitor kinazy Rho Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
Przeciwciało drugorzędowe Kozioł anty-mysie IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Gospodarz: Koza; Rozcieńczenie: 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Kozioł anty-królicze IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	?32732	Gospodarz: Koza; Rozcieńczenie: 1/500
Sox9 (D8G8H) Przeciwciało monoklonalne	CellSignalling	82630	Gospodarz: Rb; Rozcieńczenie: 1/400
TeSR-1 medium	STEMCELL technologies	85850
TGF-β 1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/ml