Artykuł metodologiczny

Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67484

⸱

22 listopada 2024

 ,  ,  , 
1Department of Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Granada, 2Department of Preventive Medicine and Public Health, Food Science, Toxicology and Forensic Medicine, Faculty of Pharmacy and Food Science, University of Valencia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zweryfikowaną metodę chromatografii cieczowej, mobilności jonów i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, do określania obecności alkaloidów sporyszu w żywności, zgodnie z niedawno wydanym rozporządzeniem Komisji (UE) 2023/915.

Streszczenie

Spektrometria mas ruchliwości jonów (IMS) działa jako dodatkowy wymiar separacji, gdy jest zintegrowana z przepływami pracy chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Metody LC-IMS-MS zapewniają wyższą rozdzielczość szczytową, lepszą separację związków izobarycznych i izomerycznych oraz lepszy stosunek sygnału do szumu (S/N) w porównaniu z tradycyjnymi metodami LC-MS. IMS zapewnia kolejną cechę molekularną do identyfikacji analitów, a mianowicie parametr przekroju zderzenia (CCS), co zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich. W związku z tym metody LC-IMS-MS odpowiadają na ważne wyzwania analityczne w dziedzinie bezpieczeństwa żywności (tj. wykrywanie związków na poziomach śladowych w złożonych matrycach żywności oraz jednoznaczna identyfikacja cząsteczek izobarycznych i izomerycznych).

Alkaloidy sporyszu (EA) to rodzina mykotoksyn wytwarzanych przez grzyby, które atakują wiele różnych gatunków traw, w tym małe ziarna, takie jak żyto, pszenżyto, pszenica, jęczmień, proso i owies. Najwyższe dopuszczalne poziomy tych mikotoksyn zostały ustanowione w kilku środkach spożywczych, zgodnie z rozporządzeniem Komisji (WE) 2023/915. To nowe prawodawstwo obejmuje sześć głównych EA i odpowiadających im epimerów, dlatego potrzebna jest skuteczna metodologia, aby właściwie rozróżnić te cząsteczki izomeryczne, biorąc pod uwagę ich współwystępowanie.

Dlatego celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób integracja IMS w przepływach pracy LC-MS przyczynia się do separacji izomerycznych EA, zwiększając selektywność metody analitycznej. Ponadto zilustrowano, w jaki sposób generowanie bibliotek CCS poprzez charakterystykę wzorców analitycznych zapewnia większą pewność identyfikacji mikotoksyn. Protokół ten ma na celu jasne wyjaśnienie korzyści płynących z wdrożenia ZSZ w zakresie bezpieczeństwa żywności, na przykładzie oznaczania EA w zbożach. Ekstrakcja oparta na QuEChERS, a następnie analiza spektrometrii ruchliwości jonów uwięzionych w cieniu cieplnym (TIMS)-MS zapewniła granice kwantyfikacji w zakresie od 0,65 do 2,6 ng / g z akceptowalną dokładnością (chociaż niski odzysk dla ergotamininy) przy 1,5x, 1x i 0,5x ML i wykazała znikomy efekt matrycy.

Wprowadzenie

Spektrometria mas z mobilnością jonów (IMS) staje się coraz częściej wykorzystywaną techniką analityczną, często przedstawianą jako dodatkowy wymiar rozdziału zintegrowany z tradycyjnymi przepływami pracy chromatografii cieczowej/gazowej (LC/GC) sprzężonej z MS. IMS polega na rozdziałie cząsteczek w komorze mobilności wypełnionej gazem buforowym, w polu elektrycznym i pod ciśnieniem atmosferycznym1. W zależności od stosunku masy do ładunku (m/z) oraz konformacji geometrycznej, zjonizowana cząsteczka będzie oddziaływać z gazem buforowym podczas przemieszczania się przez komorę mobilności, co znajduje odzwierciedlenie w parametrze mobilności jonów (K)2, obliczanym za pomocą następującego równania:

Równanie kinetyczne, K=D/(td×E), równowaga statyczna, wzór, schemat edukacyjny.

gdzie D oznacza całkowitą długość strefy migracji, td jest całkowity czas dryfu oraz E jest pole elektryczne. Zatem K mierzy się w m2 V−1 s−1choć z przyczyn praktycznych często wyraża się go w cm2 V−1 s−1Wewnętrzna zdolność do przemieszczania się przez komórkę mobilności może być mierzona za pomocą czasu dryfu, a następnie przeliczona na tak zwaną wartość przekroju poprzecznego zderzeń (CCS), która jest parametrem wysoce powtarzalnym dla każdej cząsteczki, niezależnie od zastosowanego urządzenia IMS.3Wartość CCS można wyznaczyć na podstawie ruchliwości zgodnie z następującym równaniem:

Równanie mobilności jonowej K=3q/16N×√(2π/μkBT)×1/CCS, stosowane w analizie spektrometrii mas.

q oznacza ładunek jonu; N gęstość liczbową gazu buforowego; µ masę zredukowaną partnerów kolizyjnych gazu buforowego i jonu; kB stałą Boltzmanna; a T temperaturę gazu buforowego. W związku z tym IMS dostarcza dodatkowych informacji uzupełniających dane analityczne wynikające z analiz chromatograficznych i MS.

Wykazano, że implementacja IMS w platformach LC-MS zwiększa wiarygodność oznaczeń analitycznych, zwłaszcza w przypadku związków występujących w stężeniach śladowych. W kilku badaniach stwierdzono, że metody LC-IMS-MS poprawiają jakość widm masowych poprzez redukcję szumu tła, co w efekcie wpływa na czułość metody, oraz zmniejszają odsetek wyników fałszywie dodatnich i ujemnych otrzymywanych w wielorezydualnych metodologiach LC-MS4,5,6. Ponadto powtarzalność wartości CCS umożliwia porównania nie tylko między różnymi instrumentami wykorzystującymi tę samą technologię, ale także między różnymi technologiami mobilności jonów, mianowicie spektrometrią mobilności jonów z falą przemieszczającą się (TWIMS), spektrometrią mobilności jonów pułapkowanych (TIMS) oraz spektrometrią mobilności jonów w rurze dryfu (DTIMS)2,7, które są najczęściej stosowanymi systemami1. Zatem istotną konsekwencją potencjału CCS jako parametru identyfikacyjnego jest możliwość tworzenia bibliotek CCS, co znajduje odzwierciedlenie w ich zastosowaniu w badaniach metabolomicznych8. Niemniej jednak jedną z najpotężniejszych funkcji IMS jest zdolność do rozdzielania związków izomerycznych i izobarycznych, które mogą nie zostać wystarczająco rozdzielone za pomocą metod LC-MS. Może to mieć miejsce podczas pracy z dużymi zestawami interesujących analitytów w złożonych matrycach, co jest częstą sytuacją w analizach środowiskowych i żywności. W tym kontekście metody LC-IMS-MS zostały zaproponowane do monitorowania pestycydów oraz, w mniejszym stopniu, leków weterynaryjnych i mikotoksyn w żywności9.

Dzięki wysokiej rozdzielczości i selektywności, platformy LC/GC-IMS-MS stają się najużyteczniejszymi narzędziami do rozwiązywania niektórych z obecnych problemów w zakresie bezpieczeństwa żywności, szczególnie tych związanych z mieszaninami izomerycznymi. Zagrożenia zdrowotne związane z mieszaninami izomerycznymi jako zanieczyszczeniami żywności zostały odzwierciedlone w aktualnych przepisach europejskich, które na przykład ograniczają maksymalną stężenie sześciu głównych alkaloidów sporyszu (EAs) oraz ich odpowiadających sześciu epimerów w kilku produktach spożywczych10.

Alkaloidy sporyszowe (EA) stanowią rodzinę toksycznych metabolitów wtórnych produkowanych przez szeroki zakres grzybów, głównie z rodziny Clavicipitaceae (np. Claviceps purpurea, najważniejszego producenta EA ze względu na szeroki zakres gospodarzy), ale także Trichocomaceae, które mogą pasożytować na kłosach żywych roślin (takich jak żyto, jęczmień, pszenica i owies) w czasie kwitnienia11,12. W określonych warunkach, zwłaszcza w zależności od temperatury i aktywności wody, grzyby z rodzaju Claviceps mogą produkować EA, które kumulują się w owocnikach, znanych jako sklerocja lub sporysz, w uprawach gospodarza. W pewnym stopniu EA mogą przetrwać przetwarzanie surowca aż do uzyskania produktu końcowego, dostając się tym samym do łańcucha pokarmowego. Spożycie zanieczyszczonej żywności może prowadzić do zatrucia EA, znanego jako sporyszizm, który objawia się ostrymi symptomami, takimi jak bóle brzucha, wymioty, uczucie pieczenia skóry, bezsenność i halucynacje13. Aby ograniczyć wpływ EA na zdrowie ludzi, Komisja Europejska ustanowiła poziomy maksymalne (ML) w kilku produktach spożywczych dla sumy głównych EA: R-epimerów ergometryny (Em), ergotaminy (Et), ergosyny (Es), ergokrystyny (Ecr), ergokryptyny (Ekr) i ergokorniny (Eco) oraz ich odpowiadających S-epimerów: ergometryniny (Emn), ergosyniny (Esn), ergotamininy (Etn), ergokornininy (Econ), ergokryptyniny (Ekrn) i ergokrystyniny (Ecrn). Związki te mogą ulegać epimeryzacji z form R na S i vice versa, szczególnie pod wpływem silnego światła, długotrwałego przechowywania lub kontaktu z niektórymi rozpuszczalnikami przy wysokim lub niskim pH 12. Chociaż proporcje form R i S mogą się różnić w zależności od warunków, panel CONTAM EFSA zgłosił częstsze występowanie form R niż form S po przeanalizowaniu dostępnej literatury na temat EA w produktach spożywczych14. Zatem poziomy ML różnią się w zależności od kilku czynników, takich jak podatność uprawy, stopień przetworzenia lub częstotliwość spożycia. W ramach regulacji UE poziomy ML dla produktów mącznych z jęczmienia, pszenicy, pszenicy płaskurki i owsa ustalono na 50 lub 150 µg/kg (odpowiednio w zależności od zawartości popiołu niższej lub wyższej niż 900 mg/100 g), podczas gdy zboża przeznaczone bezpośrednio do spożycia przez ludzi podlegają ML na poziomie 150 µg/kg, z wyjątkiem żywności dla niemowląt na bazie zbóż, w której ML jest obniżony do 20 µg/kg10.

Te rygorystyczne przepisy wymagają metod analitycznych o czułości wystarczającej do oznaczania poziomów śladowych stężeń (µg/kg), przy jednoczesnej właściwej identyfikacji regulowanych EA oraz ich odpowiadających epimerów, ponieważ obie formy, izomery R- i S-, mogą występować razem w zanieczyszczonych próbkach. Zadanie to stanowi ogromne wyzwanie, ponieważ każda para toksyna-epimer posiada tę samą dokładną masę i wzór fragmentacji. Ponadto prawidłowa separacja chromatograficzna obu związków może być złożona. Dlatego wymagane są dobrze zoptymalizowane gradienty LC, aby uniknąć błędów w oznaczaniu ilościowym, gdy epimery EA współwystępują w próbkach żywności. Chociaż w kilku badaniach zgłoszono metody LC-MS dla jednoznacznego oznaczania EA15,16,17,18, metoda chromatograficzna musi być szeroko badana, aby uzyskać odpowiednią separację pików chromatograficznych w celu jednoznacznej identyfikacji EA. Jednak nie jest to zazwyczaj możliwe w przypadku metod wieloklasowych, w których jednocześnie oznaczane są zanieczyszczenia należące do różnych rodzin chemicznych. W tym kontekście w niedawnym badaniu przeprowadzonym przez Carbonell-Rozas, Hernández-Mesa i wsp.19 opisano metodę LC-IMS-MS do ilościowego oznaczania EA w próbkach pszenicy i jęczmienia, z wykorzystaniem dwóch różnych instrumentów TWIMS, które zapewniły powtarzalne wartości CCS i niskie granice oznaczania ilościowego (LOQs), pozwalając wykryć wszelkie niezgodności z aktualnym ustawodawstwem. Celem niniejszego protokołu jest zatem pokazanie, w jaki sposób integracja IMS w schematach LC-MS przyczynia się do separacji izomerycznych EA, zwiększając selektywność metody analitycznej. Dodatkowo ilustruje on, jak tworzenie bibliotek CCS poprzez charakterystykę standardów analitycznych zapewnia wyższą pewność identyfikacji mikotoksyn. Protokół ten został zaprojektowany, aby jasno wyjaśnić korzyści z wdrożenia IMS w analizie bezpieczeństwa żywności, przyjmując za przykład oznaczanie EA w zbożach. Protokół ten obejmuje przygotowanie próbek w oparciu o procedurę QuEChERS, analizę próbek metodą LC-TIMS-MS oraz ekstrakcję i interpretację danych IMS.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów standardowych, pośrednich i roboczych

UWAGA: Używaj rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych.

  1. Przygotować indywidualne roztwory podstawowe 12 EA (patrz tabela materiałów) o stężeniu 10 000 ng/ml w 4 ml fiolkach ze szkła oranżowego przy użyciu acetonitrylu. Formy R (-ine) były wcześniej podawane w porcjach 25 000 ng, podczas gdy formy S (-inina) były dystrybuowane w porcjach 10 000 ng. Badanie to rozpoczęło się od tych podwielokrotności, osiągając stężenia 10 000 ng / ml poprzez rozcieńczenie form R i S odpowiednio w 2,5 i 1 ml acetonitrylu, a następnie wirowanie przez 2 minuty.
  2. Przygotować pośredni roztwór podstawowy o stężeniu 1 000 ng/ml wszystkich EA (83,33 ng/ml każdej) w fiolce o pojemności 12 ml ze szkła oranżowego, dodając 65 μl każdego pojedynczego roztworu alkaloidu i 7,02 ml acetonitrylu.
    UWAGA: Po przygotowaniu pośredniego roztworu podstawowego, poszczególne roztwory podstawowe muszą być wysuszone i przechowywane w temperaturze -20 °C przykryte folią aluminiową, aby uniknąć epimeryzacji.
  3. Przygotować robocze roztwory wzorcowe z pośredniego roztworu podstawowego, pipetując 2,7, 1,8 i 0,9 ml w probówkach ze szkła oranżowego o pojemności 4 ml. Doprowadzić je do wyschnięcia pod delikatnym strumieniem azotu i ponownie zamieszać w 600 μl acetonitrylu.
    UWAGA: Uzyskane stężenia ustalono na poziomie 1,5, 1 i 0,5x ml (150 ng/g) po dodaniu 50 μl do 1 g próbki. Są one wybierane jako poziomy stężeń do badań walidacyjnych (tj. odzysk, powtarzalność itp.).
  4. Podzielić 600 μl każdego roboczego roztworu wzorcowego na trzy fiolki ze szkła bursztynowego o pojemności 2 ml, pipetując 200 μl i doprowadzić do ich wyschnięcia.
    UWAGA: Kroki od 1.2 do 1.4 są schematycznie wyjaśnione w Rysunek 1. Poprzez podzielenie i wysuszenie roboczych roztworów wzorcowych możliwe jest wzbogacenie w trzech powtórzeniach przez trzy różne dni, zgodnie z wymogami badania walidacyjnego, bez utraty integralności chemicznej EA.
  5. W każdym dniu walidacji zawiesić jedną fiolkę ze szkła bursztynowego o pojemności 2 ml z każdym stopniem wzbogacenia w 200 μl acetonitrylu.
    UWAGA: Każdy poziom wzbogacenia ocenia się w trzech egzemplarzach przy użyciu 50 μl na próbkę; w związku z tym zostanie użytych łącznie 150 μl roztworu.

2. Przygotowanie odczynników i roztworów

UWAGA: Używaj rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych.

  1. Przygotować 5 mM roztwór węglanu amonu, ważąc 24,02 mg węglanu amonu i rozpuszczając go w 50 ml wody. Odważyć 24,02 mg węglanu amonu do zlewki i dodać około 5 ml wody. Rozpuścić węglan amonu, delikatnie mieszając roztwór ręcznie, a następnie przenieść go do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Aby osiągnąć końcową objętość 50 ml, przepłukać zlewkę dodatkową wodą i przenieść wyrastający płyn do kolby miarowej.
  2. Przygotować 250 ml roztworu ekstrakcyjnego [acetonitryl: 5 mM węglanu amonu (85:15, v/v)] mieszając 212,5 ml acetonitrylu i 37,5 ml roztworu amonu przygotowanego w kroku 2.1.
  3. Przygotować 100 ml mieszaniny metanolu i wody (1:1, v/v) w celu ponownego zawieszenia ekstraktów próbki (etap 8.8).
  4. Dla każdej próbki odważyć 150 mg dyspersyjnego materiału w fazie stałej C18: mieszanina sorbentu na bazie tlenku cyrkonu (1:1, m/m) w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml w celu oczyszczenia dyspersyjnego (etap 8.5).
  5. Przygotować rozpuszczalniki do rozdzielania chromatograficznego w dwóch różnych butelkach, a mianowicie 1 l wody ultraczystej (rozpuszczalnik A) i metanolu (rozpuszczalnik B), z których obie zawierają 0,3% (v/v) kwasu mrówkowego. Aby osiągnąć to stężenie, do butelek dodano 3,03 ml kwasu mrówkowego (czystość 99%).
    UWAGA: Rozpuszczalniki do fazy ruchomej należy przygotować tuż przed rozpoczęciem analiz LC-IMS-MS.

3. Ustawianie parametrów instrumentalnych

UWAGA: Instrumentem użytym do przeprowadzenia tego badania LC-IMS-MS był UHPLC sprzężony z IM-HRMS, wyposażony w izolowaną próżniowo sondę podgrzewaną źródłem jonizacji elektrorozpylającej (VIP-HESI). Przyrząd pracował w trybie dodatnim.

  1. Stworzyć metodę chromatograficzną przy użyciu oprogramowania akwizycyjnego do rozdzielania analitów, ustawiając następujący gradient elucji: 0 min, 10% B; 2 min, 10% B; 4,5 min, 40% B; 9 min, 45% B; 11 min, 95% B; 12 min, 95% B; 13 min, 10% B; 16 min, 10% B.
  2. Ustawić natężenie przepływu fazy ruchomej na 0,4 ml/min, temperaturę kolumny na 35 °C, a objętość wtrysku na 5 μl. Jeśli to możliwe, utrzymuj stałą temperaturę 10 °C wewnątrz automatycznego podajnika próbników.
  3. Ustaw parametry IMS w następujący sposób: wartości mobilności (1/K0), od 0,1 do 1,5 V·s/cm2; czas narastania, 100 ms; czas dokładności, 10 ms; cykl pracy, 10%; i szybkość narastania, 9,05 Hz.
  4. Ustaw parametry źródła jonów do wykrywania MS w następujący sposób: napięcie kapilarne, 2 500 V; ciśnienie nebulizatora, 2,5 bara; natężenie przepływu suchego gazu, 8 l/min; temperatura suchego gazu, 200 °C; temperatura gazu w osłonie, 450 °C; natężenie przepływu gazu w osłonie, 4 l/min. Do akwizycji MS należy wybrać następujące parametry, biorąc pod uwagę dwa zdarzenia skanowania: pełny skan całego widma masowego z m/z od 20 do 1,300, a następnie bbCID (szerokopasmowa dysocjacja wywołana zderzeniem), która generuje jony produktowe z dowolnego prekursora przy trzech stałych energiach zderzenia 24, 36 i 50 eV. Wykonaj jonizację i akwizycję danych w trybie polaryzacji dodatniej.
  5. Zapisz ten plik metody pozyskiwania do dalszego wykorzystania.

4. Akwizycja danych ze standardów analitycznych EA

UWAGA: Używaj rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych tylko w kroku 4.1.

  1. Przygotować dwie fiolki bursztynowe o pojemności 1,5 ml z 500 μl roztworu pośredniego o stężeniu 1 000 ng/ml i kolejną fiolkę z mieszaniną rozpuszczalników A i B (1:1, v/v) jako roztwór do mycia.
  2. Skalibruj przyrząd timsTOF zgodnie ze wskazaniami producenta i wybierz biegunowość dodatnią zarówno dla akwizycji IMS, jak i MS.
  3. Umieść kolumnę C18 (patrz Tabela materiałów) w piecu LC z temperaturą ustawioną na 35 °C, jak wskazano w pliku metody akwizycji zapisanym w kroku 3.5.
    UWAGA: Upewnij się, że oba końce są dobrze dokręcone; W przeciwnym razie zaobserwuje się upływ fazy ruchomej.
  4. Kondycjonować kolumnę LC tak, aby umożliwić przepływ fazy ruchomej o natężeniu 0,1 ml / min i wybrać stosunek mieszaniny rozpuszczalnika A i B 90:10 (%) jako początkowy stosunek składu fazy ruchomej.
  5. Poczekaj, aż ciśnienie w kolumnie ustabilizuje się (~130 bar).
  6. Zwiększ natężenie przepływu fazy ruchomej do 0,2 ml/min, poczekaj, aż ciśnienie się ustabilizuje i ponownie zwiększ do 0,3 ml/min.
  7. Gdy ciśnienie ponownie się ustabilizuje, ustaw natężenie przepływu na 0,4 ml, co będzie roboczym natężeniem przepływu zgodnie z opisem w pliku metody akwizycji zapisanym w kroku 3.5 i poczekaj, aż ciśnienie ustabilizuje się około 350 bar.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie zwiększać bezpośrednio przepływu z 0,2 do 0,4 ml/min. Silna zmiana przepływu wywołuje skoki wysokiego ciśnienia, które mogą uszkodzić kolumnę chromatograficzną.
  8. Podczas kondycjonowania kolumny należy napisać listę roboczą, w tym dwie próbki odpowiadające dwóm fiolkom zawierającym roztwór pośredni EA o stężeniu 1 000 ng / ml, jak wskazano w kroku 4.1, oraz fiolkę do płukania. Przeanalizować fiolkę do płukania dwukrotnie, na początku i na końcu partii próbki.
  9. W kolumnie Plik metody listy roboczej załaduj plik metody pozyskiwania zapisany wcześniej w kroku 3.5.
  10. Utwórz folder, w którym zostaną zapisane wszystkie pobrane pliki danych i rozsyłane wszystkie próbki, wybierając folder w kolumnie Przykładowa ścieżka.
    UWAGA: Upewnij się, że używasz tego samego folderu do zapisania wszystkich plików wygenerowanych podczas badania walidacyjnego w celu dalszego przetwarzania. Podczas kondycjonowania kolumny wartości, przy których ciśnienie się stabilizuje, mogą się nieznacznie różnić. Niemniej jednak upewnij się, że ciśnienie jest stabilne przed ponownym zwiększeniem natężenia przepływu, aby zachować integralność kolumny. Ponadto, gdy zostanie osiągnięte robocze natężenie przepływu, ciśnienie musi być również stabilne, aby uzyskać odtwarzalną separację chromatograficzną.
  11. Przejdź do górnego paska narzędzi oprogramowania i uruchom listę roboczą.

5. Przetwarzanie danych w celu stworzenia metody kwantyfikacji

  1. Po wykonaniu listy roboczej otwórz oprogramowanie jakościowe.
  2. Załaduj wszystkie analizowane próbki, klikając Plik | Otwórz listę roboczą.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy próbkę odpowiadającą roztworowi pośredniemu EA o stężeniu 1 000 ng/ml, przejdź do Edytuj chromatogram, a następnie wybierz Typ | Wyekstrahowany chromatogram jonowy i wprowadzić teoretyczną masę cząsteczkową jonu protonowanego odnoszącego się do każdego EA. Następnie kliknij Dodaj, a na końcu OK. Ponieważ zestaw analitów składa się z sześciu EA i powiązanych z nimi epimerów, które mają dokładnie tę samą masę, pojawi się sześć wyekstrahowanych chromatogramów jonowych.
    UWAGA: Parametr Width zmienia szerokość okna m/z. Zaleca się wybór wystarczająco szerokiego okna m/z w przypadku trudności ze znalezieniem piku chromatograficznego interesującego analitu. Zaleca się jednak ustawienie wąskich okien m/z, aby uniknąć ewentualnych zakłóceń (poniżej 0,05 jednostki).
  4. Na każdym ekstrahowanym chromatogramie jonowym pojawią się dwa piki chromatograficzne związane z głównym EA i jego epimerem. Kliknij prawym przyciskiem myszy, zaznaczając cały obszar jednego szczytu. W związku z tym widmo ruchliwości jonów pojawi się tuż poniżej.
  5. Przejdź do osi x widma ruchliwości jonów, kliknij prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij Przekrój kolizji. Zapisz wartość CCS.
    UWAGA: Jeśli wartości CCS nie pojawią się automatycznie, przejdź do opcji Kalibruj na górnym pasku narzędzi, a następnie do Kalkulator mobilności i ręcznie wpisz wartość mobilności, aby uzyskać odpowiadający im NUW.
  6. Wybrać obszar odpowiadający drugiemu pikowi chromatograficznemu w obrębie tego samego chromatogramu jonowego i powtórzyć kroki 5.4 i 5.5.
  7. Podobnie, wzorzec fragmentacji pojawi się również po kroku 5.4. Na podstawie wzorca fragmentacji opisanego w literaturze i bazach danych porównaj i wybierz najbardziej intensywny jon produktowy jako uzupełniający punkt identyfikacji.
  8. Zapisz czas retencji, wartość CCS i dokładną masę adduktu jonów głównych (zwykle jonu protonowanego) każdego EA, aby stworzyć metodę ilościową.
  9. Powtórzyć kroki 5.4-5.8 dla pozostałych analitów.
  10. Zaznacz wszystkie masy cząsteczkowe wygenerowane w kroku 5.3, klikając je i naciskając Ctrl. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Kopiuj. Przejdź do drugiego przykładu odpowiadającego rozwiązaniu pośredniemu EA, kliknij go prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Wklej. Chromatogramy jonowe i widma ruchliwości zostaną automatycznie wyodrębnione.
  11. Należy dokładnie sprawdzić parametry identyfikacyjne dla wszystkich analitów w tej drugiej próbce.

6. Stworzenie metody przetwarzania danych do rutynowego oznaczania alkaloidów sporyszu

  1. Otwórz oprogramowanie i kliknij kartę Zarządzanie metodami.
  2. Kliknij Ustawienia analitu i wprowadź nazwę każdego EA wraz z jego czasem retencji, wartością CCS i masą protonowanych adduktów zebranych w krokach od 5.4. do 5.9. W razie potrzeby należy zmienić tolerancję każdego punktu identyfikacyjnego, chociaż do stosowania tego protokołu zalecane są ustawienia domyślne.
    UWAGA: Im wyższe ustawione wartości tolerancji, tym większe prawdopodobieństwo radzenia sobie z fałszywie dodatnimi, ponieważ dopuszczalne jest większe odchylenie od wartości teoretycznych. Podobnie zbyt rygorystyczne wartości tolerancji mogą prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. Dzieje się tak, gdy odchylenie od wartości teoretycznej jest spowodowane wyłącznie wydajnością instrumentu.
  3. Zachowaj metodę oznaczania ilościowego do dalszego wykorzystania.

7. Pobieranie próbek

  1. Próbki pszenicy i owsa należy pobierać w supermarketach, najlepiej w pojemnikach o wadze 1 kg, zgodnie z wytycznymi Komisji Europejskiej dotyczącymi pobierania próbek określonymi przez Komisję Europejską20. Jeśli opakowania 1 kg nie są dostępne, po prostu upewnij się, że masz co najmniej 50 g próbek, aby zakończyć całą analizę.
  2. Zmiel próbki za pomocą młynka. W tym badaniu użyto młynka ostrzowego do zmielenia całej zawartości opakowań, które następnie zostały zwrócone do oryginalnych opakowań w celu homogenizacji.
    UWAGA: Dokładnie wyczyść młynek między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Użyj fartucha laboratoryjnego.
  3. Homogenizowane próbki należy rozdzielić na porcje w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i przechowywać w chłodnych i suchych warunkach.

8. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie harmonogramu przeprowadzenia badania walidacyjnego przez trzy nienastępujące po sobie dni (w celu oceny odtwarzalności we własnym zakresie). Dla każdego dnia oznaczać trzy poziomy stężenia, wzmacniając próbki o stężeniu 225 ng/g (1,5 ml), 150 ng/g (ML) i 75 ng/g (0,5 ml). Zbadaj każdy poziom w trzech egzemplarzach, reprezentując dziewięć próbek wzbogaconych oraz kolejne trzy próbki ślepe dziennie.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę 3 dni walidacji, wymagane będzie łącznie 36 próbek wraz z kolejnymi 8 próbkami ślepymi przeznaczonymi do przygotowania krzywej kalibracyjnej dopasowanej do matrycy. Używaj rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych przez całą tę sekcję protokołu.
  2. Odważyć 1 g próbki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Podczas przeprowadzania badania walidacyjnego należy wzmocnić próbki zaraz po ważeniu 50 μl odpowiedniego roboczego roztworu wzorcowego opisanego w krokach 1.3. oraz 1.5.
  3. Dodać 4 ml roztworu ekstrakcyjnego [wodny roztwór węglanu amonu acetonitrylu:5 mM (85:15, v/v)]. Wirować próbkę przez 1 minutę.
  4. Odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 9 750 × g i temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Pojemność wirówki może być czynnikiem ograniczającym procedurę, dlatego zaleca się jednoczesną ekstrakcję tylko dokładnej liczby próbek, które zmieszczą się w wirówce.
  5. Przenieść cały supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 150 mg mieszaniny sorbentu oczyszczającego (1:1, m/m). Wirować próbkę przez 1 minutę.
  6. Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 9 750 × g i temperaturze 4 °C.
  7. Zebrać supernatant i umieścić go w fiolce o pojemności 4 ml ze szkła oranżowego. Odparować ekstrakt pod delikatnym strumieniem azotu.
    UWAGA: Próbki muszą być suszone w temperaturze -20 °C, jeśli nie zostały przeanalizowane tego samego dnia.
  8. Rozpuść próbkę w 750 μl mieszaniny metanol-woda (1:1, v/v).
  9. Przenieść ekstrakt do strzykawki o pojemności 2 ml i przefiltrować go przez nylonowy filtr 0,22 μm do bursztynowej fiolki chromatograficznej o pojemności 1,5 ml.
  10. Odtworzone ekstrakty z ośmiu próbek zerowych przeznaczonych do krzywej kalibracyjnej dopasowanej do matrycy zebrać do fiolki ze szkła oranżowego o pojemności 12 ml (każda próbka jest ponownie zawieszona w 750 μl, co odpowiada całkowitej objętości 6 ml).
  11. Pobrać pipetą 1 ml roztworu pośredniego o stężeniu 1 000 ng/ml (83,33 ng/ml dla każdego alkaloidu sporyszu) (krok 1.2) do fiolki ze szkła oranżowego o pojemności 2 ml, wysuszyć rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem azotu i ponownie zawiesić w 1 ml wcześniej pobranego ekstraktu próbki ślepej.
    UWAGA: Ta mieszanina o stężeniu 1,000 ng/ml (83,33 ng/ml dla każdego EA) zostanie użyta do przygotowania krzywej kalibracyjnej dopasowanej do matrycy.
  12. Przygotować dziesięć fiolek ze szkła oranżowego o pojemności 2 ml i umieścić w każdej z nich 450 μl ekstraktu z próbki zerowej (etap 8.10) i oznaczyć je numerami od 1 do 10. Każda fiolka będzie punktem krzywej kalibracyjnej.
    UWAGA: W tym protokole użyto 450 μl, ponieważ była to najniższa wartość, jaką urządzenie LC mogło osiągnąć wewnątrz fiolki bez użycia wkładek. Jeżeli igła nie sięga tak głęboko w fiolkę, należy zwiększyć objętość i w związku z tym obliczyć, ile dodatkowych próbek ślepych należy wyekstrahować, biorąc pod uwagę, że każda z nich jest ponownie zawieszona w 750 μl mieszaniny metanol:woda (1/1, v:v).
  13. Zbuduj krzywą kalibracyjną przez szeregowe rozcieńczanie. Przenieść 450 μl mieszanki przygotowanej w kroku 8.11. do fiolki 1, która zawiera już 450 μl ekstraktu próbki ślepej, w celu uzyskania stężenia 41,67 ng/ml (najwyższy punkt kalibracji). Wirować fiolkę przez 2 minuty
    UWAGA: Objętość mieszaniny musi odpowiadać objętości ekstraktu próbki ślepej, aby rozcieńczyć ją dwukrotnie na każdym etapie.
  14. Przenieść 450 μl z fiolki 1 do fiolki 2, która zawiera już 450 μl ekstraktu z próbki ślepej, aby osiągnąć stężenie 20,83 ng/ml (drugi najwyższy punkt kalibracji).
  15. Powtórzyć krok 8.14 (tj. od fiolki 2 do fiolki 3 i tak dalej) i kontynuować kolejno, aż do uzyskania dziesięciu punktów kalibracji. Zakres stężeń dla każdego EA będzie wtedy wynosił: 41,67, 20,83, 10,42, 5,21, 2,60, 1,30, 0,65, 0,33, 0,16 i 0,08 ng/ml.
  16. Przygotować wzorcową mieszaninę o stężeniu 1 000 ng/ml (83,33 ng/ml dla każdego EA), jak opisano w kroku 8.11, ale używając 1 ml mieszaniny metanol:woda (1:1, v/v).
  17. Przygotować wzorcową krzywą kalibracyjną zgodnie z opisem w krokach od 8.13 do 8.15, ale przy użyciu 450 μl mieszaniny metanol:woda (1:1, v/v) do seryjnych rozcieńczeń. Ta krzywa kalibracyjna zostanie wykorzystana do oceny efektu matrycy poprzez porównanie jej z krzywą kalibracyjną dopasowaną do matrycy.

9. Przetwarzanie danych ilościowych

  1. Zainicjuj i uruchom instrument zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach od 4.1 do 4.11. Zobacz Rysunek 2 dla listy roboczej używanej w tym protokole.
    UWAGA: Pisząc listę roboczą dla krzywych kalibracyjnych, wstrzyknij je przed wzbogaconymi próbkami, zaczynając od standardowej krzywej kalibracyjnej od najniższego do najwyższego stężenia, fiolki do płukania zawierającej metanol:woda (1:1, v/v) i krzywej kalibracyjnej dopasowanej do matrycy od najniższego do najwyższego stężenia.
  2. Otwórz oprogramowanie ilościowe i przejdź do zakładki TASQ Quick | Importuj partię w lewym dolnym rogu.
  3. Wybierz folder utworzony w kroku 4.10. zawierający wszystkie surowe dane (pliki związane z informacjami uzyskanymi po analizie LC-IMS-MS dla wszystkich próbek uwzględnionych na liście roboczej).
  4. Po zaimportowaniu do oprogramowania przejdź do Przetwarzaj partię, tuż poniżej Importuj partię.
  5. Należy wybrać próbki do przetworzenia (tj. 27 próbek wzbogaconych, 9 próbek ślepych i obie krzywe kalibracyjne) oraz metodę przetwarzania danych utworzoną wcześniej w krokach od 6.1 do 6.3. Pojawi się okno z różnymi parametrami do ustawienia (np. między innymi typ integratora do oceny pików chromatograficznych lub typ sygnału analitycznego do rozważenia). Zmień te parametry zgodnie z potrzebami, chociaż wartości domyślne są odpowiednie do wykonywania tego protokołu.
  6. Przejdź do sekcji Przeglądanie po zakończeniu przetwarzania danych i sprawdź, czy nie występują jakiekolwiek problemy związane z automatyczną integracją, takie jak wybór nieprawidłowych pików chromatograficznych, które mogą znajdować się zbyt blisko siebie. W takim przypadku należy zawęzić wartości odnoszące się do tolerancji czasu retencji, tolerancji wartości CCS i/lub błędu masy pierwotnie ustalonego w pliku metody ilościowej i ponownie przetworzyć dane. Jeśli automatyczne całkowanie pików nadal wybiera nieprawidłowe piki, należy ręcznie całkować pik, wybierając obszar na chromatogramie, który pojawia się w oknie Przegląd przesiewowy (w tym celu należy wziąć pod uwagę parametry analityczne uzyskane dla wzorców EA w sekcji 5).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przejrzeć każdą próbkę, ponieważ niektóre główne pary EA-epimer mają bardzo podobne czasy retencji i mogą być błędnie identyfikowane przez oprogramowanie.
  7. Po pomyślnym zintegrowaniu wszystkich pików dla wszystkich próbek, kliknij zakładkę Zarządzanie partiami w lewym górnym rogu i wskaż typ próbki powiązany z każdą analizą: rozpuszczalnik, ślepa próba, kontrola jakości, próbka lub punkt kalibracji. W tym drugim przypadku przypisz każdy punkt kalibracji na poziomie z numerem.
  8. Na tej samej karcie Zarządzanie partiami przejdź do dolnego okna o nazwie Stężenie partii i określ wartość stężenia dla każdego poziomu ustalonego w poprzednim kroku. Gdy to zrobisz, kliknij Zapisz stężenia.
  9. Kliknij Quantify batch i zmień parametry zgodnie z potrzebami (tj. model pasujący do danych kalibracyjnych, ważenie, czy model jest zmuszony do przekroczenia zera itp.). Wartości domyślne są odpowiednie do wykonania tego protokołu, z wyjątkiem ważenia krzywych kalibracyjnych, które zostało przełączone na 1/x.
    UWAGA: Ponieważ oprogramowanie może uwzględniać tylko jedną krzywą kalibracyjną na raz, konieczne jest dwukrotne powtórzenie kroku 9.9, aby uzyskać informacje o krzywych kalibracyjnych dopasowanych do wzorca i matrycy. W tym protokole do ilościowego oznaczania analitów użyto krzywych kalibracyjnych dopasowanych do matrycy, więc najpierw oceniono krzywe kalibracyjne rozpuszczalnika, wyodrębniono dane kalibracyjne, jak wyjaśniono później w kroku 9.13, a na koniec wybrano krzywe kalibracyjne dopasowane do matrycy w celu przeprowadzenia kwantyfikacji próbek.
  10. Po przeprowadzeniu kwantyfikacji alkaloidów sporyszu zgodnie z plikiem metody kwantyfikacji, kliknij zakładkę Kwantyfikacja w górnej części ekranu.
  11. Jeśli domyślne parametry ustawione w kroku 9.9 nie zapewniają dobrej liniowości i precyzji, dostosuj krzywe kalibracji, zmieniając dopasowanie i wagę, klikając wykres prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dobry model liniowy (R2 > 0,99) z odpowiednią precyzją na każdym poziomie kalibracji (odchylenie poniżej 20%).
    UWAGA: Oprogramowanie oznaczy na czerwono komórki z tych poziomów kalibracji, które nie zapewniają odpowiedniej precyzji.
  12. Po zakończeniu kliknij prawym przyciskiem myszy folder wsadowy po lewej stronie ekranu i wybierz opcję Generuj raport. Następnie wybierz opcję Kwantyfikacja analitu, aby wyeksportować raport do żądanego formatu.

Wyniki

W pierwszej kolejności do instrumentu LC-IMS-MS wstrzyknięto roztwory wzorców roboczych w celu uzyskania wszystkich cech identyfikacyjnych (tj. czasu retencji, CCS i widm masowych) dla każdego analizowanego tutaj EA. Ponieważ parametry identyfikacyjne, z wyjątkiem dokładnej masy, były początkowo nieznane, metoda akwizycji opierała się na zdarzeniu dwuskanowym, rozpoczynającym się od pełnego skanowania całego widma masowego, a następnie bbCID. Retrospektywne podejście do niniejszego badania jest możliwe dzięki wysokorozdzielczemu spektrometrowi mas Q-TOF, który pozyskuje i generuje dane bez żadnych danych wejściowych ani uprzednich informacji o analitach. W pozyskanych danych wyszukano dokładną masę każdej pary głównych epimerów EA, aby uzyskać również ich pozostałe charakterystyki identyfikacyjne (tj. czasy retencji i wartości CCS), które zostaną wykorzystane do stworzenia metody ilościowej do przetwarzania danych z próbek. Parametry eksperymentalne uzyskane po analizie przedstawiono szczegółowo w Tabeli 1.

Rozdział chromatograficzny zapewnił wyraźne i dobrze rozdzielone piki dla każdej głównej pary epimerów EA, z wyjątkiem Et i Etn (Rysunek 3). Podobieństwo czasów retencji pików chromatograficznych dla Et (6,85 min) i Etn (6,98 min) spowodowało niewystarczającą rozdzielczość między nimi, co objawia się niewielkim nakładaniem na siebie i w konsekwencji może prowadzić do błędów w oznaczaniu ilościowym, biorąc pod uwagę, że czasy retencji mogą ulegać przesunięciom w trakcie serii pomiarowych. Niemniej jednak, w widmach mobilności jonowej (Rysunek 4) zaobserwowano rozdzielenie tej samej pary cząsteczek do linii bazowej, uzyskując rozróżnialne wartości CCS dla każdego anality; wykazuje to zatem zalety zastosowania IMS podczas pracy z zestawem związków o podobnej strukturze.

Po ustaleniu parametrów identyfikacji dla każdego EA, zestaw próbek przygotowano zgodnie z obowiązującymi przepisami europejskimi dotyczącymi walidacji metod analitycznych20. Wybrano trzy poziomy kalibracyjne w oparciu o ML ustanowiony przez organy europejskie: sam limit (150 µg/kg), 1,5x ML (225 µg/kg) oraz 0,5x ML (75 µg/kg). Należy pamiętać, że ten ML odpowiada sumie całkowitej 12 EA. Na potrzeby walidacji przyjęto równy udział w ML; w związku z tym testowane poziomy stężeń dla każdego EA wynosiły odpowiednio 12,50, 18,75 i 6,25 µg/kg. Ponadto przygotowano zestaw ośmiu próbek ślepych oraz dwie krzywe kalibracyjne w czystym rozpuszczalniku (standardowa krzywa kalibracyjna) wraz z krzywą kalibracyjną dopasowaną do matrycy, a następnie przeanalizowano je w ramach tej samej serii analitycznej. Zakres liniowy oceniano w siedmiu punktach w zakresie stężeń od 0,08 do 41,6 ng/L (instrumentalne poziomy stężeń dla każdego EA). Parametry sprawności metody przedstawiono w Tabeli 2.

W pierwszej kolejności w oprogramowaniu ilościowym sporządzono krzywe kalibracyjne dla każdego związku, a zakres liniowy oceniono, przyjmując powierzchnię piku jako funkcję stężenia analitytu. Ważne jest uzyskanie dobrego dopasowania liniowego (R2 > 0,99) przy jednoczesnym zapewnieniu względnego odchylenia standardowego poniżej 20% w odniesieniu do precyzji dla każdego poziomu stężenia. W tym celu można zmienić wagę krzywej na „1/x”. Dobą liniowość zaobserwowano dla wszystkich analitytów w zakresie liniowym 2,6-41,3 ng/mL (1,95-31,2 g/kg w próbkach); jednak dla niektórych analitytów zakres liniowy był jeszcze szerszy, z dolną granicą na poziomie 0,65 ng/mL, przy zachowaniu stosunku sygnału do szumu powyżej 10. Rysunek 5 przedstawia przykład (a) standardowej i (b) dopasowanej do matrycy krzywej kalibracyjnej dla Econ.

Porównanie nachyleń krzywych kalibracyjnych standardowych i dopasowanych do matrycy dostarcza informacji o tym, jak potencjalne substancje współeluujące z matrycy mogą wpływać na analizę. Zakłócenie to jest znane jako efekt tłumienia/wzmocnienia sygnału (SSE) i można je ocenić poprzez porównanie nachyleń obu krzywych kalibracyjnych i zastosowanie następującego równania:

Wzór SSE dla kalibracji; równanie służące do porównania krzywych standardowej i dopasowanej do matrycy; analiza danych.

Jak pokazano w Tabeli 2, wartość SSE mieściła się w przedziale od -23 do 18%, co wskazuje, że obecność matrycy niemal nie wpływa na jonizację analitów; w związku z tym ich oznaczanie ilościowe można przeprowadzić przy użyciu standardowej krzywej kalibracyjnej.

Następnie, znając wpływ matrycy, kolejny krok polega na oznaczeniu ilościowym wzbogaconych próbek na trzech wspomnianych wcześniej poziomach stężeń z wykorzystaniem krzywych kalibracyjnych, aby ocenić, jaka część początkowego EA zostaje odzyskana po procesie ekstrakcji. Ze względu na niską wartość SSE, w oprogramowaniu ilościowym wykorzystano krzywe kalibracyjne przygotowane w rozpuszczalniku, aby automatycznie wyznaczyć stężenie w próbach wzbogaconych. Aby obliczyć odzysk, zmierzone stężenie porównano następnie ze stężeniem teoretycznym zgodnie z poniższym równaniem:

Wzór na odzysk: 100 x (stężenie zmierzone/stężenie teoretyczne); równanie, obliczenie.

Wszystkie anality pokazaly wartości odzysku w zakresie 72-117% dla wszystkich poziomów stężeń. Oznacza to, że metoda dostarczyła pomiarów stężeń w próbkach wzbogaconych na tyle zbliżonych do wartości teoretycznych, że wykazała tym samym właściwą dokładność. Niemniej jednak, metoda wykazała ograniczoną dokładność w przypadku Etn, którego wartości stężeń wynosiły od 43% do 45% w odniesieniu do teoretycznych poziomów wzbogacenia. Precyzję pomiarów oceniono poprzez obliczenie względnego odchylenia standardowego (RSD) odzysku dla każdego poziomu wzbogacenia otrzymanego w tym samym dniu (RSDr, n = 3) oraz w trakcie całego badania (RSDWR, n = 9). Odnotowano akceptowalną precyzję, biorąc pod uwagę, że wszystkie wartości wahały się poniżej 20%.

W celu oceny czułości proponowanej metody określono granice oznaczania (LOQ) na podstawie krzywej kalibracyjnej dopasowanej do matrycy. W niniejszym protokole wartości te wyznaczono jako najniższe stężenie w zakresie liniowym krzywej, dla którego odchylenie od wartości teoretycznej było mniejsze niż 20%, a stosunek sygnału do szumu przekraczał 10. Jak pokazano w Tabeli 2, wartości LOQ mieściły się w zakresie od 0,65 do 2,60 ng/mL (od 0,49 do 1,95 μg/kg w próbkach).

Schemat przygotowania roztworu alkaloidów sporyszowych, przedstawiający etapy rozcieńczania i użycie acetonitrylu do walidacji.
Rycina 1: Schematyczny przebieg przygotowania pośrednich i roboczych roztworów wzorcowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat listy roboczej chromatografii; kalibracja rozpuszczalnika, krzywe dopasowane do macierzy, analiza próbek zbóż.
Rysunek 2: Lista robocza opracowana dla analizy LC-IMS-MS w badaniu walidacyjnym połączonych próbek zbóż. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny przedstawiający piki rozdzielenia związków; wyniki analizy danych intensywności w funkcji czasu.
Rycina 3: Nałożone na siebie ekstrakowane chromatogramy jonowe analizowanych EAs. Skróty: EAs = alkaloidy sporyszowe; Eco = ergokornina; Econ = ergokorninina; Ecr = ergokrystyna; Ecrn = ergokrystynina; Ekr = ergokryptyna; Ekrn = ergokryptynina; Emn = ergometrynina; Es = ergosyna; Esn = ergosynina; Et = ergotamina; Etn = ergotaminina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres chromatograficzny pokazujący intensywność Et, Etn w funkcji czasu i mobilności; analiza rozdziału.
Rycina 4: Ekstrahowany chromatogram jonowy (góra) oraz widma mobilności jonowej (dół) dla Et i Etn. Skróty: Et = Ergotamina; Etn = Ergotaminina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stężenie ergokornininy w funkcji liniowości sygnału, R²>0,99, wykres kalibracyjny, chemia analityczna.
Rysunek 5: Krzywe kalibracyjne dla Econ. (A) Czysty rozpuszczalnik i (B) dopasowane do matrycy. Skrót: Econ = Ergokorninina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

AnalityRt (min)CCS (Å)2)[M+H]⁺+ (m/z)
Ekologiczne6.95231.67562.3029
Ekonomia8.21229.96562.3029
Ecr8.61237.74610.3029
Ercn9.85235.56610.3029
Ekr8.15233.61576.3185
Ekrn9.38229.93576.3185
Em3.57179.35326.1668
Emn4.48179.01326.1668
Es6.41229.29548.2872
Esn6.54226.65548.2872
Et6.85230.33582.2716
Etn6.98228.3582.2716

Tabela 1: Scharakteryzowane parametry LC-IMS-MS służące do jednoznacznej identyfikacji alkaloidów sporyszowych z zastosowaniem metody opisanej w niniejszym protokole.Skróty: Rt = czas retencji; CCS = przekrój czynny zderzeń; LC-IMS-MS = chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas z mobilnością jonową.

Odzysk (%)Precyzja (%) [RSDr, (RSDWR)]
AnalityLinearność (R2)SSE (%)0,5 mlML1,5 ml0,5 mlUczenie maszynowe1,5 mlLOQ w próbce (µg/kg)
Ekologia0.9937-231141111006 (15)4 (19)13 (17)0.49
Ekonomia0.9915-121051171246 (10)7 (18)8 (14)0.49
Ecr0.9965187910711013 (19)13 (18)6 (18)0.49
Ercn0.9906-209911010410 (15)11 (10)12 (10)0.49
Ekr0.992-10106101936 (9)7 (7)10 (9)0.49
Ekrn0.9925-16971181145 (11)7 (4)9 (9)0.98
Em0.9947-97279747 (8)6 (5)9 (9)0.98
Emn0.9909-328387846 (5)11 (10)7 (9)1.95
Es0.9953-16891121115 (7)8 (5)15 (8)0.98
Esn0.9971-138690813 (6)14 (12)10 (10)0.49
Et0.9953-1679888112 (15)19 (18)11 (20)0.98
Etn0.9997-14543449 (12)5 (13)12 (17)0.98

Tabela 2: Parametry wydajności metod EA pod kątem liniowości, efektu matrycy, odzysku, precyzji i granic oznaczalności.Skróty: Eco = ergokornina; Econ = ergokorninina; Ecr = ergokrystyna; Ecrn = ergokrystynina; Ekr = ergokryptyna; Ekrn = ergokryptynina; Emn = ergometrynina; Es = ergosyna; Esn = ergosynina; Et = ergotamina; Etn = ergotaminina; LOQ = granica oznaczalności; ML = poziom maksymalny; RSDr = względne odchylenie standardowe powtarzalności; RSDWR = względne odchylenie standardowe wewnątrz laboratorium; SEE = efekt tłumienia/wzmocnienia.

Dyskusja

Skuteczne zastosowanie tego protokołu opiera się na optymalizacji procedury ekstrakcji, wcześniej przeprowadzonej przez Carbonell-Rozas i wsp.17, którzy wdrożyli użycie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego wystarczająco skutecznego do ekstrakcji EA ze złożonych matryc spożywczych, takich jak jęczmień i pszenica, oraz oczyszczania, które zapewniło stosunkowo niskie wartości SSE. Wybór rozpuszczalnika ekstrakcyjnego stanowi krytyczny krok, biorąc pod uwagę charakterystykę chemiczną analitów oraz podatność EA na rozkład i epimeryzację, ale jednocześnie skład matrycy poddanej analizie. W tym przypadku EA (i ogólnie mykotoksyny) zapewniają bardzo dobrą wydajność, gdy wybranym rozpuszczalnikiem jest acetonitryl (rozpuszczalnik nieprotonowy, który może zapobiegać epimeryzacji) 21,22,23,24. Co więcej, w przypadku EA dodatek węglanu amonu zwiększa wydajność ekstrakcji poprzez zapewnienie zasadowego pH25. Ponadto należy wziąć pod uwagę stosunek rozpuszczalnika do próbki, ponieważ użycie małych objętości rozpuszczalnika może spowodować nasycenie26, co znajduje odzwierciedlenie w słabych wartościach odzysku. Ponadto duże objętości rozpuszczalników oznaczają większe rozcieńczenie roztworów analitów, utrudniając ich wykrywanie i/lub sprzyjając ekstrakcji związków matrycowych, które mogą zakłócać ich oznaczanie. Kolejny krok w tej metodologii ekstrakcji – etap oczyszczania – musi zostać zaprojektowany z perspektywy dopasowania do celu, biorąc pod uwagę skład matrycy. To ostatecznie określi, jak czyste są ekstrakty i jak silnie matryca wpływa na oznaczenie analityczne. W tym protokole mieszanina C18:Z-Sep+ (1:1, w/w) została z powodzeniem wykorzystana jako dyspersyjny sorbent w fazie stałej, co znalazło odzwierciedlenie w stosunkowo niskim zgłoszonym SSE. Biorąc pod uwagę, że EA są dobrze ekstrahowane acetonitrylem, w ekstrakcie można również spodziewać się innych słabo lub niepolarnych koeluantów. W tym kontekście C18 jest sorbentem czyszczącym tradycyjnie stosowanym do celów ogólnych, zatrzymującym związki niepolarne z matrycy, podczas gdy Z-Sep+ jest zwykle zalecany do matryc zawierających wysoki procent tłuszczu lub pigmentów27. Należy zauważyć, że większość sorbentów, w tym szeroko stosowana amina pierwszorzędowo-drugorzędowa (PSA) lub grafityzowana sadza (GCB), może wchodzić w interakcje z analitami, powodując ich zatrzymywanie w fazie stałej i utratę do późniejszego oznaczenia analitycznego28. Możliwe interakcje między analitami a sorbentami mogą być również przedmiotem badań podczas optymalizacji etapu oczyszczania, więc zmiana typologii lub, co ważniejsze, ilości sorbentu może być dobrym punktem wyjścia do optymalizacji. W protokole tym zastosowano wcześniej opracowaną metodę ekstrakcji, mimo że obserwowana tu poprawność dla Etn mocno różniła się od wartości uzyskanych w poprzednim badaniu. Chociaż para Et/Etn została opisana jako stabilna chemicznie29, wcześniej obserwowano niespójności po długotrwałym przechowywaniu30. Protokół ten został opracowany w celu zachowania integralności wzorców analitycznych poprzez suszenie, przechowywanie, a następnie ponowne zawieszanie w tym samym dniu analizy; niemniej jednak integralność norm analitycznych EA powinna zostać sprawdzona przed rozpoczęciem części doświadczalnej.

Protokół ten wybiera LC-IMS-MS jako platformę analityczną w celu wykazania jego stosowalności i poprawy wydajności w porównaniu z tradycyjnymi podejściami LC-MS obejmującymi określenie tych samych EA. Jak pokazano na rysunku 3, separacja chromatograficzna badanych EA jest optymalna dla pięciu z sześciu głównych par EA-epimer, co oznacza, że jeszcze bardziej zoptymalizowana metoda chromatograficzna może doprowadzić do całkowitego rozdzielenia pików. Niemniej jednak nie był konieczny żaden dodatkowy wysiłek w celu poprawy separacji chromatograficznej, ponieważ wymiar IMS był w stanie naprawić słabą rozdzielczość pokazaną w LC. Wadą zmniejszonej optymalizacji separacji chromatograficznej jest zwiększona złożoność przetwarzania danych, wynikająca z wprowadzenia dodatkowego etapu separacji, który dodaje kolejny wymiar. Chociaż protokół ten jest teoretycznie zaprojektowany jako metoda celowana do specyficznego oznaczania EA, akwizycja danych w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) została przeprowadzona jako nieukierunkowane badanie przesiewowe. Oznacza to, że urządzenie stale skanowało każdą cechę pochodzącą z próbki, a retrospektywnie EA zostały zidentyfikowane i określone ilościowo. Wiadomo, że takie podejście zmniejsza czułość metody, ale wręcz przeciwnie, pozwala na identyfikację nieznanych związków. Niemniej jednak LOQ podane w tabeli 2 [0,65 - 2,6 ng/ml (0,49 - 1,95 μg/kg w próbkach)] są porównywalne z tymi zgłaszanymi przez tradycyjne metody LC-MS do oznaczania EA, które działają poprzez ukierunkowane akwizycje31. Może to oznaczać, że implementacja IMS zapewnia wzmocniony sygnał analityczny, który umożliwia lepszą dyskryminację od szumu tła, co bezpośrednio wpływa na czułość metody. Kluczowym czynnikiem, który wpływa również na intensywność sygnału analitycznego, jest skuteczność jonizacji w źródle. Jeśli źródło nie zapewnia optymalnych warunków pod względem głównie napięcia, warunków gazowych i temperatury, nie wszystkie cząsteczki analitu zostaną zjonizowane i wykryte; w związku z tym powodując utratę intensywności bezwzględnej. W związku z tym zaleca się zbadanie parametrów źródła jonów w celu uzyskania lepszego sygnału analitycznego.

Celem tego protokołu jest pokazanie zalet stosowania LC-IMS-MS w analizie bezpieczeństwa żywności na przykładzie oznaczania EA. Integracja spektrometrii ruchliwości jonów z przepływami pracy chromatografii cieczowej i spektrometrii mas zapewnia zwiększoną czułość i lepszą rozdzielczość do rozdzielania tych związków, co może stać się szczególnie skomplikowane, biorąc pod uwagę izomerię regulowanych alkaloidów sporyszu. Jak wykazano, ta platforma analityczna z powodzeniem pokonała wyzwania chromatograficzne spowodowane częściowym oddzieleniem pików chromatograficznych od epimerów, a jednocześnie nieukierunkowana akwizycja zapewniła LOQ porównywalne z tymi zgłaszanymi metodami celowanymi. Opierając się na wykazanych wynikach, LC-IMS-MS okazuje się być potężną platformą analityczną do opracowywania metodologii wielopozostałościowych dla zanieczyszczeń żywności przy użyciu metod nieukierunkowanych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Consejería de Universidad, Investigación e Innovación - Junta de Andalucía (PROYEXCEL_00195) oraz grant podoktorski przyznany przez Generalitat Valenciana i Europejski Fundusz Społeczny+ (CIAPOS/2022/049). Autorzy dziękują "Centro de Instrumentación Científica (CIC)" na Uniwersytecie w Granadzie za udostępnienie oprzyrządowania analitycznego użytego w tym protokole.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylVWR83640.32
Probówki ze szkła bursztynowego 4 mlVWR548-0052
Probówki ze szkła bursztynowego 12 mlVWR548-0903
Fiolki bursztynowe 1,5 mlAgilent5190-9063
Węglan amonuFluka9716
Waga analityczna BAS 31 Boeco4400519
Balance CP 323 S Sartorius23-84182
C18Supelco52604-U
Probówki wirówkowe, 15 mlVWR525-1082
Probówki wirówkowe, 50 mlVWR525-0155
Wirówka uniwersalna 320 RHettich1406
Kompas HyStar Oprogramowanie do akwizycjidanych Bruker
OprogramowaniejakościoweBruker
Elute PLUS  Parownik UHPLCBruker
EVA EC-SVLMV830.012.12
Kwas mrówkowy GR do analizy ACS, Reag. Ph EurMerck100264
Młynek TitanMill300Cecotec1559
MetanolVWR83638.32
System oczyszczania wody Milli-Q (18,2 MΩ cm)MiliporeZD5211584
Końcówki do pipet 1- 5 mlLabortecnic162005
Końcówki do pipet 100 - 1000 i mikro; LLabortecnic1622222
Końcówki do pipet 5 - 200 i mikro; LLabortecnic162001
Pippette Transferpette S zmienna, DE-M 10 - 100 &mikro; LBRAND704774
Pippette Transferpette S zmienna, DE-M 100 - 1000 µ LBRAND704780
Pippette Transferpette S zmienna, DE-M 500 - 5000 µ LMARKA704782
Strzykawka 2 mlVWR613-2003
Filtr strzykawkowy 13 mm, 0,22&mikro; mPhenomenexAF-8-7707-12
TASQBrukerOprogramowanie ilościowe
timsTOFPro2 IM-HRMSBruker
Vortex Genie 2Scientific Industries15547335
Kolumna Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 (50  x  2,1 mm, 1,8 i mikro; m wielkość cząstek)Agilent 959757-902
Z-Sep+Supelco55299-USorbent na bazie tlenku cyrkonu
alkaloidy sporyszuSorbent rejestru CAS
Ergocornine (Eco)Techno SpecE178564-36-3
Ergocorninine (Econ)Techno SpecE130564-37-4
Ergocristine (Ecr)Techno SpecE180511-08-0
Ergokrystynina (Ecrn)Techno SpecE188511-07-9
Ergokryptyna (Ekr)Techno SpecE198511-09-1
Ergopkryptynina (Ekrn)Techno SpecE190511-10-4
Ergometryna (Em)Romer Labs"002067"60-79-7
Ergometryna (Emn)Romer LabsLMY-090-5ML479-00-5
Ergozyna (Es)Techno SpecE184561-94-4
Ergozynina (ESN)Techno SpecE194596-88-3
Ergotamina (Et)RomerLabs"002069"113-15-5
Ergotaminina (Etn)Romer Labs"002075"639-81-6

Bibliografia

  1. Kanu, A. B., Dwivedi, P., Tam, M., Matz, L., Hill, H. H. Jr Ion mobility-mass spectrometry. J Mass Spectrom. 43 (1), 1-22 (2008).
  2. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility Mass spectrometry measurements. Mass Spectrom Rev. 38 (3), 291-320 (2019).
  3. Feuerstein, M. L., et al. Comparability of steroid collision cross sections using three different IM-HRMS technologies: An interplatform study. J Am Soc Mass Spectrom. 33 (10), 1951-1959 (2022).
  4. Regueiro, J., Negreira, N., Berntssen, M. H. G. Ion-mobility-derived collision cross section as an additional identification point for multiresidue screening of pesticides in fish feed. Anal Chem. 88 (22), 11169-11177 (2016).
  5. Regueiro, J., Negreira, N., Hannisdal, R., Berntssen, M. H. G. Targeted approach for qualitative screening of pesticides in salmon feed by liquid chromatography coupled to traveling-wave ion mobility/quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Food Control. 78, 116-125 (2017).
  6. Hernández-Mesa, M., Monteau, F., Le Bizec, B., Dervilly-Pinel, G. Potential of ion mobility-mass spectrometry for both targeted and non-targeted analysis of phase II steroid metabolites in urine. Anal Chim Acta: X. 1, 100006(2019).
  7. George, A. C., et al. Interplatform comparison between three ion mobility techniques for human plasma lipid collision cross sections. Anal Chim Acta. 1304, 342535(2024).
  8. Mairinger, T., Causon, T. J., Hann, S. The potential of ion mobility-mass spectrometry for non-targeted metabolomics. Curr Opin Chem Biol. 42, 9-15 (2018).
  9. Hernández-Mesa, M., Escourrou, A., Monteau, F., Le Bizec, B., Dervilly-Pinel, G. Current applications and perspectives of ion mobility spectrometry to answer chemical food safety issues. TrAC Trend Anal Chem. 94, 39-53 (2017).
  10. European, C. Commission Regulation (EU) 2023/915 of 25 April 2023 on maximum levels for certain contaminants in food and repealing Regulation (EC) No 1881/2006. Off J Eur Union. 119, 103-157 (2023).
  11. Carbonell-Rozas, L., et al. Occurrence of egot alkaloids in major and minor cereals from Northern Italy: A three harvesting years scenario. J Agricl Food Chem. 71 (42), 15821-15828 (2023).
  12. Arroyo-Manzanares, N., Gámiz-Gracia, L., García-Campaña, A. M., Diana Di Mavungu, J., De Saeger, S. Fungal Metabolites. Jean-Michel Mérillon, J. -M., Ramawat, K. G. , Springer International Publishing. (2016).
  13. van Dongen, P., de Groot, A. History of ergot alkaloids from ergotism to ergometrine. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 60 (2), 109-116 (1995).
  14. European Food Safety Authority. Human and animal dietary exposure to ergot alkaloids. EFSA J. 15 (7), e04902(2017).
  15. Nam, M., Kim, D., Kim, M. -S. Simultaneous determination of total ergot alkaloids in wheat flour by Orbitrap mass spectrometry. Food Chem. 441, 138363(2024).
  16. García-Juan, A., León, N., Armenta, S., Pardo, O. Development and validation of an analytical method for the simultaneous determination of 12 ergot, 2 tropane, and 28 pyrrolizidine alkaloids in cereal-based food by LC-MS/MS. Food Res Int. 174 (Pt 1), 113614(2023).
  17. Carbonell-Rozas, L., Mahdjoubi, C. K., Arroyo-Manzanares, N., García-Campaña, A. M., Gámiz-Gracia, L. Occurrence of ergot alkaloids in barley and wheat from Algeria. Toxins. 13 (5), 316(2021).
  18. Carbonell-Rozas, L., Gámiz-Gracia, L., Lara, F. J., García-Campaña, A. M. Determination of the main ergot alkaloids and their epimers in oat-based functional foods by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Molecules. 26 (12), 3717(2021).
  19. Carbonell-Rozas, L., et al. Ion mobility-mass spectrometry to extend analytical performance in the determination of ergot alkaloids in cereal samples. J Chromatogr A. 1682, 463502(2022).
  20. European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2023/2782 of 14 December 2023 laying down the methods of sampling and analysis for the control of the levels of mycotoxins in food and repealing Regulation (EC) No 401/2006. Off J Eur Union. , (2023).
  21. Carbonell-Rozas, L., Vander Cruyssen, L., Dall'Asta, C., Leggieri, M. C., Battilani, P. Fit-for-purpose method development to determine co-occurring multiclass mycotoxins in apple and apple puree samples. Food Anal Methods. 16 (8), 1403-1412 (2023).
  22. Laouni, C., et al. Emerging mycotoxin occurrence in chicken feed and eggs from Algeria. Mycotoxin Res. 40, 447-456 (2024).
  23. Ben Hassouna, K., et al. Mycotoxin occurrence in milk and durum wheat samples from Tunisia using dispersive liquid-liquid microextraction and liquid chromatography with fluorescence detection. Toxins. 15 (11), 633(2023).
  24. Narváez, A., et al. Occurrence and exposure assessment of mycotoxins in ready-to-eat tree nut products through ultra-high performance liquid chromatography coupled with high resolution Q-orbitrap mass spectrometry. Metabolites. 10 (9), 344(2020).
  25. Arroyo-Manzanares, N., Rodríguez-Estévez, V., García-Campaña, A. M., Castellón-Rendón, E., Gámiz-Gracia, L. Determination of principal ergot alkaloids in swine feeding. J Sci Food Agric. 101 (12), 5214-5224 (2021).
  26. Pereira, V. L., Fernandes, J. O., Cunha, S. C. Comparative assessment of three cleanup procedures after QuEChERS extraction for determination of trichothecenes (type A and type B) in processed cereal-based baby foods by GC-MS. Food Chem. 182, 143-149 (2015).
  27. Tuzimski, T., Szubartowski, S. Method development for selected bisphenols analysis in sweetened condensed milk from a can and breast milk samples by HPLC-DAD and HPLC-QqQ-MS: Comparison of sorbents (Z-SEP, Z-SEP Plus, PSA, C18, chitin and EMR-lipid) for clean-up of QuEChERS extract. Molecules. 24 (11), 2093(2019).
  28. Łozowicka, B., Rutkowska, E., Jankowska, M. Influence of QuEChERS modifications on recovery and matrix effect during the multi-residue pesticide analysis in soil by GC/MS/MS and GC/ECD/NPD. Environ Sci Pollut Res. 24 (8), 7124-7138 (2017).
  29. Schummer, C., Xandonella, I., van Nieuwenhuyse, A., Moris, G. Epimerization of ergot alkaloids in feed. Heliyon. 6 (6), e04336(2020).
  30. Cherewyk, J. E., Grusie-Ogilvie, T. J., Parker, S. E., Blakley, B. R., Al-Dissi, A. M. The impact of storage temperature and time on ergot alkaloid concentrations. Toxins. 15 (8), 497(2023).
  31. Silva, Â, Mateus, A. R., Barros, S. C., Silva, A. S. Ergot alkaloids on cereals and seeds: Analytical methods, occurrence, and future perspectives. Molecules. 28 (20), 7233(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie alkaloid w sporyszuchromatografia cieczowa sprz ona z spektrometri masanaliza bezpiecze stwa ywno cioznaczanie ilo ci mykotoksynprzekr j czynny zderzerozdzia chromatograficznykalibracja w macierzyekstrakcja QuEChERSrozdzia epimer w
Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.