Artykuł metodologiczny

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

DOI:

10.3791/67485

⸱

8 listopada 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, San José State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko złożone Drosophila to precyzyjnie wzorowana tkanka, która ujawniła mechanizmy molekularne i procesy biologiczne kierujące morfogenezą. Jest to prosta struktura powtarzających się oczu jednostkowych, określana jako ommatidia, która służy do charakteryzowania interakcji genetycznych i funkcji genów. Mutacje, które wpływają na architekturę oka, można łatwo wykryć i przeanalizować; W związku z tym system ten jest często stosowany w instytucjach o ograniczonych zasobach. Dalsza analiza fenotypowa często obejmuje skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) do generowania obrazów o dużym powiększeniu, odpowiednich do analizy ilościowej. Jednak SEM są drogie i wymagają kosztownych odczynników; przygotowanie próbki trwa kilka dni; Często też potrzebują pełnoetatowego personelu do przygotowywania próbek i konserwacji instrumentów. Ogranicza to ich użyteczność w instytucjach o ograniczonych zasobach lub w okresie cięć budżetowych. W entomologii stosowanie technologii obrazowania cyfrowego o wysokiej rozdzielczości jest powszechną praktyką identyfikacji i charakterystyki gatunków. W artykule opisano metodę, która łączy strategie i pozwala na cyfrowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości struktur dorosłego Drosophila oraz analizę ilościową przy użyciu otwartego oprogramowania ImageJ. Przepływ pracy jest szybką i przyjazną dla studentów alternatywą, która usuwa ograniczenia niedofinansowanych i niedofinansowanych ośrodków badawczych dzięki opłacalnemu i szybkiemu podejściu do ilościowej analizy fenotypowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster to potężny model genetyczny organizmu, który od dziesięcioleci jest używany do wyjaśniania molekularnych szlaków sygnałowych i zachowań komórkowych. Wiele ewolucyjnie zachowanych szlaków sygnałowych, które są niezbędne do rozwoju wielokomórkowego, zostało po raz pierwszy zidentyfikowanych, a ich mechanizm działania zdefiniowany u Drosophila. Około 65-75% wszystkich ludzkich genów związanych z chorobami ma ortologi w Drosophila1,2. Oko dorosłego Drosophila jest ważnym modelem, który pozwolił na bezstronne badania genetyczne, które ułatwiły odkrycie ważnych konserwatywnych genów związanych z chorobami ludzkimi, w tym rakiem3,4, neurodegeneration5 i zaburzenia metaboliczne6.

Oko Drosophila składa się z ~800 jednostkowych oczu, zwanych ommatidia, które są precyzyjnie ułożone w sześciokątny wzór na powierzchni dorosłego oka7. Każde ommatidium składa się z ośmiu neuronów fotoreceptorowych, które zajmują odrębne miejsce w asymetrycznym trapezie. Są one wspierane przez cztery nienerwowe czopki i dwie pierwotne komórki pigmentowe, które wydzielają soczewkę i pseudo-stożek, aby skupić światło na wyczuwających światło rabdomerach neuronów fotoreceptorowych. Sąsiednie ommatydia są oddzielone pojedynczym rzędem międzyzębowych komórek sieciowych, składających się z drugorzędowych komórek barwnikowych, trzeciorzędowych komórek pigmentowych i mechanosensorycznych kompleksów szczeciny8,9,10.

Zaburzenia w rozwoju oczu są widoczne w oczach dorosłych jako zwiększony lub zmniejszony rozmiar oka, nienormalna obfitość lub struktura soczewek lub szczeciny, lub jako "szorstkie oko", gdzie normalnie niezmienny sześciokątny wzór jest zakłócony tak, że rząd ommatidiów nie może być już śledzony po powierzchni oka. Te fenotypy można ocenić na poziomie tkanki brutto za pomocą mikroskopów preparacyjnych. Szczegółowa analiza fenotypów tradycyjnie obejmuje skaningową mikroskopię elektronową, po której następuje ilościowa analiza obrazu11. Jednak skaningowa mikroskopia elektronowa wymaga drogiego oprzyrządowania, kosztownych odczynników, przygotowania próbki trwającego kilka dni, a często także pełnoetatowego personelu do konserwacji.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przebieg pracy w obrazowaniu struktur dorosłej Drosophila. (A) Zebrać i utrwalić dorosłe Drosophila w 70% etanolu. (B) Przygotuj próbki do obrazowania poprzez montaż punktowy i przymocowanie do kołków. (C) Uzyskuj obrazy o wysokiej rozdzielczości dzięki ustawianiu ostrości i integracji. (D) Określ ilościowo obrazy za pomocą FIDŻI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten artykuł przedstawia przepływ pracy, który jest stosunkowo tani, ma krótki czas przygotowania próbki, można go łatwo ustawić na 3-metrowym stole laboratoryjnym, nie wymaga materiałów niebezpiecznych i może być długotrwałym dodatkiem do laboratoriów badawczych Drosophila (Rysunek 1). Montaż punktowy to technika entomologiczna stosowana do suszenia na powietrzu i konserwacji małych owadów o miękkim ciele, takich jak Drosophila12. Metoda ta polega na połączeniu obiektywów mikroskopowych z lustrzankami cyfrowymi o wysokiej rozdzielczości w celu uzyskania efektywnych powiększeń od 10x do 1,000x. Ograniczona głębia ostrości nieodłącznie związana z makrofotografią jest przezwyciężana przez focus stacking: zszywanie ze sobą serii obrazów z płaszczyzną ogniskową poruszającą się po interesującym nas okazie13. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości odpowiednie do ilościowej identyfikacji fenotypów i może być łatwo dostosowana do innych interesujących struktur, takich jak skrzydło, noga, klatka piersiowa i brzuch. Przepływ pracy analizy obrazu wykorzystuje bezpłatny program do analizy obrazu FIJI (NIH ImageJ). Metodologia ta sprawia, że przygotowanie próbek, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i analiza są dostępne dla studentów studiów licencjackich i naukowców w instytucjach o ograniczonych zasobach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kolekcja i utrwalenie dorosłego Drosophila

  1. Ustaw krzyżówki Drosophila lub wybrane szczepy i umieść je w fiolkach zawierających pokarm dla much. Inkubować fiolki w żądanej temperaturze (zwykle 25 °C), aż muchy się rozwiną, a dorosłe osobniki zakończą się (~10-14 dni w temperaturze 25 °C).
  2. Znieczulij muchy CO2 i umieść je na podkładce CO2 .
  3. Posortuj muchy według pióra i wybierz osobniki o pożądanym fenotypie (np. proste skrzydła). Przygotuj sortownik much z piór, przycinając gęsie pióro tak, aby zmieściło się w zwężającym się końcu pipety serologicznej o pojemności 1 ml.
  4. Przygotuj probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml z 1 ml 70% etanolu. Umieść wybrane muchy w probówce mikrowirówki i połóż na lodzie. Probówki do mikrowirówek należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc (Rysunek 2A).
    UWAGA: Nie przechowuj much w etanolu dłużej niż 24 godziny. Długotrwałe przechowywanie much w 70% etanolu spowoduje utratę pigmentu oczu i ciała.

2. Przygotowanie próbki przez montaż punktowy

UWAGA: Drosophila to owady o miękkim ciele, które stają się kruche i zapadają się po wysuszeniu na powietrzu; dlatego ten protokół wymaga, aby próbki były obrazowane tego samego dnia, w którym zostały zamontowane. Pracuj w małych zestawach po ~5 much na raz, aby zapobiec utracie próbki. Zwiększ liczbę próbek w zestawie w oparciu o wydajność. Próbki, które wymagają więcej czasu przed obrazowaniem, mogą zostać odwodnione za pomocą serii o rosnącym stężeniu heksametyldisilazanu (HMDS)14.

  1. Wytnij małe trójkątne punkty (7,1 mm x 2,7 mm) z archiwalnego kartonu o wadze 65 funtów za pomocą specjalistycznego dziurkacza. Przygotuj punkty, zginając końcówkę (najwęższą 25%) pod kątem 90° za pomocą kleszczyków Dumont #5 z cienką końcówką (Rysunek 2B).
  2. Za pomocą kleszczyków Dumont #5 z cienką końcówką usuń muchy z probówek do mikrowirówek (krok 1.4). Delikatnie osusz muchy niestrzępiącą się chusteczką laboratoryjną, aby usunąć nadmiar etanolu. Umieść każdą muchę po lewej stronie na karcie indeksowej pod mikroskopem preparacyjnym.
    UWAGA: Usuń muchy z tuby, trzymając się struktury anatomicznej, która nie jest obszarem zainteresowania - podczas obrazowania głowy trzymamy próbki za skrzydło lub nogę. Nie trzymaj próbek za brzuch, ponieważ ta struktura służy do przyklejania muchy do punktu karty.
  3. Przygotuj klej do skóry, dostosowując jego konsystencję do pożądanej lepkości. Wymieszaj 1-2 krople kleju do skóry z 1-2 kroplami wody dejonizowanej (DI) i wymieszaj z pipetą transferową na karcie indeksowej. Podnieś kleszczami przygotowany punkt karciany na szerokim końcu i umieść niewielką ilość rozcieńczonego kleju na wygiętym końcu punktu, wcierając go w mieszankę kleju i wody (Rysunek 2C).
    UWAGA: Klej powinien nadawać się do rozprowadzania, ale nie być rzadki.
  4. Przyłóż zgiętą końcówkę czubka do przedniej strony prawego brzucha wokół segmentów brzucha 2-3 (Rysunek 2C). Zanim klej wyschnie, dokonaj niewielkich korekt muchy tak, aby oś przednio-tylna muchy była prostopadła do zgiętego końca punktu.
  5. Włóż kołek montażowy nr 3 w szeroki koniec punktu karty (Rysunek 2D) i przymocuj go do bloku przypinającego owady (Rysunek 2E). Oznacz każdą szpilkę lub rząd szpilek odpowiednim genotypem.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Przygotowanie próbki. (A) Dorosłe Drosophila są sortowane na podstawie markerów fenotypowych i zbierane do oznakowanych probówek mikrowirówek zawierających 70% etanolu na lodzie. Muchy są przechowywane w temperaturze 4°C przez noc. (B) Papierowe punkty karciane są przygotowywane przez zgięcie wąskiego końca pod kątem 90° od reszty karty za pomocą pary kleszczy #5. (C) Muchy są wydobywane z probówek i na krótko pozostawiane do wyschnięcia na powietrzu. Klej do skóry nakłada się na mały, zagięty koniec przygotowanego punktu karcianego i przykleja do dorosłej muchy w segmentach brzusznych 2-3. (D) Próbki są montowane, z etykietą identyfikacyjną, na szpilce przeciw owadom ze stali nierdzewnej #3. (E) Przypięte próbki są przechowywane na płytce z próbkami do czasu, gdy będą gotowe do akwizycji obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Akwizycja obrazowania z wykorzystaniem ostrości w wysokiej rozdzielczości

  1. Rób zdjęcia oczu muchy w wysokiej rozdzielczości za pomocą zmontowanego i dostosowanego systemu obrazowania z ustawianiem ostrości, zmontowanego i dostosowanego.
    1. Rób zdjęcia za pomocą korpusu lustrzanki cyfrowej z teleobiektywem 70-200 mm podłączonym do obiektywu mikroskopowego Apo 20x za pomocą adaptera obiektywu 77 mm.
    2. Upewnij się, że próbka jest oświetlona lampą błyskową przez dyfuzor (Rysunek 3).
    3. Kontroluj położenie Z za pomocą kontrolera Stackshot i szyny makro
      4. .
    4. Podłącz aparat, lampę błyskową i zmotoryzowany stolik do wytrzymałego statywu z anodyzowanego aluminium.
  2. Umieść każdą próbkę zamontowaną punktowo na uniwersalnym gimbalu stage z głową skierowaną tak, aby oko było skierowane w stronę obiektywu. Dokonaj regulacji pozycji głowy, delikatnie przesuwając głowę kleszczami.
    UWAGA: Duże i szybkie regulacje mogą spowodować przypadkowe ścięcie głowy.
  3. Gdy kamera jest podłączona do laptopa, dostosuj ustawienia akwizycji w oprogramowaniu. Fotografuj próbki w 20-krotnym powiększeniu z następującymi ustawieniami: moc błysku 1/32, czas otwarcia migawki 1/200, przysłona F2,8 i ISO 400. Upewnij się, że wszystkie funkcje autofokusa i stabilizacji obrazu są wyłączone.
    UWAGA: Te ustawienia równoważą optymalne oświetlenie lampy błyskowej, czas otwarcia migawki i głębię ostrości. Musiałyby one zostać dostosowane do innych powiększeń i/lub kombinacji soczewek.
  4. Ustaw lokalizację zapisywania wynikowego stosu obrazów (10-50 obrazów) w żądanym folderze plików. Upewnij się, że pamięć masowa jest wystarczająca dla obrazów (~8,5 MB na obraz).
  5. Dostosuj ustawienia stosu ostrości w jednostce sterującej Stackshot w trybie Auto Distance.
    1. Ustaw rozmiar kroku na 5 μm i oblicz liczbę kroków, ustawiając pozycję początkową i końcową stosu ostrości.
    2. Wyświetl próbkę w trybie LiveView i w aparacie w trybie automatycznego fotografowania, aby określić pozycję początkową i końcową.
    3. Przesuń szynę tak, aby najbliższa część próbki była zogniskowana (ustaw pozycję początkową), a następnie przejdź do miejsca, w którym znajduje się najdalsza cecha zainteresowania (ustaw pozycję końcową).
  6. Przywróć aparat do trybu fotografowania ręcznego i rozpocznij akwizycję obrazu z jednostki sterującej Stackshot.
    UWAGA: Czas akwizycji obrazu zależy od wielkości próbki. Im większa głębia ostrości niezbędna dla dużych próbek, tym więcej plasterków znajduje się w stosie obrazów, co wydłuży całkowity czas akwizycji.
  7. Otwórz pliki w oprogramowaniu do ustawiania ostrości, do którego się odwołuje. Wygeneruj obraz piętrowy, klikając Stos | Wyrównaj i ułóż wszystko (PMax).
  8. Zapisz ostateczny obraz na dysku twardym komputera jako plik .tif, klikając Plik | Zapisz obraz wyjściowy.
    UWAGA: W zależności od rozdzielczości pliku obrazu w stosie i liczby próbków zobrazowanych, do tworzenia kopii zapasowych obrazu mogą być konieczne duże zewnętrzne dyski twarde (1 TB). W tym protokole obrazy ułożone w stos mają około 100 MB każdy, zanim zostaną skompresowane.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Akwizycja obrazu. (A) Aparatura do obrazowania z częściami oznaczonymi w następujący sposób: a) Korpus lustrzanki cyfrowej; b) teleobiektyw; c) Obiektyw mikroskopowy 20x Apo i adapter; d) Lampa błyskowa; e) Dyfuzory soczewek i kopułek; f) Kontroler Stackshot, szyna makro i stolik obrotowy; g) Uniwersalny gimbal sceniczny; h) Statyw. (B) Aparatura do obrazowania z założonym dyfuzorem światła. (C) Zbliżenie zamontowanej próbki w pozycji do obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przepływ pracy analizy FIJI do obliczenia obszaru oczu dorosłego

  1. Do analizy obrazu należy pobrać plik FIJI software15 ze strony internetowej ImageJ.net.
  2. Wybierz obrazy do analizy, na których oko jest wyśrodkowane i wyrównane przy odpowiednim oświetleniu i minimalnym rozmyciu peryferyjnym, co wskazuje na prawidłowe wyrównanie z aparatem.
  3. Skalibruj skalę obrazu.
    1. Pobierz obraz podziałki liniowej, aby uzyskać 20-krotne powiększenie, które odpowiada 500 μm. Alternatywnie, podczas pozyskiwania obrazu, sfotografuj linijkę przy użyciu tych samych ustawień. Otwórz obraz w oprogramowaniu FIJI.
    2. Zmierz długość podziałki liniowej (Rysunek 4A). Użyj narzędzia Linia prosta, aby dokładnie obrysować linię. Kliknij pozycję Analizuj | Miara. Ta odległość pikseli jest równoważna 500 μm (Rysunek 4B).
    3. Obliczanie pikseli na mikron. Użyj tego, aby przekonwertować pomiary pikseli na pomiary mikrometryczne.
  4. Otwórz plik obrazu stosu w FIJI (Rysunek 4C).
  5. Wybierz opcję Lupa z paska narzędzi, aby powiększyć obszar ostrości. Spróbuj wypełnić ekran okiem i bezpośrednio otaczającym go naskórkiem głowy (Rysunek 4D).
  6. Z paska narzędzi wybierz opcję Narzędzie wyboru odręcznego. Obrysuj obszar siatkówki tak dokładnie, jak to możliwe, podążając za konturami najbardziej zewnętrznego rzędu ommatidiów (Ryc. 4E). Aby usunąć część zaznaczenia, przytrzymaj przycisk opcji i wybierz piksele do usunięcia. Aby dodać coś do zaznaczenia, przytrzymaj przyciski Option i Shift, a następnie wybierz piksele, które chcesz dodać.
  7. Aby obliczyć powierzchnię, wybierz punkt menu Analizuj | Zmierz z górnego menu (Rysunek 4F). Pojawi się nowe okno z parametrami powierzchni, średniej, minimum i maksimum. Skopiuj i wklej te dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dokumentacji i konwersji z pomiarów pikseli na mikrometryczne.
  8. Przeprowadzaj odpowiednie analizy statystyczne.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Analiza obrazu na FIDŻI. (A) Przeskaluj oryginalny obraz. Pobierz obraz kalibracyjny i zmierz długość pręta 500 μm. (B) Dostosuj skalowanie za pomocą funkcji Ustaw skalę. (C) Otwórz obraz ułożony w stos. (D) Powiększ obraz tak, aby oko było wyśrodkowane i prawie na całym ekranie. (E) Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby obrysować oko na granicy między najbardziej zewnętrznym rzędem ommatidiów a otaczającym je naskórkiem. (F) Zmierz obszar w wybranym regionie jest obliczany przez kliknięcie przycisku Analizuj | Środek | Obszar. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko Drosophila to doskonały system modelowy do badania wzorców tkanek, kontroli wzrostu i śmierci komórek. Niedawno opublikowaliśmy badanie sprawdzające, w jaki sposób wewnątrzkomórkowe pH (pHi) wpływa na wzrost tkanek. Po pierwsze, ustaliliśmy system genetyczny, w którym nadekspresja wymiennika sodowo-protonowego DNhe2 (ortologia ssaka NHE1) w rozwijającym się oku powoduje defekty wzorca i zwiększoną proliferację16. Zwiększoną proliferację przy wyższym pH obserwuje się u różnych gatunków, od drożdży po ssaki17. Jednak zaobserwowaliśmy również, że przy zwiększonym pH oko dorosłego oka wydawało się mniejsze w porównaniu z grupą kontrolną.

Przeprowadzono analizę ilościową obszaru oczu u dorosłych, aby określić, jak podwyższona ekspresja DNhe2 zmniejsza rozmiar tkanki w oku Drosophila. Najpierw uzyskaliśmy obrazy o niskiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu z wkładką okularową (Ryc. 5A), ale były one niewystarczającej jakości, aby wykonać pomiary ilościowe. W szczególności krawędzie oka nie są ostre, co uniemożliwia dokładny pomiar obszaru oczu.

Zmierzyliśmy obszar każdego oka na obrazach o wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila (Rysunek 5B). Muszki wykazujące ekspresję GMR>DN2 miały znacznie mniejsze oczy (średnio 74,28μm2) niż kontrola genetyczna w1118 muchach (średnia 125,83μm2) lub kontrola kierowcy GMRGAL4 muchy heterozygotyczne (średnio 142,49μm2), co stanowi odpowiednio 41% i 48% zmniejszenie powierzchni (Rysunek 5C). Ten spadek wielkości oczu, pomimo zwiększonej proliferacji, można przypisać podwyższonemu poziomowi śmierci komórek.

Znane geny autofagii, w tym Atg1, który indukuje powstawanie fagoforów, były używane w badaniach interakcji genetycznych (Rysunek 5). Wpływ na wielkość oczu dorosłego osobnika określono ilościowo za pomocą fotografii o wysokiej rozdzielczości i analizy obszaru (Rysunek 5B). Przywrócono rozmiar oka (129,9 μm2 vs 74,28 μm2) u much GMR>DNhe2 heterozygotycznych pod względem Atg13 w porównaniu z samym GMR>DNhe2 i był podobny do kontrolnych (Rysunek 5C). W połączeniu z analizą markerów molekularnych, nasze wyniki potwierdzają zwiększoną autofagiczną śmierć komórek przy wyższym pHi.

figure-results-1
Rysunek 5: Uratowanie zmniejszonego rozmiaru siatkówki związane ze zwiększonym wewnątrzkomórkowym pH ze zmniejszoną autofagią. (A) Obrazy o niskiej rozdzielczości oczu dorosłej muchy wykonane za pomocą mikroskopu z wkładką do oka. (B) Obrazy o wysokiej rozdzielczości oczu dorosłych much wykorzystywane do ilościowego określania wielkości oczu dla następujących genotypów: w1118; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; Atg13; GMR>DNhe2; Atg13. (C) Średnie zmierzone rozmiary oczu osoby dorosłej wynosiły: w1118 (125,83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) i GMR>DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 μm2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) i wskazywane przez pokazanie wartości mediany z przedziałami międzykwartylowymi. Istotność statystyczną określono za pomocą niesparowanych testów t z poprawką Welcha. Dane w B i C zostały wcześniej opublikowane18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nasze wnioski są wzmocnione przez przygotowanie próbki, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i analizę opisaną tutaj. Metody te pozwoliły na precyzyjny i ilościowy opis wielkości oczu dorosłych Drosophila o różnych genotypach. Kontynuujemy stosowanie tego podejścia do oceny innych interakcji genetycznych, które wyjaśnią mechanizmy kontroli wzrostu zależnej od pH.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę przygotowania próbek, obrazowania w wysokiej rozdzielczości i analizy struktur dorosłych Drosophila . Oko Drosophila jest genetycznie wykonalnym systemem modelowym, który dostarczył krytycznych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób, w tym raka19, neurodegeneracji20 i chorób metabolicznych21. W szczególności generowane są "awatary" pacjentów z rakiem, w których generowane są transgeniczne Drosophila przenoszące mutacje onkogenne i mogą być wykorzystywane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków22. Chociaż skupiamy się na oku dorosłego, protokół ten można dostosować do analizy innych interesujących struktur, takich jak skrzydło, noga, klatka piersiowa i brzuch.

Umiejętności motoryczne są wymagane na kilku kluczowych etapach tego protokołu. Przygotowanie próbki dorosłej Drosophila poprzez montaż punktowy wymaga cierpliwości i praktyki. Radzimy początkującym, aby poćwiczyli montaż punktowy przed przygotowaniem rzadkich lub cennych próbek. Istnieje kilka krytycznych kroków, które będą wymagały ćwiczenia umiejętności motorycznych i uważnej uwagi.

Pierwszymi krytycznymi krokami w protokole jest przygotowanie punktów karcianych i nałożenie kleju w celu przyklejenia punktu karty do brzucha (krok protokołu 2.4-2.5). Ważne jest, aby nałożyć odpowiednią ilość kleju, ponieważ docelowe struktury anatomiczne (np. głowa) mogą zostać pokryte klejem, jeśli nałoży się go za dużo lub nie jest to właściwa konsystencja. Próbka musi być również sklejona w odpowiedniej pozycji, tak aby oś przednio-tylna była prostopadła do kołka mocującego. Drugim krytycznym krokiem jest ustawienie głowicy do obrazowania w wysokiej rozdzielczości (krok 3.2 protokołu). Bardzo ważne jest, aby głowa była zorientowana z okiem skierowanym w stronę obiektywu aparatu. Aby wyregulować głowę, małe regulacje wykonuje się za pomocą kleszczy. Delikatne i stopniowe ruchy mają kluczowe znaczenie, ponieważ przy dużych lub siłowych korektach może dojść do przypadkowej dekapitacji. Dodatkowym krokiem, w którym wymagane są umiejętności motoryczne, jest użycie narzędzia wyboru odręcznego z paska narzędzi FIJI (krok 4.6 protokołu). W tym przypadku ważne jest, aby prześledzić jak najbliżej zewnętrznego rzędu ommatidia oka. Ta precyzja ma kluczowe znaczenie dla rygorystycznych i powtarzalnych pomiarów obszaru oka (ryc. 4E).

Metody obrazowania, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), pozostają podstawowym podejściem do wizualizacji i analizy struktur zewnętrznych. Jednak protokoły SEM wymagają od użytkownika obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami i obsługi wielu urządzeń, w tym suszarek do punktów krytycznych, aparatów do napylania i samego SEM. Przygotowanie próbki trwa kilka dni i wymaga intensywnego szkolenia oraz umiejętności. Istotnym wyzwaniem, przed którym stoją instytucje akademickie, są inwestycje finansowe i zaangażowanie w konserwację urządzenia, a z naszego doświadczenia wynika, że personel posiadający wiedzę specjalistyczną w zakresie konserwacji i obsługi tego sprzętu na ogół nie jest wspierany na poziomie instytucjonalnym. Nasz protokół obniża koszty i eliminuje narażenie na niebezpieczne chemikalia kosztem obrazowania o niższej rozdzielczości w porównaniu z SEM.

System opisany w tym badaniu był wstępnie zmontowanym pakietem, ale jego modułowy charakter pozwala na obniżenie kosztów poprzez zastąpienie poszczególnych komponentów sprzętem wyprodukowanym we własnym zakresie (np. stolikami na próbki, dyfuzorami błyskowymi), alternatywnymi markami lub modelami lub sprzętem, który może być już obecny w laboratorium. Podczas gdy łączenie obiektywów mikroskopowych z aparatami makro staje się coraz bardziej popularne wśród hobbystów i profesjonalnych fotografów, w przypadku różnych kombinacji obiektywów i obiektywów może być wymagane kilka prób i błędów. Aby odtworzyć opisany tutaj system, obiektyw mikroskopowy z korekcją nieskończoności musi być podłączony do soczewki tubusu (tutaj teleobiektywu) za pomocą odpowiednio gwintowanego adaptera. Kolejną kwestią przy wymianie komponentów jest upewnienie się, że odległość robocza obiektywu jest zgodna z wymiarami mocowania kamery, mocowania preparatu i szyny makrofokusa. Wreszcie, wybrane tutaj oprogramowanie do ustawiania ostrości jest komercyjne, ale istnieje wiele tanich lub bezpłatnych rozwiązań do ustawiania ostrości po obróbce, w tym wtyczki ImageJ.

Chociaż protokół ten wymaga praktyki, aby opanować techniki obsługi próbek, jest przeznaczony do pozyskiwania i analizowania obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu szczegółowej analizy fenotypowej. Przedstawione tu procedury stanowią szybką i tanią alternatywę dla tradycyjnych metodologii obrazowania. Dzięki wykorzystaniu bezpłatnych technik obrazowania cyfrowego do analizy ilościowej, nasza metodologia jest dostępna i nie wymaga kosztownych zakupów oprogramowania ani aktualizacji. Konfiguracja obrazowania wymaga pewnych kosztów i wysiłku, ale po ustaleniu powinna być długotrwałym dodatkiem do laboratoriów Drosophila . Metoda ta pozwala uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości odpowiednie do ilościowej identyfikacji fenotypów i może być łatwo dostosowana do innych interesujących struktur, takich jak skrzydło, noga, klatka piersiowa i brzuch. Metodologia ta sprawia, że przygotowanie próbek, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i analiza są dostępne dla studentów studiów licencjackich i naukowców w instytucjach o ograniczonych zasobach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium pHly w Grillo-Hill za dyskusje i wsparcie. Dziękujemy Timowi Andriese, Randy'emu Kirschnerowi, Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen, Marco Parentowi, Jonny'emu Shaloubowi i Librado Velizowi za doskonałe wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez nagrody NIH SC3GM132049 i 1R16GM153640 (BKGH), nagrodę CSU Biotechnology Faculty-Student Research Award (LM i BKGH) oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Stanowym San José (FJL). Szczególne wyróżnienie należy się Berndowi Beckerowi za zaradność i pomoc w tym procesie. Dziękujemy społeczności BioIcons (https://bioicons.com/) za dostarczenie wysokiej jakości ikon dla naszych figurek, a w szczególności dla Serviere za ikonę pipety oraz DBCLS dla ikon Drosophila, kleszczyków i mikroskopu elektronowego na biurku użytych na Rysunku 1 i Rysunku 2, które są objęte licencją CC-BY 4.0 Unported. Dziękujemy również społeczności SciDraw (https://scidraw.io/) za dostarczenie wysokiej jakości ikon dla naszych figurek, w szczególności Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953), które są dostępne na licencji Creative Commons 4.0 (CC-BY).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 1 mlThermoFisher Scientific170353N
1,7 ml probówki do mikrowirówek GeneseeScientific 24-282LR
20x Obiektyw mikroskopu ApoMitutoyo Corp.378-804-3
Karton archiwalny 65 lb Neenah, Inc.91901
Teleobiektyw Canon EF 70-200 mm USM IICanon3044C002
Canon EOS 6D Mark II Korpus lustrzanki cyfrowejCanon1897C002
Dyfuzor KopułaRozwiązania makroskopowe Dyfuzor PA-DIF-GIM-SM
do Mitutoyo M Plan Cele APORozwiązania makroskopowe mitutoyo-dyfuzory
Drosophila fiolki i zatyczkiGenesee Scientific 32-117BF
Kleszcze drobnokońcówkowe Dumont #5Fisher ScientificNC9889584
Gęsie pióraAmazonB01CMMJI6U
Wytrzymały statyw z anodyzowanego aluminiumReally Right Stuff, LLCTFA-32G
KimwipesFisher Scientific06-666Aniestrzępiąca się chusteczka laboratoryjna
Aparat cyfrowy Levenhuk M1000 PlusTrzpień montażowy Levenhuk70358
nr 3Indigo Instruments33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila mediaGenesee Scientific 66-113pokarm dla much
Point-PunchM.C. Mieth Manufacturing, Inc.448Detail
Zacisk śrubowyReally Right Stuff, LLCSK-ClampDo mocowania szyny makro do statywu
Kontroler Stackshot i szyna makroCognisys Inc.
Adapter pierścienia obniżającego napięcie RAF Camera763461174207Adapter obiektywu do podłączenia obiektywu mikroskopu do obiektywu aparatu
Titebond GlueFranklin International5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite FlashShenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.YN-24EX
strong>Software
Canon EOS Utility (wersja 3.16.1). Oprogramowanie do nabywaniaproduktów firmy Canon
FIJINational Institutes of HealthFiji zostało wydane jako oprogramowanie typu open source na licencji GNU General Public License.  FIDŻI wersja 2.14.0/1.54f 
GraphPad PrismOprogramowanie GraphPad, Boston, Massachusetts, USAPrism Wersja 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)Zerene Systems, LLCOprogramowanie do układania ostrości
ST3X_100_BUNDLE<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia. Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).
  4. Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila. Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).
  5. Bonini, N. M. A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease. Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).
  6. Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases. Development. 147 (11), dev189340(2020).
  7. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  8. Johnson, R. I. Hexagonal patterning of the Drosophila eye. Dev Biol. 478, 173-182 (2021).
  9. Weasner, B. P., Kumar, J. P. The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster. Genetics. 221 (1), iyac041(2022).
  10. Pichaud, F., Casares, F. Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye. Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).
  11. Oster, I. I., Crang, R. E. Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes. Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).
  12. Gibb, T. J., Oseto, C. Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory. , Academic Press. (2019).
  13. Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects. ZooKeys. 712, 141-154 (2017).
  14. Brown, B. V. A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies. Fly Times. 11, 10(1993).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 4, e03270(2015).
  17. White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).
  18. Peralta, J., et al. Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death. Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).
  19. Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies. Front Genet. 13, 949241(2022).
  20. Nitta, Y., Sugie, A. Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis. Fly. 16 (1), 275-298 (2022).
  21. Pletcher, R. C., et al. A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development. G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).
  22. Bangi, E., et al. A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

oko Drosophilaanaliza fenotypowaobrazowanie o wysokiej rozdzielczo cikwantyfikacja w programie ImageJsk adanie ostro cipomiar ommatidi wmikroskopia cyfrowatechniki entomologicznealternatywa dla skaningowej mikroskopii elektronowej

Powiązane artykuły