Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.
Artykuł metodologiczny
Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oko złożone Drosophila to precyzyjnie wzorowana tkanka, która ujawniła mechanizmy molekularne i procesy biologiczne kierujące morfogenezą. Jest to prosta struktura powtarzających się oczu jednostkowych, określana jako ommatidia, która służy do charakteryzowania interakcji genetycznych i funkcji genów. Mutacje, które wpływają na architekturę oka, można łatwo wykryć i przeanalizować; W związku z tym system ten jest często stosowany w instytucjach o ograniczonych zasobach. Dalsza analiza fenotypowa często obejmuje skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) do generowania obrazów o dużym powiększeniu, odpowiednich do analizy ilościowej. Jednak SEM są drogie i wymagają kosztownych odczynników; przygotowanie próbki trwa kilka dni; Często też potrzebują pełnoetatowego personelu do przygotowywania próbek i konserwacji instrumentów. Ogranicza to ich użyteczność w instytucjach o ograniczonych zasobach lub w okresie cięć budżetowych. W entomologii stosowanie technologii obrazowania cyfrowego o wysokiej rozdzielczości jest powszechną praktyką identyfikacji i charakterystyki gatunków. W artykule opisano metodę, która łączy strategie i pozwala na cyfrowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości struktur dorosłego Drosophila oraz analizę ilościową przy użyciu otwartego oprogramowania ImageJ. Przepływ pracy jest szybką i przyjazną dla studentów alternatywą, która usuwa ograniczenia niedofinansowanych i niedofinansowanych ośrodków badawczych dzięki opłacalnemu i szybkiemu podejściu do ilościowej analizy fenotypowej.
Wprowadzenie
Drosophila melanogaster jest potężnym genetycznym organizmem modelowym, wykorzystywanym od dziesięcioleci do wyjaśniania molekularnych szlaków sygnałowych i zachowań komórkowych. Wiele ewolucyjnie konserwatywnych szlaków sygnałowych, niezbędnych dla rozwoju organizmów wielokomórkowych, zostało po raz pierwszy zidentyfikowanych, a ich mechanizmy działania określone w Drosophila. Około 65-75% wszystkich genów związanych z chorobami ludzi posiada ortologi w Drosophila1,2. Oko dorosłej Drosophila stanowi ważny model, który umożliwił przeprowadzenie nieobciążonych genetycznych przesiewów, co z kolei ułatwiło odkrycie istotnych konserwatywnych genów zaangażowanych w ludzkie choroby, w tym nowotwory3,4, neurodegenerację5 oraz zaburzenia metaboliczne6.
Oko Drosophila składa się z około 800 oczu jednostkowych, nazywanych ommatidiami, które są precyzyjnie rozmieszczone w układzie heksagonalnym na powierzchni oka dorosłego osobnika7. Każde ommatidium składa się z ośmiu neuronów photoreceptorowych, które zajmują określone miejsce wewnątrz asymetrycznego trapezu. Wspierają je cztery nie-neuronalne komórki stożkowe oraz dwie pierwotne komórki pigmentowe, które wydzielają soczewkę i pseudostożek w celu skupienia światła na rhabdomerach neuronów photoreceptorowych, które odpowiadają za detekcję światła. Sąsiednie ommatidia są oddzielone pojedynczym rzędem komórek sieci interommatidialnej, w skład której wchodzą wtórne komórki pigmentowe, trzeciorzędowe komórki pigmentowe oraz kompleksy mechanosensorycznych szczecinek8,9,10.
Zaburzenia w rozwoju oka są widoczne u dorosłych osobników jako zwiększony lub zmniejszony rozmiar oka, nieprawidłowa liczba lub struktura soczewek lub szczecinek, a także jako „szorstkie oko” (rough eye), w którym normalnie niezmienny wzór heksagonalny zostaje zaburzony w taki sposób, że rzędy ommatidiów nie mogą być już śledzone w poprzek powierzchni oka. Fenotypy te można oceniać na poziomie tkanek przy użyciu mikroskopów stereoskopowych. Szczegółowa analiza fenotypów tradycyjnie obejmuje skaningową mikroskopię elektronową, po której następuje ilościowa analiza obrazu11. Jednak skaningowa mikroskopia elektronowa wymaga drogiej aparatury, kosztownych odczynników, przygotowania próbek trwającego wiele dni, a często także stałego personelu do konserwacji sprzętu.
Rycina 1: Schemat obrazowania struktur dorosłych osobników Drosophila. (A) Pobranie i utrwalenie dorosłych osobników Drosophila w 70% etanolu. (B) Przygotowanie próbek do obrazowania poprzez montaż na punktach i mocowanie do szpilek. (C) Pozyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości za pomocą stosowania skupienia (focus stacking) i integracji. (D) Ilościowa analiza obrazów z wykorzystaniem programu FIJI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Niniejsza praca przedstawia schemat postępowania, który jest stosunkowo niedrogi, charakteryzuje się krótkim czasem przygotowania próbek, może być łatwo zorganizowany na stole laboratoryjnym o szerokości 3 stóp, nie wymaga użycia materiałów niebezpiecznych i może stanowić trwałe uzupełnienie wyposażenia laboratoriów badających Drosophila (Rysunek 1). Montaż na szpilce jest techniką entomologiczną stosowaną do suszenia i konserwacji małych owadów o miękkim ciele, takich jak Drosophila12. Metoda ta opiera się na połączeniu obiektywów mikroskopowych z aparatami DSLR o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na uzyskanie powiększeń od 10x do 1 000x. Ograniczona głębia ostrości charakterystyczna dla makrofotografii jest niwelowana poprzez stosowanie techniki focus stackingu: łączenia serii obrazów, w których płaszczyzna ostrości przesuwa się przez badany okaz13. Metoda ta pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, odpowiednich do kwantyfikacji fenotypów, i może być łatwo zaadaptowana do obrazowania innych struktur, takich jak skrzydło, noga, klatka piersiowa i odwłok. Przepływ analizy obrazów wykorzystuje bezpłatny program do analizy obrazu FIJI (NIH ImageJ). Dzięki tej metodologii przygotowanie próbek, obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz analiza stają się dostępne dla studentów studiów licencjackich oraz naukowców w instytucjach o ograniczonych zasobach.
Protokół
1. Pobieranie i utrwalanie dorosłych osobników Drosophila
- Przygotuj krzyżówki Drosophila lub wybierz szczepy i umieść je w probówkach zawierających pożywkę dla muszek. Inkubuj probówki w żądanej temperaturze (zazwyczaj 25 °C) aż do momentu rozwoju muszek i wyklucia się osobników dorosłych (~10-14 dni w 25 °C).
- Znieczul muszki za pomocą CO2 i umieść je na podkładce do CO2.
- Posegreguj muszki za pomocą piórka i wybierz osobniki o pożądanym fenotypie (np. proste skrzydła). Sorter do muszek z piórka wykonaj, przycinając pióro gęsie tak, aby pasowało do zwężonego końca pipety serologicznej o pojemności 1 mL.
- Przygotuj probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL z 1 mL 70% etanolu. Umieść wybrane muszki w probówce i ustaw ją na lodzie. Przechowuj probówki w temperaturze 4 °C przez noc (Rysunek 2A).
UWAGA: Nie konserwuj muszek w etanolu przez więcej niż 24 h. Długotrwałe przechowywanie muszek w 70% etanolu spowoduje utratę pigmentu oczu i ciała.
2. Przygotowanie próbek metodą montażu punktowego
UWAGA: Drosophila to owady o miękkim ciele, które po wysuszeniu na powietrzu stają się kruche i zapadają się; dlatego protokół ten wymaga obrazowania próbek w tym samym dniu, w którym zostały zamontowane. Aby zapobiec utracie próbek, należy pracować w małych zestawach po około 5 much. Liczbę próbek w zestawie można zwiększać w zależności od wypracowanej wydajności. Okazy, które wymagają więcej czasu przed obrazowaniem, można odwadniać za pomocą serii zwiększających się stężeń heksametylodisilazanu (HMDS)14.
- Wytnij małe trójkątne punkty (7,1 mm x 2,7 mm) z archiwalnego brystolu o gramaturze 65 lb, używając specjalistycznego dziurkacza do punktów. Przygotuj punkty, zginając czubek (najwężniejsze 25%) pod kątem 90° za pomocą pęsety precyzyjnej Dumont #5 (Rysunek 2B).
- Używając pęsety precyzyjnej Dumont #5, wyjmij muchy z probówek do mikrocentryfugi (krok 1.4). Delikatnie osusz muchy beztkankową chusteczką laboratoryjną, aby usunąć nadmiar etanolu. Umieść każdą muchę na lewym boku na karcie indeksowej pod mikroskopem stereoskopowym.
UWAGA: Wyjmuj muchy z probówki, trzymając je za strukturę anatomiczną, która nie jest obszarem zainteresowania – podczas obrazowania głowy trzymamy próbki za skrzydło lub odnóże. Nie trzymaj próbek za odwłok, ponieważ struktura ta służy do przyklejenia muchy do punktu z brystolu. - Przygotuj klej skórny, dostosowując jego konsystencję do pożądanej lepkości. Wymieszaj 1-2 krople kleju skórnego z 1-2 kroplami wody dejonizowanej (DI) za pomocą pipety transferowej na karcie indeksowej. Chwyć przygotowany punkt z brystolu za szeroki koniec pęsetą i nanieś niewielką ilość rozcieńczonego kleju na zgięty czubek punktu, przykładając go do mieszaniny kleju i wody (Rysunek 2C).
UWAGA: Klej powinien być rozprowadzalny, ale nie może spływać. - Przyłóż zgięty czubek punktu do przedniej strony prawego odwłoka w obrębie segmentów odwłoka 2-3 (Rysunek 2C). Zanim klej wyschnie, delikatnie skoryguj ułożenie muchy tak, aby oś przednio-tylna muchy była prostopadła do zgiętego czubka punktu.
- Wsuń szpilkę entomologiczną nr 3 w szeroki koniec punktu z brystolu (Rysunek 2D) i przymocuj go do bloku do szpilikowania owadów (Rysunek 2E). Oznacz każdą szpilkę lub rząd szpilek odpowiednim genotypem.
Rycina 2: Przygotowanie próbek. (A) Dorosłe osobniki Drosophila są sortowane na podstawie markerów fenotypowych i zbierane do oznakowanych probówek do mikrocentryfugi zawierających 70% etanol, umieszczonych na lodzie. Muchy są przechowywane w temperaturze 4° C przez noc. (B) Papierowe punkty montażowe są przygotowywane poprzez zgięcie wąskiego końca o 90° względem reszty kartonika za pomocą pęsety nr 5. (C) Muchy są wyjmowane z probówek i krótko suszone na powietrzu. Klej skórny jest nakładany na mały, zgięty koniec przygotowanego punktu i przyklejany do dorosłej muchy na poziomie segmentów odwłosa 2-3. (D) Okazy wraz z etykietą identyfikacyjną są montowane na stalowej szpilce entomologicznej nr 3. (E) Przyszpilone okazy są przechowywane na tablicy z próbkami do momentu rozpoczęcia akwizycji obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Akwizycja obrazowania z wykorzystaniem stosowania ostrości o wysokiej rozdzielczości
- Wykonaj wysokorozdzielcze fotografie oczu much przy użyciu zmontowanego i dostosowanego systemu obrazowania z nakładaniem ostrości (focus stacking).
- Wykonaj zdjęcia za pomocą korpusu aparatu DSLR z teleobiektywem 70-200 mm połączonym z obiektywem mikroskopowym 20x Apo poprzez adapter obiektywu 77 mm.
- Upewnij się, że preparat jest oświetlony lampą błyskową przez dyfuzor (Rysunek 3).
- Kontroluj pozycjonowanie w osi Z za pomocą kontrolera Stackshot i szyny makro.
- Zamocuj aparat, lampę błyskową i zmotoryzowany stół do solidnego, anodowanego aluminiowego statywu.
- Umieść każdą próbkę zamocowaną punktowo na uniwersalnym gimbalu stołu, orientując głowę tak, aby oko było skierowane w stronę obiektywu. Koryguj pozycję głowy, delikatnie przesuwając ją pęsetą.
UWAGA: Gwałtowne i szerokie korekty mogą doprowadzić do przypadkowego odcięcia głowy. - Przy aparacie podłączonym do laptopa dostosuj ustawienia akwizycji w oprogramowaniu. Fotografuj preparaty przy powiększeniu 20x przy następujących ustawieniach: moc lampy 1/32, czas naświetlania 1/200, przysłona F2.8 oraz ISO 400. Upewnij się, że funkcje Autofocus oraz stabilizacji obrazu są wyłączone.
UWAGA: Ustawienia te zapewniają równowagę między optymalnym oświetleniem lampą błyskową, czasem naświetlania a głębią ostrości. Musiałyby one zostać zmienione dla innych powiększeń i/lub kombinacji obiektywów. - Wskaż folder docelowy dla zapisu wynikowego stosu obrazów (10-50 obrazów). Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca pojemność pamięci dla obrazów (~8,5 MB na obraz).
- Dostosuj ustawienia stosu ostrości w jednostce sterującej Stackshot w trybie Auto Distance .
- Ustaw wielkość kroku na 5 µm i oblicz liczbę kroków, ustawiając pozycje start i stop stosu ostrości.
- Kieruj się obrazem w trybie LiveView Mode z aparatem w trybie Auto Shoot Mode, aby zidentyfikować pozycje startowe i końcowe.
- Przesuwaj szynę tak, aby najbliższa część preparatu była w ostrości (ustaw pozycję start ), następnie przesuń ją do miejsca, w którym najdalej wysunięty istotny element jest w ostrości (ustaw pozycję end ).
- Przełącz aparat z powrotem w tryb Manual Shoot i rozpocznij akwizycję obrazów z jednostki sterującej Stackshot.
UWAGA: Czas akwizycji obrazu zależy od wielkości preparatu. Im większa głębia ostrości jest wymagana dla dużych preparatów, tym więcej przekrojów zostanie uwzględnionych w stosie obrazów, co wydłuży całkowity czas akwizycji. - Otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu do nakładania ostrości. Wygeneruj obraz złożony, klikając Stack | Align & Stack All (PMax).
- Zapisz końcowy obraz na dysku twardym komputera jako plik .tif, klikając File | Save Output Image.
UWAGA: W zależności od rozdzielczości pliku obrazu złożonego i liczby fotografowanych preparatów, do kopii zapasowych mogą być potrzebne duże zewnętrzne dyski twarde (1 TB). W niniejszym protokole obrazy złożone mają rozmiar około 100 MB każdy przed kompresją.
Rysunek 3: Pozyskiwanie obrazów. (A) Aparatura obrazująca z elementami opisanymi w następujący sposób: a) korpus aparatu DSLR; b) teleobiektyw; c) obiektyw mikroskopowy Apo 20x wraz z adapterem; d) lampa błyskowa; e) dyfuzory soczewkowe i kopułowe; f) kontroler Stackshot, szyna makro i stół obrotowy; g) uniwersalny gimbal stołu; h) statyw. (B) Aparatura obrazująca z zamontowanym dyfuzorem światła. (C) Zbliżenie zamocowanego preparatu w pozycji do obrazowania. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Procedura analizy w programie FIJI w celu obliczenia powierzchni oka dorosłego osobnika
- Do analizy obrazów pobierz oprogramowanie FIJI15 ze strony internetowej ImageJ.net.
- Wybierz do analizy obrazy, na których oko jest wycentrowane i wyrównane, przy odpowiednim oświetleniu i minimalnym rozmyciu peryferyjnym, co wskazuje na właściwe ustawienie względem kamery.
- Kalibruj skalę obrazu.
- Pobierz obraz paska skali dla powiększenia 20x, który odpowiada 500 µm. Alternatywnie, w momencie pozyskiwania obrazów, sfotografuj linijkę przy użyciu tych samych ustawień. Otwórz obraz w oprogramowaniu FIJI.
- Zmierz długość paska skali (Rycina 4A). Użyj narzędzia Straight Line Tool, aby dokładnie obrysować linię. Kliknij Analyze | Measure. Ta odległość w pikselach jest równoważna 500 µm (Rycina 4B).
- Oblicz liczbę pikseli na mikron. Wykorzystaj tę wartość do przeliczenia pomiarów z pikseli na mikrometry.
- Otwórz plik obrazu w stosie (stacked image) w programie FIJI (Rycina 4C).
- Wybierz narzędzie Magnifying Glass z paska narzędzi, aby powiększyć obszar zainteresowania. Postaraj się, aby oko i bezpośrednio otaczająca je kutykula głowy wypełniały ekran (Rycina 4D).
- Wybierz narzędzie Freehand Select Tool z paska narzędzi. Obrysuj obszar siatkówki tak dokładnie, jak to możliwe, podążając za konturami zewnętrznego rzędu ommatidiów (Rycina 4E). Aby usunąć część zaznaczenia, przytrzymaj przycisk option i zaznacz piksele do usunięcia. Aby dodać do zaznaczenia, przytrzymaj przyciski option oraz shift i zaznacz piksele do dodania.
- Aby obliczyć powierzchnię, wybierz Analyze | Measure z górnego menu (Rycina 4F). Pojawi się nowe okno z parametrami area, mean, minimum oraz maximum. Skopiuj i wklej te dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dokumentacji i przeliczenia z pikseli na mikrometry.
- Przeprowadź odpowiednie analizy statystyczne.
Rysunek 4: Analiza obrazów w programie FIJI. (A) Skalowanie oryginalnego obrazu. Pobranie obrazu kalibracyjnego i pomiar długości paska 500 µm. (B) Dostosowanie skalowania za pomocą funkcji Set Scale. (C) Otwarcie obrazu w stosie (stacked image). (D) Powiększenie obrazu tak, aby oko znajdowało się w centrum i zajmowało prawie cały ekran. (E) Użycie narzędzia Freehand Select do obrysowania oka na granicy między zewnętrznym rzędem ommatidiów a otaczającą je kutykulą. (F) Obliczenie powierzchni wewnątrz wybranego regionu poprzez kliknięcie Analyze | Measure | Area. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Wyniki
Oko Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania wzorowania tkanek, kontroli wzrostu oraz śmierci komórkowej. Niedawno opublikowaliśmy badanie nad wpływem wewnątrzkomórkowego pH (pHi) na wzrost tkanki. Po pierwsze, opracowaliśmy system genetyczny, w którym nadekspresja wymiennika sodowo-protonowego DNhe2 (ortologa ssaczego NHE1) w rozwijającym się oku powoduje defekty wzorowania i zwiększoną proliferację16. Zwiększona proliferacja przy wyższym pHi jest obserwowana u wielu gatunków, od drożdży po ssaki17. Zaobserwowaliśmy jednak również, że przy zwiększonym pHi oko dorosłego owada wydawało się mniejsze w porównaniu z grupą kontrolną.
Przeprowadzono analizę ilościową powierzchni oczu osobników dorosłych, aby określić, w jaki sposób zwiększona ekspresja DNhe2 zmniejsza wielkość tkanki w oku Drosophila. W pierwszej kolejności pozyskano obrazy o niskiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopu z wkładką okularną (Rysunek 5A), jednak ich jakość była niewystarczająca do wykonania pomiarów ilościowych. W szczególności krawędzie oka nie były w ogniskowej, co uniemożliwiło dokładny pomiar powierzchni oka.
Zmierzyliśmy powierzchnię każdego oka na obrazach o wysokiej rozdzielczości oczu dorosłych osobników Drosophila (Rycina 5B). Muchy wykazujące ekspresję GMR>DNhe2 miały znacznie mniejsze oczy (średnio 74,28 µm2) niż muchy kontrolne o tym samym tle genetycznym w1118 (średnio 125,83 µm2) lub heterozygotyczne muchy kontrolne z driverem GMRGAL4 (średnio 142,49 µm2), co stanowi odpowiednio redukcję powierzchni o 41% i 48% (Rycyna 5C). Ten spadek wielkości oka, pomimo zwiększonej proliferacji, można przypisać podwyższonemu poziomowi śmierci komórkowej.
W badaniach nad interakcjami genetycznymi wykorzystano znane geny autofagii, w tym Atg1, który indukuje tworzenie fagoforem (Rysunek 5). Wpływ na wielkość oka dorosłych osobników określono za pomocą fotografii o wysokiej rozdzielczości i analizy powierzchni (Rysunek 5B). Wielkość oka została przywrócona (129,9 µm2 vs 74,28 µm2) u much GMR>DNhe2 heterozygotycznych pod względem Atg13 w porównaniu do samych GMR>DNhe2 i była zbliżona do grupy kontrolnej (Rysunek 5C). W połączeniu z analizą markerów molekularnych nasze wyniki wskazują na zwiększoną autofagiczną śmierć komórek przy wyższym pHi.
Rycina 5: Przywrócenie zmniejszonego rozmiaru siatkówki związanego z podwyższonym wewnątrzkomórkowym pH poprzez zmniejszenie autofagii. (A) Obrazy oczu dorosłych much o niskiej rozdzielczości wykonane za pomocą mikroskopu z wkładką okularną. (B) Obrazy oczu dorosłych much o wysokiej rozdzielczości użyte do kwantyfikacji rozmiaru oczu dla następujących genotypów: w1118; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; Atg13; GMR>DNhe2; Atg13. (C) Średnie zmierzone rozmiary oczu dorosłych wynosiły: w1118 (125,83 µm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 µm2, N = 9), GMR>DNhe2 (74,28 µm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 µm2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg13 (129,9 µm2, N = 19); wartości te przedstawiono jako mediany z zakresami międzykwartylowymi. Istotność statystyczną określono za pomocą nieparzystych testów t z poprawką Welcha. Dane w punktach B i C zostały opublikowane wcześniej18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Nasze wnioski zostają wzmocnione dzięki przygotowaniu próbek, obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości oraz analizie opisanej w niniejszym materiale. Metody te pozwoliły na precyzyjny i ilościowy opis wielkości oczu dorosłych osobników Drosophila o różnych genotypach. Kontynuujemy stosowanie tego podejścia w celu oceny innych oddziaływań genetycznych, które wyjaśnią mechanizmy zależnej od pH kontroli wzrostu.
Dyskusja
Tutaj opisujemy metodę przygotowania próbek, obrazowania w wysokiej rozdzielczości i analizy struktur dorosłych Drosophila . Oko Drosophila jest genetycznie wykonalnym systemem modelowym, który dostarczył krytycznych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób, w tym raka19, neurodegeneracji20 i chorób metabolicznych21. W szczególności generowane są "awatary" pacjentów z rakiem, w których generowane są transgeniczne Drosophila przenoszące mutacje onkogenne i mogą być wykorzystywane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków22. Chociaż skupiamy się na oku dorosłego, protokół ten można dostosować do analizy innych interesujących struktur, takich jak skrzydło, noga, klatka piersiowa i brzuch.
Umiejętności motoryczne są wymagane na kilku kluczowych etapach tego protokołu. Przygotowanie próbki dorosłej Drosophila poprzez montaż punktowy wymaga cierpliwości i praktyki. Radzimy początkującym, aby poćwiczyli montaż punktowy przed przygotowaniem rzadkich lub cennych próbek. Istnieje kilka krytycznych kroków, które będą wymagały ćwiczenia umiejętności motorycznych i uważnej uwagi.
Pierwszymi krytycznymi krokami w protokole jest przygotowanie punktów karcianych i nałożenie kleju w celu przyklejenia punktu karty do brzucha (krok protokołu 2.4-2.5). Ważne jest, aby nałożyć odpowiednią ilość kleju, ponieważ docelowe struktury anatomiczne (np. głowa) mogą zostać pokryte klejem, jeśli nałoży się go za dużo lub nie jest to właściwa konsystencja. Próbka musi być również sklejona w odpowiedniej pozycji, tak aby oś przednio-tylna była prostopadła do kołka mocującego. Drugim krytycznym krokiem jest ustawienie głowicy do obrazowania w wysokiej rozdzielczości (krok 3.2 protokołu). Bardzo ważne jest, aby głowa była zorientowana z okiem skierowanym w stronę obiektywu aparatu. Aby wyregulować głowę, małe regulacje wykonuje się za pomocą kleszczy. Delikatne i stopniowe ruchy mają kluczowe znaczenie, ponieważ przy dużych lub siłowych korektach może dojść do przypadkowej dekapitacji. Dodatkowym krokiem, w którym wymagane są umiejętności motoryczne, jest użycie narzędzia wyboru odręcznego z paska narzędzi FIJI (krok 4.6 protokołu). W tym przypadku ważne jest, aby prześledzić jak najbliżej zewnętrznego rzędu ommatidia oka. Ta precyzja ma kluczowe znaczenie dla rygorystycznych i powtarzalnych pomiarów obszaru oka (ryc. 4E).
Metody obrazowania, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), pozostają podstawowym podejściem do wizualizacji i analizy struktur zewnętrznych. Jednak protokoły SEM wymagają od użytkownika obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami i obsługi wielu urządzeń, w tym suszarek do punktów krytycznych, aparatów do napylania i samego SEM. Przygotowanie próbki trwa kilka dni i wymaga intensywnego szkolenia oraz umiejętności. Istotnym wyzwaniem, przed którym stoją instytucje akademickie, są inwestycje finansowe i zaangażowanie w konserwację urządzenia, a z naszego doświadczenia wynika, że personel posiadający wiedzę specjalistyczną w zakresie konserwacji i obsługi tego sprzętu na ogół nie jest wspierany na poziomie instytucjonalnym. Nasz protokół obniża koszty i eliminuje narażenie na niebezpieczne chemikalia kosztem obrazowania o niższej rozdzielczości w porównaniu z SEM.
System opisany w tym badaniu był wstępnie zmontowanym pakietem, ale jego modułowy charakter pozwala na obniżenie kosztów poprzez zastąpienie poszczególnych komponentów sprzętem wyprodukowanym we własnym zakresie (np. stolikami na próbki, dyfuzorami błyskowymi), alternatywnymi markami lub modelami lub sprzętem, który może być już obecny w laboratorium. Podczas gdy łączenie obiektywów mikroskopowych z aparatami makro staje się coraz bardziej popularne wśród hobbystów i profesjonalnych fotografów, w przypadku różnych kombinacji obiektywów i obiektywów może być wymagane kilka prób i błędów. Aby odtworzyć opisany tutaj system, obiektyw mikroskopowy z korekcją nieskończoności musi być podłączony do soczewki tubusu (tutaj teleobiektywu) za pomocą odpowiednio gwintowanego adaptera. Kolejną kwestią przy wymianie komponentów jest upewnienie się, że odległość robocza obiektywu jest zgodna z wymiarami mocowania kamery, mocowania preparatu i szyny makrofokusa. Wreszcie, wybrane tutaj oprogramowanie do ustawiania ostrości jest komercyjne, ale istnieje wiele tanich lub bezpłatnych rozwiązań do ustawiania ostrości po obróbce, w tym wtyczki ImageJ.
Chociaż protokół ten wymaga praktyki, aby opanować techniki obsługi próbek, jest przeznaczony do pozyskiwania i analizowania obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu szczegółowej analizy fenotypowej. Przedstawione tu procedury stanowią szybką i tanią alternatywę dla tradycyjnych metodologii obrazowania. Dzięki wykorzystaniu bezpłatnych technik obrazowania cyfrowego do analizy ilościowej, nasza metodologia jest dostępna i nie wymaga kosztownych zakupów oprogramowania ani aktualizacji. Konfiguracja obrazowania wymaga pewnych kosztów i wysiłku, ale po ustaleniu powinna być długotrwałym dodatkiem do laboratoriów Drosophila . Metoda ta pozwala uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości odpowiednie do ilościowej identyfikacji fenotypów i może być łatwo dostosowana do innych interesujących struktur, takich jak skrzydło, noga, klatka piersiowa i brzuch. Metodologia ta sprawia, że przygotowanie próbek, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i analiza są dostępne dla studentów studiów licencjackich i naukowców w instytucjach o ograniczonych zasobach.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium pHly w Grillo-Hill za dyskusje i wsparcie. Dziękujemy Timowi Andriese, Randy'emu Kirschnerowi, Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen, Marco Parentowi, Jonny'emu Shaloubowi i Librado Velizowi za doskonałe wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez nagrody NIH SC3GM132049 i 1R16GM153640 (BKGH), nagrodę CSU Biotechnology Faculty-Student Research Award (LM i BKGH) oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Stanowym San José (FJL). Szczególne wyróżnienie należy się Berndowi Beckerowi za zaradność i pomoc w tym procesie. Dziękujemy społeczności BioIcons (https://bioicons.com/) za dostarczenie wysokiej jakości ikon dla naszych figurek, a w szczególności dla Serviere za ikonę pipety oraz DBCLS dla ikon Drosophila, kleszczyków i mikroskopu elektronowego na biurku użytych na Rysunku 1 i Rysunku 2, które są objęte licencją CC-BY 4.0 Unported. Dziękujemy również społeczności SciDraw (https://scidraw.io/) za dostarczenie wysokiej jakości ikon dla naszych figurek, w szczególności Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953), które są dostępne na licencji Creative Commons 4.0 (CC-BY).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipeta serologiczna 1 ml | ThermoFisher Scientific | 170353N | |
| 1,7 ml probówki do mikrowirówek Genesee | Scientific | 24-282LR | |
| 20x Obiektyw mikroskopu Apo | Mitutoyo Corp. | 378-804-3 | |
| Karton archiwalny 65 lb | Neenah, Inc. | 91901 | |
| Teleobiektyw Canon EF 70-200 mm USM II | Canon | 3044C002 | |
| Canon EOS 6D Mark II Korpus lustrzanki cyfrowej | Canon | 1897C002 | |
| Dyfuzor Kopuła | Rozwiązania makroskopowe | Dyfuzor PA-DIF-GIM-SM | |
| do Mitutoyo M Plan Cele APO | Rozwiązania makroskopowe | mitutoyo-dyfuzory | |
| Drosophila fiolki i zatyczki | Genesee Scientific | 32-117BF | |
| Kleszcze drobnokońcówkowe Dumont #5 | Fisher Scientific | NC9889584 | |
| Gęsie pióra | Amazon | B01CMMJI6U | |
| Wytrzymały statyw z anodyzowanego aluminium | Really Right Stuff, LLC | TFA-32G | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | niestrzępiąca się chusteczka laboratoryjna |
| Aparat cyfrowy Levenhuk M1000 Plus | Trzpień montażowy Levenhuk | 70358 | |
| nr 3 | Indigo Instruments | 33414-3 | |
| Nutri-Fly Bloomington Drosophila media | Genesee Scientific | 66-113 | pokarm dla much |
| Point-Punch | M.C. Mieth Manufacturing, Inc. | 448Detail | |
| Zacisk śrubowy | Really Right Stuff, LLC | SK-Clamp | Do mocowania szyny makro do statywu |
| Kontroler Stackshot i szyna makro | Cognisys Inc. | ||
| Adapter pierścienia obniżającego napięcie | RAF Camera | 763461174207 | Adapter obiektywu do podłączenia obiektywu mikroskopu do obiektywu aparatu |
| Titebond Glue | Franklin International | 5013 | |
| Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash | Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co. | YN-24EX | |
| strong>Software | |||
| Canon EOS Utility (wersja 3.16.1). | Oprogramowanie do nabywania | produktów firmy Canon | |
| FIJI | National Institutes of Health | Fiji zostało wydane jako oprogramowanie typu open source na licencji GNU General Public License. FIDŻI wersja 2.14.0/1.54f | |
| GraphPad Prism | Oprogramowanie GraphPad, Boston, Massachusetts, USA | Prism Wersja 10.3.1 | |
| Zerene Stacker (v.1.04) | Zerene Systems, LLC | Oprogramowanie do układania ostrości |
Bibliografia
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia. Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).
- Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila. Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).
- Bonini, N. M. A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease. Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).
- Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases. Development. 147 (11), dev189340(2020).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Johnson, R. I. Hexagonal patterning of the Drosophila eye. Dev Biol. 478, 173-182 (2021).
- Weasner, B. P., Kumar, J. P. The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster. Genetics. 221 (1), iyac041(2022).
- Pichaud, F., Casares, F. Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye. Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).
- Oster, I. I., Crang, R. E. Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes. Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).
- Gibb, T. J., Oseto, C. Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory. , Academic Press. (2019).
- Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects. ZooKeys. 712, 141-154 (2017).
- Brown, B. V. A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies. Fly Times. 11, 10(1993).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 4, e03270(2015).
- White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).
- Peralta, J., et al. Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death. Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).
- Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies. Front Genet. 13, 949241(2022).
- Nitta, Y., Sugie, A. Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis. Fly. 16 (1), 275-298 (2022).
- Pletcher, R. C., et al. A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development. G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).
- Bangi, E., et al. A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).
Przedruki i uprawnienia
